与脂肪酸合成相关的蛋白 GmLEC1A 及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域中与脂肪酸合成相关的蛋白 GmLEC1A 及其编码基因与应用。 背景技术
植物油作为主要的食用油和一种重要的可再生能源物质而受到广泛关注。目前， 世界上食用油的 85％来自于植物油， 只有 25％来自于动物和海洋生物。同时， 植物油也被 广泛应用于工业领域， 如洗涤剂， 润滑油， 油漆和生物可降解塑料等。另外， 值得一提的是， 植物柴油的开发可能为解决全球能源危机和环境污染提供了一条新的途径。 随着人们对植 物油的需求量越来越大， 现有的产量将远远不能满足社会的需求。
大豆作为主要的经济作物之一， 是食用植物油的重要来源。大豆油的饱和脂肪酸 与不饱和脂肪酸的比例相对其它的植物油 ( 如菜籽油、 花生油等 ) 较为合理， 其消费量和食 用量也已经逐步超过了其它植物油， 成为人们日常饮食重要的营养来源之一。我国是大豆 的故乡， 世界上其他国家种植的大豆， 大都是直接或间接从我国传入的。20 世纪 50 年代以 前， 中国是世界大豆的重大生产国。然而从 1953 年， 这个地位被美国取而代之， 随着大豆在 美洲的扎根、 受扶植以及转基因技术盛行， 到 1996 年， 中国由大豆净出口国变成了净进口 国。至 2006 年， 大豆进口量已接近中国粮食进口总量的 90％， 而且大多来自美洲。因此提 高大豆油的产量和含油量是我国目前迫切需要解决的问题。
随着生物技术的发展， 转基因工程为我们提供了一个有效的途径。首先通过遗传 学的方法鉴定与油脂合成有关的调控基因， 然后利用基因工程的方法来改善这些调控基 因， 从而提高大豆种子的含油量。近十余年来， 科学家们利用生物技术对脂肪酸生物合成 过程中的关键基因进行遗传改良， 但都没能取得显著的效果， 其中一个主要的原因是植物 体内的脂肪酸合成是一个复杂和高度协调的过程， 是多基因协同完成的， 因此改良单个的 脂肪酸合成的基因， 并不能有效的改善脂肪酸的含量。最近的研究发现， 在脂肪酸的代谢 过程中， 很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因子 ( 例如转录因子 ) 在起全面的调控作用 (Girke， T.， Todd， J.， Ruuska， S.， White， J.， Benning， C.， andOhlrogge， J..Microarray analysis of developing Arabidopsis seeds.Plant Physiol.2000， 124， 1570-1581.)。 那 么通过对这些调控因子的遗传改良达到增加脂肪酸含量的目的将成为可能。
目前， 通过对拟南芥的研究发现， 参与植物脂肪酸代谢的最重要的转录因子是 LEC1(Leafy Cotyledon 1)。LEC1 是拟南芥胚胎发生和种子成熟过程中一个关键的调控因 子， 同时也对胚胎形成过程中胚胎储存物的积累进行调控 (Lotan， T.， Ohto， M.， Yee， K.M.， West， M.A.， Lo， R.， Kwong， R.W.， Yamagishi， K.， Fischer， R.L.， Goldberg， R.B.， andHarada， J.J.Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryodevelopment in vegetative cells.Cell.1998， 93， 1195-1205.)。过量表达 LEC1 可以诱导数目众多的与 脂肪酸合成相关基因的表达， 包括编码脂肪酸从头合成关键限速酶乙酰辅酶 A 羧化酶中三 个核基因组编码亚基的基因， 与此相吻合， 在 LEC1 过量表达植株中主要脂肪酸组分的含量大幅度上升 (Mu， J.， Tan， H.， Zheng， Q.， Fu， F.， Liang， Y.， Zhang， J.， Yang， X.， Wang， T.， Chong， K.， Wang， X.J.， et al..LEAFY COTYLEDON1 is a keyregulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis.Plant Physiol.2008， 148， 1042-1054.)。 发明内容
本发明的一个目的是提供与脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与脂肪酸合成相关的蛋白， 名称为 GmLEC1A， 来源于大豆 (Glycine max L.)， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ：
1) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ；
2) 将序列表中序列 1 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加且与脂肪酸合成相关的由 1) 衍生的蛋白质。
为了使 1) 中的 GmLEC1A 蛋白便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列 组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上 6Xc-myc 标签 ( 序列为 EQKLISEEDL)。
上述 2) 中的 GmLEC1A 蛋白可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达 得到。上述 2) 中的 GmLEC1A 的编码基因可通过将序列表中序列 2 所示的 DNA 序列中缺失 或添加一个或几个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或 在其 5′端和 / 或 3′端连上 6Xc-myc 标签的编码序列得到。 上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因 ( 命名为 GmLEC1A 基因 ) 也属于本发明的 保护范围。
所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因为如下 1)-6) 中任一所述的基因 ：
1) 其核苷酸序列是序列表中的序列 2 ；
2) 其核苷酸序列是序列表中的序列 3 的自 5’ 末端起第 49-2122 位所示 ；
3) 其核苷酸序列是序列表中的序列 3 ；
4) 其核苷酸序列是序列表中的序列 4 ；
5) 在严格条件下与 1) 或 2) 或 3) 或 4) 的基因杂交且编码所述蛋白的基因 ；
6) 与 1) 或 2) 或 3) 或 4) 或 5) 的基因具有 90％以上的同源性且编码所述蛋白的 基因。
上述严格条件可为用 6×SSC， 0.5％ SDS 的溶液， 在 65℃下杂交， 然后用 2×SSC， 0.1％ SDS 和 1×SSC， 0.1％ SDS 各洗膜一次。
序列表中的序列 3 由 2122 个碱基组成， 自 5’ 末端第 1-48 位碱基为 5’ -UTR， 自 5’ 末端第 49-100 位碱基为第一个外显子， 自 5’ 末端第 101-1502 位碱基为第一个内含子， 自 5’ 末端第 1503-2122 位碱基为第二个外显子。
扩增上述 GmLEC1A 基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围 ；
所述引物对中， 一条引物序列如序列表中序列 5 所示， 另一条引物序列如序列表 中序列 6 所示。
含有上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因的表达盒、 重组载体、 转基因细胞系 或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为在双元载体 pER10 的多克隆位点间插入上述与脂肪酸合 成相关蛋白的编码基因得到重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法， 是将上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码 基因 GmLEC1A 或基因组 DNA 转入目的植物中， 得到脂肪酸含量高于所述目的植物的转基因 植物。
所述脂肪酸为 ： C16:0、 C18:0、 C18:1、 C18:2、 C18:3、 C20:0、 C20:1、 C20:2 和 / 或 C22:1。
上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因 GmLEC1A 是通过上述重组表达载体导入 目的植物中的。
上述与脂肪酸合成相关蛋白 GmLEC1A、 编码基因 GmLEC1A 和 / 或含有编码基因 GmLEC1A 的表达盒、 重组载体、 转基因细胞系或重组菌在合成脂肪酸中的应用也属于本发明 保护的范围 ； 所述脂肪酸为 ： C16:0、 C18:0、 C18:1、 C18:2、 C18:3、 C20:0、 C20:1、 C20:2 和 / 或 C22:1。
携带有本发明编码的 GmLEC1A 基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原 生质体 - 化学介导法 (Ca2+、 PEG)、 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 花粉管、 微注射、 电激、 基因枪、 农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化 植物细胞、 组织或器官， 并将转化的植物细胞、 组织或器官培育成植株 ； 所述组织和器官可 包括宿主植物的果荚、 愈伤组织、 茎尖、 叶片和种子等。被转化的宿主植物 ( 目的植物 ) 为 双子叶植物或单子叶植物 ； 所述双子叶植物具体为拟南芥或大豆。
本发明获得了与脂肪酸合成相关的基因 GmLEC1A， 并通过转基因功能互补实验验 证了该基因的功能。实验证明， 将本发明保护的基因 GmLEC1A 在拟南芥中过量表达后， 可以 提高拟南芥幼苗中脂肪酸的含量。 这对提高大豆的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要 的理论及实际意义， 在农业领域具有广阔的应用和市场前景。 附图说明
图 1 为重组表达载体 pER10-GmLEC1-6XMYC 的图谱。 图 2 为通过 RT-PCR 检测转基因植株中 GmLEC1A 基因的表达量。 图 3 为转基因拟南芥植株在诱导培养基上的表型。 图 4 为通过苏丹红染色指示转基因拟南芥植株体内脂肪酸含量的变化。具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 基因的发现
通过同源序列比对， 在大豆中找到拟南芥 AtLEC1 基因的同源基因 GmLEC1A。在序 列比对中发现大豆 GmLEC1A 基因与拟南芥 AtLEC1 基因的保守结构域达到 95.5％的同源性。
实施例 2、 转基因植物的获得及其检测
一、 转基因植物的获得
1、 重组表达载体构建
以大豆 (Glycine max cultivar Nannong11382)( 公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得， 记载过该材料的非专利文献是 Liao Y， Zou HF， Wei W， Hao YJ， Tian AG， Huang J， Liu YF， Zhang JS* and Chen SY*.Soybean GmbZIP44， GmbZIP62 and GmbZIP78 genes function as negative regulator of ABA signaling and confer salt and freezing tolerance in transgenic Arabidopsis.Planta.2008， 228 ： 225-240) 的叶 片基因组 DNA 为模板， 用以下引物 ：
GmLEC1A-F1 ： CCctcgagAACGCCTACTTCATCTCTCTTATA( 小 写 字 母 为 XhoI 的 酶 切 位 点)和
GmLEC1A-R ： GGgaattccTATGGAGCGAGCATTTGGTTCATG( 小写字母为 EcoRI 酶切位点 ) 进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 产物连接到中间载体 pGEM-T Easy(Promega 公司 ) 上， 获得重组 载体 pT-GmLEC1A， 经测序得到序列表中序列 3 第 1-2119 位所示的核苷酸序列。
序列表中的序列 3 由 2122 个碱基组成， 为包含 GmLEC1A 基因的基因组 DNA 片段。 序列 3 自 5’ 末端第 1-48 位碱基为 5’ -UTR， 自 5’ 末端第 49-100 位碱基为该基因的第一个 外显子， 自 5’ 末端第 101-1502 位碱基为该基因的第一个内含子， 自 5’ 末端第 1503-2122 位碱基为该基因的第二个外显子。
序列表中的序列 3 第 49-2122 位所示的基因组 DNA 对应的 cDNA 的核苷酸序列如 序列表中序列 2 所示。序列 2 由 672 个碱基组成， 编码具有序列表中序列 1 的氨基酸序列 的蛋白， 将该蛋白命名为 GmLEC1A。序列表中序列 1 由 223 个氨基酸残基组成。 用 SmaI 和 BamHI 酶对载体 pBA-6xmyc( 公众可从中国科学院遗传与发育生物学 研究所获得， 记载过该载体的非专利文献是 Zhou Q， Hare PD， Yang S W， Zeidler M， Huang LF and Chua NH.FHL is required for full phytochrome A signaling and shares overlapping functions with FHY1.Plant Journal.2005.43， 356-370.) 双酶切得到的 小片段插入中间载体 pSK( 默克公司上海办事处 ) 的 SmaI 和 BamHI 酶切位点间， 得到重 组载体 pSK-6xmyc。然后用 XhoI 和 EcoRI 双酶切上述获得的 pT-GmLEC 1A 得到的小片 段插入 pSK-6xmyc 的 XhoI 和 EcoRI 识别位点间， 得到 pSK-GmLEC1A-6xmyc。然后用 XhoI 和 XbaI 双酶切上述获得的 pSK-GmLEC1A-6xmyc， 得到的小片段与用 XhoI 和 SpeI 双酶切 双元载体 pER10( 公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得， 记载过该载体的非 专利文献是 Zuo， J.， Hare， P.D.， and Chua， N.H.Applications of chemical-inducible expression systems in functional genomics and biotechnology.Methods in Molecular Biology-Arabidopsis Protocols， eds.Salinas， J.， and Sanchez-Serrano， J.J.， pp 2006.329-342.Humana Press， NJ， pER10 细 菌 抗 性 为 壮 观 酶 素， 转基因植物 抗 性 为 卡 那 酶 素 ) 连 接， 因 XbaI 和 SpeI 可 产 生 相 同 的 粘 性 末 端， 因此得到最终载体 pER10-GmLEC1-6XMYC， 测序验证， 结果在 pER10 的 XhoI 和 SpeI 酶切位点间插入了序列 4 所 示 DNA 片段， 序列 4 中第 1-2119 位为 GmLEC1A 基因， 第 2150-2371 位为 6xmyc， 表明构建的 载体构建正确。图 1 为重组表达载体 pER10-GmLEC1-6XMYC 结构模式图 ： 其中 promoter 指 启动子 ； Ter 为终止子 ； NPTII 为卡那抗性筛选基因 )。LexA 是细菌抑制子 ； XVE 是 LexA 细 菌抑制子的 DNA 结合域 (X) 和单纯疱疹病毒蛋白 VP16 的反式活化域 (V) 以及雌激素受体 的配体结合域 (E) 构成， pER10 在雌激素的诱导下可以使目的基因在植物体内过量表达， 是 35S 启动子的 3-5 倍。
2、 转基因植物获得
将步骤 1 得到的重组表达载体 pER10-GmLEC1-6XMYC 用电激转化方法转入农杆菌 GV3101(Invitrogen 公司 ) 菌株中。筛选出具有壮观霉素抗性的农杆菌即为阳性转化农杆 菌。挑取阳性转化农杆菌单菌落接种于 20ml LB 液体培养基 ( 含壮观酶素 50mg/L， 利福平 50mg/L) 中， 28℃， 150rpm 振荡培养 2 天。所获菌液以 2％接种量接菌于含有利福平和壮观 酶素的 300ml LB 培养基， 按照上述条件振荡培养 16-18 小时。所获菌液经 5,000rpm、 20 分 钟离心收集菌体， 菌体重悬于 250ml 含有 5％蔗糖和 Silwet L-77(LEHLE SEEDS 公司 ) 转化 液中， 慢慢摇匀。转化液转入 250ml 烧杯中， 将已去掉花和果荚的拟南芥 Col-0 野生型倒置 于烧杯中， 在真空状态保持 20 秒为宜。将转化后的拟南芥培养得到种子， 将得到的拟南芥 种子在含卡那霉素的培养基中培养， 长出绿叶和根系的苗为转基因拟南芥 T1 代。按照获得 转 pER10-GmLEC1-6XMYC 的 T1 代转基因拟南芥的方法， 将空载体 pER10 转化拟南芥 Col-0 野 生型， 得到转空载体对照拟南芥。从 T1 代转基因和转空载体对照拟南芥植株上收获种子， 播种后获得 T2 代转基因拟南芥植株和转空载体对照拟南芥植株的纯合系。同时， 设未进行 任何转基因处理的拟南芥作为野生型对照植株。
二、 转基因植物的检测
1、 通过 RT-PCR 检测 GmLEC1A 基因的表达量 T2 代转基因和转空载体对照植株的纯合系种子以及野生型对照植株的种子萌发 后 7 天， 用 10μM 的雌激素 (Sigma 公司 ) 处理 24h 后， 参照下面的方法提取 RNA， 并取 1μg RNA 反转成相应的 cDNA， 然后利用引物 GmLEC1A-F1 和 GmLEC1A-R 进行 RT-PCR 检测 GmLEC1A 基因的表达量 (GmLEC1A-F1 位于 5’ UTR 处 )， 引物 GmLEC1A-F1 的序列为序列表中序列 5， 引物 GmLEC1A-R 的序列为序列表中序列 6。利用引物 UBQ5-F1 和 UBQ5-F2 扩增 UBQ 基因作 为内标， 引物序列如表 1。结果如图 2 所示， Col 代表野生型植株， L5、 L7 和 L8 分别代表不 同的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因株系， 从图中可见， 与野生型 (Col) 对照植株相比， 转基因 植株中 GmLEC1A 基因的表达量显著增加。获得了 3 个高表达量的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转 基因株系 L5、 L7 和 L8， 将用于下面脂肪酸的检测。转空载体对照植株和野生型对照植株中 GmLEC1A 基因的表达量无显著差异。
表 1 引物序列
引物名称 GmLEC1A-F1 GmLEC1A-R UBQ5-F1 UBQ5-F2
引物序列 (5’ -3’ ) CCctcgagAACGCCTACTTCATCTCTCTTATA GGgaattccTATGGAGCGAGCATTTGGTTCATG CTTCAGCAGCCGTTGCCTCA CTGGTAAACGTAGGTGAGTCCRNA 提取方法如下 ：
TRIzol 法 ： 参照厂商 (Invitrogen) 提供的使用说明进行。首先预冷研钵、 研杵、 1.5ml 离心管和 TRIzol 试剂。分别取上述转基因不同的株系 100mg， 用液氮快速粉碎， 转移至预冷的离心管。加入 1ml TRIzol 试剂， 振荡混匀。室温放置 5 分钟， 4℃ 12,000g 离心 10 分钟。取上清移入新离心管， 加入 200μl 氯仿， 轻摇混匀。室温放置 3 分钟， 4℃ 12000g 离 心 10 分钟。取上层水相移入新管， 加入 250μl 异丙醇和 250μl 高盐沉淀剂 (0.8M 柠檬酸 钠， 1.2M 氯化钠 )， 室温放置 3 分钟， 4℃ 12000g 离心 10 分钟， 去除上清。沉淀用 1ml 75％ 乙醇洗涤， 4℃ 7500g 离心 5 分钟， 去除上清。沉淀于室温干燥 5-10 分钟， 加入适量 (50μl 左右 )DEPC 水溶解 ( 为了有利于 RNA 溶解， 可置于 50℃水浴 10-30 分钟 ) 获得 RNA。
cDNA 反转录 ：
cDNA 第一链的合成 ：
(1) 取上述提取的 RNA 1-2μg， 加 DEPC 水至 10μl ；
(2) 加入 1μl(0.5g)Oligo(dT)15 和 1μl 10mM dNTP， 混匀 ；
(3)65 ℃， 5 分钟， 然后放在冰上， 快速加入 ： 5×buffer 4μl， RNAse inhibitor 1μl， 0.1M DTT 2μl， 5U/μl 反转录酶 H 0.5μl ；
(4) 反转录反应 (cDNA 第一链合成 ) 在 PCR 仪上进行， 使用如下程序 ：
先 42℃， 50 分钟 ； 再 45℃， 10 分钟 ； 再 50℃， 10 分钟 ； 再 70℃， 15 分钟 ；
(5) 反应结束之后快速取出， 冰上加入 10mg/ml 1μl RNase， 然后在 37 ℃放置 30-60 分钟， 获得 cDNA。 PCR 扩增 ：
PCR 反 应 体 系 (20μl) ： 模 板 DNA 1μl ； 10×buffer 2μl ； 2.5mM dNTP 2μl ； 10μMprimers 2μl ； 超纯水 12.8μl ； 5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.2μl。
PCR 扩增程序为 ： 先 94℃预变性 2min ； 再 94℃变性 30s， 54℃退火 30s， 72℃延长 1min， 循环数分别为 27 和 33 ； 然后再 72℃延长 10min ； 4℃保存。
所用 PCR 仪型号为 Whatman Biometra T Gradient 96 和 MJ PTC-200。
2、 转基因植株的脂肪酸代谢检测
(1) 转基因植株在诱导培养基上的萌发表型
将上述获得的过表达 pER10-GmLEC1-6XMYC 的阳性转基因株系、 野生型 Col-0、 以及转空载体植株的种子分别播在不含和含有 10μM 雌激素 (Sigma 公司 ) 的 MS 培养基 (Sigma) 上， 4℃放置 2 天， 然后移至温室中在 22℃、 光照强度 80-120μE-2S-1 条件下培养 7 天。在不加雌激素的培养基上萌发时， 转基因植株与野生型以及转空载体植株没有明显 的区别。 而在加雌激素的培养基上萌发时， 转基因植物则表现为严重的形态异常， 主要表现 为子叶很小而且黄化， 不分化真叶， 萌发后不久整个植株生长和发育几乎停止， 最终死亡， 如图 3 所示 ： 左侧为野生型， 右侧为代表性的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因株系 L8， 标尺为 1mm。转空载体对照植株的表型与野生型无显著差异。
(2) 苏丹红染色指示体内脂肪酸含量的变化
将上述培养基中萌发后生长 7 天的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因植株与野生型 Col-0 对照、 转空载体植株分别浸泡于 1％苏丹红 (Fat Red 7B)(Sigma 公司 )， 室温 30min 后， 用去离子水清洗 3 遍， 每遍 2min， 染色结果如图 4 所示， 左侧为野生型， 右侧为代表性的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因株系 L8， 标尺为 1mm。 在 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因植株的根 部和子叶处， 脂肪酸的积累量明显高于野生型。这说明转基因植株的体内脂肪酸含量大大 提高。转空载体对照植株的表型与野生型无显著差异。
(3)GC-MS 方法检测体内脂肪酸含量变化
将 上 述 (1) 中 在 诱 导 培 养 基 中 萌 发 后 生 长 7 天 的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转 基 因植株的幼苗与转空载体对照植株的幼苗、 野生型植株的幼苗各 0.15 克， 在液氮中研 磨 成 干 粉， 然 后 转 移 到 带 密 封 盖 的 试 管 中， 加 入 3mL 甲 醇 ( 含 2.5 ％ (V/V) 浓 硫 酸 )， 在 80 ℃ 水 浴 加 热 90 分 钟 . 再 加 入 4.5mL 0.9 ％ NaCl 水 溶 液 和 1mL 正 己 烷， 混 匀， 4， 000rpm 离心 10 分钟， 收集正己烷相。真空抽干， 用 100ul 乙酸乙酯溶解， 取 1ul 上样， 用 PerkinElmer 公司的 TurboMass GC/MS 仪分析各种脂肪酸组分的含量变化情况， 所用 GC 柱 为 30m×0.25mmBPX-70 柱， GC 升温程序为 ： 初始温度 120℃， 保持 1 分钟， 再以每分钟 10℃ 的速率升至 150℃， 然后以每分钟 4℃的速率升温至 230℃， 保持 10 分钟。
检测结果如下 ：
pER10-GmLEC1-6XMYC 转 基 因 植 株 中， 检测到如下脂肪酸组分 ： C16:0， C18:0， C18:1， C18:2， C18:3， C20:0， C20:1， C20:2， C22:1 ；
野生型对照植株中， 检测到如下脂肪酸组分 ： C16:0， C18:0， C18:1， C18:2， C18:3 ；
转空载体对照植株的检测结果与野生型对照植株的结果一致。
为 了 对 比 野 生 型 和 转 基 因 植 物 之 间 的 脂 肪 酸 含 量， 将 各 组 份 以 C17:0 的 三 酯 酰 甘 油 作 内 标 转 换 为 脂 肪 酸 的 相 对 含 量， 结 果 如 表 2 所 示， 与 野 生 型 对 照 相 比， pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因植株经诱导后脂肪酸的各个组分含量都明显上升， 其中十八碳 三稀酸 (18:3) 提高的幅度最大， 达到 68 倍， 而总的脂肪酸含量也上升了 31 倍。转空载体 对照植株的结果与野生型植株无显著差异。
表 2 野生型和转基因植株的脂肪酸相对含量对比情况
本发明涉及生物技术领域中与脂肪酸合成相关的蛋白 GmLEC1A 及其编码基因与应用。 背景技术
植物油作为主要的食用油和一种重要的可再生能源物质而受到广泛关注。目前， 世界上食用油的 85％来自于植物油， 只有 25％来自于动物和海洋生物。同时， 植物油也被 广泛应用于工业领域， 如洗涤剂， 润滑油， 油漆和生物可降解塑料等。另外， 值得一提的是， 植物柴油的开发可能为解决全球能源危机和环境污染提供了一条新的途径。 随着人们对植 物油的需求量越来越大， 现有的产量将远远不能满足社会的需求。
大豆作为主要的经济作物之一， 是食用植物油的重要来源。大豆油的饱和脂肪酸 与不饱和脂肪酸的比例相对其它的植物油 ( 如菜籽油、 花生油等 ) 较为合理， 其消费量和食 用量也已经逐步超过了其它植物油， 成为人们日常饮食重要的营养来源之一。我国是大豆 的故乡， 世界上其他国家种植的大豆， 大都是直接或间接从我国传入的。20 世纪 50 年代以 前， 中国是世界大豆的重大生产国。然而从 1953 年， 这个地位被美国取而代之， 随着大豆在 美洲的扎根、 受扶植以及转基因技术盛行， 到 1996 年， 中国由大豆净出口国变成了净进口 国。至 2006 年， 大豆进口量已接近中国粮食进口总量的 90％， 而且大多来自美洲。因此提 高大豆油的产量和含油量是我国目前迫切需要解决的问题。
随着生物技术的发展， 转基因工程为我们提供了一个有效的途径。首先通过遗传 学的方法鉴定与油脂合成有关的调控基因， 然后利用基因工程的方法来改善这些调控基 因， 从而提高大豆种子的含油量。近十余年来， 科学家们利用生物技术对脂肪酸生物合成 过程中的关键基因进行遗传改良， 但都没能取得显著的效果， 其中一个主要的原因是植物 体内的脂肪酸合成是一个复杂和高度协调的过程， 是多基因协同完成的， 因此改良单个的 脂肪酸合成的基因， 并不能有效的改善脂肪酸的含量。最近的研究发现， 在脂肪酸的代谢 过程中， 很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因子 ( 例如转录因子 ) 在起全面的调控作用 (Girke， T.， Todd， J.， Ruuska， S.， White， J.， Benning， C.， andOhlrogge， J..Microarray analysis of developing Arabidopsis seeds.Plant Physiol.2000， 124， 1570-1581.)。 那 么通过对这些调控因子的遗传改良达到增加脂肪酸含量的目的将成为可能。
目前， 通过对拟南芥的研究发现， 参与植物脂肪酸代谢的最重要的转录因子是 LEC1(Leafy Cotyledon 1)。LEC1 是拟南芥胚胎发生和种子成熟过程中一个关键的调控因 子， 同时也对胚胎形成过程中胚胎储存物的积累进行调控 (Lotan， T.， Ohto， M.， Yee， K.M.， West， M.A.， Lo， R.， Kwong， R.W.， Yamagishi， K.， Fischer， R.L.， Goldberg， R.B.， andHarada， J.J.Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryodevelopment in vegetative cells.Cell.1998， 93， 1195-1205.)。过量表达 LEC1 可以诱导数目众多的与 脂肪酸合成相关基因的表达， 包括编码脂肪酸从头合成关键限速酶乙酰辅酶 A 羧化酶中三 个核基因组编码亚基的基因， 与此相吻合， 在 LEC1 过量表达植株中主要脂肪酸组分的含量大幅度上升 (Mu， J.， Tan， H.， Zheng， Q.， Fu， F.， Liang， Y.， Zhang， J.， Yang， X.， Wang， T.， Chong， K.， Wang， X.J.， et al..LEAFY COTYLEDON1 is a keyregulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis.Plant Physiol.2008， 148， 1042-1054.)。 发明内容
本发明的一个目的是提供与脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与脂肪酸合成相关的蛋白， 名称为 GmLEC1A， 来源于大豆 (Glycine max L.)， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ：
1) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ；
2) 将序列表中序列 1 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加且与脂肪酸合成相关的由 1) 衍生的蛋白质。
为了使 1) 中的 GmLEC1A 蛋白便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列 组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上 6Xc-myc 标签 ( 序列为 EQKLISEEDL)。
上述 2) 中的 GmLEC1A 蛋白可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达 得到。上述 2) 中的 GmLEC1A 的编码基因可通过将序列表中序列 2 所示的 DNA 序列中缺失 或添加一个或几个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或 在其 5′端和 / 或 3′端连上 6Xc-myc 标签的编码序列得到。 上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因 ( 命名为 GmLEC1A 基因 ) 也属于本发明的 保护范围。
所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因为如下 1)-6) 中任一所述的基因 ：
1) 其核苷酸序列是序列表中的序列 2 ；
2) 其核苷酸序列是序列表中的序列 3 的自 5’ 末端起第 49-2122 位所示 ；
3) 其核苷酸序列是序列表中的序列 3 ；
4) 其核苷酸序列是序列表中的序列 4 ；
5) 在严格条件下与 1) 或 2) 或 3) 或 4) 的基因杂交且编码所述蛋白的基因 ；
6) 与 1) 或 2) 或 3) 或 4) 或 5) 的基因具有 90％以上的同源性且编码所述蛋白的 基因。
上述严格条件可为用 6×SSC， 0.5％ SDS 的溶液， 在 65℃下杂交， 然后用 2×SSC， 0.1％ SDS 和 1×SSC， 0.1％ SDS 各洗膜一次。
序列表中的序列 3 由 2122 个碱基组成， 自 5’ 末端第 1-48 位碱基为 5’ -UTR， 自 5’ 末端第 49-100 位碱基为第一个外显子， 自 5’ 末端第 101-1502 位碱基为第一个内含子， 自 5’ 末端第 1503-2122 位碱基为第二个外显子。
扩增上述 GmLEC1A 基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围 ；
所述引物对中， 一条引物序列如序列表中序列 5 所示， 另一条引物序列如序列表 中序列 6 所示。
含有上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因的表达盒、 重组载体、 转基因细胞系 或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为在双元载体 pER10 的多克隆位点间插入上述与脂肪酸合 成相关蛋白的编码基因得到重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法， 是将上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码 基因 GmLEC1A 或基因组 DNA 转入目的植物中， 得到脂肪酸含量高于所述目的植物的转基因 植物。
所述脂肪酸为 ： C16:0、 C18:0、 C18:1、 C18:2、 C18:3、 C20:0、 C20:1、 C20:2 和 / 或 C22:1。
上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因 GmLEC1A 是通过上述重组表达载体导入 目的植物中的。
上述与脂肪酸合成相关蛋白 GmLEC1A、 编码基因 GmLEC1A 和 / 或含有编码基因 GmLEC1A 的表达盒、 重组载体、 转基因细胞系或重组菌在合成脂肪酸中的应用也属于本发明 保护的范围 ； 所述脂肪酸为 ： C16:0、 C18:0、 C18:1、 C18:2、 C18:3、 C20:0、 C20:1、 C20:2 和 / 或 C22:1。
携带有本发明编码的 GmLEC1A 基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原 生质体 - 化学介导法 (Ca2+、 PEG)、 Ti 质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA 转化、 花粉管、 微注射、 电激、 基因枪、 农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化 植物细胞、 组织或器官， 并将转化的植物细胞、 组织或器官培育成植株 ； 所述组织和器官可 包括宿主植物的果荚、 愈伤组织、 茎尖、 叶片和种子等。被转化的宿主植物 ( 目的植物 ) 为 双子叶植物或单子叶植物 ； 所述双子叶植物具体为拟南芥或大豆。
本发明获得了与脂肪酸合成相关的基因 GmLEC1A， 并通过转基因功能互补实验验 证了该基因的功能。实验证明， 将本发明保护的基因 GmLEC1A 在拟南芥中过量表达后， 可以 提高拟南芥幼苗中脂肪酸的含量。 这对提高大豆的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要 的理论及实际意义， 在农业领域具有广阔的应用和市场前景。 附图说明
图 1 为重组表达载体 pER10-GmLEC1-6XMYC 的图谱。 图 2 为通过 RT-PCR 检测转基因植株中 GmLEC1A 基因的表达量。 图 3 为转基因拟南芥植株在诱导培养基上的表型。 图 4 为通过苏丹红染色指示转基因拟南芥植株体内脂肪酸含量的变化。具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 基因的发现
通过同源序列比对， 在大豆中找到拟南芥 AtLEC1 基因的同源基因 GmLEC1A。在序 列比对中发现大豆 GmLEC1A 基因与拟南芥 AtLEC1 基因的保守结构域达到 95.5％的同源性。
实施例 2、 转基因植物的获得及其检测
一、 转基因植物的获得
1、 重组表达载体构建
以大豆 (Glycine max cultivar Nannong11382)( 公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得， 记载过该材料的非专利文献是 Liao Y， Zou HF， Wei W， Hao YJ， Tian AG， Huang J， Liu YF， Zhang JS* and Chen SY*.Soybean GmbZIP44， GmbZIP62 and GmbZIP78 genes function as negative regulator of ABA signaling and confer salt and freezing tolerance in transgenic Arabidopsis.Planta.2008， 228 ： 225-240) 的叶 片基因组 DNA 为模板， 用以下引物 ：
GmLEC1A-F1 ： CCctcgagAACGCCTACTTCATCTCTCTTATA( 小 写 字 母 为 XhoI 的 酶 切 位 点)和
GmLEC1A-R ： GGgaattccTATGGAGCGAGCATTTGGTTCATG( 小写字母为 EcoRI 酶切位点 ) 进行 PCR 扩增， 得到的 PCR 产物连接到中间载体 pGEM-T Easy(Promega 公司 ) 上， 获得重组 载体 pT-GmLEC1A， 经测序得到序列表中序列 3 第 1-2119 位所示的核苷酸序列。
序列表中的序列 3 由 2122 个碱基组成， 为包含 GmLEC1A 基因的基因组 DNA 片段。 序列 3 自 5’ 末端第 1-48 位碱基为 5’ -UTR， 自 5’ 末端第 49-100 位碱基为该基因的第一个 外显子， 自 5’ 末端第 101-1502 位碱基为该基因的第一个内含子， 自 5’ 末端第 1503-2122 位碱基为该基因的第二个外显子。
序列表中的序列 3 第 49-2122 位所示的基因组 DNA 对应的 cDNA 的核苷酸序列如 序列表中序列 2 所示。序列 2 由 672 个碱基组成， 编码具有序列表中序列 1 的氨基酸序列 的蛋白， 将该蛋白命名为 GmLEC1A。序列表中序列 1 由 223 个氨基酸残基组成。 用 SmaI 和 BamHI 酶对载体 pBA-6xmyc( 公众可从中国科学院遗传与发育生物学 研究所获得， 记载过该载体的非专利文献是 Zhou Q， Hare PD， Yang S W， Zeidler M， Huang LF and Chua NH.FHL is required for full phytochrome A signaling and shares overlapping functions with FHY1.Plant Journal.2005.43， 356-370.) 双酶切得到的 小片段插入中间载体 pSK( 默克公司上海办事处 ) 的 SmaI 和 BamHI 酶切位点间， 得到重 组载体 pSK-6xmyc。然后用 XhoI 和 EcoRI 双酶切上述获得的 pT-GmLEC 1A 得到的小片 段插入 pSK-6xmyc 的 XhoI 和 EcoRI 识别位点间， 得到 pSK-GmLEC1A-6xmyc。然后用 XhoI 和 XbaI 双酶切上述获得的 pSK-GmLEC1A-6xmyc， 得到的小片段与用 XhoI 和 SpeI 双酶切 双元载体 pER10( 公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得， 记载过该载体的非 专利文献是 Zuo， J.， Hare， P.D.， and Chua， N.H.Applications of chemical-inducible expression systems in functional genomics and biotechnology.Methods in Molecular Biology-Arabidopsis Protocols， eds.Salinas， J.， and Sanchez-Serrano， J.J.， pp 2006.329-342.Humana Press， NJ， pER10 细 菌 抗 性 为 壮 观 酶 素， 转基因植物 抗 性 为 卡 那 酶 素 ) 连 接， 因 XbaI 和 SpeI 可 产 生 相 同 的 粘 性 末 端， 因此得到最终载体 pER10-GmLEC1-6XMYC， 测序验证， 结果在 pER10 的 XhoI 和 SpeI 酶切位点间插入了序列 4 所 示 DNA 片段， 序列 4 中第 1-2119 位为 GmLEC1A 基因， 第 2150-2371 位为 6xmyc， 表明构建的 载体构建正确。图 1 为重组表达载体 pER10-GmLEC1-6XMYC 结构模式图 ： 其中 promoter 指 启动子 ； Ter 为终止子 ； NPTII 为卡那抗性筛选基因 )。LexA 是细菌抑制子 ； XVE 是 LexA 细 菌抑制子的 DNA 结合域 (X) 和单纯疱疹病毒蛋白 VP16 的反式活化域 (V) 以及雌激素受体 的配体结合域 (E) 构成， pER10 在雌激素的诱导下可以使目的基因在植物体内过量表达， 是 35S 启动子的 3-5 倍。
2、 转基因植物获得
将步骤 1 得到的重组表达载体 pER10-GmLEC1-6XMYC 用电激转化方法转入农杆菌 GV3101(Invitrogen 公司 ) 菌株中。筛选出具有壮观霉素抗性的农杆菌即为阳性转化农杆 菌。挑取阳性转化农杆菌单菌落接种于 20ml LB 液体培养基 ( 含壮观酶素 50mg/L， 利福平 50mg/L) 中， 28℃， 150rpm 振荡培养 2 天。所获菌液以 2％接种量接菌于含有利福平和壮观 酶素的 300ml LB 培养基， 按照上述条件振荡培养 16-18 小时。所获菌液经 5,000rpm、 20 分 钟离心收集菌体， 菌体重悬于 250ml 含有 5％蔗糖和 Silwet L-77(LEHLE SEEDS 公司 ) 转化 液中， 慢慢摇匀。转化液转入 250ml 烧杯中， 将已去掉花和果荚的拟南芥 Col-0 野生型倒置 于烧杯中， 在真空状态保持 20 秒为宜。将转化后的拟南芥培养得到种子， 将得到的拟南芥 种子在含卡那霉素的培养基中培养， 长出绿叶和根系的苗为转基因拟南芥 T1 代。按照获得 转 pER10-GmLEC1-6XMYC 的 T1 代转基因拟南芥的方法， 将空载体 pER10 转化拟南芥 Col-0 野 生型， 得到转空载体对照拟南芥。从 T1 代转基因和转空载体对照拟南芥植株上收获种子， 播种后获得 T2 代转基因拟南芥植株和转空载体对照拟南芥植株的纯合系。同时， 设未进行 任何转基因处理的拟南芥作为野生型对照植株。
二、 转基因植物的检测
1、 通过 RT-PCR 检测 GmLEC1A 基因的表达量 T2 代转基因和转空载体对照植株的纯合系种子以及野生型对照植株的种子萌发 后 7 天， 用 10μM 的雌激素 (Sigma 公司 ) 处理 24h 后， 参照下面的方法提取 RNA， 并取 1μg RNA 反转成相应的 cDNA， 然后利用引物 GmLEC1A-F1 和 GmLEC1A-R 进行 RT-PCR 检测 GmLEC1A 基因的表达量 (GmLEC1A-F1 位于 5’ UTR 处 )， 引物 GmLEC1A-F1 的序列为序列表中序列 5， 引物 GmLEC1A-R 的序列为序列表中序列 6。利用引物 UBQ5-F1 和 UBQ5-F2 扩增 UBQ 基因作 为内标， 引物序列如表 1。结果如图 2 所示， Col 代表野生型植株， L5、 L7 和 L8 分别代表不 同的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因株系， 从图中可见， 与野生型 (Col) 对照植株相比， 转基因 植株中 GmLEC1A 基因的表达量显著增加。获得了 3 个高表达量的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转 基因株系 L5、 L7 和 L8， 将用于下面脂肪酸的检测。转空载体对照植株和野生型对照植株中 GmLEC1A 基因的表达量无显著差异。
表 1 引物序列
引物名称 GmLEC1A-F1 GmLEC1A-R UBQ5-F1 UBQ5-F2
引物序列 (5’ -3’ ) CCctcgagAACGCCTACTTCATCTCTCTTATA GGgaattccTATGGAGCGAGCATTTGGTTCATG CTTCAGCAGCCGTTGCCTCA CTGGTAAACGTAGGTGAGTCCRNA 提取方法如下 ：
TRIzol 法 ： 参照厂商 (Invitrogen) 提供的使用说明进行。首先预冷研钵、 研杵、 1.5ml 离心管和 TRIzol 试剂。分别取上述转基因不同的株系 100mg， 用液氮快速粉碎， 转移至预冷的离心管。加入 1ml TRIzol 试剂， 振荡混匀。室温放置 5 分钟， 4℃ 12,000g 离心 10 分钟。取上清移入新离心管， 加入 200μl 氯仿， 轻摇混匀。室温放置 3 分钟， 4℃ 12000g 离 心 10 分钟。取上层水相移入新管， 加入 250μl 异丙醇和 250μl 高盐沉淀剂 (0.8M 柠檬酸 钠， 1.2M 氯化钠 )， 室温放置 3 分钟， 4℃ 12000g 离心 10 分钟， 去除上清。沉淀用 1ml 75％ 乙醇洗涤， 4℃ 7500g 离心 5 分钟， 去除上清。沉淀于室温干燥 5-10 分钟， 加入适量 (50μl 左右 )DEPC 水溶解 ( 为了有利于 RNA 溶解， 可置于 50℃水浴 10-30 分钟 ) 获得 RNA。
cDNA 反转录 ：
cDNA 第一链的合成 ：
(1) 取上述提取的 RNA 1-2μg， 加 DEPC 水至 10μl ；
(2) 加入 1μl(0.5g)Oligo(dT)15 和 1μl 10mM dNTP， 混匀 ；
(3)65 ℃， 5 分钟， 然后放在冰上， 快速加入 ： 5×buffer 4μl， RNAse inhibitor 1μl， 0.1M DTT 2μl， 5U/μl 反转录酶 H 0.5μl ；
(4) 反转录反应 (cDNA 第一链合成 ) 在 PCR 仪上进行， 使用如下程序 ：
先 42℃， 50 分钟 ； 再 45℃， 10 分钟 ； 再 50℃， 10 分钟 ； 再 70℃， 15 分钟 ；
(5) 反应结束之后快速取出， 冰上加入 10mg/ml 1μl RNase， 然后在 37 ℃放置 30-60 分钟， 获得 cDNA。 PCR 扩增 ：
PCR 反 应 体 系 (20μl) ： 模 板 DNA 1μl ； 10×buffer 2μl ； 2.5mM dNTP 2μl ； 10μMprimers 2μl ； 超纯水 12.8μl ； 5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.2μl。
PCR 扩增程序为 ： 先 94℃预变性 2min ； 再 94℃变性 30s， 54℃退火 30s， 72℃延长 1min， 循环数分别为 27 和 33 ； 然后再 72℃延长 10min ； 4℃保存。
所用 PCR 仪型号为 Whatman Biometra T Gradient 96 和 MJ PTC-200。
2、 转基因植株的脂肪酸代谢检测
(1) 转基因植株在诱导培养基上的萌发表型
将上述获得的过表达 pER10-GmLEC1-6XMYC 的阳性转基因株系、 野生型 Col-0、 以及转空载体植株的种子分别播在不含和含有 10μM 雌激素 (Sigma 公司 ) 的 MS 培养基 (Sigma) 上， 4℃放置 2 天， 然后移至温室中在 22℃、 光照强度 80-120μE-2S-1 条件下培养 7 天。在不加雌激素的培养基上萌发时， 转基因植株与野生型以及转空载体植株没有明显 的区别。 而在加雌激素的培养基上萌发时， 转基因植物则表现为严重的形态异常， 主要表现 为子叶很小而且黄化， 不分化真叶， 萌发后不久整个植株生长和发育几乎停止， 最终死亡， 如图 3 所示 ： 左侧为野生型， 右侧为代表性的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因株系 L8， 标尺为 1mm。转空载体对照植株的表型与野生型无显著差异。
(2) 苏丹红染色指示体内脂肪酸含量的变化
将上述培养基中萌发后生长 7 天的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因植株与野生型 Col-0 对照、 转空载体植株分别浸泡于 1％苏丹红 (Fat Red 7B)(Sigma 公司 )， 室温 30min 后， 用去离子水清洗 3 遍， 每遍 2min， 染色结果如图 4 所示， 左侧为野生型， 右侧为代表性的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因株系 L8， 标尺为 1mm。 在 pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因植株的根 部和子叶处， 脂肪酸的积累量明显高于野生型。这说明转基因植株的体内脂肪酸含量大大 提高。转空载体对照植株的表型与野生型无显著差异。
(3)GC-MS 方法检测体内脂肪酸含量变化
将 上 述 (1) 中 在 诱 导 培 养 基 中 萌 发 后 生 长 7 天 的 pER10-GmLEC1-6XMYC 转 基 因植株的幼苗与转空载体对照植株的幼苗、 野生型植株的幼苗各 0.15 克， 在液氮中研 磨 成 干 粉， 然 后 转 移 到 带 密 封 盖 的 试 管 中， 加 入 3mL 甲 醇 ( 含 2.5 ％ (V/V) 浓 硫 酸 )， 在 80 ℃ 水 浴 加 热 90 分 钟 . 再 加 入 4.5mL 0.9 ％ NaCl 水 溶 液 和 1mL 正 己 烷， 混 匀， 4， 000rpm 离心 10 分钟， 收集正己烷相。真空抽干， 用 100ul 乙酸乙酯溶解， 取 1ul 上样， 用 PerkinElmer 公司的 TurboMass GC/MS 仪分析各种脂肪酸组分的含量变化情况， 所用 GC 柱 为 30m×0.25mmBPX-70 柱， GC 升温程序为 ： 初始温度 120℃， 保持 1 分钟， 再以每分钟 10℃ 的速率升至 150℃， 然后以每分钟 4℃的速率升温至 230℃， 保持 10 分钟。
检测结果如下 ：
pER10-GmLEC1-6XMYC 转 基 因 植 株 中， 检测到如下脂肪酸组分 ： C16:0， C18:0， C18:1， C18:2， C18:3， C20:0， C20:1， C20:2， C22:1 ；
野生型对照植株中， 检测到如下脂肪酸组分 ： C16:0， C18:0， C18:1， C18:2， C18:3 ；
转空载体对照植株的检测结果与野生型对照植株的结果一致。
为 了 对 比 野 生 型 和 转 基 因 植 物 之 间 的 脂 肪 酸 含 量， 将 各 组 份 以 C17:0 的 三 酯 酰 甘 油 作 内 标 转 换 为 脂 肪 酸 的 相 对 含 量， 结 果 如 表 2 所 示， 与 野 生 型 对 照 相 比， pER10-GmLEC1-6XMYC 转基因植株经诱导后脂肪酸的各个组分含量都明显上升， 其中十八碳 三稀酸 (18:3) 提高的幅度最大， 达到 68 倍， 而总的脂肪酸含量也上升了 31 倍。转空载体 对照植株的结果与野生型植株无显著差异。
表 2 野生型和转基因植株的脂肪酸相对含量对比情况
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