罗格列酮半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种罗格列酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体，同时本发明也公开了所述罗格列酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体的制备方法和应用。本发明以罗格列酮为原料，与卤代酸盐反应生成含羧基的罗格列酮半抗原；然后通过活泼脂法或者混合酸酐法将罗格列酮半抗原与蛋白质偶联制备罗格列酮人工抗原。将罗格列酮人工抗原免疫动物后产生对罗格列酮高特异性抗体。应用所述罗格列酮抗体和罗格列酮人工抗原免疫检测方法可用于罗格列酮现场快速检测，对实现保健食品安全的快速检测具有重要现实意义。

1、  一种罗格列酮半抗原，其特征在于分子结构式为：

n为1～6的自然数。

2、  一种罗格列酮人工抗原，是由权利要求1所述的罗格列酮半抗原与载体蛋白结合而成，其特征在于：所述罗格列酮人工抗原分子结构式为：

n为1～6的自然数；
所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、伴刀豆球蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白。

3、  一种罗格列酮抗体，是能与权利要求2所述的罗格列酮人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。

4、  权利要求1所述罗格列酮半抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)卤代酸盐与罗格列酮按摩尔比1∶1～5∶1混合，加入无水乙醇至溶解；
(2)加入与卤代酸盐等摩尔数的碳酸钾，在50～70℃下回流反应，在反应过程中加入与碳酸钾摩尔比为0.5∶1～1∶1的碘化钾作为催化剂，回流反应4～6小时；
(3)过滤反应混合物，得到黄棕色滤液，浓缩滤液得到棕黄色油脂状物质；
(4)棕黄色油脂状物质过硅胶柱，体积比6∶1～8∶1氯仿/甲醇洗脱液洗脱，收集，浓缩洗脱液至干，得到棕黄色油脂状物质即为罗格列酮半抗原。

5、  根据权利要求4所述罗格列酮半抗原的制备方法，其特征在于：所述卤代酸盐为卤代酸钠，其结构式为R-(CH₂)_n-COONa，其中R为Cl或Br，n为1～6的自然数。

6、  权利要求2所述罗格列酮人工抗原的制备方法为活泼脂法或混合酸酐法，其特征在于：
所述活泼酯方法包括以下步骤：
(1)将30～50μmol的罗格列酮半抗原溶解于1～1.5 ml二甲基亚砜；
(2)在步骤(1)的溶液中分别加入与罗格列酮等摩尔的N，N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酸亚胺，室温避光反应过夜；
(3)0～4℃离心，取上清液，将上清液缓慢加入到4～6ml 0.1mol/LpH9.0～9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，然后在4℃下反应过夜；所述的碳酸盐缓冲液含有载体蛋白，其中载体蛋白的浓度为10～15mg/ml；
(4)步骤(3)的溶液反应完成后，将其装入透析袋，再用生理盐水透析，得到无色罗格列酮人工抗原；
所述活泼脂法步骤(3)中的载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、伴刀豆球蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白；
所述的混合酸酐法包括以下步骤：
(1)将80～200μmol罗格列酮半抗原溶于1～1.5ml二甲基亚砜中，再加入60～90μl正三丁胺，冰浴；
(2)接着，缓慢滴加0.1～0.2mmol氯甲酸异丁酯到步骤(1)的溶液中，0～4℃搅拌反应0.5～1小时，得到甲液；将60～80mg载体蛋白溶于4～6ml 1mol/L pH 9.0～9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，得到乙液；将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃反应过夜；
(3)步骤(2)的溶液反应完成后，将其装入透析袋，再用生理盐水透析，得到罗格列酮人工抗原；
所述混合酸酐法步骤(2)中的载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、伴刀豆球蛋白、甲状腺球蛋白或卵清蛋白。

7、  权利要求3所述罗格列酮抗体的制备方法，其特征在于：
(1)实验采用健康的雄性小鼠或雄性兔作为实验对象，免疫剂量基础免疫为0.25～1mg/kg，使用等体积的抗原与弗氏完全佐剂乳化免疫，加强免疫为0.5～1mg/kg，使用等体积的抗原与弗氏不完全佐剂乳化免疫；雄性兔子采用背部皮下多点注射，雄性小鼠采用腹腔注射，基础免疫15～20天后进行加强免疫，每隔15天加强免疫一次，第4次加强免疫后8～10天内，耳缘静脉采血，测定效价和特异性，待其血清效价和特异性合格后，兔子采用心脏采血，分离出抗血清；或用小鼠脾细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，获得单克隆抗体；
(2)采用辛酸-硫酸铵法或采用蛋白A亲和层析法，得到兔抗血清或是小鼠腹水中的免疫球蛋白G；所述的免疫球蛋白G是罗格列酮抗体。

8、  权利要求3所述的罗格列酮抗体的应用，其特征在于，所述的罗格列酮抗体应用于罗格列酮含量的免疫检测。

9、  根据权利要求8所述罗格列酮抗体的应用，其特征在于：所述的罗格列酮抗体应用于食品中罗格列酮含量的免疫检测。

10、  根据权利要求9所述罗格列酮抗体的应用，其特征在于：所述的罗格列酮抗体应用于降糖类保健食品中罗格列酮含量的免疫检测。

罗格列酮半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种罗格列酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体，还涉及上述罗格列酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体的制备方法和应用。
背景技术
罗格列酮(Rosiglitazone)又名文迪雅，其化学名为5-[4-[2-(N-甲基-N-(2-吡啶基)氨基)乙氧基]苄基]噻唑烷-2，4-二酮，分子量为429.92，在水中几乎不溶，其结构式为：

罗格列酮属噻唑烷二酮类抗糖尿病药，是高选择性过氧化酶体增殖激活受体γ(PPAR-γ)激动剂，通过与PPAR-γ结合，激活脂肪、骨骼肌和肝脏等胰岛素所作用组织的PPAR-γ，增加多种蛋白质的合成，调节胰岛素应答基因的转录，控制血糖的生成、转运和利用，纠正糖及脂质代谢异常，降低空腹及餐后血糖，改善高葡萄糖毒性。这种药物的开发和使用为2型糖尿病患者尤其是伴有胰岛素抵抗的2型糖尿病患者的治疗提供了一种新途径。在罗格列酮的临床应用过程中，FDA注意到与罗格列酮相关的安全性问题，服用罗格列酮的病人心脏缺血和心脏相关死亡发生的危险性明显增加，同时还会有水肿(局部或全身)、皮疹、腹泻、头晕、头痛等症状。
我国糖尿病人的增长速度较快，因此，我国的糖尿病OTC、保健食品市场种类繁多。但是，其中不少鱼龙混杂，尤其是一些标榜纯中药却非法掺加西药成分情况最为常见。保健食品中是不允许处方药添加的，罗格列酮属于国家医保乙类药物，因此，罗格列酮在保健食品中属于违禁的药物。
目前，对保健食品中罗格列酮的检测主要采用高效液相色谱法(HPLC)、气相等仪器检测方法。然而应用仪器方法时，仪器方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，测定方法复杂、繁琐，检测通量小，需要培养专业人员进行检测，检测成本昂贵，不能实现大批量样品的快速检测分析。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检测方法。
免疫检测方法，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，检测成本很低，使用简单，适合大量样品的筛选检测，已经在食品安全检测中发挥了重要作用。目前，尚未有有效的罗格列酮免疫学检测方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种罗格列酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体。
本发明的另一目的在于提供所述罗格列酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述罗格列酮半抗原及其相应的人工抗原和抗体的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种罗格列酮半抗原的分子结构式为：

n为1～6的自然数。
所述的n优选为1。
所述的罗格列酮半抗原与载体蛋白结合，得到罗格列酮人工抗原，其分子结构式为：

n为1～6的自然数。
所述的n优选为1。
所述的载体蛋白为BSA(牛血清白蛋白)、KLH(血蓝蛋白)、CONA(伴刀豆球蛋白)、THY(甲状腺球蛋白)或OVA(卵清蛋白)。
一种罗格列酮抗体为能与罗格列酮人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
所述罗格列酮半抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)卤代酸盐与罗格列酮按摩尔比1∶1～5∶1混合，加无水乙醇至溶解；
(2)加入与卤代酸盐等摩尔数的碳酸钾，在50～70℃下回流反应，在反应过程中加入与碳酸钾摩尔比为0.5∶1～1∶1的碘化钾作为催化剂，回流反应4～6小时；
(3)过滤反应混合物，得到黄棕色滤液，浓缩滤液得到棕黄色油脂状物质；
(4)棕黄色油脂状物质过硅胶柱，体积比6∶1～8∶1氯仿/甲醇洗脱液洗脱，收集，浓缩洗脱液至干，得到棕黄色油脂状物质，即为罗格列酮半抗原。
所述卤代酸盐为卤代酸钠，其结构式为R-(CH₂)_n-COONa，其中R为Cl或Br，n为1～6的自然数。
所述罗格列酮人工抗原的制备方法为活泼脂法或混合酸酐法。
所述活泼酯方法包括以下步骤：
(1)将30～50μmol的罗格列酮半抗原溶解于1～1.5ml二甲基亚砜(DMSO)；
(2)在步骤(1)的溶液中分别加入与罗格列酮等摩尔的DCC(N，N-二环己基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酸亚胺)，室温避光反应过夜；
(3)0～4℃离心，取上清液，将上清液缓慢加入到4～6ml 0.1mol/LpH9.0～9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，然后在4℃下反应过夜；所述的碳酸盐缓冲液含有载体蛋白，其中载体蛋白的浓度为10～15mg/ml；
(4)步骤(3)的溶液反应完成后，将其装入透析袋，再用生理盐水透析，得到无色罗格列酮人工抗原。
所述活泼脂法步骤(3)中的载体蛋白为BSA、OVA、KLH、CONA或THY。
所述的混合酸酐法包括以下步骤：
(1)将80～200μmol罗格列酮半抗原溶于1～1.5ml DMSO中，再加入60～90μl正三丁胺，冰浴；
(2)接着，缓慢滴加0.1～0.2mmol氯甲酸异丁酯到步骤(1)的溶液中，0～4℃反应0.5～1小时，得到甲液；将60～80mg载体蛋白溶于4～6ml 1mol/L pH 9.0～9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，得到乙液；将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃反应过夜；
(3)步骤(2)的溶液反应完成后，将其装入透析袋，再用生理盐水透析，得到罗格列酮人工抗原。
所述混合酸酐法步骤(2)中的载体蛋白为BSA、KLH、CONA、THY或OVA。
所述罗格列酮抗体的制备方法，具体步骤如下：
(1)实验选用健康的雄性小鼠或雄性兔作为实验对象，免疫剂量基础免疫为0.25～1mg/kg，使用等体积的抗原与弗氏完全佐剂乳化免疫，加强免疫为0.5～1mg/kg，使用等体积的抗原与弗氏不完全佐剂乳化免疫。雄性兔子采用背部皮下多点注射，雄性小鼠采用腹腔注射，基础免疫15～20天后进行加强免疫，每隔15天加强免疫一次，第4次加强免疫后8～10天内，耳缘静脉采血，测定效价和特异性，待其血清效价和特异性合格后，兔子采用心脏采血，分离出抗血清；或用小鼠脾细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，进而获得单克隆抗体(刘秀梵，《单克隆抗体在农业上的应用》)；
(2)采用辛酸-硫酸铵法或采用蛋白A亲和层析法，得到兔抗血清或是小鼠腹水中的免疫球蛋白G；所述的免疫球蛋白G即是罗格列酮抗体。
所述罗格列酮抗体的制备方法步骤(1)中的雄性小鼠优选为Balb/c雄性小鼠，雄性兔优选为雄性新西兰兔。
所述的罗格列酮抗体特异性、效价、亲和力高。
所述的罗格列酮抗体应用于罗格列酮含量的免疫检测。
所述的罗格列酮抗体应用于食品中罗格列酮含量的免疫检测，特别是应用于降糖类保健食品中罗格列酮含量的免疫检测。
所述的免疫检测为酶联免疫吸附剂测定(即ELISA)。
所述酶联免疫吸附剂测定方法为间接竞争法。
本发明的原理：由于罗格列酮是小分子物质(分子量小于1000)，本身不具有免疫原性，必须与大分子载体偶联制备人工抗原，才能诱导特异性抗体的产生。由于罗格列酮本身并不具有活性基团，不能与大分子载体偶联，因此需要对罗格列酮分子进行改造，引入活性基团(-COOH、-NH₂、-OH等)，合成罗格列酮半抗原。本发明以罗格列酮为原料，与卤代酸盐反应生成含羧基的罗格列酮半抗原；然后通过活泼脂法或者混合酸酐法将罗格列酮半抗原与蛋白质偶联制备罗格列酮人工抗原。将罗格列酮人工抗原免疫动物后产生对罗格列酮高特异性抗体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)应用本发明制备的的罗格列酮人工抗原和抗体的免疫检测分析方法，与仪器方法相比较，其检测成本低，其成本只是仪器方法检测费用的1/10左右；
(2)应用本发明制备的的罗格列酮人工抗原和抗体的免疫检测分析方法灵敏度高、特异性强，其检测线性范围为7.5～1740ng/ml，检测限为1.5ng/ml；
(3)应用本发明制备的的罗格列酮人工抗原和抗体的免疫检测分析方法能够同时检测大批量的样品，速度较快，方便操作，因此适用于罗格列酮含量的现场监控的痕量分析。
附图说明
图1为罗格列酮标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)罗格列酮半抗原(n＝1)的制备，如下反应式所示：

称取0.43g(1mmol)的罗格列酮(纯度：98.5％)与0.232g(2mmol)的氯乙酸(分析纯)钠置于圆底烧瓶中，并将其混合物用5ml的无水乙醇溶解，同时加入2mmol碳酸钾，在60℃下回流搅拌反应，在反应过程中加入1mmol的碘化钾作为催化剂，回流搅拌反应4小时。过滤反应混合物得到黄棕色滤液，浓缩得到棕黄色油脂状物质。棕黄色油脂状物质过硅柱层析硅胶柱，收集体积比8∶1氯仿/甲醇洗脱相的洗脱液，浓缩洗脱液至干，得到0.09g罗格列酮半抗原。
(2)罗格列酮人工抗原的制备，采用活泼酯法制备免疫抗原，混合酸酐法制备包被抗原：
免疫抗原的制备：将50μmol的罗格列酮半抗原溶解于1.5ml DMSO中，然后在该溶液里加入50μmol DCC和50μmol NHS，室温避光反应过夜，4℃离心弃沉淀，留上清液；将上清液其缓慢加入到5ml 0.1mol/L pH9.5的含有载体蛋白BSA的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，其中BSA的浓度为10mg/ml。混合物在4℃下反应过夜，然后装入孔径为8～14kD(千道尔顿)的透析袋，用质量百分比0.9％生理盐水透析3天，得到无色的罗格列酮人工抗原(RG-BSA)。
包被抗原的制备：将100μmol罗格列酮半抗原溶于1.5ml DMSO中，加入80μl正三丁胺，冰浴下缓慢滴加0.15mmol氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应1小时，得到甲液；将80mg OVA溶于5ml 1mol/L pH9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，得到乙液；将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃磁力搅拌反应过夜，待反应完成后，装入孔径为8～14kD的透析袋，然后用质量百分比0.9％的生理盐水透析3天，得到透析好的罗格列酮人工抗原(RG-OVA)。
按照分光光度法测定罗格列酮半抗原、载体蛋白以及罗格列酮人工抗原的最大吸收值，计算罗格列酮人工抗原的偶联比。扫描波长为200～400nm，计算得到：罗格列酮半抗原与BSA的偶联比为15.3∶1，罗格列酮半抗原与OVA的偶联比为7.5∶1。
(3)兔罗格列酮抗体的制备
实验选用2～3月、体重2～2.5kg健康雄性的新西兰兔作为实验对象，同时免疫两只兔子，基础免疫剂量为0.5mg/kg，将RG-BSA抗原与弗氏完全佐剂乳化免疫；加强免疫剂量为1mg/kg，将RG-BSA抗原与弗氏不完全佐剂乳化免疫。采用背部皮下多点注射，基础免疫20天后进行加强免疫，每隔15天加强免疫一次，第4次免疫后8～10天内，耳缘静脉采血，测定效价，待其血清效价稳定不再增长后，兔子采用心脏采血，分离出抗血清。得到的抗血清的效价为1/320000。
抗血清采用辛酸-硫酸铵盐析法纯化：在抗血清内加入同抗血清等体积的pH4.0、60mmol/L醋酸盐缓冲液，并用0.1mol/L NaOH调pH至4.5。在振荡下滴加正辛酸(33μl/ml)，室温搅拌30分钟，4℃静置1小时，然后在4℃10000rpm离心30分钟。弃沉淀，取上清液，用定性滤纸过滤，加入0.1mol/L PBS，用1mol/LNaOH调pH至7.4，在4℃条件下预冷15分钟。每毫升混合液加入0.277g硫酸铵，搅拌30分钟后在4℃冰箱内静置2～3小时，10000rpm离心30分钟，弃上清。沉淀用少量0.01mol/L PBS溶解，并于4℃下在pH7.4 0.01mol/L PBS中透析，每天换液3～5次，得到纯化的兔罗格列酮抗体。
实施例2
(1)罗格列酮半抗原(n＝6)的制备，如下反应式所示：

称取0.43g(1mmol)的罗格列酮(纯度：98.5％)与0.76g(5mmol)的氯庚酸(分析纯)钠置于圆底烧瓶中，并将其混合物用5ml的无水乙醇溶解，同时加入5mmol碳酸钾，在50℃下回流搅拌反应，在反应过程中加入5mmol的碘化钾作为催化剂，回流搅拌反应5小时后，停止反应。过滤反应混合物得到黄棕色滤液，浓缩得到棕黄色油脂状物质。过硅柱层析硅胶柱，收集体积比7∶1氯仿/甲醇洗脱相的洗脱液，浓缩洗脱液至干，得到0.08g罗格列酮半抗原。
(2)罗格列酮人工抗原的制备，采用活泼酯法制备免疫抗原，混合酸酐法制备包被抗原：
免疫抗原的制备：将30μmol的上述罗格列酮半抗原溶解于1ml DMSO中，然后在该溶液里加入30μmol DCC和30μmol NHS，室温避光反应过夜，4℃离心弃沉淀，留上清液；将上清液其缓慢加入到4ml 0.1mol/L pH9.0的含有载体蛋白OVA的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，其中OVA的浓度为15mg/ml。混合物在4℃下反应过夜。待反应完成后，装入孔径为8～14kD(千道尔顿)的透析袋，然后用质量百分比0.9％的生理盐水透析3天，得到无色的罗格列酮人工抗原(RG-OVA)。
包被抗原的制备：将80μmol罗格列酮半抗原溶于1.0ml DMSO中，加入60μl正三丁胺，冰浴下缓慢滴加0.1mmol氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应45分钟，得到甲液；将60mg BSA溶于4ml 1mol/L pH9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，得到乙液；将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃磁力搅拌反应过夜，待反应完成后，装入孔径为8～14kD的透析袋，然后用质量百分比0.9％的生理盐水透析3天，得到透析好的罗格列酮人工抗原(RG-BSA)。
按照分光光度法测定罗格列酮半抗原、载体蛋白以及罗格列酮人工抗原的最大吸收值，计算罗格列酮人工抗原的偶联比。扫描波长为200～400nm，计算得到：罗格列酮半抗原与OVA的偶联比为13.5∶1，罗格列酮半抗原与BSA的偶联比为8.2∶1。
(3)兔罗格列酮抗体的制备：按照实施例1步骤(3)进行兔抗体的制备进行制备。
实施例3罗格列酮半抗原(n＝1)的制备，R为Br，如下反应式所示：

称取0.43g(1mmol)的罗格列酮(纯度：98.5％)与0.16g(1mmol)的溴乙酸钠(分析纯)置于圆底烧瓶中，并将其混合物用5ml的无水乙醇溶解，同时加入1mmol碳酸钾，在70℃下回流搅拌反应，在反应过程中加入0.75mmol的碘化钾作为催化剂，回流搅拌反应6小时后，停止反应。过滤反应混合物得到黄棕色滤液，浓缩得到棕黄色油脂状物质。过硅柱层析硅胶柱，收集体积比6∶1氯仿/甲醇洗脱相的洗脱液，浓缩洗脱液至干，得到0.10g罗格列酮半抗原。
(2)罗格列酮人工抗原的制备，采用活泼酯法制备免疫抗原，混合酸酐法制备包被抗原：
免疫抗原的制备：将40μmol的上述罗格列酮半抗原溶解于1.2mlDMSO中，然后在该溶液里加入40μmol DCC和40μmol NHS，室温避光反应过夜，4℃离心弃沉淀，留上清液；将上清液其缓慢加入到5ml 0.1mol/LpH9.0的含有载体蛋白BSA的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，其中BSA的浓度为12mg/ml。混合物在4℃下反应过夜。待反应完成后，装入孔径为8～14kD(千道尔顿)的透析袋，然后用质量百分比0.9％的生理盐水透析3天，得到无色的罗格列酮人工抗原(RG-BSA)。
包被抗原的制备：将200μmol罗格列酮半抗原溶于1.5ml DMSO中，加入90μl正三丁胺，冰浴下缓慢滴加0.2mmol氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应45分钟，得到甲液；将80mg THY溶于6ml 1mol/L pH9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，得到乙液；将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃磁力搅拌反应过夜，待反应完成后，装入孔径为8～14kD的透析袋，然后用质量百分比0.9％的生理盐水透析3天，得到透析好的罗格列酮人工抗原(RG-THY)。
按照分光光度法测定罗格列酮半抗原、载体蛋白以及罗格列酮人工抗原的最大吸收值，计算罗格列酮人工抗原的偶联比。扫描波长为200～400nm，计算得到：罗格列酮半抗原与BSA的偶联比为16.5∶1，罗格列酮半抗原与THY的偶联比为9.5∶1。
(3)兔罗格列酮抗体的制备：按照实施例1步骤(3)进行兔抗体的制备进行制备。
实施例4
使用实施例1制备得到到的RG-VOA和罗格列酮抗体进行免疫检测。
(1)包被：在96孔酶标板上每孔加入100μl含有RG-OVA包被抗原的包被液，4℃过夜；包被液中RG-OVA包被抗原的浓度为100ng/ml；
(2)封闭：取出包被好的酶标板，使用PBST(磷酸盐吐温20缓冲溶液)洗板两次，每孔加入120μl脂牛奶封闭液，在37℃温箱中温育3小时后将脱脂牛奶封闭液甩干，置烘箱1小时；
(3)加样：在封闭好的酶标板中每孔加入经系列稀释制备的罗格列酮标准液50μl，浓度梯度(单位为ng/ml)为0、1、5、25、125、625、3125、10000，再加入抗体稀释液稀释20000倍的兔罗格列酮抗体50μl，在37℃恒温箱里反应45分钟，使用PBST洗板6次；
(4)加入二抗：每孔加入经1∶10000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶(250U/mg)稀释液100μl，放在37℃恒温箱里反应60分钟，使用PBST洗板6次。
(5)显色：每孔加入底物TMB-过氧化氢溶液100μl，即150μl的0.1mol/L的TMB与2μl 30％的过氧化氢溶液混合，使用10ml底物缓冲液稀释；37℃显色15分钟后用50μl 10％的H₂SO₄终止反应。在酶标仪上450nm波长下测吸光值。根据百分吸光度值与罗格列酮浓度之间的半对数关系按照四参数拟合得到标准曲线，如图1所示：
其中所述百分吸光度值的计算式为：
百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100
B为标准溶液的平均吸光值，B0为0浓度标准溶液的平均吸光度值。分析得到罗格列酮的检测限为1.5ng/ml，其检测范围为7.5～1740.0ng/ml。
表1罗格列酮ELISA基本参数