二缩5羟甲基糠醛及其合成方法及其医药用途.pdf

本发明涉及二缩(5-羟甲基糠醛)及其合成方法及其医药用途。属于新化合物及其合成方法及其药物用途。通过将5-HMF溶解在二甲基亚砜中，用酸调节pH为3.0-4.0，在搅拌条件下提高反应温度至115℃～125℃加热回流3小时，140℃加热回流2小时，冷却后，用0.1M碱液调节pH为7.0，过滤，滤液浓缩至干，得粗二缩(5-羟甲基糠醛)，产率达70％以上。二缩(5-羟甲基糠醛)在制备免疫增强药物中有着广泛的药物用途。

1、  一种如下式的二缩(5-羟甲基糠醛)：

其化学名称为：二缩(5-羟甲基糠醛)[Dimer(5-methylol-furfural)]。

2、  一种二缩(5-羟甲基糠醛)的合成方法：其特征在于：
通过将5-HMF溶解在二甲基亚砜中，用酸调节pH为3.0-4.0，在搅拌条件下提高反应温度至115℃～125℃加热回流3小时，140℃加热回流2小时，冷却后，用0.1M碱液调节pH为7.0，过滤，滤液浓缩至干，得粗二缩(5-羟甲基糠醛)。

3、  根据权利要求2所述的二缩(5-羟甲基糠醛)的合成方法，其特征在于：还包括二缩(5-羟甲基糠醛)的纯化：取粗二缩(5-羟甲基糠醛)进行硅胶柱层析，再用丙酮反复重结晶，得纯二缩(5-羟甲基糠醛)。

4、  根据权利要求2所述的二缩(5-羟甲基糠醛)的合成方法，其特征在于：调节酸性使用的酸为浓硫酸或对甲苯磺酸。

5、  根据权利要求2所述的二缩(5-羟甲基糠醛)的合成方法，其特征在于：碱液采用NaOH、Na₂CO₃或KOH碱溶液。

6、  如权利要求1所述的二缩(5-羟甲基糠醛)在制备免疫增强药物中的应用。

二缩(5-羟甲基糠醛)及其合成方法及其医药用途
技术领域
本发明涉及二缩(5-羟甲基糠醛)及其合成方法及其在制备免疫增强药物中的应用。
背景技术
5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl-2-furfural，简称5-HMF)是糖的热解产物，广泛存在于各类含糖药品和食品的生产和贮存过程中，据文献报道5-HMF是一个氧化左旋多巴的非竞争抑制剂，并且引入不同取代基团的其药效也相应改变；5-HMF能抑制甘草次酸氧化为3-脱氢甘草次酸，增加甘草酸在体内的吸收，从而促进甘草酸和甘草次酸的抑制肿瘤、抗炎、降低血中胆固醇的作用；5-HMF对于黑腹果蝇幼虫有杀虫作用；5-HMF能直接导致结肠小囊异常生长，并呈剂量依赖性；5-HMF口服给药可改善脑缺血再灌注引起的学习记忆障碍，其机制可能与恢复脑组织清除自由基的酶活力抗自由基损伤有关。此外5-HMF还具有抗心肌缺血作用、抗氧化作用、Ca²⁺拮抗活性、改善血液流变性作用等药理活性。
有文献报道5-HMF具有一定的基因毒性，对人体横纹肌和内脏有毒副作用，但也有大量文献报道5-HMF并不具有某些毒副作用，5-HMF虽能使正常细胞内谷胱甘肽活性受到一定影响，但远远不会给人体造成严重的损害。
现有5-HMF医药用途相关专利5项：
序号    申请号               专利名称

目前未见到有关二缩(5-羟甲基糠醛)化合物及其合成方法及其药物用途的报道，该化合物属于新化合物，属于首次合成；该化合物的新的药物用途属首次发现。
发明内容
本发明提供一种二缩(5-羟甲基糠醛)及其合成方法及其医药用途。
一种如下式的二缩(5-羟甲基糠醛)：

其化学名称为：二缩(5-羟甲基糠醛)[Dimer(5-methylol-furfural)]。白色针晶(丙酮)，mp.180～182℃，溶于丙酮、甲醇。因该化合物为新化合物，是以5-HMF为原料经过合成方法得到，其结构特征两分子5-HMF经聚合反应生成的含两个呋喃环的二缩(5-羟甲基糠醛)。
本发明的目的还在于利用5-HMF为前体，经过羰基亲核加成等有机合成方法，制备一种具有较强生物活性的新物质。
为实现上述发明目的，本发明采取的合成方法是：
通过将5-HMF溶解在二甲基亚砜中，用酸调节pH为3.0-4.0，在搅拌条件下提高反应温度至115℃～125℃加热回流3小时，140℃加热回流2小时，冷却后，用0.1M碱液调节pH为7.0，过滤，滤液浓缩至干，得粗二缩(5-羟甲基糠醛)。反应式如下：

本发明调节酸性使用的酸为浓硫酸或对甲苯磺酸。
本发明碱液采用NaOH、Na₂CO₃或KOH碱溶液。
二缩(5-羟甲基糠醛)的纯化
取粗二缩(5-羟甲基糠醛)进行硅胶柱层析，经丙酮反复重结晶，得纯二缩(5-羟甲基糠醛)，产率72～77％。
反应条件的选择：使用的有机溶剂既要对5-HMF溶解度好又要沸点高，故选择二甲基亚砜为反应的溶剂，调节酸性使用的酸可以为浓硫酸或对甲苯磺酸；碱液优选采用0.1M NaOH水溶液。
本发明二缩(5-羟甲基糠醛)在制备免疫增强药物中的应用。
当本发明用于制备免疫增强的药物时，口服或胃肠外给药均是安全的，在口服情况下，其可以任何常规形式给药，如颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服乳剂等：当该药物肠胃外给药时，可采取任何常规形式，例如注射剂：如静脉内注射、软膏剂、经皮给药、吸入剂等。
本发明制备免疫增强的药物是由有效成分单体或有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个具体例子，散剂是内服的粉末剂，它的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氧化镁、硬脂酸镁，碳酸氢钠、干燥酵母等；溶液剂的赋形剂有水、甘油、1，2-丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂腊、木腊、液体石腊、树脂、高级腊等组合成的疏水剂或亲水剂。
本发明的有益效果在于，新化合物二缩(5-羟甲基糠醛)可用于制备免疫增强的药物，具有疗效显著的特点。
有效物质的剂量可以根据服用方式，病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类似的因素而改变，口服量为：5.0～10.0mg/kg，每日二次服用：注射5.0～7.5mg/kg，每日一次。
本发明可通过以下免疫增强试验例进一步说明。
1、材料与方法
1.1 主要仪器
751-GW型分光光度计(上海分析仪器厂)；Nikon生物学显微镜(南京江南光电集团新兴光学仪器有限公司)；电子天平(上海民侨精密仪器有限公司)；800型离心沉淀机(上海手术器械厂)；细胞计数板。
1.2 实验动物
昆明种小白鼠，体重20±2g，购自吉林大学实验动物饲养中心，动物质量合格证编号：0012254，共48只，雌雄各半。均饲喂颗粒饲料，按实验动物饲养方法饲养，预试2d后，进入正试期。
1.3 实验药物
二缩(5-羟甲基糠醛)：再生医学科学研究所新药研究室提供，批号：081012；松杉灵芝口服液：由长白山制药股份有限公司生产，批号：080301；
环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：08052021。
1.4 主要试剂
(1)ACP试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)
(2)1％淀粉溶液由本实验室配制。
(3)PBS缓冲液由本实验室配制。
1.5 试验步骤
A：实验动物分组及处理
将小鼠随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、阳性药组、实验药高、中、低剂量组。每组8只(雌雄各半)，分笼饲养，实验周期为17天。空白对照组每天正常进食，实验开始后分别在第3d、6d、9d、12d、15d腹腔注射生理盐水0.2ml.，其余各组都在同一时间腹腔注射0.2ml环磷酰胺(50mg/kg)造成小鼠免疫抑制。模型组每天灌胃0.2ml生理盐水，阳性药组每天灌胃0.2ml松杉灵芝口服液(0.05ml/20g)，实验药组分别按照12.5mg/kg，25mg/kg，50mg/kg三个剂量灌胃二缩(5-羟甲基糠醛)。连续灌胃15天。每隔三天称一次体重，根据实时体重调整注射量及灌胃量。
B：样本采集
第15d，小鼠腹腔注射1％支链淀粉溶液1mL/只。第17d，称其体重后脱臼法处死小鼠，腹腔注射PBS液5mL/只，轻揉2min。75％酒精浸泡消毒10s，无菌打开腹腔，收集腹腔巨噬细胞。1000rpm离心10min后进行细胞记数，取4 x 10⁶个细胞，重悬于100μL无菌双蒸水中，-30℃～30℃反复冻融6次，制成破碎细胞悬液，用于ACP活性的检测，结果以U表示。取巨噬细胞后，立即剖取小鼠的脾脏与胸腺，称其湿重(mg)。并做好记录。
C：指标测定
按试剂盒说明操作进行，反应完成后，取100μL的测定样、酚标准液(0.1mg/mL)、双蒸水(空白样)，分别加入0.5mL的缓冲液与0.5mL的基质液，充分混匀，37℃水浴30min。加入1.0mL的碱液与1.5mL的显色剂，立即混匀，静置10min。492nm，1cm光径，空白样调零，比色测定各管吸光度。用751—GW型分光光度计(520nm)比色测定各管吸光度。100ml细胞悬液(4 x 10⁹个细胞)在37℃与基质作用30min产生1mg酚为1个单位。
计算公式：


脾脏系数(mg/Kg)＝脾脏重量(mg)÷体重(g)；
胸腺系数(mg/Kg)＝胸腺重量(mg)÷体重(g)
2、结果与分析
2.1 二缩(5-羟甲基糠醛)对免疫抑制小鼠胸腺和脾脏的作用
处死小鼠之前，称其体重，在取出巨噬细胞后立即将其解剖，摘取胸腺和脾脏，用生理盐水洗净后称其重量，分别计算出每组小鼠的胸腺系数和脾脏系数，求出平均值和标准差，试验结果见表1。
表1 二缩(5-羟甲基糠醛)对免疫抑制小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

与模型组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001
由上表可见，模型组动物的胸腺指数和脾脏指数均明显低于空白对照组(P<0.01)，说明环磷酰胺对小鼠的免疫器官的发育造成了破坏作用，动物模型比较成功。二缩(5-羟甲基糠醛)低剂量无明显改善，二缩(5-羟甲基糠醛)中、高剂量组对受抑制的脾脏的发育都有明显的改善作用，尤以二缩(5-羟甲基糠醛)高剂量组最明显(P<0.01)；而对于受破坏的胸腺来说，三个剂量组均有明显改善作用，高剂量组效果极明显(P<0.001)。
2.2 二缩(5-羟甲基糠醛)对免疫抑制小鼠ACP活力的作用
取得相同数量小鼠的腹腔巨噬细胞，应用试剂盒测得巨噬细胞酸性磷酸酶活力(用U/100ml)表示，每组动物取平均值和标准差，试验结果见表2。
表2 二缩(5-羟甲基糠醛)对免疫抑制小鼠ACP酶活力的影响

与模型组比较，^*P<0.05；^**P<0.01；^***P<0.001
由上表可见，小鼠腹腔注射环磷酰胺后，巨噬细胞ACP酶活力极其显著低于空白对照组(P<0.001)，二缩(5-羟甲基糠醛)三个剂量组巨噬细胞ACP酶活力均增强，其中中剂量组调节作用较强(P<0.01)。
3、讨论
本实验的研究中，小鼠间隔2天连续5次腹腔注射50mg/kg的环磷酰胺后，小鼠的外观形态、活动能力、皮毛状况还有体重方面都明显低于空白组小鼠。实验后发现，模型组小鼠的巨噬细胞酸性磷酸酶(ACP)活力、胸腺指数和脾脏指数也都明显低于空白对照组，表明造模是成功的。给予免疫低下小鼠灌服不同剂量的二缩(5-羟甲基糠醛)，三个剂量组都能不同程度地改善ACP酶活力和受损伤的免疫器官，但量效关系不够明显。二缩(5-羟甲基糠醛)虽然能够在一定程度上改善免疫低下小鼠的免疫水平，但是还是远未能达到不造模的空白组水平，三个剂量组中高剂量组的活性最强，提示如果提高二缩(5-羟甲基糠醛)的给药剂量，活性是否会更强有待进一步研究。总之，以上试验结果表明二缩(5-羟甲基糠醛)具有提高化疗引起的免疫损伤小鼠的胸腺指数、脾脏指数及ACP酶活力的作用。
附图说明
图1本发明二缩(5-羟甲基糠醛)氢谱图；
图2本发明二缩(5-羟甲基糠醛)碳谱图；
图3本发明二缩(5-羟甲基糠醛)HMBC谱图；
图4本发明二缩(5-羟甲基糠醛)HMBC谱的主要相关信号图。
具体实施方式
实施例1：
a、合成方法，通过将5-HMF溶解在二甲基亚砜中，用对甲苯磺酸调节为pH为3.0，在搅拌条件下提高反应温度至115℃加热回流3小时，140℃加热回流2小时，冷却后，用0.1M NaOH碱液调节pH为7.0，过滤，滤液浓缩至干，得粗二缩(5-羟甲基糠醛)。
b、二缩(5-羟甲基糠醛)的纯化
取粗二缩(5-羟甲基糠醛)进行硅胶柱层析，经丙酮重结晶2次，得纯二缩(5-羟甲基糠醛)，产率72％。
二缩(5-羟甲基糠醛)的结构鉴定：
白色针晶(丙酮)，溶于丙酮、甲醇。
¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)谱中，低场给出δ6.29(1H，m)、6.28(1H，m)2个芳氢信号，δ5.29(2H，m)为连氧碳上的叔氢信号，δ4.42-4.35(2H，m)为连氧碳上亚甲基质子信号。氢谱见附图1。
DEPTQSP(125.8MHz，CDCl₃)谱，给出6组碳信号，其中δ152.8、152.7为季碳信号，δ111.3、110.3、99.2为叔碳信号，δ64.3为连氧仲碳信号。结合¹H-NMR谱数据，初步确定该化合物具有对称结构。碳谱见附图2。
将该化合物的¹³C-NMR谱数据与文献报道的5-羟甲基糠醛(相婷，吴立军，林瑞红，等.西南忍冬化学成分的结构鉴定II[J].中国药物化学杂志，1999，9(1)：48-49.)比较，结果见表3。
表3 二缩(5-羟甲基糠醛)与5-羟甲基糠醛的13C-NMR谱数据比较

从表中发现，5-羟甲基糠醛C-2、C-4和C＝O化学位移发生了明显变化，说明5-羟甲基糠醛C-2和C＝O位连有其它基团，但是在DEPTQSP并没有发现其它碳信号的存在，因此推断可能产生了自身聚合物。
在HMBC谱中，可见δ6.29与δ152.8、152.7、111.3存在相关信号，δ6.28与δ152.8、152.7、110.3、64.3存在相关信号，δ5.29与δ152.8、110.3、64.3存在相关信号，δ4.42、4.35与δ152.7、111.3、99.2存在相关信号，HMBC谱见附图3，HMBC谱的主要相关信号见图4。
综合波谱解析，确定该化合物为二缩(5-羟甲基糠醛)。化学结构式如下。经Science Finder检索未发现有关该化合物的文献报道，为一新化合物。
实施例2
a、半合成方法，通过将5-HMF溶解在二甲基亚砜中，用对甲苯磺酸调节pH为3.5，在搅拌条件下提高反应温度至125℃加热回流3小时，140℃加热回流2小时，冷却后，用0.1M NaOH碱液调节pH为7.0，过滤，滤液浓缩至干，得粗二缩(5-羟甲基糠醛)。
b、二缩(5-羟甲基糠醛)的纯化
取粗二缩(5-羟甲基糠醛)进行硅胶柱层析，丙酮重结晶，得纯二缩(5-羟甲基糠醛)，产率77％。
实施例3
a、半合成方法，通过将5-HMF溶解在二甲基亚砜中，滴加浓硫酸调节pH为4.0，在搅拌条件下提高反应温度至120℃加热回流3小时，140℃加热回流2小时，冷却后，用0.1M NaOH碱液调节pH为7.0，过滤，滤液浓缩至干，得粗二缩(5-羟甲基糠醛)。
b、二缩(5-羟甲基糠醛)的纯化
取粗二缩(5-羟甲基糠醛)进行硅胶柱层析，经丙酮重结晶，得纯二缩(5-羟甲基糠醛)，产率75％。
实施例4
a、半合成方法，通过将5-HMF溶解在二甲基亚砜中，滴加浓硫酸调节pH为4.0，在搅拌条件下提高反应温度至120℃加热回流3小时，140℃加热回流2小时，冷却后，用0.1M KOH碱液调节pH为7.0，过滤，滤液浓缩至干，得粗二缩(5-羟甲基糠醛)。
b、二缩(5-羟甲基糠醛)的纯化
取粗二缩(5-羟甲基糠醛)进行硅胶柱层析，经丙酮重结晶，得纯二缩(5-羟甲基糠醛)，产率75％。
实施例5
a、半合成方法，通过将5-HMF溶解在二甲基亚砜中，滴加浓硫酸调节pH为4.0，在搅拌条件下提高反应温度至120℃加热回流3小时，140℃加热回流2小时，冷却后，用0.1MNa₂CO₃碱液调节pH为7.0，过滤，滤液浓缩至干，得粗二缩(5-羟甲基糠醛)。
b、二缩(5-羟甲基糠醛)的纯化
取粗二缩(5-羟甲基糠醛)进行硅胶柱层析，经丙酮重结晶，得纯二缩(5-羟甲基糠醛)，产率75％。
制备药剂的实施例1
二缩(5-羟甲基糠醛)5g，加入1，2-丙二醇1000ml，混合后装入1000支安瓶中，每支1ml，含二缩(5-羟甲基糠醛)5mg。
制备药剂的实施例2
二缩(5-羟甲基糠醛)10.0g，药用淀粉240g，二者充分混合，装胶囊，制成1000粒胶囊，每粒重0.25g，含二缩(5-羟甲基糠醛)10mg。