用于实现多阶段方法的容器的盖帽.pdf

本发明的各实施例提供了用于实现样品分析的多阶段方法(如嵌套PCT或RT-PCR)的容器的盖帽。在一个实施例中，盖帽包括配置为与容器相配合以封闭容器内部的本体，用于存放反应物的盖帽空腔，以及在第一阶段位置和第二阶段位置之间相对于本体是可调整的盖帽空腔控制部分，其中在第一阶段位置，盖帽空腔是封闭的并且与容器内部是流体隔离的，在第二阶段位置，盖帽空腔与容器内部是流体连通的。

1.  一种用于容器的盖帽，所述盖帽被配置为与所述容器相配合以封闭容器内部，所述盖帽包括：
a)本体，配置为与所述容器相配合；
b)盖帽空腔；以及
c)盖帽空腔控制部分，其在第一阶段位置和第二阶段位置之间相对于所述本体是可调整的，其中，在所述第一阶段位置，所述盖帽空腔与所述容器内部是流体隔离的，在所述第二阶段位置，所述盖帽空腔与所述容器内部是流体连通的。

2.  如权利要求1所述的盖帽，其中所述盖帽空腔设置在所述本体内，所述本体具有封闭的底部和敞开的顶部，并且在所述第一阶段位置所述封闭的底部使所述盖帽空腔与所述容器内部流体隔离。

3.  如权利要求2所述的盖帽，其中所述盖帽空腔控制部分包括钉状帽部分，所述钉状帽部分具有与钉部相连接的顶部，并且其中所述钉状帽部分被配置为：在所述第一阶段位置将所述钉部设置在所述盖帽空腔内而并不穿透所述封闭的底部，而且所述顶部使所述盖帽空腔封闭。

4.  如权利要求3所述的盖帽，其进一步包括由所述本体向上延伸的上壁，其中在所述第一阶段位置所述钉状帽部分的所述顶部与所述上壁的顶部边缘基本对齐。

5.  如权利要求4所述的盖帽，其中在所述第一阶段位置所述上壁部分地围绕所述钉状帽部分，并且所述上壁包括敞开的区域，在所述敞开的区域所述上壁不围绕所述钉状帽部分。

6.  如权利要求5所述的盖帽，其进一步包括在所述敞开的区域、连接于所述钉状帽部分与所述本体之间的钉状帽臂。

7.  如权利要求6所述的盖帽，其中所述钉状帽臂包括柔性带。

8.  如权利要求3所述的盖帽，其进一步包括具有支撑面的驱动帽部分，所述支撑面被抵靠所述钉状帽部分的所述顶部按压，从而使所述钉状帽部分由所述第一阶段位置移动至所述第二阶段位置，所述钉部被配置为在所述第二阶段位置穿透所述封闭的底部从而使所述盖帽空腔与所述容器内部流体连通。

9.  如权利要求8所述的盖帽，其进一步包括连接于所述驱动帽部分与所述上壁之间的驱动帽臂。

10.  如权利要求9所述的盖帽，其中所述驱动帽臂包括柔性带。

11.  如权利要求9所述的盖帽，其进一步包括连接于所述钉状帽部分与所述本体之间的钉状帽臂，其中所述钉状帽臂与所述驱动帽臂大致彼此相对设置。

12.  如权利要求3所述的盖帽，其进一步包括可拆卸地连接至所述钉状帽部分的可拆卸挡块，所述可拆卸挡块使所述钉状帽部分相对于所述盖帽空腔定位，以防止所述钉部在所述第一阶段位置穿透所述封闭的底部。

13.  如权利要求12所述的盖帽，其中所述可拆卸挡块被从所述钉状帽部分除去以允许所述钉部在所述第二阶段位置穿透所述封闭的底部。

14.  如权利要求1所述的盖帽，其中所述盖帽空腔控制部分相对于所述本体可进一步调整从而使所述盖帽空腔处于装填位置，在所述装填位置所述盖帽空腔是敞开的，从而接纳来自所述容器外部的反应物。

15.  如权利要求1所述的盖帽，其中所述本体包括敞开的盖帽通道，并且其中所述盖帽空腔控制部分包括有孔的贮器部分，所述有孔的贮器部分具有带孔的所述盖帽空腔。

16.  如权利要求15所述的盖帽，其中所述有孔的贮器部分部分地插入所述本体的所述敞开的盖帽通道，并使所述孔敞开以使反应物在盖帽空腔装填位置由所述容器外部引入。

17.  如权利要求16所述的盖帽，其中所述有孔的贮器部分可由所述盖帽空腔装填位置向所述本体的所述敞开的盖帽通道内进一步移动，直至所述本体的侧面使所述孔封闭，从而使所述盖帽空腔在所述第一阶段位置与所述容器内部并与所述容器外部流体隔离。

18.  如权利要求17所述的盖帽，其中所述有孔的贮器部分可由所述第一阶段位置向所述本体的所述敞开的盖帽通道进一步移动，直至所述孔在所述第二阶段位置向所述容器内部敞开。

19.  如权利要求15所述的盖帽，其进一步包括可拆卸地连接至所述有孔的贮器部分的可拆卸挡块，所述可拆卸挡块使所述有孔的贮器部分相对于所述敞开的盖帽通道定位以防止所述孔在所述第一阶段位置向所述容器内部敞开。

20.  如权利要求15所述的盖帽，其中所述有孔的贮器部分被配置为在所述第一阶段位置和所述第二阶段位置封闭所述容器内部。

21.  如权利要求1所述的盖帽，其进一步包括连接至所述本体侧面的锁定部件，所述锁定部件被配置为将所述本体锁定至所述容器。

22.  如权利要求1所述的盖帽，其中所述本体包括具有第一下壁的基部，所述第一下壁具有第一开口，所述盖帽空腔控制部分包括插入所述基部的插入部分，所述盖帽空腔设置在所述插入部分内，所述插入部分具有第二下壁，所述第二下壁具有第二开口，并且所述插入部分可相对于所述基部旋转调整，从而使所述第一开口和所述第二开口在所述第一阶段位置不重叠以使所述盖帽空腔与所述容器内部流体隔离，并且使所述第一开口和所述第二开口在所述第二阶段位置对准以使所述盖帽空腔与所述容器内部流体连通。

23.  如权利要求22所述的盖帽，其进一步在所述插入部分的顶部包括用于旋转所述插入部分的突出物。

24.  如权利要求1所述的盖帽，其中所述盖帽空腔包含有在所述容器内部完成第一阶段反应之后用于进行第二阶段反应的第二阶段反应物。

25.  如权利要求24所述的容器，其中在所述盖帽空腔中的所述反应物为干燥或冻干的形态。

26.  一种用于容器的盖帽，所述盖帽被配置为与所述容器相配合以封闭容器内部，所述盖帽包括：
a)本体，配置为与所述容器相配合；
b)盖帽空腔；以及
c)控制装置，用于使所述盖帽由第一阶段位置向第二阶段位置转换，其中，在所述第一阶段位置，所述盖帽空腔是封闭的并与所述容器内部是流体隔离的，在所述第二阶段位置，所述盖帽空腔与所述容器内部是流体连通的。

27.  如权利要求26所述的盖帽，其进一步包括用于在所述第一阶段位置和所述第二阶段位置封闭所述容器内部的装置。

28.  如权利要求26所述的盖帽，其中所述本体包括封闭的底部和敞开的顶部，并且其中所述盖帽空腔设置在所述本体内。

29.  如权利要求26所述的盖帽，其中所述控制装置包括钉部，所述钉部可由所述第一阶段位置向所述第二阶段位置移动，从而穿透所述封闭的底部以使所述盖帽空腔和所述容器内部流体连通。

30.  如权利要求26所述的盖帽，其中所述控制装置包括用于使所述盖帽转换至装填位置的装置，其中在所述装填位置所述盖帽空腔是敞开的，从而接纳来自所述容器外部的反应物。

31.  如权利要求26所述的盖帽，其中所述盖帽空腔包含有在所述容器内部完成第一阶段反应之后用于进行第二阶段反应的第二阶段反应物。

32.  如权利要求31所述的容器，其中在所述盖帽空腔内的所述反应物为干燥或冻干的形态。

33.  一种用于在容器内对样品进行反应的多阶段方法，其中所述容器被配置为容纳盖帽以封闭容器内部，所述盖帽包括本体和盖帽空腔，并且所述盖帽在第一阶段位置和第二阶段位置之间是可调整的，其中在所述第一阶段位置所述盖帽空腔与所述容器内部是流体隔离的，在所述第二阶段位置所述盖帽空腔与所述容器内部是流体连通的，所述方法包括以下步骤：
a)在所述容器内部提供与第一阶段反应物混合的样品，以进行第一阶段反应；
b)使所述盖帽与所述容器相配合以封闭所述容器内部；
c)使所述样品与所述第一阶段反应物在所述容器内部进行所述第一阶段反应，其中所述第一阶段反应在所述盖帽处于所述第一阶段位置时进行，在所述第一阶段位置所述盖帽空腔与所述容器内部是流体隔离的；
d)将存放在所述盖帽空腔内的第二阶段反应物添加至所述第一阶段反应的反应产物中，其中通过将所述盖帽移动至所述第二阶段位置来添加所述第二阶段反应物，在所述第二阶段位置所述盖帽空腔与所述容器内部是流体连通的，并且使所述第二阶段反应物与所述第一阶段反应的所述反应产物混合；并且
e)使所述第一阶段反应的所述反应产物和所述第二阶段反应物在所述容器内部进行第二阶段反应。

34.  如权利要求33所述的方法，其中所述本体包括封闭的底部和敞开的顶部，所述盖帽空腔设置在所述本体内，而且所述封闭的底部使所述容器内部封闭并使所述盖帽空腔与所述容器内部在所述第一阶段位置流体隔离。

35.  如权利要求34所述的方法，其中所述盖帽包括钉状帽部分，所述钉状帽部分具有连接至钉部的顶部，并且其中将所述盖帽移动至所述第二阶段位置的步骤包括利用所述钉部穿透所述封闭的底部以使所述盖帽空腔与所述容器内部流体连通。

36.  如权利要求35所述的方法，其中在所述第一阶段位置，将所述钉部设置在所述盖帽空腔内而并不穿透所述封闭的底部，而且钉部顶部部分使所述盖帽空腔封闭。

37.  如权利要求35所述的方法，其中利用所述钉部穿透所述封闭的底部的步骤包括抵靠所述钉状帽部分的所述顶部压迫所述盖帽的驱动帽部分的支撑面。

38.  如权利要求35所述的方法，其中可拆卸挡块在所述第一阶段位置可拆卸地连接至所述钉状帽部分，所述可拆卸挡块使所述钉状帽部分相对于所述盖帽空腔定位以防止所述钉部在所述第一阶段位置穿透所述封闭的底部。

39.  如权利要求38所述的方法，其中将所述可拆卸挡块从所述钉状帽部分除去以允许所述钉部在所述第二阶段位置穿透所述封闭的底部。

40.  如权利要求33所述的方法，其进一步包括在将所述盖帽的所述本体插入所述容器的端口之后将所述第二阶段反应物置入所述盖帽空腔的步骤。

41.  如权利要求40所述的方法，其中所述本体包括敞开的盖帽通道，所述盖帽包括有孔的贮器部分，所述有孔的贮器部分具有带孔的所述盖帽空腔，并且所述孔是敞开的以使所述第二阶段反应物在盖帽空腔装填位置由所述容器外部引入。

42.  如权利要求33所述的方法，其中所述本体包括敞开的盖帽通道，所述盖帽包括有孔的贮器部分，所述有孔的贮器部分具有带孔的所述盖帽空腔，并且所述有孔的贮器部分向所述本体的所述敞开的盖帽通道内移动，直至所述本体的侧面使所述孔封闭，从而使所述盖帽空腔在所述第一阶段位置与所述容器内部并与所述容器的外部流体隔离，所述有孔的贮器部分在所述第一阶段位置使所述容器内部封闭。

43.  如权利要求42所述的方法，其中将所述盖帽移动至所述第二阶段位置的步骤包括由所述第一阶段位置进一步向所述本体的所述敞开的盖帽通道移动所述有孔的贮器部分，直至所述孔在所述第二阶段位置向所述容器内部敞开，所述有孔的贮器部分在所述第二阶段位置封闭所述容器内部。

44.  如权利要求43所述的方法，其中可拆卸挡块在所述第一阶段位置可拆卸地连接至所述有孔的贮器部分，所述可拆卸挡块使所述有孔的贮器部分相对于所述敞开的盖帽通道定位以防止所述孔在所述第一阶段位置向所述容器内部敞开。

45.  如权利要求44所述的方法，其中在将所述盖帽移动至所述第二阶段位置之前，将所述可拆卸挡块从所述有孔的贮器部分除去以允许所述有孔的贮器部分的所述孔在所述第二阶段位置向所述容器内部敞开。

46.  如权利要求33所述的方法，其中所述本体包括具有第一下壁的基部，所述第一下壁具有第一开口，所述盖帽进一步包括插入所述基部的插入部分，所述盖帽空腔设置在所述插入部分内，所述插入部分具有第二下壁，所述第二下壁具有第二开口，并且将所述盖帽移动至所述第二阶段位置的步骤包括相对于所述基部旋转所述插入部分以使所述第一开口和所述第二开口对准，从而使所述盖帽空腔与所述容器内部流体连通。

47.  如权利要求46所述的盖帽，其中所述旋转的步骤包括扭动所述插入部分顶部的突出物。

48.  如权利要求33所述的方法，其中所述第一阶段反应包括第一阶段聚合酶链式反应，并且所述第二阶段反应包括第二阶段聚合酶链式反应。

49.  如权利要求33所述的方法，其中所述第一阶段反应和所述第二阶段反应为嵌套PCR方法的第一阶段反应和第二阶段反应。

50.  如权利要求33所述的方法，其中所述第一阶段反应包括逆转录反应，并且其中所述第二阶段反应包括聚合酶链式反应。

51.  如权利要求33所述的方法，其中在所述盖帽中以干燥或冻干的形态存放所述第二阶段反应物。

52.  如权利要求33所述的方法，其中所述混合的步骤包括使所述容器和所述盖帽旋转或离心运动。

53.  如权利要求33所述的方法，其中所述混合的步骤包括摇动所述容器和所述盖帽。

用于实现多阶段方法的容器的盖帽
相关申请的交叉引用
不适用
背景技术
本申请一般涉及用于在封闭条件下分析样品中一种或多种核酸的存在的系统和方法，具体涉及用于进行该分析的容器的盖帽，特别是核酸扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)。
对于许多研究、医疗和工业应用来说，核酸扩增反应都是至关重要的。这些反应用于临床和生物学研究、传染性疾病的检测和监测、突变的检测、癌症标志物的检测、环境监测、遗传鉴定、生物防御应用中的病原体检测等等，如Schweitzer等人的Current Opinion inBiotechnology，12：21-27(2001)以及Koch的Nature Reviews DrugDiscovery，3：749-761(2004)。特别地，聚合酶链式反应(PCR)已经在所有这些领域中应用，包括应用于病毒和细菌检测、病毒负荷监测、稀有和/或难以培养的病原体的检测、生物恐怖威胁的快速检测、癌症患者中最少量残留疾病的检测、食物病原体试验、血液供给筛选等等，如Mackay的Clin.Microbiol.Infect.，10：190-212(2004)以及Bernard等人的Clinical Chemistry，48：1178-1185(2002)。关于PCR，如此广泛应用的主要原因是由于它的速度和容易使用(典型地使用标准化试剂盒和相对简单且低成本的器具在数小时内进行)、它的灵敏度(经常可以检测到样品中几十个拷贝的靶序列)、以及它的鲁棒性(可以容易地分析低质量样品或保存的样品，例如法医样品或固定的组织样品)，如Strachan和Read所著的《人类分子遗传学2》(HumanMolecular Genetics 2)(John Wiley & Sons，New york，1999)。
尽管如此广泛的应用反映出核酸扩增技术中的进步，但依然需要在速度和灵敏度上的进一步提高，特别是在感染性疾病检测、最少量残留疾病检测、生物防御应用等领域中。
通过在两阶段扩增反应中使用嵌套的成套引物已经得到了PCR的灵敏度的显著提高，例如，Albert等人的J.Clin.Microbiol.，28：1560-1564(1990)。在此方法中，第一扩增反应的扩增子成为用于使用新一套引物的第二扩增反应的样品，所述新一套引物中的至少一个结合到第一扩增子内部的位置。尽管提高了灵敏度，但是该方法遭受增加的试剂操作和增加的引入污染序列的风险，其能够导致假阳性。
通过在封闭环境中进行反应也得到了灵敏度的显著提高和假阳性的减少。高灵敏度扩增技术的缺点是由非靶序列的不当扩增造成的假阳性试验结果的发生，例如，Borst等人的Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.，23：289-299(2004)。非靶序列的存在可能是由于在反应中缺乏特异性，或者由于来自在前反应的污染(即“携带(carry over)”污染)，或者由于来自直接环境的污染，例如水、一次性器械、试剂等等。可以通过在封闭容器中进行扩增来改善这些问题，使得一旦加入样品和试剂并将容器密封，就不再发生对反应物或产物的更多操作。“实时”扩增的出现很大程度上使得所述操作成为可能，该“实时”扩增使用连续报告反应混合物中产物含量的标记。
一些方法，如嵌套PCR包括两个依次进行的步骤。例如，常规的嵌套PCR方法利用两个依序的扩增步骤，包括：使用外引物扩增延伸靶序列的第一轮反应，以及使用内引物将第一轮反应的产物扩增内部序列的第二轮反应。内部序列能够或不能与延伸序列的一端交叠。通过对第一和第二扩增步骤的反应条件的严格控制，增强了嵌套PCR的灵敏度，从而促成了预期产物的产生。但不幸的是，达到由嵌套PCR方法提供的高灵敏度是以潜在的假阳性为代价的，这是由于包含高浓缩第一扩增子的反应管只能被敞开并操作以实现第二扩增，因此造成了污染的可能，这是导致假阳性的主要原因并降低了分析的可靠性。
发明内容
本发明的各实施例提供了用于容器的盖帽和用于分析样品所进行的多阶段反应的方法，如两阶段PCR方法，例如嵌套PCR方法或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。盖帽便于进行多阶段反应，而无需在反应的各阶段之间敞开容器或向外界环境暴露其内容，从而显著降低了污染的风险。
根据一个方面，本发明提供了用于使样品在容器中进行反应的多阶段方法。容器被配置为容纳盖帽以封闭容器内部。盖帽包括本体和盖帽空腔，并且盖帽在第一阶段位置和第二阶段位置之间是可调整的，其中在第一阶段位置盖帽空腔与容器内部是流体隔离的，在第二阶段位置盖帽空腔与容器内部是流体连通的。该方法包括以下步骤：在容器内部提供与第一阶段反应物混合的样品以进行第一阶段反应，使盖帽的本体与容器相配合，并且使样品与第一阶段反应物在容器内部进行第一阶段反应。第一阶段反应在盖帽处于第一阶段位置时进行，在第一阶段位置盖帽空腔与容器内部是流体隔离的。当进行第一阶段反应时，盖帽封闭容器内部。该方法进一步包括以下步骤：将存放在盖帽空腔内的第二阶段反应物添加至第一阶段反应的反应产物中。通过将盖帽移动至第二阶段位置来添加第二阶段反应物，在第二阶段位置盖帽空腔与容器内部是流体连通的，并且使第二阶段反应物与第一阶段反应的反应产物混合。使第一阶段反应的反应产物和第二阶段反应物在容器内部进行第二阶段反应。通过在由第一阶段位置向第二阶段位置转换的过程中利用容器和盖帽保持封闭的系统，降低了污染的危险。
在一些实施例中，本体包括封闭的底部和敞开的顶部，在本体内设置盖帽空腔，而且封闭的底部使容器内部封闭并使盖帽空腔与容器内部在第一阶段位置是流体隔离的。盖帽优选地包括具有连接至钉部的顶部的钉状帽部分，并且将盖帽移动至第二阶段位置的步骤优选地包括利用钉部穿透封闭的底部以使盖帽空腔与容器内部流体连通。在第一阶段位置，将钉部优选地设置在盖帽空腔内并不穿透封闭的底部，而且钉部顶部部分使盖帽空腔封闭。在一些实施例中，利用钉部穿透封闭的底部的步骤包括抵靠钉状帽部分的顶部压迫盖帽的驱动帽部分的支撑面。在一些实施例中，可拆卸挡块在第一阶段位置可拆卸地连接至钉状帽部分，可拆卸挡块使钉状帽部分相对于盖帽空腔定位以防止钉部在第一阶段位置穿透封闭的底部。将可拆卸挡块从钉状帽部分除去以允许钉部在第二阶段位置穿透封闭的底部。
在一些实施例中，本体包括敞开的盖帽通道，盖帽包括具有带孔的盖帽空腔的有孔的贮器部分，并且孔是敞开的以使第二阶段反应物在盖帽空腔装填位置由容器外部引入。在一些实施例中，有孔的贮器部分向本体的敞开的盖帽通道内移动，直至本体的侧面使孔封闭，从而使盖帽空腔在第一阶段位置与容器内部并与容器外部流体隔离，有孔的贮器部分在第一阶段位置使容器内部封闭。在一些实施例中，将盖帽移动至第二阶段位置的步骤包括由第一阶段位置进一步向本体的敞开的盖帽通道移动有孔的贮器部分，直至孔在第二阶段位置向容器内部敞开，有孔的贮器部分在第二阶段位置封闭容器内部。在一些实施例中，可拆卸挡块在第一阶段位置可拆卸地连接至有孔的贮器部分，可拆卸挡块使有孔的贮器部分相对于敞开的盖帽通道定位以防止孔在第一阶段位置向容器内部敞开。在将盖帽移动至第二阶段位置之前，将可拆卸挡块从有孔的贮器部分除去以允许有孔的贮器部分的孔在第二阶段位置向容器内部敞开。
在一些实施例中，本体包括具有第一下壁的基部，第一下壁具有第一开口，盖帽进一步包括插入基部的插入部分，在插入部分内设置盖帽空腔，插入部分具有第二下壁，第二下壁具有第二开口，并且将盖帽移动至第二阶段位置的步骤包括相对于基部旋转插入部分以使第一开口和第二开口对准，从而使盖帽空腔与容器内部流体连通。旋转的步骤优选地包括扭动插入部分顶部的突出物。
根据另一个方面，本发明提供了用于容器的盖帽。盖帽被配置为与容器相配合以封闭容器内部。盖帽包括配置为与容器相配合的本体，盖帽空腔，以及盖帽空腔控制部分，其在第一阶段位置和第二阶段位置之间相对于本体是可调整的，其中，在第一阶段位置，盖帽空腔与容器内部是流体隔离的，在第二阶段位置，盖帽空腔与容器内部是流体连通的。
在一些实施例中，在本体中设置盖帽空腔，本体具有封闭的底部和敞开的顶部，并且在第一阶段位置封闭的底部使盖帽空腔与容器内部流体隔离。盖帽空腔控制部分包括具有与钉部相连接的顶部的钉状帽部分，并且钉状帽部分优选地被配置为：在第一阶段位置将钉部设置在盖帽空腔内并不穿透封闭的底部，而且顶部使盖帽空腔封闭。在一些实施例中，盖帽进一步包括由本体向上延伸的上壁，并且在第一阶段位置钉状帽部分的顶部与上壁的顶部边缘基本对齐。在第一阶段位置上壁优选地部分围绕钉状帽部分，并且上壁包括敞开的区域，在敞开的区域上壁不围绕钉状帽部分。
在一些实施例中，盖帽进一步包括在敞开的区域、在钉状帽部分和本体之间连接的钉状帽臂，如柔性的带子。盖帽优选地进一步包括具有支撑面的驱动帽部分，支撑面被抵靠钉状帽部分的顶部按压，从而使钉状帽部分由第一阶段位置移动至第二阶段位置，钉部被配置为在第二阶段位置穿透封闭的底部从而使盖帽空腔与容器内部流体连通。在一些实施例中，盖帽进一步包括在驱动帽部分和上壁之间连接的驱动帽臂，如柔性的带子。在一些实施例中，盖帽进一步包括在钉状帽部分和本体之间连接的钉状帽臂，其中钉状帽臂与驱动帽臂大致彼此相对设置。
在一些实施例中，盖帽进一步包括可拆卸地连接至钉状帽部分的可拆卸挡块，可拆卸挡块使钉状帽部分相对于盖帽空腔定位以防止钉部在第一阶段位置穿透封闭的底部。将可拆卸挡块从钉状帽部分除去以允许钉部在第二阶段位置穿透封闭的底部。在一些实施例中，盖帽空腔控制部分相对于本体可进一步调整从而使盖帽空腔处于装填位置，在装填位置盖帽空腔是敞开的，从而接纳来自容器外部的反应物。在一些实施例中，盖帽进一步包括连接至本体侧面的锁定部件，锁定部件被配置为将本体锁定至容器。在一些实施例中，盖帽空腔包含在容器内部完成第一阶段反应之后用于进行第二阶段反应的第二阶段反应物(例如处于干燥或冻干的形态)。
在一些实施例中，本体包括敞开的盖帽通道，并且盖帽空腔控制部分包括具有带孔的盖帽空腔的有孔的贮器部分。有孔的贮器部分部分地插入本体的敞开的盖帽通道，并使孔敞开以使反应物在盖帽空腔装填位置由容器外部引入。有孔的贮器部分可由盖帽空腔装填位置向本体的敞开的盖帽通道内进一步移动，直至本体的侧面使孔封闭，从而使盖帽空腔在第一阶段位置与容器内部并与容器外部流体隔离。有孔的贮器部分可由第一阶段位置向本体的敞开的盖帽通道进一步移动，直至孔在第二阶段位置向容器内部敞开。在一些实施例中，可拆卸挡块可拆卸地连接至有孔的贮器部分，可拆卸挡块使有孔的贮器部分相对于敞开的盖帽通道定位以防止孔在第一阶段位置向容器内部敞开。有孔的贮器部分优选地被配置为在第一阶段位置和第二阶段位置封闭容器内部。
在一些实施例中，本体包括具有第一下壁的基部，第一下壁具有第一开口，盖帽空腔控制部分包括插入基部的插入部分，在插入部分内设置盖帽空腔，插入部分具有第二下壁，第二下壁具有第二开口，并且插入部分可相对于基部旋转调整，从而使第一开口和第二开口在第一阶段位置不重叠以使盖帽空腔与容器内部流体隔离，并且使第一开口和第二开口在第二阶段位置对准以使盖帽空腔与容器内部流体连通。在一些实施例中，盖帽进一步在插入部分的顶部包括用于旋转插入部分的突出物。
根据另一个方面，本发明提供了用于容器的盖帽。盖帽被配置为与容器相配合以封闭容器内部。盖帽包括配置为与容器相配合的本体，盖帽空腔，以及用于使盖帽由第一阶段位置向第二阶段位置转换的控制装置，其中，在第一阶段位置，盖帽空腔是封闭的并与容器内部是流体隔离的，在第二阶段位置，盖帽空腔与容器内部是流体连通的。盖帽优选地进一步包括用于在第一阶段位置和第二阶段位置封闭容器内部的装置。
在一些实施例中，本体包括封闭的底部和敞开的顶部，并且在本体内设置盖帽空腔。控制装置优选地包括可由第一阶段位置向第二阶段位置移动的钉部，从而穿透封闭的底部以使盖帽空腔和容器内部流体连通。盖帽还优选地可转换至装填位置，其中在装填位置盖帽空腔是敞开的，从而接纳来自容器外部的反应物。在一些实施例中，盖帽空腔包含在容器内部完成第一阶段反应之后用于进行第二阶段反应的第二阶段反应物(例如处于干燥或冻干的形态)。
在一些实施例中，本体包括敞开的盖帽通道，并且控制装置包括具有带孔的盖帽空腔的有孔的贮器部分。有孔的贮器部分可向本体的敞开的盖帽通道内移动，直至本体的侧面使孔封闭，从而使盖帽空腔在第一阶段位置与容器内部并与容器外部流体隔离。有孔的贮器部分可由第一阶段位置向本体的敞开的盖帽通道进一步移动，直至孔在第二阶段位置向容器内部敞开。在一些实施例中，可拆卸挡块可拆卸地连接至有孔的贮器部分，可拆卸挡块使有孔的贮器部分相对于敞开的盖帽通道定位以防止孔在第一阶段位置向容器内部敞开。有孔的贮器部分优选地被配置为在第一阶段位置和第二阶段位置封闭容器内部。
在一些实施例中，本体包括具有第一下壁的基部，第一下壁具有第一开口，控制装置包括插入基部的插入部分，在插入部分内设置盖帽空腔，插入部分具有第二下壁，第二下壁具有第二开口，并且插入部分可相对于基部旋转调整，从而使第一开口和第二开口在第一阶段位置不重叠以使盖帽空腔与容器内部流体隔离，并且使第一开口和第二开口在第二阶段位置对准以使盖帽空腔与容器内部流体连通。在一些实施例中，盖帽进一步在插入部分的顶部包括用于旋转插入部分的突出物。
本发明对于进行系统封闭的多阶段核酸扩增反应是非常有用的，如在2004年10月27日提交的、题目为“系统封闭的多阶段核酸扩增反应(Closed-System Multi-Stage Nucleic Acid Amplification Reactions)”的、申请号为60/622,393的、共同转让的、共同未决的美国专利中所描述的反应，在此以引用的方式引入该专利的全部公开内容。
如本文中所用，“聚合酶链式反应”或“PCR”指用于体外扩增特定DNA序列的反应，该反应通过DNA互补链的同时引物延伸来进行。换句话说，PCR是产生靶多核苷酸的在侧翼具有引物结合位点的多个拷贝或复制物的反应，所述反应包括以下步骤的一次或多次重复：(i)变性靶核酸，(ii)将引物退火至引物结合位点，和(iii)在三磷酸核苷存在下，通过核酸聚合酶延伸引物。通常，反应在温度循环仪器中在为每一步骤优化的不同温度间循环。具体温度、每一步骤的持续时间以及步骤间转变的速度依赖于本领域技术人员公知的许多因素，例如，参考文献所列举的：McPherson等人编写的《PCR：实践方法》(PCR：A Practical Approach)和《PCR2：实践方法》(PCR2：A PracticalApproach)(IRL Press，Oxford，分别在1991年和1995年出版)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，可以在>90℃下使双链靶核酸变性，在50-75℃范围内的温度下使引物退火，并且在72-78℃范围内的温度下延伸引物。术语“PCR”包括反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR等等。反应体积从数百纳升，例如200nL，至数百微升，例如200μL。“逆转录PCR”或“RT-PCR”指先进行将靶RNA转换成互补的单链DNA的逆转录反应，然后再扩增该DNA的PCR，例如，Tecott等人的第5,168,038号美国专利，通过引用将该专利包括于此。“实时PCR”指随着反应进行其反应产物的含量被监测的PCR，所述反应产物即扩增子。存在许多形式的实时PCR，它们的主要区别在于用来监测反应产物的检测化学，例如，Gelfand等人的第5,210,015号美国专利(“taqman”)；Wittwer等人的第6,174,670号和第6,569,627号(插入染料)美国专利；Tyagi等人的第5,925,517号美国专利(分子灯塔)；通过引用将所述专利包括于此。用于实时PCR的检测化学被综述在Mackay等人的Nucleic Acids Research，30：1292-1305(2002)中，也通过引用将其包括于此。“嵌套PCR”指两阶段PCR，其中第一PCR的扩增子成为使用新一套引物的第二PCR的样品，新一套引物中的至少一个结合到第一扩增子的内部位置。用在本文中时，关于嵌套扩增反应“初始引物”指用于产生第一扩增子的引物，并且“次级引物”指用于产生第二或嵌套扩增子的一种或多种引物。“多重PCR”指在同一反应混合物中多种靶序列(或单一靶序列和一种或多种参照序列)同时进行的PCR，例如，Bernard等人的Anal.Biochem.，273：221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，对每一扩增序列使用不同的成套引物。典型地，多重PCR中靶序列数目在2至10的范围内，或者2至6，或者更典型地，2至4。“定量PCR”指设计用来测量样品或标本中一种或多种特定靶序列丰度的PCR。定量PCR包括所述靶序列的绝对定量和相对定量。使用可以单独地或与靶序列一起测定的一种或多种参照序列进行定量测量。参照序列对于样品或标本可以是内源或外源的，并且在后一种情况中，可以包含一种或多种竞争模板。典型的内源参照序列包括以下基因的转录物的区段：β-肌动蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖体RNA等等。定量PCR技术为本领域普通技术人员所公知，如以下通过引用包括于本文的参考文献中所举例的：Freeman等人的Biotechniques，26：112-126(1999)；Becker-Andre等人的NucleicAcids Research，17：9437-9447(1989)；Zimmerman等人的Biotechniques，21：268-279(1996)；Diviacco等人的Gene，122：3013-3020(1992)；Becker-Andre等人的Nucleic Acids Research，17：9437-9446(1989)等等。
附图说明
图1为根据本发明的一个实施例的具有钉状帽部分和驱动帽部分的盖帽处于开放位置的顶部立体图；
图2为图1所示盖帽的底部立体图；
图3为图1所示盖帽的剖视图；
图4为图1所示盖帽在第一阶段位置的剖视图；
图5为图1所示盖帽在第二阶段位置的剖视图；
图6为容器的立体图，示出了在放置盖帽之前向容器内部引入第一流体反应物；
图7为由图1所示的盖帽封闭的容器的立体图，示出了向盖帽的盖帽空腔内引入第二流体反应物；
图8为由图1所示的盖帽封闭的容器的立体图，示出了在第一阶段位置由盖帽的钉状帽部分关闭盖帽空腔；
图9为由图1所示的盖帽封闭的容器的立体图，示出了在第二阶段位置通过关闭驱动帽部分将第二流体反应物由盖帽空腔输送至容器内部；
图10为在图8所示的第一阶段位置由盖帽封闭的容器的剖视图；
图11为在图9所示的第二阶段位置由盖帽封闭的容器的剖视图；
图12为根据本发明的另一个实施例的具有钉状帽部分和可拆卸挡块的盖帽处于开放位置的顶部立体图；
图13为图12所示盖帽的剖视图；
图14为由图12所示的盖帽封闭的容器的立体图，示出了向盖帽的盖帽空腔内引入第二流体反应物；
图15为由图12所示的盖帽封闭的容器的立体图，示出了由盖帽的钉状帽部分关闭盖帽空腔，所述钉状帽部分由可拆卸挡块支撑在第一阶段位置；
图16为由图12所示的盖帽封闭的容器的立体图，示出了通过除去可拆卸挡块并将钉状帽部分推至第二阶段位置，将第二流体反应物由盖帽空腔输送至容器内部；
图17为在图15所示的第一阶段位置由盖帽封闭的容器的剖视图；
图18为在图16所示的第二阶段位置由盖帽封闭的容器的剖视图；
图19为根据本发明的另一个实施例的具有有孔的贮器(pocket)的盖帽处于开放位置的剖视图；
图20为由图19所示的盖帽封闭的容器的剖视图，示出了在装填贮器的位置向有孔的贮器内引入第二流体反应物；
图21为由图19所示的盖帽封闭的容器的剖视图，示出了当由可拆卸挡块支撑时在第一阶段位置关闭的有孔的贮器；
图22为由图19所示的盖帽封闭的容器的剖视图，示出了通过除去可拆卸挡块并将有孔的贮器部分推至第二阶段位置，将第二流体反应物由有孔的贮器输送至容器内部；
图23为根据本发明的另一个实施例的用于容器的盖帽的分解立体图；
图24为图23所示盖帽和容器的分解正视图。
具体实施方式
图1至图5示出了根据本发明第一实施例的盖帽10。由于盖帽10为核酸分析装置带来的功能和特性，其可被称为助推帽。盖帽10包括具有封闭的底部14的本体12，从而形成作为盖帽空腔16的本体空腔。盖帽空腔16为用于容纳反应物的容器。该反应物可为液态(如水溶液)，或干燥的或冻干的形态(如冻干的珠形形态)。在本体12的侧面设置有锁定部件18，锁定部件18可为由本体12的侧面向外分隔开的钩形或其他形状。钉状帽部分20通过钉状帽臂22与本体12相连接。钉状帽部分20包括封闭的顶部24和具有锐利的末端的钉部26。钉状帽臂22为柔性带，其可使钉状帽部分20在图1所示的开放位置和图4与图5所示的位置之间运动。驱动帽部分30通过驱动帽臂32与本体12相连接，驱动帽部分30包括支撑面34。驱动帽臂32为柔性带，其可使驱动帽部分30在图1所示的开放位置和图5所示的第二阶段位置之间运动。钉状帽臂22和驱动帽臂32可通过任何适当的方式连接在本体12上。在示出的结构中，钉状帽臂22连接至本体12的上端，而驱动帽臂32连接至由本体12的上端向上延伸的上壁36。在钉状帽臂22与本体12相连接的区域，理想的上壁36是敞开的。驱动帽臂32与钉状帽臂22大致相对设置，但在另外实施例中，所述臂可以具有其他的方向。
图6至图9示出了用于在封闭条件下分析样品中一种或多种核酸存在的多阶段反应的盖帽10的使用方法，特别是核酸扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)，其包括嵌套PCR、RT-PCR等。通常，本发明的盖帽可被配置为用于任何种类的、具有容器内部(如反应室)并且具有用于向容器内部添加样品和反应物的开口(如端口)的容器。适于本发明的方法和盖帽的多种反应容器是本领域公知的和/或市场上可买到的(如试管、反应管、滤筒、玻璃毛细管、塑料容器等)。在具体阐述的各实施例中，容器50为共同所有的第6,369,893号美国专利“多道光学探测系统”中公开的反应容器，其内容通过引用合并于此。应该理解，本领域所公知的和/或市场上可买到的许多其他类型的反应容器也适于本发明的盖帽和方法，并且本发明的范围并不限于所示出的具体容器。盖帽被配置为与容器相配合以封住容器内部，从而在多阶段反应的过程中，使容器内部相对于容器的外部环境保持封闭。在优选实施例中，盖帽10具有成形为待插入容器开口的本体。然而，应该理解，本发明的盖帽和方法并不局限于该优选实施例。通过许多其他方法可使盖帽与容器相配合以封住容器内部，这些方法包括如下实施例(但不限于这些实施例)：盖帽可被旋在容器上或容器内。盖帽可被压配在容器内、容器上或容器外。盖帽可被扣在容器上、容器内或嵌入容器。盖帽可被贴在、粘在、熔在容器上或熔在容器内。
如图6所示，容器50具有通向其内部的开口或端口52，以及与盖帽10的锁定部件18啮合的凸缘或鳍状物54。将在多阶段反应中分析的样品由管筒58或注射器、吸液管等装置通过端口52引入容器内部。在置入容器内部之前，可先将样品与第一阶段反应物混合从而进行多阶段反应中的第一阶段，或者样品也可在容器内部与第一阶段反应物混合。例如，可将第一阶段反应物以流体形态、干燥的或冻干的形态储存在容器内部，从而只需将样品添加至容器内部的反应物中并混合。在任一种情况下，第一阶段反应物均应该是足够用于与样品进行预期的第一阶段反应的。例如，如果多阶段反应是嵌套PCR，则第一阶段反应物包括进行第一PCR所必需的酶和引物。作为另一例，如果预期的多阶段反应是RT-PCR，则第一阶段反应物应足够进行逆转录。然后用盖帽10封闭端口52从而在容器内部提供封闭的系统，如图7所示。盖帽10的锁定部件18优选地与容器50的鳍状物54啮合从而将盖帽10锁定在容器50上。这可以通过以下步骤完成，即，推动盖帽10以使其与容器50的端口52相配合，并且使锁定部件18与鳍状物54处于相偏移的位置(如90°的偏移量)，然后旋转盖帽10直至锁定部件18与鳍状物54相互啮合。可选择地，将塞子(stopper)置于盖帽空腔16内，并且在盖帽10与容器10连接后移除塞子以露出盖帽空腔16。如图7所示，用于进行多阶段反应中第二阶段的第二阶段反应物由容器50的外部引入盖帽10的、处于装填位置的盖帽空腔16中。在可选的实施例中，在加工时已在盖帽空腔16中置入第二阶段反应物，由于第二阶段反应物已预装，从而使最终使用者可跳过将其装填入盖帽空腔16的步骤。在任一种情况下，第二阶段反应物均应该是足够用于与第一阶段反应的反应产物进行预期的第二阶段反应的。例如，如果多阶段反应是嵌套PCR，则第二阶段反应物包括扩增嵌套核酸序列所必需的酶和引物。作为另一例，如果预期的多阶段反应是RT-PCR，则第二阶段反应物应足够进行在第一阶段的逆转录反应中产生的DNA的PCR扩增。第二阶段反应物可为流体形态、干燥或冻干的形态。如果反应物是干燥或冻干的形态，最终使用者可向盖帽空腔16添加缓冲剂(如，水)以重新构成反应物。如图8所示，钉状帽部分20的钉部26被推入盖帽空腔16内，从而在第一阶段的位置封闭盖帽空腔16。在第一阶段的位置，钉状帽部分20的顶部24与上壁36的上缘大致对齐。上壁36部分地环绕钉状帽部分20，理想情况下环绕部分超过半个圆周(即，大于180°)。上壁36所具有的高度，使得钉状帽部分20的顶部24处于使钉部26不穿透封闭的底部14的位置。
如图9所示，驱动帽部分30的支撑面34与钉状帽部分20的封闭的顶部24相接触，从而推动钉部26穿过封闭的底部14进入容器内部，并在第二阶段位置将第二流体反应物引入容器内部。驱动帽部分30所具有的高度将使得钉状帽部分26移至第二阶段位置以穿透封闭的底部14。上壁36的优点在于不妨碍钉状帽部分20和钉状帽臂22向下移动，因为在面向钉状帽臂22的区域，上壁是敞开的。钉状帽部分20可在图7所示的盖帽空腔装填位置、图8所示的第一阶段位置和图9所示的第二阶段位置之间相对于本体12移动。
图10为在图8所示的第一阶段位置由盖帽10封闭的容器50的剖视图。其中钉状帽部分20的钉部26位于盖帽空腔16内，封闭的底部14使盖帽空腔16与容器内部60是流体隔离的。在第一阶段位置，容器50可用于进行第一反应物与样品间的第一阶段反应，如在封闭的容器内部60中的第一阶段PCR反应或逆转录(RT)反应。在容器中用于控制所需反应温度的温度控制系统或热循环器是本领域公知的。
图11为在图9所示的第二阶段位置由盖帽10封闭的容器50的剖视图。钉部26的锐利的末端穿破或撕破本体12的封闭的底部14并进入容器内部60。这样使得在第二阶段位置将第二阶段反应物释放入容器内部60。容器50典型地置于旋转器或离心机装置内以使第二阶段反应物和第一阶段反应的反应产物在容器内部60混合。所以通过将容器50连接至温度控制系统(如，热循环器)，容器50可用于进行第二反应，如在封闭的容器内部60内的第二阶段PCR反应。在由第一阶段位置向第二阶段位置转换的过程中，容器内部60保持为封闭的系统，从而不会产生污染的问题。
如图12和13所示的另一个实施例中，盖帽110包括具有封闭底部114和作为盖帽空腔116的本体空腔的本体112。本实施例并没有示出锁定部件，但也可设置锁定部件。钉状帽部分120通过钉状帽臂122与本体112相连。钉状帽部分120包括封闭的顶部124和具有锐利末端的钉部126。钉状帽臂122为柔性带，其可使钉状帽部分120在图14所示的开放位置和图15与图16所示的位置之间运动。钉状帽臂122可通过任何适当的方式连接在本体112上。在示出的结构中，钉状帽臂122连接至本体112的上端。可拆卸的挡块或夹子130包括连接部分132和制动部分134。连接部分132可释放地连接至钉状帽部分120。在示出的实施例中，连接部分132为夹子，但在其他实施例中也可采用其他可释放的连接部件。
图14至图16示出了用于在封闭条件下分析样品中一种或多种核酸存在的两阶段方法的盖帽110的使用方法。再次提及图6中的容器50，将在多阶段反应中分析的样品由管筒58或注射器、吸液管等装置通过端口52引入容器内部。在样品被置入容器内部60之前，可先将样品与第一阶段反应物混合从而进行多阶段反应中的第一阶段，或者样品也可在容器内部60与第一阶段反应物混合。然后用盖帽110封闭端口52从而在容器内部60提供封闭的系统，如图14所示。在这个盖帽空腔装填位置，第二阶段反应物由容器50的外部引入盖帽空腔116。如图15所示，钉状帽部分120的钉部126被推入盖帽空腔116内，从而在第一阶段位置封闭盖帽空腔116。可拆卸挡块130使钉状帽部分120的封闭的顶部124与盖帽110的本体112隔开，从而阻止钉状帽部分120穿透封闭的底部114。采用可拆卸挡块130是将钉状帽部分120放置到第一阶段位置的方便并且安全的方法。如果使用者不使用可拆卸挡块130也可在第一阶段位置放置钉状帽部分120并避免穿透封闭的底部114，则可省去可拆卸挡块130。如图16所示，将可拆卸挡块130从钉状帽部分120上除去，并且钉状帽部分120从第一阶段位置至第二阶段位置进一步向容器内部60移动。在第二阶段位置，钉部126被推动穿过封闭的底部114进入容器内部60，并向容器内部60释放第二阶段反应物。钉状帽部分120可在图14所示的盖帽空腔装填位置、图15所示的第一阶段位置和图16所示的第二阶段位置之间相对于本体112移动。
图17为在图15所示的第一阶段位置由盖帽110封闭的容器50的剖视图。其中钉状帽部分120的钉部126位于盖帽空腔116内，封闭的底部114使盖帽空腔116与容器内部60是流体隔离的。在第一阶段位置，通过将容器50连接至温度控制系统，容器50可用于进行第一流体反应物与样品间的第一反应，如在封闭的容器内部60中的第一阶段PCR反应。
图18为在图16所示的第二阶段位置由盖帽110封闭的容器50的剖视图。钉部126的锐利的末端穿破或撕破本体112的封闭的底部114并进入容器内部60。这样便在第二阶段位置将第二阶段反应物释放入容器内部60。容器50典型地置于旋转器或离心机装置内以使第二阶段反应物和第一阶段反应的反应产物在容器内部60混合。所以通过将容器50连接至温度控制系统(如，热循环器)，容器50可用于进行第二阶段反应，如在封闭的容器内部60内的第二阶段PCR反应。在由第一阶段位置向第二阶段位置转换的过程中，容器内部60保持为封闭的系统。
在图19所示的另一个实施例中，盖帽210包括具有敞开的盖帽通道216的本体212。本实施例并没有示出锁定部件，但也可设置锁定部件。有孔的贮器部分220通过贮器臂222与本体212连接。有孔的贮器部分220包括封闭的顶部224和有孔的贮器226，贮器226在其允许流体流入和流出的侧面具有孔228。在本实施例中，有孔的贮器226将作为盖帽空腔。贮器臂222为柔性带，其可使有孔的贮器部分220在图19所示的开放位置和图20至图22所示的位置之间运动。贮器臂222可通过任何适当的方式连接在本体212上。在示出的结构中，贮器臂222连接至本体212的上端。类似于如图12所示的可拆卸挡块130的可拆卸挡块或夹子230包括连接部分232和制动部分234。连接部分232可释放地连接至有孔的贮器部分220。
图20至图22示出了用于在封闭条件下分析样品中一种或多种核酸存在的两阶段方法的盖帽210的使用方法。再次提及图6中的容器50，将在多阶段反应中分析的样品由管筒58或注射器、吸液管等装置通过端口52引入容器内部。在样品被置入容器内部之前，可先将样品与第一阶段反应物混合从而进行多阶段反应中的第一阶段，或者样品也可在容器内部与第一阶段反应物混合。然后用盖帽210封闭端口52从而在容器内部60提供封闭的系统，如图20所示。在图20所示的贮器或盖帽空腔的装填位置，孔228是外露的，所以第二阶段反应物可由容器50的外部引入至贮器226内。作为盖帽空腔，贮器226在孔228以下具有一定深度，从而可存放第二阶段反应物而使它们不会从孔228溢出。
如图21所示，有孔的贮器部分220被进一步推入盖帽通道216中。盖帽通道216的侧面使孔228封闭，所以贮器226在第一阶段位置对于外界和容器内部60均为流体隔离的。可拆卸挡块230使有孔的贮器部分220的封闭的顶部224与盖帽210的本体212隔开，从而阻止有孔的贮器部分220向容器内部60移动过多。如果使用者不使用可拆卸挡块130也可在第一阶段位置放置有孔的贮器部分220并避免向容器空腔60移动过多，则可省去可拆卸挡块230。
如图22所示，将可拆卸挡块230从有孔的贮器部分220上除去，并且有孔的贮器部分220从第一阶段位置至第二阶段位置进一步向容器内部60移动。在第二阶段位置，孔228不再被盖帽通道216的侧面封闭，而且由于孔228与容器内部60的侧面是分隔开的，所以孔228对于容器内部60是敞开的。这将使第二阶段反应物被引入至容器内部60。在图21所示的第一阶段位置，容器50可用于进行在第一流体反应物和样品间的第一反应，如在封闭的容器内部60中的第一阶段PCR反应。在第二阶段位置，容器50可置入离心机装置内以使第二阶段反应物和第一阶段反应的反应产物在容器内部60混合，然后利用容器50进行第二反应，如在封闭的容器内部60的第二阶段PCR反应。有孔的贮器部分220可在图20所示的盖帽空腔装填位置、图21所示的第一阶段位置和图22所示的第二阶段位置之间相对于本体212移动。在由第一阶段位置向第二阶段位置转换的过程中，容器内部60保持为封闭的系统。
图23和图24示出了本发明的另一个实施例。盖帽310具有包括柱状基部312A和配置为插入基部312A的插入部分312B(在图23和图24中由基部312A分解示出)的本体。基部312A被配置为插入容器50的端口52。基部具有下壁314A，下壁314A具有第一开口318A。同样，插入部分312B具有下壁314B，下壁314B具有第二开口318B。在插入部分312B内设置有盖帽空腔316。当插入部分312B插入基部312A时，插入部分312B相对于基部312A是可旋转调整位置的，从而控制盖帽空腔316与容器内部60是否流体隔离(第一阶段位置)或流体连通(第二阶段位置)。优选地，在插入部分312B的顶部设置有用于旋转或扭动插入部分312B的突出物324。通过扭动插入部分312B可实现对盖帽空腔的控制，从而使开口318A和318B在第一阶段位置没有对准或交叠，由此下壁314A和314B共同为盖帽310形成了封闭的底部。为了将盖帽310移动至第二阶段位置，旋转插入部分312B直至开口318A和318B至少部分对准，从而在盖帽310的底部形成孔，并且使盖帽空腔316与容器内部60是流体连通的。
盖帽310被用于进行在封闭条件下分析样品中一种或多种核酸存在的两阶段方法。将在多阶段反应中分析的样品由管筒或注射器、吸液管等装置通过端口52引入容器内部60。在样品被置入容器内部60之前，可先将样品与第一阶段反应物混合从而进行多阶段反应中的第一阶段，或者样品也可在容器内部60与第一阶段反应物混合。插入部分312B插入基部312A并旋转至装填反应物的位置，在该位置开口318A和318B对准。通过开口318A和318B，在盖帽空腔316中放置用于进行第二阶段反应的第二阶段反应物。然后扭动插入部分312B直至开口318A和318B不再对准并没有交叠，从而使下壁314A和314B共同为盖帽310形成了临时封闭的底部。盖帽310的基部312A插入容器50的端口52以使容器内部60封闭。在此第一阶段位置，开口318A和318B没有对准并且盖帽空腔316与容器内部60是流体隔离的，在容器内部60内发生第一阶段反应，如嵌套PCR的第一阶段或为RT-PCR的第一阶段的逆转录反应。
在发生第一阶段反应后，将盖帽310移动至第二阶段位置，在第二阶段位置，通过扭动插入部分312B直至开口318A和318B对准，使盖帽空腔与容器内部60是流体连通的。这样便在第二阶段位置将第二阶段反应物释放入容器内部60。容器50典型地置于旋转器或离心机装置内以使第二阶段反应物和第一阶段反应的反应产物在容器内部60混合。通过将容器50连接至温度控制系统(如，热循环器)，容器50可用于进行第二阶段反应，如在封闭的容器内部60内的第二阶段PCR反应。在由第一阶段位置向第二阶段位置转换的过程中，容器内部60对外界环境保持封闭，所以没有污染。
上面所描述的盖帽可由任何适当的材料利用任何适当的方法制成。在一个实施例中，利用喷射模塑法等将塑料材料模制成盖帽。对于使用了可拆卸挡块的结构，可拆卸挡块是单独成形的，如由塑料材料模制。
应当理解，以上描述只是为了对本发明加以说明，而不是对本发明进行限制。参照以上描述，本领域技术人员可实现很多实施例。例如，在一个可供选择的实施例中，在第一阶段反应完成后，再向盖帽空腔内添加第二阶段反应物。因此，第二阶段反应物不受第一阶段反应所需的温度的影响。以上实施例和许多其他实施例都是可以实现的。因此，不应依据以上的描述确定本发明的范围，而应根据权利要求和其所涵盖的全部范围来确定本发明的范围。