四氢苯并呋喃4酮肟基三唑药物，制备方法及其应用.pdf

本发明涉及一种四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑药物，该药物为四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑的顺式异构体：该药物还包括药学上可接受的盐以及衍生物。具体制备方法是首先制备了3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮(中间体1)和叠氮(中间体2)，再通过缩合反应将中间体1转化为顺式酮肟(中间体3)，经分离提纯后将其烷基化得到炔丙基肟醚(中间体4)，最后将中间体4和叠氮中间体2经铜催化的环加成反应合成1,2,3-三氮唑基取代的呋喃并环己酮肟及其衍生物。该类化合物具有抗溃疡和抗胃癌双重疗效，可作为胃癌治疗的替代药物。

1.  一种四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑药物，其特征在于，该药物的结构式为：

该结构式为四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑的顺式异构体；
该药物还包括药学上可接受的盐，四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑药学可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐或草酸盐中的任意一种，其结构式为


2.  权利要求1所述的四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑药物还可以为四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物药物，其特征在于，该衍生类药物的结构式为：

其中，四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物为顺式异构体，R为烷基或芳基；
该药物还包括药学上可接受的盐，四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物药学可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐或草酸盐中的任意一种，其结构式为

3.  根据权利要求2所述的衍生物药物，其特征在于，所述的R为PhCH₂-、Ph-、PhCOCH₂-、(p)-MeO-PhCOCH₂-、(p)-F-PhCOCH₂-、(m)-HO-PhCOCH₂-、(p)-Ph-PhCOCH₂-中的任意一种。

4.  根据权利要求2所述的衍生物药物，其特征在于，所述的R为(m)-HO-PhCOCH₂-。

5.  权利要求1-4任一项所述的含四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑的药物的组合物，其特征在于，该组合物包括权利要求1～4任一项所述的药物，以及药学上可接受的辅料或载体。

6.  一种四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑或其衍生物的药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)采用55,-二甲基-1,3环己二酮经加成后得到3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮(中间体1)；
2)将中间体1和盐酸羟胺用溶剂无水乙醇溶解得到混合液，再向混合液中加入无水醋酸钠，搅拌、回流2-5h、冷却、倒至冰水中、真空干燥后得到(Z)-3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮肟(中间体3)；
3)将中间体3溶于乙腈溶剂后，加入氢化钠，在充分搅拌下，滴加炔丙基溴，室温搅拌1-3h，旋蒸、乙酸乙酯萃取、分液、干燥、分离得到(Z)-3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮肟基炔丙醚(中间体4)；
4)将对羟基苯乙酮溶于乙酸乙酯中，然后向溶液中加入溴化铜，加热回流，冷却至室温后，过滤，乙酸乙酯萃取，分液，干燥，抽滤，分离得到α-溴代-4-羟基苯乙酮，将生成的α-溴代-4-羟基苯乙酮溶于丙酮中，并加入叠氮化钠，35-50℃搅拌1-3小时，冷却至室温，加水，乙酸乙酯萃取，分液，干燥，抽滤、分离得到α-叠氮基-4-羟基苯乙酮(叠氮中间体2)；
5)将中间体4、叠氮中间体2或叠氮化合物悬浮在水和叔丁醇的混合溶剂中，依次加入抗坏血酸钠、五水硫酸铜，在70-90℃油浴中搅拌过夜直至反应完全(TLC监测)，冷却反应液，向反应混合物中加水稀释，得到白色沉淀物，过滤、真空干燥，得到四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑或四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物。

7.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
步骤2)中，中间体1、盐酸羟胺、无水醋酸钠的摩尔比为8-12：10-15：10-15；
步骤3)中，中间体3、氢化钠、炔丙基溴的摩尔比为8-12：8-12：10-15；
步骤4)中，对羟基苯乙酮、溴化酮的摩尔比为8-12：18-25，α-溴代-4-羟基苯乙酮、叠氮化钠的摩尔比为3-6：5-10；
步骤5)中，中间体4、叠氮中间体2、抗坏血酸、无水硫酸铜的摩尔比为5：5.05～5.5：0.8-1.5：0.05-0.2。

8.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
步骤2)中，中间体1、盐酸羟胺、无水醋酸钠的摩尔比为5：6：6；
步骤3)中，中间体3、氢化钠、炔丙基溴的摩尔比为5：5：6；
步骤4)中，对羟基苯乙酮、溴化酮的摩尔比为1：2，α-溴代-4-羟基苯乙酮、叠氮化钠的摩尔比为5：6；
步骤5)中，中间体4、叠氮中间体2、抗坏血酸、无水硫酸铜的摩尔比为5：5：1：0.1。

9.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中，叠氮中间体2还可以为叠氮化合物为2-叠氮芳基乙酮、叠氮芳烃、芳亚甲基基叠氮中的任意一种。

10.  根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的无水乙醇溶剂还可以为甲醇、吡啶或甲苯中的任意一种；步骤3)中，乙腈溶剂还可以为乙醚、四氢呋喃、甲苯或苯中的任意一种；步骤5)中，叔丁醇-水的混合溶剂还可以为二氯甲烷-水或异丙醇-氯仿的混合溶剂。

11.  根据权利要求1～10任一项所述的四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑及其组合物、四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物及其组合物、或其盐在制备治疗抗胃癌药物上的应用。

12.  根据权利要求1～10任一项所述的四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑及其组合物、四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物及其组合物、或其盐在制备治疗抗溃疡药物上的应用。

四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑药物,制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一类四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑类抗胃癌药物的合成方法、结构鉴定、抗胃癌活性及抑酸活性，该类化合物具有抗溃疡和抗胃癌双重疗效，可作为胃癌治疗的替代药物。
背景技术
随着人口老龄化趋势的加剧、环境污染及现代生活方式的改变，癌症已成为严重危害公共健康和社会发展的主要疾病之一。自20世纪70年代以来，我国恶性肿瘤发病率和死亡率呈现出持续增长趋势。据全国肿瘤登记中心的肿瘤登记数据及第三次全国死因调查资料的汇总和分析发现，我国恶性肿瘤发病率在近20年间呈明显上升趋势，目前每年肿瘤新发病例约309万，死亡196万，肺癌、女性乳腺癌、胃癌、肝癌和食管癌是最常见的恶性肿瘤(陈万青,郑荣寿,张思维.中国恶性肿瘤的动态变化.科技导报2014年第32卷26期,65-71页)。因此，合理开展健康教育，加强抗肿瘤药物的研发投入，才能从源头上有效控制癌症形势的恶化。
作为一种常见消化道恶性肿瘤，胃癌(Gastric Cancer)在全球范围内的发病率和死亡率一直占据着各类肿瘤的前列。由于淋巴转移或腹腔转移等原因，胃癌仍是外科治疗效果不理想的恶性肿瘤之一(荣维淇,吴健雄.胃癌早期诊断的研究进展.中国肿瘤临床与康复2006年10月第13卷第5期,469-472页)，因此必须对胃癌进行综合治疗，包括手术和辅助化疗、放疗、免疫治疗等。胃癌化疗的常用药物包括紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂等，由于胃癌对化疗药物大多为低敏感性，因此临床上常通过加大化疗药物的剂量或多药物联合来增加敏感性，但剂量增大对正常组织(如骨髓、心脏及肝脏等)的毒性也会增加，反 而降低了机体对化疗的耐受性(张琦,徐智,陈锦飞.胃癌药物治疗进展.癌症进展,2014年第12卷第1期,22-28页)。胃癌中晚期缺乏有效的治疗手段，尚不能满足临床对胃癌进行有效控制的需要，因此必须加强高选择性的抗胃癌化疗药物的研究开发力度，提高胃癌患者的生存率。
苯并呋喃类化合物是广泛分布于菊科(Asteraceae)、芸香科(Rutaceae)、百合科(Liliaceae)和莎草科(Cyperaceae)等高等植物中的一类生物活性物质，可作为激动雌激素受体调节剂、甲状腺素受体拮抗剂、H3受体和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等用于防治阿尔茨海默病、骨质疏松症、心律失常、帕金森病以及肿瘤等方面(王宝,赖宜生,张奕华.苯并呋喃类化合物的生物活性及构效关系.药学进展,2008年第32卷第8期,351-356页)。该类化合物的合成方法及生物活性研究一直是药物化学及有机合成领域的研究热点(潘崇峰,(5R)-6-羟基-3,8-二氧二环[3.2.1]辛烷、苯并二氢呋喃和苯并呋喃类衍生物的高效合成新方法研究.中国科学技术大学博士学位论文,2007)。欧阳宇迪等以2,2,7,7-四甲基-2,3,6,7-四氢苯并[1,2-b∶6,5-b′]二呋喃为原料，经过开环、傅克和亲核反应，合成了三个2,2,7,7-四甲基-2,3,6,7-四氢苯并[1,2-b:6,5-b’]二呋喃衍生物(欧阳宇迪,吴道新,臧阳陵,罗先福,周勇,毛春晖.2,2,7,7-四甲基-2,3,6,7-四氢苯并[1,2-b:6,5-b’]二呋喃衍生物的合成.精细化工中间体,2012年第42卷第4期,29-31页)。吕泽良等以甲氧基取代苯甲醛和氯仿为起始物合成了13种3-芳基苯并呋喃酮类化合物，采用噻唑蓝法对其中11种化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制活性研究，发现化合物4a、4b、4i、4j具有较强的抗结肠癌活性(吕泽良,高扬,李军,黄桐堃,何树杰,邹永.3-芳基苯并呋喃酮类化合物的合成及抗肿瘤活性.高等学校化学学报,2013年第34卷11期,2531-2539页)。沈芳等采用酰化、α-溴代、噻唑环化和亚胺化等反应合成了16种4-(7-甲氧基-2,2-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基)-2-苄亚氨基噻唑新化合物，生物活性测试发现该类物质对棉红蜘蛛、油菜菌核病均具有杀灭活性，还对苘麻、刺苋、藜具有一定的除草活性(沈芳,胡艾希,罗先福,叶姣,欧晓明.4-(7-甲氧基-2,2-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基)-2-苄亚氨基噻唑的合成与生物活性.有机化学,2012年第32卷,388-392页)。
近年药物化学研究表明，三氮唑衍生物可作为一类新型的具有抗肿瘤潜力的化合物，已有多个三唑类药物用于临床治疗肿瘤。例如商品化药物来曲唑(Letrozole)、阿那曲唑(Anastrozole)和伏氯唑，通过抑制芳香化酶的活性，降低雌激素水平，作为一种新型的雌激素拮抗药用于治疗绝经后晚期乳腺癌。(米佳丽,吴俊,周成合.三唑类抗肿瘤药物的研究进展.华西药学杂志,2008年第23卷第1期,84-86页)。杨锐生等以4-氨基-5-(吡啶-3-基)-1,2,4-三唑硫醇为原料，经硫醚化、缩合得到的三唑类化合物具有较强的体外抑制人肝癌细胞株SMMC-7721和Bel-7402的活性(杨锐生,胡国强,谢松强,黄文龙.3-甲硫基-4-氨基-5-(吡啶-3-基)-1,2,4-三唑席夫碱的合成及抗肿瘤活性.应用化学,2008年第25卷第7期,783-786页)。王盟盟等以哌嗪、二硫化碳和溴丙炔为原料一锅得哌嗪基二硫代甲酸酯双炔化合物，再利用“点击化学”合成 了未见文献报道的含有1,2,3-三唑和哌嗪二硫代甲酸酯结构单元的1,4-双哌嗪二硫代甲酸[1-取代(1,2,3-三唑)-4-]甲酯类化合物，体外抗肿瘤活性测试发现部分化合物对胃癌细胞MGC-803的抗肿瘤活性与阳性对照氟尿嘧啶相当，对肝癌细胞SMMC-7721的抗肿瘤活性优于阳性对照氟尿嘧啶，半数抑制浓度(IC₅₀)分别为11.15和14.75μmol/L(王盟盟,段迎超,叶先炜,任景丽,余斌,张恩,刘宏民.新型1,4-双哌嗪二硫代甲酸[1-取代(1,2,3-三唑)-4]-甲酯类化合物的设计、合成和抗肿瘤活性研究.有机化学,2013年第33卷,2384-2390页)。
本专利以活性亚基团拼接原理为指导，立体专一性制备并分离了四氢苯并呋喃-4-酮肟衍生物，采用醚化、点击合成的方式制备了含三唑基的药物分子，利用NMR、ESI-MS、IR等现代波谱技术鉴定了产物的化学结构，通过细胞毒活性实验和氢钾-ATP酶抑制活性实验测试了化合物的抗胃癌活性及其作用机制，为胃癌的化疗提供了新型参考药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑药物，该药物的结构式为：

该结构式为四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑的顺式异构体；
该药物还包括药学上可接受的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐或草酸盐等。

进一步本发明提供一种四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物药物，该衍生类药物的结构式为：

其中，其中四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物为顺式异构体，R为烷基或芳基；
该药物还包括药学上可接受的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐或草酸盐等。

所述的R为PhCH₂-、Ph-、PhCOCH₂-、(p)-MeO-PhCOCH₂-、(p)-F-PhCOCH₂-、(m)-HO-PhCOCH₂-、(p)-Ph-PhCOCH₂-中的任意一种，R进一步优选为(m)-HO-PhCOCH₂-。
本发明还提供一种含四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑的药物的组合物，该组合物包括，四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑、四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑盐、四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物或四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物盐，以及药学上可接受的辅料或载体，其中，四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物为上述中的任意衍生物。
1.四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑化合物及其衍生物的制备
1.1仪器及药品 
实验仪器包括：SHB-IIIA循环水式多用真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司)、DZF-6020型真空干燥箱(上海型新苗医疗器械制造有限公司)、EYELA SB-1100型旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)、2XZ-4型旋片式真空泵(临海市谭氏真空设备有限公司)、FA2104B分析天平(上海越平科技仪器有限公司)、GZX-9240MBE型数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、CL-4型平板磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)、ZF-6型三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)、XRC-1型微熔点测定仪(四川大学科仪厂)、DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)。
化学试剂包括：无水甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、丙酮(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、乙腈(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)、石油醚(沸程60-90℃，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)、乙酸乙酯(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、叔丁醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、5,5-二甲基-1,3-环己二酮(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、丙酮醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、盐酸羟胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、溴丙炔(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、ω-溴代苯乙酮(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、醋酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、氢化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、叠氮化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、无水硫酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、溴化铜(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、抗坏血酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、无水硫酸铜(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、薄层预制板(青岛高达化工有限公司)。
四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑药物的制备方法，包括如下步骤：
1)采用55,-二甲基-1,3环己二酮经加成后得到3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮 (中间体1)；
2)将中间体1和盐酸羟胺用无水乙醇溶解得到混合液，再向混合液中加入无水醋酸钠，搅拌、回流2-5h、冷却、倒至冰水中、真空干燥后得到(Z)-3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮肟(中间体3)；
3)将中间体3溶于乙腈后，加入氢化钠，在充分搅拌下，滴加炔丙基溴，室温搅拌1-3h，旋蒸、乙酸乙酯萃取、分液、干燥、分离得到中间体4；
4)将对羟基苯乙酮溶于乙酸乙酯中，然后向溶液中加入溴化铜，加热回流，冷却至室温后，过滤，乙酸乙酯萃取，分液，干燥，抽滤，分离得到α-溴代-4-羟基苯乙酮，将生成的α-溴代-4-羟基苯乙酮溶于丙酮中，并加入叠氮化钠，35-50℃搅拌1-3小时，冷却至室温，加水，乙酸乙酯萃取，分液，干燥，抽滤、分离得到α-叠氮基-4-羟基苯乙酮(叠氮中间体2)；
5)将中间体4与叠氮中间体2悬浮在水和叔丁醇的混合液中，依次加入抗坏血酸钠、五水硫酸铜，在70-90℃油浴中搅拌过夜直至反应完全(TLC监测)，冷却反应液，向反应混合物中加水稀释，得到白色沉淀物，过滤、真空干燥，得到四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑。
工艺流程如下：

制备步骤中，中间体3可用甲醇、乙醇、吡啶、甲苯等溶剂进行合成，以甲醇产率最高，成本最低，优选甲醇为溶剂；中间体4可用乙醚、四氢呋喃、甲苯、苯和乙腈进行合成，以乙腈反应速度最快，产率最高，优选乙腈为溶剂；目标产物可用叔丁醇-水、二氯甲烷-水或异丙醇-氯仿为溶剂，但叔丁醇-水体系的产率最高，时间最短，优选其为反应溶剂。
其中，步骤2)中，中间体1、盐酸羟胺、无水醋酸钠的摩尔比为8-12：10-15：10-15(优选为中间体1、盐酸羟胺、无水醋酸钠的摩尔比为5：6：6)。
步骤3)中，中间体3、氢化钠、炔丙基溴的摩尔比为8-12：8-12：10-15(优选为中间体3、氢化钠、炔丙基溴的摩尔比为5：5：6)。
步骤4)中，对羟基苯乙酮、溴化酮的摩尔比为8-12：18-25，α-溴代-4-羟基苯乙酮、叠氮化钠的摩尔比为3-6：5-10(优选为对羟基苯乙酮、溴化酮的摩尔比为1：2，α-溴代-4-羟基苯乙酮、叠氮化钠的摩尔比为5：6)。
步骤5)中，中间体4、叠氮中间体2、抗坏血酸、无水硫酸铜的摩尔比为5：5.05～5.5：0.8-1.5：0.05-0.2(优选为中间体4、中间体2、抗坏血酸、无水硫酸铜的摩尔比为5：5：1：0.1)。
步骤5)中，叠氮化合物还可以为2-叠氮芳基乙酮、叠氮芳烃、芳亚甲基基叠氮中的任意一种。
以叠氮钠和卤代烷的取代反应制备2-叠氮芳基乙酮、芳亚甲基基叠氮，以芳胺重氮化、叠氮取代反应制备叠氮芳烃。
2、四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑类化合物的结构分析
2.1仪器及试剂 
实验仪器：Ultrashied 400MHz Plus核磁共振仪(瑞士Bruker公司)、API 4000LC-MS/MS质谱仪(德国布鲁克道尔顿公司)、360FT-IR型红外光谱仪(美国Nicolet公司)。
实验试剂：氘代氯仿-d(氘原子含量99.8％，TMS含量0.03％V/V，10*0.5mL/盒，瑞士ARMAR公司)；色谱纯乙腈(含量99.99％，4L瓶装，德国MILAK公司)；蒸馏水(4.5L/桶，屈臣氏Watsons公司)；核磁管(5mm 100/pk 2ST500-8，美国Norell公司)；溴化钾(国药集团化学试剂有限公司)。
2.2测试过程
精确称取10mg目标化合物，在核磁管中用0.5mL氘代氯仿溶解，通过核磁共振仪测试其化学结构；在分析天平上取1.0mg样品，加溴化钾200mg在玛瑙研钵内研磨均匀，烘干后在压片模具内加压制备盐窗，在红外光谱仪上测试化合物的红外光谱图；将待测样品用色谱乙腈溶解，配制成1.0ppm的溶液，用微量注射器取样后，在电喷雾质谱仪上测试其质谱。
2.3化合物的结构分析
(Z)-3,6,6-Trimethy-6,7-dihydrobenzofuran-4(5H)-one O-(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl oxime(5a):Yellow solids,yield 88％,m.p:85-87 ℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.46(s,1H),7.36-7.33(m,3H),7.26-7.24(m,2H),7.02(brs,1H),5.52(s,2H),5.20(s,2H),2.47(s,2H),2.45(s,2H),2.04(d,J＝1.2Hz,3H),1.01(s,6H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ(ppm):156.7,152.9,145.7,138.6,134.6,129.0,128.7,128.0,122.9,118.2,114.2,67.1,54.0,37.1,36.7,32.8,28.6,10.3；IR(KBr)ν(cm^-1):2959,2921,1633,1461,1435,1219,1034,1008,978,870,727,715,696.MS(ESI)m/z:365.02[M+H]. 
(Z)-3,6,6-Trimethy-6,7-dihydrobenzofuran-4(5H)-one O-(1-phenyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl oxime(5b):Yellow oil,yield 83％；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):8.01(s,1H),7.74-7.71(m,2H),7.54-7.50(m,2H),7.45-7.41(m,1H),7.05(brs,1H),5.32(s,2H),2.52(s,2H),2.49(s,2H),2.17(d,J＝1.2Hz,3H),1.05(s,6H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ(ppm):156.8,153.1,146.0,138.7,137.1,129.7,128.7,121.1,120.6,118.2,114.2,67.1,37.1,36.8,32.8,28.7,10.5；IR(KBr)ν(cm^-1):2958,2871,1805,1758,1598,1502,1466,1034,978,759,690.MS(ESI)m/z:351.08[M+H]. 
(Z)-3,6,6-trimethy-6,7-dihydrobenzofuran-4(5H)-one O-[1-(2-oxo-2-phenyl-ethyl)-1H-1,2,3-triazol-4- yl]methyl oxime(5c):Yellow solids,yield 89％,m.p.112-114 ℃；¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ(ppm):8.01-7.98(m,2H),7.74(s,1H),7.67(t,J＝7.6 Hz,1H),7.53(t,J＝7.6 Hz,2H),7.03(brs,1H),5.84(s,2H),5.29(s,2H),2.50(s,2H),2.48(s,2H),2.15(d,J＝1.2 Hz,3H),1.04(s,6H)；¹³C NMR(100 MHz,CDCl₃)δ(ppm):190.2,156.7,153.0,145.7,138.6,134.6,134.0,129.1,128.1,124.7,118.3,114.3,67.2,55.3,37.2,36.8,32.8,28.7,10.4；IR(KBr)ν(cm^-1):2957,2928,2871,1703,1632,1597,1450,1227,1052,1000,756,689.MS(ESI)m/z:393.11[M+H]. 
(Z)-3,6,6-Trimethy-6,7-dihydrobenzofuran-4(5H)-one O-{1-[2-(4-hydroxyphenyl)-2-oxo-2-ethyl]-1H-1,2,3-triazol-4-yl}methyl oxime(5d):Yellow solids,yield 84％,m.p.75-77 ℃；¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.82(d,J＝8.8 Hz,2H),7.77(s,1H),7.02(brs,1H),6.93(d,J＝8.8 Hz,2H),5.73(s,2H),5.25(s,2H),5.19(brs,1H),2.50(s,2H),2.48(s,2H),2.11(d,J＝1.2 Hz,3H),1.01(s,6H)；¹³C NMR(100 MHz,CDCl₃)δ(ppm):188.4,163.6,156.8,153.2,145.3,138.6,130.9,125.5,125.2,118.3,116.3,114.2,66.7,55.1,37.1,36.8,32.8,28.6,10.4；IR(KBr)ν(cm^-1):3146,2958,2926,1687,1603,1582,1464,1235,1068,837.MS(ESI)m/z:409.06[M+H]. 
(Z)-3,6,6-Trimethy-6,7-dihydrobenzofuran-4(5H)-one O-{1-[2-(4-methoxyphenyl)-2-oxo-2-ethyl]-1H-1,2,3-triazol-4-yl}methyl oxime(5e):Yellow solids,yield 80％,m.p.129-131℃；¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.98-7.96(m,2H),7.74(s,1H),7.03(brs,1H),7.00-6.97(m,2H),5.79(s,2H),5.28(s,2H),3.89(s,3H),2.50(s,2H),2.48(s,2H),2.14(d,J＝1.2 Hz,3H),1.03(s,6H)；¹³C NMR(100 MHz,CDCl₃)δ(ppm):188.6,164.6,156.7,152.9,145.5,138.6,130.9,126.9,124.8,118.3,114.3,114.2,67.2,55.6,55.0,37.1,36.8,32.8,28.6,10.4；IR(KBr)ν(cm^-1):2956,1757,1693,1601,1575,1265,1239,1172,990,834.MS(ESI)m/z:423.09[M+H]. 
(Z)-3,6,6-Trimethy-6,7-dihydrobenzofuran-4(5H)-one O-{1-[2-(4-fluolophenyl)-2-oxo-2-ethyl]-1H-1,2,3-triazol-4-yl}methyl oxime(5f):Yellow solids,yield 81％,m.p.60-62 ℃；¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ(ppm):8.05-8.02(m,2H),7.74(s,1H),7.21(t,J＝8.4 Hz,2H),7.03(brs,1H),5.82(s,2H),5.29(s,2H),2.50(s,2H),2.48(s,2H),2.14(d,J＝1.2 Hz,3H),1.03(s,6H)；¹³C NMR(100 MHz,CDCl₃)δ(ppm):188.8,166.5(d,J＝256.2 Hz),156.7,152.9,145.8,138.6,130.97(d,J＝9.4 Hz),130.40(d,J＝2.8 Hz),124.7,118.3,116.46(d,J＝22.0 Hz),114.2,67.1,55.3,37.1,36.8,32.8,28.6,10.4；IR(KBr)ν(cm^-1):2957,2926,1703,1599,1509,1231,1159,1052,995,836.MS(ESI)m/z:411.06[M+H]. 
(Z)-3,6,6-Trimethy-6,7-dihydrobenzofuran-4(5H)-one O-{1-[2-(3-hydroxyphenyl)-2-oxo-2-ethyl]-1H-1,2,3-triazol-4-yl}methyl oxime(5g):Yellow solid,yield 92％,m.p.86-88 ℃；¹H NMR(400 MHz,CDCl₃)δ(ppm):8.02(s,1H),7.99(s,1H),7.50(d,J＝8.0 Hz,1H),7.37(t,J＝8.0 Hz,1H),7.20-7.17(m,1H),7.02(brs,1H),6.01(s,2H),5.30(s,2H),5.05(brs,1H),2.50(s,2H),2.47(s,2H),2.14(d,J＝1.2 Hz,3H),1.03(s,6H)； ¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ(ppm):190.3,157.7,156.9,153.3,145.5,138.6,134.7,130.4,125.7,122.3,119.1,118.3,115.8,114.2,66.6,55.7,37.1,36.8,32.8,28.6,10.4；IR(KBr)ν(cm^-1):3146,2958,1702,1585,1450,1281,1055,865.MS(ESI)m/z:409.02[M+H]. 
(Z)-3,6,6-Trimethy-6,7-dihydrobenzofuran-4(5H)-one O-[1-(2-biphenyl-4-yl-2-oxo-2-ethyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl]methyloxime(5h):Yellow solid,yield 82％,m.p.66-68 ℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):8.07(d,J＝8.4Hz,2H),7.77-7.74(m,3H),7.66-7.63(m,2H),7.51-7.49(m,2H),7.47-7.43(m,1H),7.04(brs,1H),5.88(s,2H),5.30(s,2H),2.50(s,2H),2.48(s,2H),2.15(d,J＝1.2Hz,3H),1.04(s,6H)； ¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ(ppm):189.8,156.7,152.9,147.3,145.7,139.3,138.6,132.6,129.1,128.7,128.6,127.7,127.3,124.8,118.3,114.3,67.2,55.4,37.1,36.8,32.8,28.7,27.8,10.4；IR(KBr)ν(cm^-1):2955,2869,1758,1697,1602,1404,1231,1059,996,764.MS(ESI)m/z:469.23[M+H]. 
核磁共振谱结果分析：中间体肟(中间体3)和肟醚(中间体4)的立体结构通过1D和2D NMR谱进行了表征，中间体3中的NOE光谱中可观察到羟基的质子(δ：8.93ppm)和3-甲基质子(δ：2.15ppm)的相关峰，由此确定中间体肟为(Z)-构型。在肟醚中间体4的¹HNMR谱中，炔丙基的末端炔质子和亚甲基质子之间存在长程偶合(⁴J＝2.4Hz)；同时在其¹³C核磁共振谱中也可观察到炔丙基的碳信号分别为80.2，73.8和61.3ppm。目标化合物5的¹H NMR谱中，三唑的质子在7.46～8.01ppm范围内出现单峰；呋喃环上的在7.02～7.05ppm之间表现出宽单峰，该质子与C(3)-甲基质子存在远程偶合；N-CH₂和O-CH₂的亚甲基的质子分别在5.52～6.01ppm和5.20～5.32ppm之间表现出两个单峰。¹³C NMR谱中在114.2～190.3ppm范围内的共振吸收峰均与化合物中不饱和碳的数目一致，表明四氢苯并呋喃环已和三唑基成功连接。在目标化合物的红外光谱中可观察到C＝N强伸缩振动吸收峰在1601～1646cm_-¹，目标化合物的分子量均与ESI-MS中的离子加合峰相对应。如图1为中间体3的NOESY光谱图。
3.本发明将所述的四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑及其组合物、四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物及其组合物、或其盐应用于制备治疗抗胃癌药物上。
3.1试剂及仪器 
实验试剂：RPMI1640培养液(将10.4g干粉型无酚红RPMI640溶入1000mL三蒸水中，加入2.0g碳酸氢钠搅拌至充分溶解，然后用0.22μm无菌正压过滤器过滤，分装，再加入10％小牛血清、0.5％青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)。
实验仪器：超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、超声波清洗仪(凌波新芝生物科技股份有限公司)、TDZ4-WS型低速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)、DK-8A型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)、自动双蒸水蒸馏器(上海亚荣生化设备仪器有限公司)、HTC-100A型恒温恒湿培养箱(上海三腾仪器有限公司)、LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、二氧化碳培养箱(日本三洋公司)、Stat Fax-2100型酶联免疫检测仪(美国Awareness公司)。
3.2实验部分
利用MTT方法评价四氢苯并呋喃类化合物对胃癌细胞HGC-27的增殖抑制作用：胃癌细胞HGC-27由中科院上海细胞库提供，采用含100U/ml青链霉素和10％新生胎牛血清的RPMI1640作为细胞培养液，细胞置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱培养。细胞传代时，调整细胞密度为5×10⁴～1×10⁵细胞/孔接种到96孔板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。24h后加入不同浓度的药物，另设空白对照组(培养液)、正常对照组(细胞+培养液)和阳性对照组(以抗肿瘤药物紫杉醇为阳性对照)，处理48h。实验终止后加MTT(5mg/mL)20μL/孔37℃继续孵育4h，吸出上清液，每孔加入150μL的DMSO，摇匀，测定492nm波长时吸光度(OD)。MTT被活细胞摄取后经线粒体代谢生成甲瓒，线粒体活力越旺盛甲瓒生成越多，吸光度也越高，反映细胞存活情况。计算细胞抑制率，以细胞抑制率(细胞的抑制率T/C＝1-加药细胞OD/对照细胞OD)判断药物是否对细胞的增殖有抑制作用。半数抑制浓度(IC₅₀)，常作为反映药物效果的定量指标，在各种药物筛选中广泛应用，因此利用统计软件SPSS 13.0分别计算并比较药物作用于不同细胞的IC₅₀，反映药物作用效果。
3.3活性评价分析 
以商品化抗癌药物紫杉醇为阳性对照，通过MTT法评价了三唑基呋喃并环己酮肟类化合物对HGC-27的细胞毒活性(见下表)。结果表明，大部分化合物具有中等的细胞毒活性，其中5c、5g、5h对HGC-27的抗增殖IC₅₀值达到20μM以下，推测含羟基时有利于提高该类化合物的细胞毒活性。以上的研究结果为苯并呋喃类化合物的抗胃癌药物用途提供了参考。

4、本发明还将所述的四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑及其组合物、四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑衍生物及其组合物、或其盐应用于制备治疗抗溃疡药物上。
质子泵抑制剂是一类新型的抑制胃酸分泌的药物，特异性和非竞争性的作用于H⁺/K⁺-ATP酶，能抑制基础胃酸的分泌及组胺、进食等多种刺激引起的酸分泌。H⁺/K⁺-ATP酶位于壁细胞的管状囊泡和分泌管膜上，通过自身的磷酸化(E1→E2)与去磷酸化(E2→E1)完成的H⁺/K⁺电中性跨膜离子转运，不断将壁 细胞内的质子运输到膜外行使泌酸的功能，因此抑制H⁺/K⁺-ATP酶，可发挥强大的抑制胃液分泌作用。化疗耐药是目前肿瘤治疗的主要难题之一，近来研究已证实，细胞内pH增高是大多数肿瘤耐药细胞株的共同特征，质子泵抑制剂可通过抑制肿瘤细胞空泡ATP酶活性，改善细胞内碱外酸的微环境而阻断肿瘤微环境的酸化，提高肿瘤对化学治疗药物的敏感性，还可通过增加溶酶体的通透性、将溶酶体碱化等机制，诱导胃癌细胞发生自噬或凋亡。鉴于此，本专利采用氢钾-ATP酶试剂盒评价化合物对氢钾-ATP的抑制活性，开发其抑酸的药效。
体外H⁺/K⁺-ATP酶抑制活性测试原理
4.1体外H⁺/K⁺-ATP酶抑制活性实验方案
取胃溃疡的小鼠胃粘膜，加生理盐水制成胃粘膜匀浆，经差速离心后得到含H⁺，K⁺-ATP酶微粒体的上清液。转入细胞培养板，加入待测药物并孵育一定时间后，用市售的H⁺/K⁺-ATP酶活性测定试剂盒测定酶活性。
4.2胃溃疡模型的建立
取体18～22g昆明种小鼠，在清醒状态下处死，于75％酒精中灭菌3～5min，无菌条件下剖检。取小鼠胃，用冷的PBS缓冲液清洗，洗去食物碎屑和血迹后，用平口镊子将胃内侧黏膜层刮下，放入无菌的离心管中，剪碎，用移液枪将0.5％胰酶注入离心管中(每胃约5ml)，37℃水浴消化8～10min，并在消化过程中适当振动离心管。消化完成后，迅速加入冷的PBS溶液，降低胰酶的消化能力，同时用移液枪吹打，使细胞脱落，过200目筛，重复收集2次，1200r/min离心7min，离心管底部沉淀即为胃壁细胞。弃除上层液体，细胞沉淀用DMEM培养基悬浮，即为胃壁细胞悬液。
4.3胃壁细胞鉴定 
胃壁细胞：①形态：壁细胞形态较大，核多居中央，线粒体丰富。HE染色，光镜下可见核染成蓝色，胞质粉红色。②活率:1.0g/L Trypan blue染色，死细胞染成蓝色，活细胞不着色。③细胞计数：将细胞悬液小心地滴入血细胞计数盘内，按红细胞计数方法，数四大方格内细胞数之和为N，则每升细胞数为：cells/L＝N×4×10⁴。
4.4胃壁细胞的培养及H⁺/K⁺-ATP酶活性测定
纯化后的壁细胞悬液转入96孔细胞培养板，加入待药物37℃孵育2h后，用H⁺，K⁺-ATP酶活性测定试剂盒测定酶活性，操作按说明书进行，规定每小时每毫克蛋白的ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为1个H⁺/K⁺-ATP酶活性单位，以mmol·mg^-1·h^-1表示。阳性对照药物：市售的质子泵抑制剂奥美拉唑、瑞伐拉赞。
4.5活性化合物的酶抑制活性结果


结论：具有较强抗胃癌活性的化合物5c、5g和5h(IC₅₀<20μM)均具有较强的H⁺/K⁺-ATP酶抑制活性，强于市售的不可逆型质子泵抑制剂奥美拉唑(IC₅₀80.03μM)，略优于市售的可逆型质子泵抑制剂瑞伐拉赞(IC₅₀38.77μM)。结构-活性关系研究表明，在三唑基团上引入联苯基或3-羟基苯基，有望提高化合物的抑酸作用。
附图说明
图1为中间体3的NOESY光谱图。
具体实施方式
实施例1
首先制备了3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮(中间体1)和叠氮(中间体2)，再通过缩合反应将中间体1转化为顺式酮肟(中间体3)，经分离提纯后将其烷基化得到炔丙基肟醚(中间体4)，最后将中间体4和叠氮中间体2经铜催化的环加成反应合成1,2,3-三氮唑基取代的呋喃并环己酮肟类衍生物，合成路线如下：

叠氮的合成(中间体2)：将对羟基苯乙酮(1.36g，10.0mmol)溶于乙酸乙酯(20ml)中，然后向溶液中加入溴化铜(4.48g，20.0mmol)，加热回流5小时。冷却至室温后，过滤，向滤液中倒入100mL水，用乙酸乙酯萃取(3×100mL)，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压下除去溶剂后得到的残余物用柱色谱法分离(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1:25，v/v)，得到α-溴代-4-羟基苯乙酮。
将生成的α-溴代-4-羟基苯乙酮(1.075g，5.0mmol)溶于丙酮(20ml)中，然后向溶液中加入叠氮化钠(0.39g，6.0mmol)，40℃搅拌2小时。冷却至室温后，向溶液中倒入50mL水，用乙酸乙酯萃取(3×50mL)，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压下除去溶剂后得到的残余物用柱色谱法分离(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1:15，v/v)，得到α-叠氮基-4-羟基苯乙酮。
肟(中间体3)的合成：(Z)-3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮肟(中间体3)的合成：将3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮(中间体1，1.78g，10.0mmol)和盐酸羟胺(0.834g，12.0mmol)用30mL无水甲醇溶解，然后向溶液中加入无水醋酸钠(0.984g，12.0mmol)。搅拌、加热回流4h，待反应液冷却，将其倒至150ml冰水中，过滤得到白色固体，真空干燥过夜即得化合物3。
肟醚(中间体4)的合成：(Z)-3,6,6-三甲基-6,7-二氢苯并呋喃-4(5H)-酮肟基炔丙醚的合成(中间体4)的合成：将中间体3(1.92g，10.0mmol)溶于乙腈(25ml)中，然后向溶液中缓慢加入氢化钠(0.24g，10.0mmol)，充分搅拌下滴加炔丙基溴(1.428g，12.0mmol)，室温搅拌2小时。旋蒸除去溶剂后，向其中倒入50mL水，用乙酸乙酯萃取(3×50mL)，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，抽滤，减压下除去溶剂后得到的残余物用柱色谱法分离(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1:20，v/v)，得到中间体4。
目标化合物5的合成：将炔丙基醚(中间体4，0.5mmol)与α-叠氮基-4-羟基苯乙酮(叠氮中间体2，0.5mmol)悬浮在水(3mL)和叔丁醇(3mL)的混合液中，再加入抗坏血酸钠(19.8mg,0.1mmol)，然后加入五水硫酸铜(2.5mg,0.01mL)，在80℃油浴中搅拌过夜直至反应完全(TLC监测)。冷却反应液，向反应混合物中加水(20mL)稀释，得到白色沉淀物。过滤并真空干燥，得到四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑。
实施例2
其它步骤同实施例1，目标化合物5a～5h的合成步骤中，将炔丙基醚(中间体4，0.5mmol)与 2-叠氮芳基乙酮在叔丁醇-水混合体系中反应，反应控制及分离纯化方式同实施例1，只需更换不同类型的叠氮中间体2即可。叠氮化合物为2-叠氮芳基乙酮、叠氮芳烃、芳亚甲基基叠氮
实施例3
四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑盐的制备方法，以盐酸盐为例。在50mL三颈瓶中称取1.0mmol目标产物5a～5h其中的一种，溶解于5mL无水甲醇中，在氮气保护下将反应瓶冷却至0℃，用恒压滴液漏斗滴加1mol/L的氯化氢/甲醇溶液，搅拌至产物完全成盐(薄层色谱监测中性分子的盐化进程)，蒸干溶剂，及得到四氢苯并呋喃-4-酮肟基三唑盐酸盐。
氢溴酸盐、硫酸盐、草酸盐等的制备方法同上。