TrkB 抗体用于治疗呼吸病症的用途 发明背景
酪氨酸激酶受体 B(TrkB) 属于单跨膜受体酪氨酸激酶家族， 该家族还包括 TrkA 和 TrkC。 这些酪氨酸激酶受体 (trks) 介导神经营养蛋白的活性。 神经营养蛋白是神经元的存 活和发育所必需的， 其通过调节神经元结构和突触可塑性来调控突触传递。神经营养蛋白 包括但不限于 ： 神经生长因子 (NGF)、 脑衍生神经营养因子 (BDNF)、 神经营养蛋白 -3(NT-3) 和神经营养蛋白 -4/5(NT-4/5)(Lo， KY et al.， (2005)J.Biol.Chem.， 280 ： 41744-52)。
TrkB 是 BDNF 的高亲和性受体 (Minichiello， et al.， Neuron 21 ： 335-45(1998))， 其在脑中， 特别是新皮层、 海马、 纹状体和脑干中高水平表达 ； 还在肌肉组织中发现了同 种型。神经营养蛋白与 trk 结合， 活化受体， 使得受体细胞内结构域上的特定酪氨酸残 基 二 聚 化 并 且 自 磷 酸 化 (Jing， etal.， (1992)Neuron 9 ： 1067-1079 ； Barbacid， (1994) J.Neurobiol.25 ： 1386-1403 ； Bothwell， (1995)Ann.Rev.Neurosci.18 ： 223-253 ； Segal andGreenberg， (1996)Ann.Rev.Neurosci.19 ： 463-489 ； Kaplan and Miller， (2000)Curr. Opinion Neurobiol.10 ： 381-391)。这些磷酸酪氨酸残基作为细胞内信号级联元件的停靠 点发挥作用， 导致对神经元死亡的抑制 (suppression)、 对神经突 (neurite) 长出的促进作 用以及神经营养蛋白的其它作用。例如， Shc、 FRS-2、 SH2B、 rAPS 和 PLCγ 通过磷酸化的酪 氨酸残基与 TrkB 发生相互作用。这些衔接分子与活化的 TrkB 的联结导致信号途径 ( 包括 有丝分裂原活化的蛋白激酶、 磷脂酰肌醇 3- 激酶和 PLCγ 途径 ) 的启动， 由此介导神经营 养蛋白的作用 (Lo， KY et al.， (2005)J.Biol.Chem.， 280 ： 41744-52)。
雷 特 综 合 征 (RTT) 最 初 由 Dr.Andreas Rett 于 1966 年 鉴 定 出 来， 其是来自 晚期神经发育缺陷的破坏性的 CNS 病症。其几乎仅仅影响所有种族的女童， 发病率为 1/10,000-15,000 出生人口。一些患有 RTT 的个体在童年时死亡， 但是， 很多可以活到成年 阶段并高度残障。高达 25％的患者死于心脏 // 呼吸衰竭。迄今为止对该疾病没有有效治 疗。
表观正常发育期之后， 受到影响的女童在 6 至 18 个月期间发展出 RTT 症状， 症 状在未来数年来不断恶化。症状包括 ： 出生时正常头围之后头部生长减速 ； 获得性语言能 力丧失 ； 交流障碍 ； 认知受损 ； 有目的的手部技能被刻板的手部运动代替 ( 扭曲绞手、 洗手 (hand washing)、 拍手 (clapping)、 轻拍 (patting) 等 ) ； 受损或变差的运动能力 ( 步态共 济失调 (gait ataxia)、 缺乏柔性 (stiffness) 等 ) ； 清醒时呼吸困难 ； 从婴儿期早期开始受 损的睡眠模式 ； 异常肌肉紧张伴肌肉消瘦和肌张力失常 ； 外周血管舒缩障碍 ； 进行性脊柱 侧凸或驼背和生长迟缓。
该病症特征还在于中枢自主功能障碍， 并且 Rett 患者显示出下述症状中的一些 或全部 ： 由屏气、 浅呼吸、 换气过度、 延长的呼吸暂停期构成的多种呼吸节律障碍 ； 心律不 齐伴随基线心迷走紧张的降低 ； h 和心压力感受器反射敏感性。这些症状威胁生命， 并且使 得 Rett 患者处于猝死风险中。他们显示出脑干不成熟， 并且在觉醒期间缺乏心肺网络中的 和来自下丘脑或边缘皮层的综合抑制。此外， 在 Rett 患者中报道了脑干神经营养蛋白信号 (NGF 和 BDNF) 的改变， 以及单胺 (5- 羟色胺、 去甲肾上腺素 ) 和神经肽 ( 物质 P) 水平的降
低。 RTT 是单基因型疾病， 在绝大多数情况下， 是 X 染色体连锁的基因 mecp2 的突变导 致的， 该基因编码转录阻遏子 MeCP2( 甲基 -CpG 胞嘧啶结合蛋白 2)。MeCP2 与甲基化的 DNA 优先结合。
神经营养蛋白因子 BDNF 是 MeCP2 的已知的直接靶标， 是去甲肾上腺素和 5- 羟色 胺神经元的重要营养性因子。令人惊奇地， Mecp2-KO 小鼠是脑 BDNF 缺陷的， 脑 BDNF 的遗 传过量表达可增加其寿命， 并且弥补其运动缺陷。目前需要寻找 BDNF 治疗策略， 包括用于 雷特综合征和其它呼吸病症等状况的策略 ； 此类策略包括靶向 BDNF 的此类结合伴侣， 例如 酪氨酸激酶受体 TrkB。
发明内容 本发明提供了治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如， 雷特综合征 (RTT)) 的 方法， 所述方法包括施用酪氨酸激酶受体 B(TrkB) 的经分离的抗体激动剂 ( 在本文中还称 为 “TrkB 激动性抗体” 、 “TrkB 结合分子” 等 )。在一些实施方式中， 抗体是人源化抗体。在 其它实施方式中， 抗体是单链抗体。在一些实施方式中， 抗体不与酪氨酸激酶受体 A 或酪氨 酸激酶受体 C 结合。在一些实施方式中， 抗体能结合人的 TrkB， 并且不与其它物种的 TrkB 结合。 在一些实施方式中， 抗体既能结合人的 TrkB， 也能与其它物种的 TrkB 结合 ( 即， 能交 叉反应 )( 包括， 例如， 与小鼠、 大鼠和 / 或非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ))。
在一些实施方式中， 抗体与 TrkB 的配体结合结构域 (LBD) 结合。在一些实施方式 中， 抗体与脑衍生神经营养因子 (BDNF) 竞争结合 TrkB。在一些实施方式中， 抗体与下述竞 争抗体针对与 TrkB 的结合竞争， 所述竞争抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 3 的重链可变区和包 含 SEQ ID NO ： 4 的轻链可变区。 在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 7 的重链可 变区和包含 SEQ ID NO ： 8 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 11 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 12 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 15 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 16 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗 体包含 ： 包含 SEQ IDNO ： 7、 SEQ ID NO ： 11 和 / 或 SEQ ID NO ： 15 的重链可变区和包含 SEQ IDNO ： 8、 SEQ ID NO ： 12 和 / 或 SEQ ID NO ： 16 的轻链可变区的组合。在一些实施方式中， 抗 体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 3 的重链可变区和包含 SEQ IDNO ： 4 的轻链可变区。
在一些实施方式中， 本发明方法的抗体作为 BDNF 模拟物发挥作用， 其能例如重现 所述配体的营养性活性 ( 因此能施加神经保护性和神经营养性作用 )。
在一些实施方式中， 抗体不与 TrkB 的配体结合结构域 (LBD) 结合。在一些实施方 式中， 抗体不与脑衍生神经营养因子 (BDNF) 竞争结合 TrkB。在一些实施方式中， 在一些实 施方式中， 抗体与下述竞争抗体竞争结合 TrkB， 所述竞争抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 1的 重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 2 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ IDNO ： 5 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 6 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 9 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 10 的轻链可变区。 在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 13 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 14 的轻链可变区。在一些 实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 5、 SEQ ID NO ： 9 和 / 或 SEQ ID NO ： 13 的重链可变 区和包含 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 10 和 / 或 SEQ ID NO ： 14 的轻链可变区的组合。在一
些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 2 的轻链可 变区。
TrkB 激动性抗体与 TrkB 相互作用， 其因此能调节 TrkB 功能。TrkB 激动性结合分 子可用于促进 TrkB 途径信号传递 ； 因此， TrkB 激动性结合分子可用于例如诊断、 改善与异 常低的 TrkB 途径信号传递水平相关的呼吸病症 ( 例如， 由于患病受试者中 TrkB 或其蛋白 相互作用者之一的突变形式导致的 )， 提供保护以抵抗所述呼吸病症以及治疗所述呼吸病 症。与对 TrkB 信号传递异常下调相关的病症的非限制性例子 ( 例如， 由于 TrkB 或其蛋白 相互作用者之一的突变形式导致的 ) 是 (i) 雷特综合征 (RTT)， 其特征在于编码 MeCP2( 与 BDNF 直接结合 ) 的基因中的突变 ； 和 (ii) 由于 TrkB 功能丧失突变导致的严重肥胖和发育 迟缓 (Giles， S.， et al.(2004)Nature Neuroscience 7 ： 1187-9)。
本发明还提供了治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 的方法， 所述方法包括施用包含治疗或预防有效量的 TrkB 激动性抗体和药物载体的药物 组合物。在一些实施方式中， 药物组合物还包含能治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸性窘迫 的症状 ( 例如呼吸困难 ) 的分开的、 独立的试剂， 例如去甲肾上腺素和 / 或 5- 羟色胺途径的 小分子活化剂 ( 例如三环类抗抑郁剂地昔帕明 (DMI)、 5- 羟色胺 1A 受体部分激动剂、 丁螺 旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀 )、 谷氨酸能 AMPA 受体的活化剂 ： AMPAkine CX546、 前列腺素、 孕酮或 TrkB 活性的增强剂 ( 例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂 )。 在一些实施方式中， 向个体施用与 TrkB 的抗体激动剂 ( 或含有其的药物组合物 ) 组合的治疗和 / 或预防有效量的有效治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合 征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的第二种试剂。在一些实施方式中， 第二种试剂和 TrkB 的抗 体激动剂 ( 或含有其的药物组合物 ) 作为混合物施用。在一些实施方式中， 第二种试剂选 自下述物质构成的组 ： 去甲肾上腺素和 / 或 5- 羟色胺途径的小分子活化剂 ( 例如三环类抗 抑郁剂地昔帕明 (DMI)、 5- 羟色胺 1A 受体部分激动剂、 丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗 抑郁剂氟西汀和瑞波西汀 )、 谷氨酸能 AMPA 受体的活化剂 ： AMPAkine CX546、 前列腺素、 孕 酮或 TrkB 活性的增强剂 ( 例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂 )。
本发明还提供了治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸窘迫 ( 例如通常随呼吸病症发现 的那些 ) 的方法， 所述方法包括施用 TrkB 激动性抗体 ( 或包含其的药物组合物 )。所述症 状包括但不限于 ： 呼吸困难 ( 例如喘鸣或喘息， 屏气、 浅呼吸、 换气过度、 延长的呼吸暂停 )、 不良或减少的血氧 ( 例如青紫 )( 例如， 由于氧吸收受损、 不足的肺血液灌注等导致的 )、 降 低的去甲肾上腺素 (NE) 含量、 髓质中表达酪氨酸羟化酶的神经元减少以及胸痛。在一些实 施方式中， 所述方法包括向个体施用治疗或预防有效量的酪氨酸激酶受体 B(TrkB) 的抗体 激动剂。 在一些实施方式中， 所述方法包括向个体施用药物组合物， 所述组合物包含治疗或 预防有效量的 TrkB 激动性抗体和药物载体。在一些实施方式中， 个体有一种或多种呼吸病 症和 / 或正在经历一种或多种呼吸窘迫的症状。在一些实施方式中， 个体对呼吸窘迫的症 状易感。在一些实施方式中， 个体具有雷特综合征。
本发明提供了抑制神经细胞死亡的方法， 所述方法包括施用 TrkB 激动性抗体 ( 或 包含其的药物组合物 )。在一些实施方式中， 抗体是人源化抗体。在其它一些实施方式中， 抗体是单链抗体。在一些实施方式中， 抗体不与酪氨酸激酶受体 A 或酪氨酸激酶受体 C 结 合。在一些实施方式中， 抗体不与神经营养蛋白受体 p75NR 结合。在一些实施方式中， 抗
体能结合人的 TrkB， 但是不结合其它物种的 TrkB。在一些实施方式中， 抗体既能结合人的 TrkB， 也能结合其它物种的 TrkB( 即能交叉反应 )( 包括， 例如， 与小鼠、 大鼠和 / 或非人灵 长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ))。
在一些实施方式中， 抗体是人源化抗体。
在多种实施方式中， 本发明提供了用调节 ( 或促进 )TrkB 的一种或多种生物功能 的 TrkB 激动性抗体来治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或 呼吸窘迫症状的方法， 或抑制神经细胞死亡的方法。例如， TrkB 激动剂抗体可调节 TrkB 的 二聚化， 以及随后 TrkB 细胞内结构域上特定酪氨酸残基的自身磷酸化。进一步举例而言， TrkB 激动剂抗体可初始化 TrkB 相关的细胞内信号级联 ( 例如， 有丝分裂原活化的蛋白激 酶、 磷脂酰肌醇 3- 激酶和 PLCγ 途径 )， 由此导致对神经元死亡的抑制、 对神经突长出的促 进和神经营养蛋白的其它作用。
TrkB 激动性抗体包括， 例如， 与 TrkB 结合 ( 例如， 在 TrkB 的特定结构域或表位内， 例如， 与 TrkB 的配体结合结构域结合或者配体结合结构域之外 ) 的抗体和包括此类抗体的 抗原结合部分的多肽。TrkB 激动性抗体还包括下述分子 ： 其中， 结合部分并不源于抗体， 例 如源于具有免疫球蛋白样折叠的多肽的 TrkB 激动性抗体， 并且， 其中， 通过随机化、 选择和 亲和性成熟对抗原结合部分进行了工程改造， 以与 TrkB 结合。 在多种实施方式中， 本发明提供了用下述 TrkB 激动剂抗体来治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡 的方法， 所述抗体能结合人 TrkB 内的表位并且能与非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ) 的 TrkB 蛋白 ( 或其部分 ) 交叉反应。在多种实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体能与啮齿类物 种的 TrkB( 例如， 小鼠 TrkB、 大鼠 TrkB) 交叉反应。在多种实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗 体能与人 TrkA 或 TrkC 交叉反应。
在其它一些实施方式中， 本发明提供了用下述 TrkB 抗体来治疗、 诊断、 预防和 / 或 改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡的 方法， 所述抗体与人 TrkB 内的表位结合， 但是不与非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ) 的 TrkB 蛋白 ( 或其部分 ) 交叉反应。在多种实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体不与啮齿类物 种的 TrkB( 例如， 小鼠 TrkB、 大鼠 TrkB) 交叉反应。在多种实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗 体不与人 TrkA 或 TrkC 或神经营养蛋白受体 p75NR 交叉反应。
在多种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体的抗原结合部分与线性表位 结合。在多种实施方式中， 所述抗原结合部分与非线性表位结合。
在多种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体的抗原结合部分以等于或低 于 1nM、 0.5nM、 0.25nM 或 0.1nM 的解离常数 (KD) 与 TrkB 结合。
在一些实施方式中， 抗体能结合人的 TrkB， 但是不结合其它物种的 TrkB。在一些 实施方式中， 抗体既能结合人的 TrkB， 也能结合其它物种的 TrkB( 即能交叉反应 )( 包括， 例 如， 与小鼠、 大鼠和 / 或非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ))。
在多种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体的抗原结合部分以等于或低 于 0.3nM 的 KD 与非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ) 的 TrkB 结合。
在多种实施方式中， 所述抗原结合部分以等于或低于 0.5nM 的 KD 与小鼠 TrkB 结 合。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体是人抗体。在另一实施方式 中， 所述 TrkB 激动剂抗体是非人抗体。在另一实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体是嵌合 ( 例如， 人源化、 人工程化 ) 抗体。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体的抗原结合部分是人抗体的 抗原结合部分。所述抗原结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体的抗原结合部分。
本发明方法的 TrkB 激动性抗体包括例如， 抗体的 Fab 片段、 Fab’ 片段、 F(ab’ )2 或 Fv 片段。
在一些实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体是聚乙二醇化的。在一些实施 方式中， TrkB 激动剂抗体是聚乙二醇化的 Fab 片段。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体包括单链 Fv。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体包括双抗体 ( 例如单链双抗体 或具有两条多肽链的双抗体 )。
在一些实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂的抗原结合部分源于下述同种型 之一的抗体 ： IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4。在一些实施方式中， 所述抗体的抗原结合部分源于 IgA 或 IgE 同种型的抗体。
本发明方法的 TrkB 激动剂抗体可以展示出大量生物活性中的一种或多种。在多 种实施方式中， TrkB 激动剂抗体抑制 TrkB 与 BDNF、 与神经营养蛋白 4(NT-4) 和 / 或与神经 营养蛋白 5(NT-5) 的结合。例如， 相对于对照而言 ( 例如， 相对于不存在 TrkB 激动剂抗体 的情况下的结合而言 )， TrkB 激动剂抗体将 TrkB 与 BDNF、 NT-4 和 / 或 NT-5 的结合抑制至 少 5％、 10％、 15％、 25％或 50％。在其它一些实施方式中， TrkB 激动剂抗体不抑制 TrkB 与 BDNF、 NT-4 和 / 或 NT-5 的结合， 并且不以任何方式与其竞争。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体与 BDNF 竞争结合 TrkB， 由此调 节 TrkB 途径信号传导的生物活性和后果。非限制性地举例而言， 本发明方法的 TrkB 激动 剂抗体能活化、 增强或延长 TrkB 途径活化和信号传导 ( 例如通过与 BDNF 竞争结合 TrkB)。 在一些实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体与 TrkB 配体结合结构域结合， 由此与 BDNF 竞争 结合 TrkB。
在一些实施方式中， 本发明方法的抗体作为 BDNF 模拟物发挥作用， 其能， 例如， 重 现所述配体的营养性活性 ( 因此能施加神经保护性和神经营养性作用 )。
在其它一些实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体不结合 TrkB 配体结合结 构域， 并且不与 BDNF 竞争结合 TrkB， 但是其仍然可调节 TrkB 信号途径 ( 例如活化、 增强或 延长 TrkB 途径活化和信号传导 )。
在多种实施方式中， 本发明提供了用下述 TrkB 激动剂抗体来治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞死亡 的方法， 所述抗体能调节通常由 TrkB 以直接或间接方式调节的下游生物活性。所述活性的 非限制性例子包括 ： 调节 TrkB 的二聚化， 以及随后 TrkB 细胞内结构域上酪氨酸残基的自身 磷酸化 ； 启动 TrkB 相关的细胞内信号级联 ( 例如， 有丝分裂原活化的蛋白激酶、 磷脂酰肌醇 3- 激酶和 PLCγ 途径 ) ； 以及抑制神经元死亡、 促进神经突长出和神经营养蛋白的其它作 用。例如， 相对对照 ( 例如相对不存在 TrkB 激动剂抗体的情况下的活性 ) 而言， 本发明方 法的 TrkB 激动剂抗体将神经元死亡抑制至少 5％、 10％、 15％、 25％或 50％。进一步举例而言， 相对对照 ( 例如相对不存在 TrkB 激动剂抗体的情况下的活性 ) 而言， 所述 TrkB 激动剂 抗体将 TrkB 蛋白水平稳定至少 5％、 10％、 15％、 25％或 50％。
在多种实施方式中， 本发明提供了用非抗体 TrkB 激动性分子来治疗、 诊断、 预防 和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的方法或抑制神经细胞 死亡的方法。非抗体 TrkB 激动剂分子包括下述 TrkB 结合结构域， 其具有源于非抗体多肽 的免疫球蛋白样 (Ig 样 ) 折叠的氨基酸序列， 例如下述之一 ： 生腱蛋白 (tenascin)、 N- 钙 黏着蛋白、 E- 钙黏着蛋白、 ICAM、 肌联蛋白 (titin)、 GCSF- 受体、 细胞因子受体、 糖苷酶抑制 剂、 抗生素色蛋白、 髓磷脂膜粘附分子 P0、 CD8、 CD4、 CD2、 I 类 MHC、 T- 细胞抗原受体、 CD1、 C2 和 VCAM-1 的 I- 组结构域、 肌球蛋白结合蛋白 C 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 肌球蛋白结 合蛋白 H 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 端蛋白 (telokin) 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 NCAM、 颤搐蛋白、 神经胶质蛋白 (neuroglian)、 生长激素受体、 促红细胞生成素受体、 促乳素受 体、 干扰素 -γ 受体、 - 半乳糖苷酶 / 葡糖苷酸酶、 - 葡糖苷酸酶、 转谷氨酰胺酶、 T- 细胞抗 原受体、 超氧化物歧化酶、 组织因子结构域、 细胞色素 F、 绿色荧光蛋白、 GroEL 或奇甜蛋白 (thaumatin)。通常， TrkB 结合结构域的氨基酸序列相对于免疫球蛋白样折叠的氨基酸序 列而言有所改变， 使得 TrkB 结合结构域与 TrkB 特异性结合 ( 即， 其中免疫球蛋白样折叠不 与 TrkB 特异性结合 )。 在多种实施方式中， TrkB 结合结构域的氨基酸序列与纤连蛋白、 细胞因子受体或 钙黏着蛋白的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少 60％相同 ( 例如至少 65％、 75％、 80％、 85％或 90％相同 )。
在多种实施方式中， TrkB 结合结构域与下述之一的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序 列至少 60％、 65％、 75％、 80％、 85％或 90％相同 ： 生腱蛋白、 N- 钙黏着蛋白、 E- 钙黏着蛋白、 ICAM、 肌联蛋白、 GCSF- 受体、 细胞因子受体、 糖苷酶抑制剂、 抗生素色蛋白、 髓磷脂膜粘附分 子 P0、 CD8、 CD4、 CD2、 I 类 MHC、 T- 细胞抗原受体、 CD1、 C2 和 VCAM-1 的 I- 组结构域、 肌球 蛋白结合蛋白 C 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 肌球蛋白结合蛋白 H 的 I- 组免疫球蛋白结构 域、 端蛋白的 I- 组免疫球蛋白结构域、 NCAM、 颤搐蛋白、 神经胶质蛋白、 生长激素受体、 促红 细胞生成素受体、 促乳素受体、 干扰素 -γ 受体、 - 半乳糖苷酶 / 葡糖苷酸酶、 - 葡糖苷酸酶、 转谷氨酰胺酶、 T- 细胞抗原受体、 超氧化物歧化酶、 组织因子结构域、 细胞色素 F、 绿色荧光 蛋白、 GroEL 或奇甜蛋白。
在多种实施方式中， TrkB 结合结构域以等于或低于 1nM 的 KD 与 TrkB 结合 ( 例如 0.5nM、 0.1nM)。
在一些实施方式中， Ig 样折叠是纤连蛋白的 Ig 样折叠， 例如 III 型纤连蛋白的 Ig 样折叠 ( 例如 III 型纤连蛋白的模块 10 的 Ig 样折叠 )。
本发明还涉及使用包括本文所述的 TrkB 激动剂抗体的药物组合物的方法。所述 组合物包括， 例如 TrkB 激动剂抗体和可药用载体。
在一个方面， 本发明涉及通过施用治疗和 / 或预防有效量的 TrkB 的抗体激动剂 ( 或含有其的药物组合物 ) 来抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的方法。这些方法包括 将组织或生物样品 ( 例如表达 TrkB 的神经元细胞 ) 与治疗和 / 或预防有效量的 TrkB 的抗 体激动剂 ( 或含有其的药物组合物 ) 相接触， 由此活化和 / 或稳定 TrkB 信号途径， 以及针 对神经营养蛋白 ( 例如 BDNF) 的作用提供保护。TrkB 激动剂抗体 ( 或含有其的药物组合
物 ) 可以以有效抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的量施用。
在一些实施方式中， 所述方法涉及腹膜内注射施用 TrkB 的抗体激动剂 ( 或含有其 的药物组合物 )。
本发明一个或多种实施方式的细节在附图和下文说明书中详细示出。 本发明的其 它特征、 目的和优点将从说明书和附图以及权利要求中显而易见。
附图简述
图 1 图示了在施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 敲除小鼠中观察到的体重和食物摄 入的下降。在图 1A 中， 最顶上的线 ( 白色方块示出数据点 ) 代表施用盐水的 Mecp2 野生 型小鼠。次顶部的线 ( 黑色方块示出数据点 ) 代表施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 野生型 小鼠。次底部的线 ( 白色圆圈示出数据点 ) 代表施用盐水的 Mecp2 敲除小鼠。最底部的线 ( 黑色圆圈示出数据点 ) 代表施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 敲除小鼠。图 1B 中， 白色的条 形代表施用盐水的 Mecp2 野生型小鼠。黑色的条形代表施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 野 生型小鼠。浅灰色条形代表施用盐水的 Mecp2 敲除小鼠。深灰色的条形代表施用 TrkB 激 动剂抗体的 Mecp2 敲除小鼠。图 1B 左边部分代表在 6 周龄时进行的测量， 右边部分代表在 8 周龄时进行的测量。 图 2A 和 2B 分别图示了施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 敲除小鼠中握力和体脂肪 组成的改善。图 2 中， 方块示出的数据点代表用盐水 (SAL) 或 TrkB 激动剂抗体 C20 处理过 的野生型 (WT) 小鼠 ； 圆圈示出的数据点代表用盐水 (SAL) 或 TrkB 激动剂抗体 C20 处理过 的敲除 (KO) 小鼠。图 2A 的左边部分代表后肢测量， 右边是前肢测量。图 2B 的左边代表体 脂肪含量， 右边是瘦肉质含量。
图 3 图示了施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 敲除小鼠中观察到的增加的寿命。图 3A 中， 敲除小鼠被描述为 KO， 野生型描述为 WT。SAL 表示施用盐水， C20 表示施用 TrkB 激动 剂抗体。图 3B 中， 敲除小鼠被描述为 KO， TrkB 激动剂抗体描述为 C20。如图 3 所示， TrkB 激动剂 mAb 处理过的敲除小鼠 (KO-C20) 存活时间是盐水处理的 KO 小鼠的至少两倍。
发明详述
本发明提供了用酪氨酸激酶受体 B(TrkB) 的经分离的抗体激动剂 ( 本文中也被称 为 “TrkB 激动性抗体” 等等 ) 治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 的方法。
所述方法可利用任何 TrkB 激动剂抗体， 具体列出的那些被认为是非限制性的实 施方式。
本发明提供了与 TrkB 结合的分子 (“TrkB 激动性抗体” )， 特别是人抗体或其部 分， 其能与人 TrkB 结合并调节其功能。还提供了 TrkB 的表位和结合这些表位的试剂。
全长人 TrkB 序列以检索号 AAB33109(GI ： 913718) 发现， 其有 822 个残基。其由检索号 S76473(GI ： 913717) 的 mRNA 序列编码。TrkB 是在脑中广泛分布的神经营养蛋白受体。其是多结构域跨膜蛋白， 由细胞外配体结合结构域 (LBD)、 跨 膜区域和细胞内酪氨酸激酶结构域构成。 TrkB 是 BDNF 的高亲和性受体， 其也能结合神经营 养蛋白 4(NT-4)。
在一些实施方式中， 抗体是人源化抗体。在其它一些实施方式中， 抗体是单链抗 体。在一些实施方式中， 抗体不与酪氨酸激酶受体 A 或酪氨酸激酶受体 C 结合。在一些实施方式中， 抗体能结合人的 TrkB， 并且不与其它物种的 TrkB 结合。 在一些实施方式中， 抗体 既能结合人的 TrkB， 也能与其它物种的 TrkB 结合 ( 即， 能交叉反应 )( 包括， 例如， 与小鼠、 大鼠和 / 或非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ))。
在一些实施方式中， 抗体与 TrkB 的配体结合结构域 (LBD) 结合。在一些实施方式 中， 抗体与脑衍生神经营养因子 (BDNF) 竞争结合 TrkB。在一些实施方式中， 抗体与下述竞 争抗体竞争结合 TrkB， 所述竞争抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 3 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 4 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 7 的重链可变区和包 含 SEQ ID NO ： 8 的轻链可变区。 在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQID NO ： 11 的重链可 变区和包含 SEQ ID NO ： 12 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 15 的重链可变区和包含 SEQ IDNO ： 16 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 11 和 / 或 SEQ ID NO ： 15 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 12 和 / 或 SEQ ID NO ： 16 的轻链可变区的组合。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 3 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 4 的轻链可变区。
在一些实施方式中， 本发明方法的抗体作为 BDNF 模拟物发挥作用， 其能例如重现 所述配体的营养性活性 ( 因此能施加神经保护性和神经营养性作用 )。 在一些实施方式中， 本发明的 TrkB 激动剂抗体结合 TrkB 配体结合位点和 / 或与 BDNF 竞争结合 TrkB。与 TrkB 的配体结合位点结合的示例性抗体是抗体 A10F18.2( 在本文 中还被称为 “A10F18” 或 “A10” )。抗体 A10 的重链可变区在 SEQ ID NO ： 3 中例示， 抗体 A10 的轻链可变区在 SEQID NO ： 4 中例示。
因此， 本发明提供了与包含含 SEQ ID NO ： 3 的重链可变区以及含 SEQID NO ： 4 的轻 链可变区的抗体竞争结合 TrkB 的激动剂抗体。在一些实施方式中， 本发明的抗体包含 SEQ ID NO ： 3 和 / 或 4 的互补决定区 (CDRs) 中的至少之一。不限制本发明的范围的情况下， 我 们认为， CDR3 在抗体 A10 的结合中具有显著作用。因此， 在一些实施方式中， 本发明的抗体 包含 SEQ ID NOs ： 7 和 / 或 8。但是， CDR1 和 / 或 CDR2 也在结合中具有作用。因此， 在一些 实施方式中， 本发明的抗体包含 SEQ ID NOs ： 11 和 / 或 12 或 15 和 / 或 16。
在一些实施方式中， 抗体不与 TrkB 的配体结合结构域 (LBD) 结合。在一些实施方 式中， 抗体不与脑衍生神经营养因子 (BDNF) 竞争结合 TrkB。在一些实施方式中， 抗体与下 述竞争抗体竞争结合 TrkB， 所述竞争抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区和包含 SEQ ID NO ： 2 的轻链可变区。 在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 5 的重链可变区和 包含 SEQ ID NO ： 6 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 9 的重 链可变区和包含 SEQ ID NO ： 10 的轻链可变区。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 13 的重链可变区和包含 SEQID NO ： 14 的轻链可变区。 在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包 含 SEQ IDNO ： 5、 SEQ ID NO ： 9 和 / 或 SEQ ID NO ： 13 的重链可变区和包含 SEQ IDNO ： 6、 SEQ ID NO ： 10 和 / 或 SEQ ID NO ： 14 的轻链可变区的组合。在一些实施方式中， 抗体包含 ： 包含 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区和包含 SEQ IDNO ： 2 的轻链可变区。
在一些实施方式中， 本发明的 TrkB 激动剂抗体不结合 TrkB 配体结合位点和 / 或 不与 BDNF 竞争结合 TrkB。 不结合 TrkB 的配体结合位点的示例性抗体是抗体 C20.i.1.1( 本 文中还被称为 “C20.i1” “C20.I1” 、 和 “C20” )。抗体 C20 的重链可变区在 SEQ ID NO ： 1 中示 例。因此， 本发明提供了激动剂抗体， 其与包含含 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区以及含 SEQID
NO ： 2 的轻链可变区的抗体竞争结合 TrkB。在一些实施方式中， 本发明的抗体包含 SEQ ID NO ： 1 和 / 或 2 的互补决定区 (CDRs) 中的至少之一。不限制本发明的范围的情况下， 我们 认为， CDR3 在抗体 C20 的结合中具有重要作用。因此， 在一些实施方式中， 本发明的抗体包 含 SEQ ID NOs ： 5 和 / 或 6。但是， CDR1 和 / 或 CDR2 也在结合中具有作用。因此， 在一些实 施方式中， 本发明的抗体包含 SEQ ID NOs ： 9 和 / 或 10 或 13 和 / 或 14。
TrkB 激动性抗体与 TrkB 相互作用， 由此能调节 TrkB 功能。TrkB 激动性结合分子 可用于促进 TrkB 途径信号传导 ； 因此， TrkB 激动性结合分子可用于例如诊断、 改善下述呼 吸病症， 提供保护以抵挡下述呼吸病症以及治疗下述呼吸病症， 所述呼吸病症是与异常低 水平的 TrkB 途径信号传导相关的 ( 例如， 由于患病受试者中 TrkB 或其蛋白相互作用者之 一的突变形式导致的 )。与对 TrkB 信号传导异常下调相关的病症的非限制性例子 ( 例如， 由于 TrkB 或其蛋白相互作用者之一的突变形式导致的 ) 是雷特综合征 (RTT)， 其特征在于 编码 MeCP2( 与 BDNF 直接结合 ) 的基因中的突变。
本发明还提供了用包含治疗或预防有效量的 TrkB 激动性抗体和药物载体的药物 组合物治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 的方法。在一些实 施方式中， 药物组合物还包含能治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症的症状 ( 例如呼吸困 难 ) 的分开的、 独立的试剂， 例如去甲肾上腺素和 / 或 5- 羟色胺途径的小分子活化剂 ( 例 如三环类抗抑郁剂地昔帕明 (DMI)、 5- 羟色胺 1A 受体部分激动剂、 丁螺旋酮以及可能更具 选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀 )、 谷氨酸能 AMPA 受体的活化剂 ： AMPAkine CX546、 前 列腺素、 孕酮或 TrkB 活性的增强剂 ( 例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂 )。
所述方法可利用包含治疗或预防有效量的任何 TrkB 激动剂抗体的药物组合物， 具体列出的那些抗体被认为是非限制性的实施方式。
本发明还提供了治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸窘迫症状 ( 例如通常随呼吸病症 发现的那些 ) 的方法。所述症状包括但不限于 ： 呼吸困难 ( 例如喘鸣或喘息， 屏气、 浅呼吸、 换气过度、 延长的呼吸暂停 )、 不良或减少的血氧 ( 例如青紫 )( 例如， 由于氧吸收受损、 不足 的肺血液灌注等导致的 ) 以及胸痛。在一些实施方式中， 所述方法包括向个体施用治疗或 预防有效量酪氨酸激酶受体 B(TrkB) 的抗体激动剂。在一些实施方式中， 所述方法包括向 个体施用药物组合物， 所述组合物包含治疗或预防有效量的 TrkB 激动性抗体和药物载体。 在一些实施方式中， 个体有一种或多种呼吸病症和 / 或正在经历呼吸窘迫的一种或多种症 状。在一些实施方式中， 个体对呼吸病症的症状易感。在一些实施方式中， 个体具有雷特综 合征。
所述方法可利用任何 TrkB 激动剂抗体 ( 或包含任何 TrkB 激动剂抗体的药物组合 物 )， 具体列出的那些抗体被认为是非限制性的实施方式。
在一些实施方式中， 向个体施用与 TrkB 的抗体激动剂 ( 或含有其的药物组合物 ) 组合的治疗和 / 或预防有效量的第二种有效治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷 特综合征 (RTT)) 的试剂。在一些实施方式中， 第二种试剂和 TrkB 的抗体激动剂 ( 或含有 其的药物组合物 ) 作为混合物施用。在一些实施方式中， 第二种试剂选自下述物质构成的 组： 去甲肾上腺素和 / 或 5- 羟色胺途径的小分子活化剂 ( 例如三环类抗抑郁剂地昔帕明 (DMI)、 5- 羟色胺 1A 受体部分激动剂、 丁螺旋酮以及可能更具选择性的抗抑郁剂氟西汀和 瑞波西汀 )、 谷氨酸能 AMPA 受体的活化剂 ： AMPAkine CX546、 前列腺素、 孕酮或 TrkB 活性的增强剂 ( 例如蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂 )。
在一些实施方式中， 抗体是人源化抗体。
在多种实施方式中， 本发明提供了用能调节 ( 或促进 )TrkB 的一种或多种生物功 能的 TrkB 激动性抗体来治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或 呼吸窘迫症状的方法。例如， TrkB 激动剂抗体可调节 TrkB 的二聚化， 以及随后 TrkB 细胞 内结构域上特定酪氨酸残基的自身磷酸化。进一步举例而言， TrkB 激动剂抗体能启动 TrkB 相关的细胞内信号级联 ( 例如， 有丝分裂原活化的蛋白激酶、 磷脂酰肌醇 3- 激酶和 PLCγ 途径 )， 由此导致对神经元死亡的抑制、 对神经突长出的促进和神经营养蛋白的其它作用。
TrkB 激动性抗体包括， 例如， 与 TrkB 结合 ( 例如， 在 TrkB 的特定结构域或表位内， 例如， 与 TrkB 的配体结合结构域结合或者配体结合结构域之外 ) 的抗体和包括此类抗体的 抗原结合部分的多肽。TrkB 激动性抗体还包括下述分子 ： 其中， 结合部分并不源于抗体， 例 如源于具有免疫球蛋白样折叠的多肽的 TrkB 激动性抗体， 并且， 其中， 通过随机化、 选择和 亲和性成熟对抗原结合部分进行了工程改造， 以与 TrkB 结合。
在多种实施方式中， 本发明提供了用下述 TrkB 激动剂抗体来治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的方法， 所述抗体能结合人 TrkB 内的表位并且能与非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ) 的 TrkB 蛋白 ( 或其部分 ) 交叉 反应。 在多种实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体能与啮齿类物种的 TrkB( 例如， 小鼠 TrkB、 大鼠 TrkB) 交叉反应。在多种实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体能与人 TrkA 或 TrkC 交叉 反应。
在其它一些实施方式中， 本发明提供了用下述 TrkB 抗体来治疗、 诊断、 预防和 / 或 改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的方法， 所述抗体与人 TrkB 内 的表位结合， 但是不与非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ) 的 TrkB 蛋白 ( 或其部分 ) 交叉 反应。 在多种实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体不与啮齿类物种的 TrkB( 例如， 小鼠 TrkB、 大鼠 TrkB) 交叉反应。在多种实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体不与人 TrkA 或 TrkC 或神 经营养蛋白受体 p75NR 交叉反应。
在多种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体的抗原结合部分与线性表位 结合。在多种实施方式中， 所述抗原结合部分与非线性表位结合。
在多种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体的抗原结合部分以等于或低 于 1nM、 0.5nM、 0.25nM 或 0.1nM 的解离常数 (KD) 与 TrkB 结合。
在一些实施方式中， 抗体能结合人的 TrkB， 但是不结合其它物种的 TrkB。在一些 实施方式中， 抗体既能结合人的 TrkB， 也能结合其它物种的 TrkB( 即能交叉反应 )( 包括， 例 如， 与小鼠、 大鼠和 / 或非人灵长类 ( 例如， 猕猴或恒河猴 ))。
在多种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体的抗原结合部分以等于或低 于 0.3nM 的 KD 与非人灵长类 ( 例如， 猕猴或黑猩猩 ) 的 TrkB 结合。
在多种实施方式中， 所述抗原结合部分以等于或低于 0.5nM 的 KD 与小鼠 TrkB 结 合。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体是人抗体。在另一实施方式 中， 所述 TrkB 激动剂抗体是非人抗体。在另一实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体是嵌合 ( 例如， 人源化、 人工程化 ) 抗体。在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动性抗体的抗原结合部分是人抗体的 抗原结合部分。所述抗原结合部分可以是单克隆抗体或多克隆抗体的抗原结合部分。
本发明方法的 TrkB 激动性抗体包括例如， 抗体的 Fab 片段、 Fab’ 片段、 F(ab’ )2 或 Fv 片段。
在一些实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体是聚乙二醇化的。在一些实施 方式中， TrkB 激动剂抗体是聚乙二醇化的 Fab 片段。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体包括单链 Fv。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体包括双抗体 ( 例如单链双抗体 或具有两条多肽链的双抗体 )。
在一些实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体的抗原结合部分源于下述同 种型之一的抗体 ： IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4。在一些实施方式中， 所述抗体的抗原结合部分 源于 IgA 或 IgE 同种型的抗体。
在一种实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体与 BDNF 竞争结合 TrkB， 由此 调节 TrkB 途径信号传导的生物活性和后果。作为非限制性实例， 本发明方法的 TrkB 激动 剂抗体可活化、 增强或延长 TrkB 途径活化和信号传导 ( 例如通过与 BDNF 竞争结合 TrkB)。 在一些实施方式中， 所述 TrkB 激动剂抗体与 TrkB 配体结合结构域结合， 由此与 BDNF 竞争 结合 TrkB。 在一些实施方式中， 本发明方法的抗体作为 BDNF 模拟物发挥作用， 其能， 例如， 重 现所述配体的营养性活性 ( 因此能施加神经保护性和神经营养性作用 )。
在其它一些实施方式中， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体不结合 TrkB 配体结合结 构域， 并且不与 BDNF 竞争结合 TrkB， 但是其可调节 TrkB 信号途径 ( 例如活化、 增强或延长 TrkB 途径活化和信号传导 )。
在多种实施方式中， 本发明提供了用下述 TrkB 激动剂抗体来治疗、 诊断、 预防和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的方法， 所述抗体能调节通常 由 TrkB 以直接或间接方式调节的下游生物活性。 所述活性的非限制性例子包括 ： 调节 TrkB 的二聚化， 以及随后 TrkB 细胞内结构域上酪氨酸残基的自身磷酸化 ； 启动 TrkB 相关的细胞 内信号级联 ( 例如， 有丝分裂原活化的蛋白激酶、 磷脂酰肌醇 3- 激酶和 PLCγ 途径 ) ； 以及 抑制神经元死亡、 促进神经突长出和神经营养蛋白的其它作用。例如， 相对对照 ( 例如相对 不存在 TrkB 激动剂抗体的情况下的活性 ) 而言， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体将神经元 死亡抑制至少 5％、 10％、 15％、 25％或 50％。进一步举例而言， 相对对照 ( 例如相对不存在 TrkB 激动剂抗体的情况下的活性 ) 而言， 所述 TrkB 激动剂抗体将 TrkB 蛋白水平稳定至少 5％、 10％、 15％、 25％或 50％。
在多种实施方式中， 本发明提供了用非抗体 TrkB 激动性分子来治疗、 诊断、 预防 和 / 或改善呼吸病症 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 或呼吸窘迫的症状的方法。非抗体 TrkB 激 动剂分子包括下述 TrkB 结合结构域， 其具有源于非抗体多肽的免疫球蛋白样 (Ig 样 ) 折叠 的氨基酸序列， 例如下述之一 ： 生腱蛋白、 N- 钙黏着蛋白、 E- 钙黏着蛋白、 ICAM、 肌联蛋白、 GCSF- 受体、 细胞因子受体、 糖苷酶抑制剂、 抗生素色蛋白、 髓磷脂膜粘附分子 P0、 CD8、 CD4、 CD2、 I 类 MHC、 T- 细胞抗原受体、 CD1、 C2 和 VCAM-1 的 I- 组结构域、 肌球蛋白结合蛋白 C 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 肌球蛋白结合蛋白 H 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 端蛋白的 I- 组
免疫球蛋白结构域、 NCAM、 颤搐蛋白、 神经胶质蛋白、 生长激素受体、 促红细胞生成素受体、 促乳素受体、 干扰素 -γ 受体、 - 半乳糖苷酶 / 葡糖苷酸酶、 - 葡糖苷酸酶、 转谷氨酰胺酶、 T- 细胞抗原受体、 超氧化物歧化酶、 组织因子结构域、 细胞色素 F、 绿色荧光蛋白、 GroEL 或 奇甜蛋白。通常， TrkB 结合结构域的氨基酸序列相对于免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列而 言有所改变， 使得 TrkB 结合结构域与 TrkB 特异性结合 ( 即， 其中免疫球蛋白样折叠不与 TrkB 特异性结合 )。
在多种实施方式中， TrkB 结合结构域的氨基酸序列与纤连蛋白、 细胞因子受体或 钙黏着蛋白的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序列至少 60％相同 ( 例如至少 65％、 75％、 80％、 85％或 90％相同 )。
在多种实施方式中， TrkB 结合结构域与下述之一的免疫球蛋白样折叠的氨基酸序 列至少 60％、 65％、 75％、 80％、 85％或 90％相同 ： 生腱蛋白、 N- 钙黏着蛋白、 E- 钙黏着蛋白、 ICAM、 肌联蛋白、 GCSF- 受体、 细胞因子受体、 糖苷酶抑制剂、 抗生素色蛋白、 髓磷脂膜粘附分 子 P0、 CD8、 CD4、 CD2、 I 类 MHC、 T- 细胞抗原受体、 CD1、 C2 和 VCAM-1 的 I- 组结构域、 肌球 蛋白结合蛋白 C 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 肌球蛋白结合蛋白 H 的 I- 组免疫球蛋白结构 域、 端蛋白的 I- 组免疫球蛋白结构域、 NCAM、 颤搐蛋白、 神经胶质蛋白、 生长激素受体、 促红 细胞生成素受体、 促乳素受体、 干扰素 -γ 受体、 - 半乳糖苷酶 / 葡糖苷酸酶、 - 葡糖苷酸酶、 转谷氨酰胺酶、 T- 细胞抗原受体、 超氧化物歧化酶、 组织因子结构域、 细胞色素 F、 绿色荧光 蛋白、 GroEL 或奇甜蛋白。 在多种实施方式中， TrkB 结合结构域以等于或低于 1nM 的 KD 与 TrkB 结合 ( 例如 0.5nM、 0.1nM)。
在一些实施方式中， Ig 样折叠是纤连蛋白的 Ig 样折叠， 例如 III 型纤连蛋白的 Ig 样折叠 ( 例如 III 型纤连蛋白的模块 10 的 Ig 样折叠 )。
本发明还涉及使用包括本文所述的 TrkB 激动剂抗体的药物组合物的方法。所述 组合物包括， 例如 TrkB 激动剂抗体和可药用载体。
在一个方面， 本发明涉及通过施用治疗和 / 或预防有效量的 TrkB 的抗体激动剂 ( 或含有其的药物组合物 ) 来抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的方法。这些方法包括 将组织或生物样品与治疗和 / 或预防有效量的 TrkB 的抗体激动剂 ( 或含有其的药物组合 物 ) 相接触， 由此活化和 / 或稳定 TrkB 信号途径。TrkB 激动剂抗体 ( 或含有其的药物组合 物 ) 可以以有效抑制神经细胞死亡或促进神经突长出的量施用。
在一些实施方式中， 所述方法涉及腹膜内注射施用 TrkB 的抗体激动剂 ( 或含有其 的药物组合物 )。
根据本发明的方法可使用任何类型的 TrkB 激动剂抗体。通常， 使用的抗体是单 克隆抗体。可通过本领域已知的任何方法来产生单克隆抗体 ( 例如使用杂交瘤、 重组表达 和 / 或噬菌体展示 )。不加限制的情况下， 本发明的方法中可使用来自任何下述专利和非 专利公开文献的 TrkB 激动剂抗体 ： Qian， M.， et al.(2006)Journal of Neurosci.26(37) ； 9394-9403 ； 美 国 专 利 号 5,910,574( 及 其 任 何 相 关 的 同 族 专 利 ) ； PCT 专 利 公 开 号 WO06/133164( 及其任何相关的同族专利 )。
定义
在本文中使用时， 术语 “呼吸病症” 包括但不限于 ： 肺不张、 囊性纤维化、 雷特综合
征 (RTT)、 哮喘、 呼吸暂停 ( 例如睡眠呼吸暂停 )、 急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)、 慢性阻塞性 肺病 (COPD)、 肺气肿、 急性呼吸困难、 呼吸急促、 端坐呼吸、 类风湿性肺病、 肺充血或水肿、 慢 性气道阻塞性疾病 ( 例如肺气肿、 慢性支气管炎、 支气管哮喘和支气管扩张 )、 换气不足、 匹 克威克综合征、 肥胖换气不足综合征、 婴儿猝死综合征 (SIDS) 和呼吸过度。
此外， “呼吸病症”还包括人类中已知与遗传缺陷有关的状况， 例如沙 - 马 - 图 病、 Cheyne-Stokes 呼吸病、 Willi-Prader 综合征、 婴儿猝死综合征、 先天性中枢性肺换气 不足、 弥漫性间质性疾病 ( 例如结节病、 尘肺病、 过敏性肺炎、 细支气管炎、 古德帕斯丘综合 征、 特发性肺纤维化、 特发性肺含铁血黄素沉着症、 肺泡蛋白沉着症、 脱屑性间质肺炎、 慢性 间质性肺炎、 纤维化肺泡炎、 哈 - 里综合征、 肺嗜酸性粒细胞增多症、 弥漫性间质性纤维化、 韦格纳肉芽肿病、 淋巴瘤样肉芽肿和脂质性肺炎 ) 或肿瘤 ( 例如支气管原癌、 细支气管肺泡 癌、 支气管类癌、 错构瘤和间质瘤 )。
在本文中使用时， “调节” 表示直接或间接控制或影响的能力， 作为非限制性实例， 或者可表示抑制或刺激、 激动或拮抗、 阻碍或促进以及加强或削弱。
“预防有效剂量” 和 “治疗有效剂量” 的本发明的 TrkB 激动性抗体可分别预防疾病 症状 ( 例如， 与异常低的 TrkB 水平或 TrkB 的突变拷贝相关的病症的症状 ) 的发作或者使得 这些症状的严重性降低。所述术语还可分别促进或增加疾病无症状期的频率和持续时间。 “预防有效剂量” 和 “治疗有效剂量” 还可分别预防或改善由于患 TrkB 相关病症或呼吸病症 导致的受损或残障。
术语 “受试者” 意欲包括遭受或患有与异常 TrkB 信号途径相关的疾病、 病症或状 况的生物， 例如真核生物。受试者的例子包括哺乳动物， 例如， 人、 狗、 奶牛、 马、 猪、 绵羊、 山 羊、 猫、 小鼠、 兔、 大鼠和转基因非人动物。在某些实施方式中， 受试者是人， 例如， 遭受本文 所述的呼吸病症或状况 ( 例如雷特综合征 (RTT))、 处于遭受本文所述的呼吸病症或状况 ( 例如雷特综合征 (RTT)) 的风险中或可能遭受本文所述的呼吸病症或状况 ( 例如雷特综合 征 (RTT)) 的人。
术语 “抗体” 在本文中使用时表示完整的抗体或抗原结合片段 ( 即 “抗原结合部 分” ) 或其单链 ( 即轻链或重链 )。完整抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重 (H) 链和两条轻 (L) 链的糖蛋白。 每条重链包含重链可变区 ( 本文中缩写为 VH) 和重链恒定区。 重链恒定区包含三个结构域， CH1、 CH2 和 CH3。每条轻链包含轻链可变区 ( 本文中缩写为 VL) 和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域 CL。VH 和 VL 区域可进一步细分为 ： 被称为 互补决定区 (CDR) 的高变区， 其间散布有被称为构架区 (FR) 的更保守的区域。每个 VH 和 VL 由从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列的三个 CDRs 和四个 FRs 构成 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合区。抗体的恒定区 可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子 ( 包括免疫系统的多种细胞 ( 例如效应细胞 ) 和经典 补体系统的第一组分 (Clq)) 的结合。
术语抗体的 “抗原结合部分” 在本文中使用时表示完整抗体中保留有与给定抗原 ( 例如 TrkB) 特异性结合的能力的一条或多条片段。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体 的片段来实现。术语抗体的 “抗原结合部分” 所包括的结合片段的例子包括 Fab 片段—— 由 VL、 VH、 CL 和 CH1 结构域构成的单价片段 ； F(ab)2 片段——包含通过二硫桥在铰链区相 连的两条 Fab 片段 ( 通常一条来自重链， 一条来自轻链 ) 的二价片段 ； Fd 片段——由 VH 和CH1 结构域构成 ； Fv 片段——由抗体单臂的 VL 和 VH 结构域构成 ； 单结构域抗体 (dAb) 片段 (Ward et al.， 1989Nature 341 ： 544-546)——其由 VH 结构域构成 ； 以及经分离的互补决定 区 (CDR)。
此外， 虽然 Fv 片段的两个结构域 —— VL 和 VH 是不同基因编码的， 但是可使用重 组方法通过人工肽接头将其连接起来， 使得它们被制造为单条蛋白链， 其中， VL 和 VH 区域 配对形成单价分子 ( 也被称为单链 Fv(scFv) ； 见， 例如， Bird et al.， 1988Science 242 ： 423-426 ； and Huston et al.， 1988Proc.Natl.Acad.Sci.85 ： 5879-5883)。 此类单链抗体包 括抗体的一个或多个 “抗原结合部分” 。 使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体 片段， 以与完整抗体相同方式筛选这些片段的效用。
抗原结合部分还可掺入单结构域抗体、 大抗体 (maxibodies)、 微型抗体、 胞内抗 体 (intrabodies)、 双抗体、 三抗体、 四抗体、 v-NAR 和双 -scFv( 见， 例如 Hollinger and Hudson， 2005， Nature Biotechnology， 23， 9， 1126-1136)。 抗体的抗原结合部分可移植到基 于多肽 ( 例如 III 型纤连蛋白 (Fn3)) 的骨架中 ( 见美国专利号 6,703,199， 其描述了纤连 蛋白多肽单抗体 (monobodies))。
抗原结合部分可掺入包含串联 Fv 区段对 (VH-CH1-VH-CH1) 的单链分子， 与互补轻 链多肽一起形成一对抗原结合区 (Zapata et al.， 1995Protein Eng.8(10) ： 1057-1062 和 美国专利号 5,641,870)。
术语 “骆驼抗体 (camelid antibody)”在本文中使用时表示从骆驼和单峰驼 (Camelus bactrianus 和 Calelus dromaderius) 家族的成员 ( 包括新世界的成员， 例如美 洲驼物种 (Lama paccos、 Lama glama 和 Lamavicugna)) 获得的完整抗体的一个或多个片 段。骆驼抗体的小的单可变结构域 ( 被鉴定为 VHH) 区域可通过遗传工程获得， 以产生具有 针对靶标的高度亲和性的小蛋白， 从而产生被称为 “骆驼纳米抗体” 的低分子量的、 源于抗 体的蛋白。见美国专利号 5,759,808 ； 还见 Stijlemans et al.， 2004 J.Biol. Chem.279 ： 1256-1261 ； Dumoulin et al.， 2003Nature 424 ： 783-788 ； Pleschberger et al.， 2003 Bioconjugate Chem.14 ： 440-448 ； Cortez-Retamozo et al.， 2002Int.J.Cancer 89 ： 456-62 和 Lauwereys.et al.， 1998 EMBO J.17 ： 3512-3520。
“经分离的 TrkB 激动剂抗体” 在本文中使用时指这样的结合分子， 其基本上没有具 有针对非 TrkB 的抗原的抗原特异性的分子 ( 例如， 经分离的抗体， 其特异性结合 TrkB， 但是 基本上没有特异性结合非 TrkB 的抗原的抗体 )。 但是， 经分离的特异性结合 TrkB 的结合分 子可具有对其它抗原 ( 例如， 来自其它物种的 TrkB 分子 ) 的交叉反应性。如果结合分子基 本上不含细胞物质， 那么该结合分子是 “经纯化的” 。
在本文中使用时， 术语 “人工程化抗体” 表示结合相同表位但是序列不同的抗体。 示例性技术包括通过 Kalobios 的人工程化技术生产的人工程化抗体， 其中， 抗原结合区域 的序列是通过例如突变获得的， 而非由于保守氨基酸置换获得。
在本文中使用时， “特异性结合 TrkB” 的 TrkB 激动剂抗体 ( 例如抗体或其抗原结 -7 合部分 ) 意欲表示以 1x10 M 或更低的 KD 与 TrkB 结合的 TrkB 激动剂抗体。与 “抗原交叉 -6 反应” 的 TrkB 激动剂抗体 ( 例如， 抗体或其抗原结合部分 ) 意欲表示以 1x10 M 或更低的 KD 与抗原结合的 TrkB 激动剂抗体。 “不与” 给定抗原 “交叉反应” 的 TrkB 激动剂抗体 ( 例 如， 抗体或其抗原结合部分 ) 意欲表示这样的 TrkB 激动剂抗体， 其与给定抗原的结合无法检测到， 或者其以 1x10-5M 或更高的 KD 与给定抗原结合。在某些实施方式中， 不与抗原交叉 反应的此类结合分子在标准结合测定中展示出基本上检测不到的针对这些蛋白的结合。
术语 “单克隆抗体组合物” 在本文中使用时表示单种分子组成的抗体分子的制备 物。单克隆抗体组合物展示出针对特定表位的单结合特异性和亲和性。
术语 “人抗体”在本文中使用时意欲包括具有可变区的抗体， 其中， 构架和 CDR 区源于人源序列。此外， 如果抗体含有恒定区， 恒定区也源于此类人序列， 例如， 人种系 (germline) 序列或人种系序列的突变形式。 本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基 酸残基 ( 例如， 通过随机或位点特异性诱变体外引入或通过体细胞突变体内引入的突变 )。 但是， 术语 “人抗体” 在本文中使用时不包括下述抗体 ： 其中， 源于另外的哺乳动物物种 ( 例 如小鼠 ) 的种系的 CDR 序列被移植到人构架序列上。
术语 “人单克隆抗体” 指这样的抗体， 其展示出单结合特异性， 具有可变区， 其中， 构架区和 CDR 区域都源于人序列。在一种实施方式中， 人单克隆抗体是通过杂交瘤产生的， 所述杂交瘤包括 ： 与永生化细胞融合的从转基因非人动物 ( 例如， 转基因小鼠， 其具有包含 人重链转基因和轻链转基因的基因组 ) 获得的 B 细胞。
术语 “重组人抗体” 在本文中使用时包括通过重组手段制备、 表达、 制造或分离 的任何人抗体， 例如， 从对于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物 ( 例如小鼠 ) 或由其制备的杂交瘤分离的抗体 ； 从经转化以表达人抗体的宿主细胞 ( 例如从转染瘤 (transfeetoma)) 分离的抗体 ； 从重组、 组合人抗体文库分离的抗体 ； 以及通过涉及将人免 疫球蛋白基因序列的全部或部分与另外的 DNA 序列剪接的任何其它手段制备、 表达、 制造 或分离的抗体。此类重组人抗体具有下述可变区， 其中， 构架和 CDR 区源于人种系免疫球蛋 白序列。但是， 在某些实施方式中， 此类重组人抗体可经历体外诱变 ( 或者当使用对人 Ig 序列转基因的动物时， 经历体内体细胞诱变 )， 由此， 重组抗体的 VH 和 VL 区域的氨基酸序列 是这样的序列 ： 虽然源于人种系 VH 和 VL 序列及与其相关， 但可不天然存在于人的人抗体种 系的全部组成部分 (repertoire) 中。
在本文中使用时， “同种型” 指重链恒定区基因编码的抗体类 ( 例如 IgM、 IgE、 IgG， 例如 IgG1 或 IgG4)。
短语 “识别抗原的抗体” 或 “对抗原特异性的抗体” 在本文中可与术语 “特异性结 合抗原的抗体” 互换使用。
在提到蛋白或肽时， 短语 “特异性 ( 或选择性 ) 结合” 抗体或 “特异性 ( 或选择性 ) 与 ...... 免疫反应” 指这样的结合反应， 其能确定蛋白质在异源蛋白群或其它生物制剂中 的存在。 因此， 在指定的免疫测定条件下， 指出的抗体以背景至少两倍的水平与特定蛋白结 合， 并且基本上不以显著的量与样品中存在的其它蛋白结合。在此类条件下与抗体的特异 性结合可能需要针对其与特定蛋白的特异性选择出的抗体。这种选择可通过扣除与例如 TrkA 或 TrkC 或神经营养蛋白受体 p75NR 交叉反应的抗体来实现。多种免疫测定形式可用 于选择能与特定蛋白特异性免疫反应的抗体。例如， 固相 ELISA 免疫测定常规用于选择能 与蛋白特异性免疫反应的抗体 ( 关于可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条 件的描述， 见例如 Harlow&Lane， Antibodies， A Laboratory Manual(1998))。典型地， 特异 性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍， 更典型地， 超过背景 10-100 倍以上。
术语 “抗体激动剂” 指这样的抗体， 其能活化受体以诱导出完全或部分的受体介导的应答。例如， TrkB 的激动剂与 TrkB 结合， 并且诱导 TrkB 介导的信号传导。在一些实施 方式中， 可通过其接触 SH-SY5Y 细胞时结合 TrkB 并诱导神经突长出的能力， 或按照本文所 述， 来鉴定针对激动剂的 TrkB 抗体。
本发明的多肽的 “活性” 指多肽在其天然细胞或组织中的结构、 调控或生物化学功 能。多肽的活性的例子包括直接活性和间接活性。示例性的直接活性是与多肽直接相互作 用的结果， 包括配体结合， 例如， BDNF 与配体结合结构域 (LBD) 的结合。
在本文中使用时， 提到 IgG 抗体时， 术语 “高度亲和性” 表示抗体针对靶抗原具有 -9 10 M 或更低的 KD。
如果核苷酸序列被改变， 以使用在生产细胞或生物 ( 通常是真核细胞， 例如， 酵 母 ( 例如毕赤酵母 (Pichia)) 的细胞， 昆虫细胞， 哺乳动物细胞， 例如， 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 或人细胞 ) 中优选的密码子来编码氨基酸序列的话， 该核苷酸序列就被称为 “经优化 的” 。经优化的核苷酸序列被工程改造， 以编码与原始起始核苷酸序列编码的氨基酸序列 ( 也被称为 “亲本” 序列 ) 相同或几乎相同的氨基酸序列。
下文章节中更详细地描述了本发明的多个方面。
用于评估分子结合多个物种的 TrkB( 特别是 TrkB 的表位 ) 的能力的标准测定法 是本领域已知的， 其包括， 例如 ELISAs 和 western 印迹。可利用肽表位竞争测定法， 来测定 TrkB 激动剂抗体是否结合 TrkB 的特异性表位。例如， 将 TrkB 激动剂抗体与对应于感兴趣 的 TrkB 表位的肽在肽的饱和浓度下一起孵育。针对与固定化的 TrkB 的结合， 对经预孵育 的 TrkB 激动剂抗体进行测试， 例如通过 分析来进行。 与肽预孵育对 TrkB 结合的 分析， 或通过 FACS 分 抑制表明， TrkB 激动剂抗体与肽表位结合 ( 见， 例如， 美国专利公开 20070072797)。还可通 过本领域已知的标准测定法来评估结合动力学， 例如通过 析来评估表观结合。下文中详细描述了评价 TrkB 激动性抗体对 TrkB 功能性质的影响的测 定法。
因此， 按照本领域已知的和本文描述的方法测定时， “抑制” 这些 TrkB 功能性质 ( 例如， 生物化学、 细胞、 生理或其它生物活性等等 ) 中一种或多种的 TrkB 激动剂抗体将被 理解为 ： 相对于在不存在结合分子的情况下 ( 例如， 当存在无关特异性的对照分子时 ) 观察 到的而言， 特定功能性质产生统计学上显著减少。抑制 TrkB 活性的 TrkB 激动剂抗体能实 现将测定参数统计学上显著减少至少 5％。在某些实施方式中， 拮抗抗体或其它 TrkB 激动 剂抗体可使得选择的功能性质较之对照减少至少 10％、 20％、 30％或 50％。
识别或促进 TrkB 活性的 TrkB 激动剂抗体实现将测量的参数统计学上显著地增加 至少 5％。在某些实施方式中， TrkB 激动剂抗体或其部分可使得选择的功能性质较之对照 增加至少 10％、 20％、 30％或 50％。
抗体
本文描述的抗 TrkB 抗体包括人单克隆抗体。在某些实施方式中， 与 TrkB 结合的 抗体的抗原结合部分 ( 例如 VH 和 VL 链 ) 是 “混合并匹配的” ， 以产生其它抗 TrkB 激动性抗 体。可使用前文所述的结合测定 ( 例如 ELISAs) 来测试此类 “混合并匹配的” 抗体的结合。 当选择 VH 与特定 VL 序列混合并匹配时， 典型地， 选择的 VH 与其在和该 VL 的配对中置换的 VH 结构上相似。类似地， 来自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长重链序列通常被结构上相 似的全长重链序列置换。类似地， 来自特定 VH/VL 配对的 VL 序列应当被结构上相似的 VL 序列置换。类似地， 来自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长轻链序列应当被结构上相似的 全长轻链序列置换。本文上下文中， 鉴定结构相似性是本领域公知的方法。
在其它方面， 本发明提供了以多种组合包含一种或多种 TrkB 结合抗体的重链和 轻链 CDR1s、 CDR2s 和 CDR3s 的抗体。鉴于这些抗体每条都可结合 TrkB， 并且抗原结合特 异性主要由 CDR1、 2 和 3 区域提供， VHCDR1、 2 和 3 序列和 VL CDR1、 2 和 3 序列可 “混合并匹 配” ( 即， 来自不同抗体的 CDRs 可混合并匹配 )。 可使用本文描述的结合测定 ( 例如 ELISAs) 来测试此类 “混合并匹配的” 抗体的 TrkB 结合。当 VH CDR 序列结合并匹配时， 来自特定 VH 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 序列应当被结构上相似的 CDR 序列置换。类似地， 当 VL CDR 序列混合并匹配时， 来自特定 VL 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 序列应当被结构上相似的 CDR 序列置换。本文上下文中， 鉴定结构相似性是本领域公知的方法。
在本文中使用时， 如果抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因作 为序列来源的系统获得的话， 人抗体包含重或轻链可变区或全长重或轻链， 其是特定种系 序列 “的产物” 或 “源于” 特定种系序列。在一种此类系统中， 人抗体是在携带人免疫球蛋白 基因的转基因小鼠中产生的。用感兴趣的抗原 ( 例如， TrkB 的表位 ) 免疫转基因。或者， 通过提供在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库并且用感兴趣的抗原 ( 例如 TrkB 的表 位 ) 筛选该文库， 来鉴定人抗体。
可通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列相比较， 并选择 序列上与人抗体的序列最接近 ( 即， 最高％同一性 ) 的人种系免疫球蛋白序列， 来鉴定是人 种系免疫球蛋白序列 “的产物” 的或 “源于” 其的人抗体。是特定人种系免疫球蛋白序列 “的 产物” 的或 “源于” 其的人抗体较之种系编码的序列可含有氨基酸差异， 所述差异例如由于 天然存在的体细胞突变或人工定点突变导致的。但是， 选择的人抗体典型地具有与人种系 免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少 90％同一性的氨基酸序列， 并且含有当与其它物种 的种系免疫球蛋白氨基酸序列 ( 例如小鼠种系序列 ) 比较时将人抗体鉴定为人的氨基酸残 基。在某些情况下， 人抗体在氨基酸序列上可与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有 至少 60％、 70％、 80％、 90％或至少 95％同一性， 或者甚至至少 96％、 97％、 98％或 99％同一 性。
两条序列间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数量的函数 ( 即， ％同一性 ＝相同位置 #/ 总位置 #x100)， 其中要考虑到空位数量和每个空位的长度， 需要引入这些空 位以对两条序列进行最优比对。使用 E.Meyers 和 W.Miller 的算法 (1988 Comput.Appl. Biosci.， 4： 11-17)， 来比较序列并且测定两条序列间的百分比同一性， 该算法已被整合到 ALIGN 程序 ( 版本 2.0)， 其中使用 PAM120 权重残值表， 空位长度罚分为 12， 空位罚分为 4。
典型地， 源于特定人种系序列的人抗体的 VH 或 VL 将展示出与人种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列相比不超过 10 个氨基酸差异。在某些情况下， 人抗体的 VH 或 VL 可展 示出与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过 5 个或者甚至不超过 4、 3、 2或1 个氨基酸差异。
骆驼抗体
已在大小、 结构复杂性和对人受试者的抗原性方面， 对从骆驼和单峰驼 (Camelus bactrianus 和 Calelus dromaderius) 家族的成员 ( 包括新世界的成员， 例如美洲驼物种 (Lamapaccos、 Lama glama 和 Lama vicugna)) 获得的抗体蛋白进行了表征。自然界中在该家族的哺乳动物中发现的某些 IgG 抗体缺少轻链， 并且由此在结构上与来自其它动物的抗 体典型的具有两条重链和两条轻链的四链四级结构有所不同。见 WO 94/04678。
骆驼抗体的小的单可变结构域 ( 被鉴定为 VHH) 区域可通过遗传工程获得， 以产 生具有针对靶标的高度亲和性的小蛋白， 从而产生被称为 “骆驼纳米抗体” 的低分子量的 源于抗体的蛋白质。见美国专利号 5,759,808 ； 还见 Stijlemans et al.， 2004 J.Biol. Chem.279 ： 1256-1261 ； Dumoulin et al.， 2003 Nature 424 ： 783-788 ； Pleschberger et al.， 2003Bioconj ugate Chem.14 ： 440-448 ； Cortez-Retamozo et al.， 2002Int.J.Cancer 89 ： 456-62 和 Lauwereys.et al.， 1998EMBO J.17 ： 3512-3520。骆驼抗体和抗体片段的工 程化文库可商业获得， 例如从 Ablynx， Ghent， Belgium 获得。和非人来源的其它抗体一样， 骆驼抗体的氨基酸序列可被重组改变， 以获得更接近于人序列的序列， 即， 纳米抗体可以是 “人源化的” 。因此， 骆驼抗体对人的天然低抗原性可被进一步降低。
骆驼纳米抗体具有大约是人 IgG 分子十分之一的分子量， 该蛋白具有仅数纳米的 物理直径。 小尺寸的一种后果是骆驼纳米抗体能结合对于较大抗体蛋白来说功能上不可见 的抗原位点， 即， 骆驼纳米抗体可用作为试剂， 以检测使用经典免疫技术检测不到的抗原， 以及可用作为可能的治疗剂。 因此， 小尺寸的另一结果是， 由于与靶蛋白的沟或窄缝中的特 异性位点结合， 骆驼纳米抗体可抑制靶蛋白， 以及由此可以以比典型抗体更接近典型低分 子量药物的功能的能力发挥作用。 低分子量和紧凑的大小进一步导致骆驼纳米抗体极其热稳定、 对极端 pH 和对蛋 白水解消化稳定， 和更少的抗原性。另一结果是， 骆驼纳米抗体易于从循环系统移动进组 织， 并且甚至穿过血脑屏障， 因此可治疗影响神经组织的病症。 纳米抗体可进一步协助药物 运输穿过血脑屏障。见 2004 年 8 月 19 日公开的美国专利公开号 20040161738。这些特征 与在人中的低抗原性组合表明了极大的治疗潜力。 此外， 这些分子可在原核细胞， 例如大肠 杆菌中完全表达。
因此， 本发明的特征是具有针对 TrkB 的高度亲和性的骆驼抗体或骆驼纳米抗体。 在本文某些实施方式中， 骆驼抗体或纳米抗体是在骆驼动物中天然产生的， 即， 使用本文所 述针对其它抗体的技术， 用 TrkB 或其肽片段进行免疫之后由骆驼产生的。或者抗 TrkB 的 骆驼纳米抗体是工程化的， 即， 通过选择， 例如， 使用淘选方法， 用本文描述的 TrkB 或 TrkB 表位作为靶标， 从展示经合适诱变的骆驼纳米抗体蛋白的噬菌体文库进行选择， 来生产抗 TrkB 的骆驼纳米抗体。可通过遗传工程对经工程化的纳米抗体进行进一步定制， 以将接受 的受试者中的半寿期从 45 分钟增加至 2 周。
双抗体
双抗体是二价的、 双特异性的分子， 其中， VH 和 VL 结构域在单条多肽链上表达， 它 们通过短到不允许相同链上两个结构域间配对的接头相连。VH 和 VL 结构域与另一条链的 互补结构域配对， 由此产生两个抗原结合位点 ( 见例如， Holliger et al.， 1993Proc.Natl. Acad.Sci.USA90 ： 6444-6448 ； Poljak et al.， 1994Structure 2 ： 1121-1123)。可通过在相 同细胞中表达具有结构 VHA-VLB 和 VHB-VLA(VH-VL 构型 ) 或 VLA-VHB 和 VLB-VHA(VL-VH 构型 ) 的两 条多肽链， 来产生双抗体。它们中的大多数可以以可溶形式在细菌中表达。
单链双抗体 (scDb) 是通过用大约 15 个氨基酸残基的接头将两条形成双抗体的 多肽链连接起来而产生的 ( 见 Holliger and Winter， 1997Cancer Immunol.Immunother.，
45(3-4) ： 128-30 ； Wu et al.， 1996Immunotechnology， 2(1) ： 21-36)。 scDb 可以以可溶的活 性单体形式在细菌中表达 ( 见 Holliger and Winter， 1997Cancer Immunol.Immunother.， 45(34) ： 128-30 ； Wu et al.， 1996Immunotechnology， 2(1) ： 21-36 ； Pluckthun and Pack， 1997Immunotechnology ， 3(2) ： 83-105 ； Ridgway et al. ， 1996Protein Eng. ， 9(7) ： 617-21)。
双抗体可与 Fc 融合， 产生 “双双抗体” ( 见 Lu et al.， 2004J.Biol.Chem.， 279(4) ： 2856-65)。
经工程化和修饰的抗体
可使用具有一条或多条 VH 和 / 或 VL 序列的抗体作为起始材料， 对经修饰的抗体工 程化， 来制备本发明的抗体， 其中所述经修饰的抗体具有与起始抗体不同的性质。 可通过修 饰一个或全部两个可变区 ( 即， VH 和 / 或 VL) 中 ( 例如， 一个或多个 CDR 区域中和 / 或一个 或多个构架区中 ) 的一个或多个残基， 来对抗体工程化。此外或备选地， 可通过修饰恒定区 内的残基， 来对抗体进行工程化， 例如， 以改变抗体的效应功能。
可进行的一种类型的可变区工程化是 CDR 移植。抗体主要通过位于六个重链和轻 链 CDRs 中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此， 在各抗体间 CDRs 内的氨基酸序列要比 CDRs 外的序列更具多样性。因为 CDR 序列负责大部分抗体 - 抗原相互作用， 因此可通过构 建下述表达载体， 来表达模拟特异性的天然存在的抗体的性质的重组抗体， 所述表达载体 包括移植到来自具有不同性质的不同抗体的构架序列上的、 来自特异性的天然存在的抗体 的 CDR( 见， 例如 Riechmann et al.， 1998Nature 332 ： 323-327 ； Jones et al.， 1986Nature 321 ： 522-525 ； Queen et al.， 1989Proc.Natl.Acad. See.U.S.A.86 ： 10029-10033 ； 美国专 利号 5,225,539 和美国专利号 5,530,101、 5,585,089、 5,693,762 和 6,180,370)。
构 架 序 列 可 从 公 开 的 DNA 数 据 库 或 公 开 的 文 献 ( 包 括 种 系 抗 体 基 因 序 列 ) 中 获 得。 例 如， 针 对 人 重 链 和 轻 链 可 变 区 基 因 的 种 系 DNA 序 列 可 在 “VBase”人 种 系 序 列 数 据 库 ( 可 在 Internet 上 于 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 获 得 ) 中 找 到， 以 及 在 Kabat et al.， 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest， Fifth Edition， U.S.Department of Health and Human Services， NIH Publication No.91-3242 ； Tomlinson et al.， 1992 J.Mol.Biol.227 ： 776-798 和 Cox et al.， 1994Eur. J.Immunol.24 ： 827-836 中找到 ； 它们每篇的内容都通过引用明确并入本文。
VH CDR1、 2 和 3 序列和 VL CDR1、 2 和 3 序列可被移植到下述构架区上， 所述构架区 具有与构架序列来源的种系免疫球蛋白基因中所发现的相同的序列， 或者 CDR 序列可被移 植到较之种系序列而言含有一处或多处突变的构架区上。例如， 已经发现， 在某些情况下， 在构架区内突变残基以保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的 ( 见， 例如， 美国专利号 5,530,101、 5,585,089、 5,693,762 和 6,180,370)。
还可将 CDRs 移植进并非免疫球蛋白结构域的多肽的构架区中。合适的骨架形 成构象上稳定的构架， 其展示移植的残基， 使得它们形成局部表面， 并且结合感兴趣的 靶标 ( 例如 TrkB)。例如， 可将 CDRs 移植到骨架上， 其中， 构架区基于纤连蛋白、 锚蛋白 (ankyrin)、 脂质运载蛋白 (lipocalin)、 neocarzinostain、 细胞色素 b、 CP1 锌指、 PST1、 卷 曲 螺 旋、 LACI-D1、 Z 结 构 域 或 tendramisat( 见 例 如 Nygren and Uhlen， 1997Current Opinion in Structural Biology， 7， 463-469)。另一种类型的可变区修饰是对 VH 和 / 或 VL CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 区域中的氨基 酸残基加以突变， 由此改善感兴趣的抗体的一种或多种结合性质 ( 例如亲和性 )， 这被称为 “亲和性成熟” 。可进行位点定向诱变或 PCR 介导的诱变， 以引入突变， 可在本文所述的体外 或体内测定中评价对抗体结合或其它感兴趣的功能性质的影响。可引入保守修饰。突变可 以是氨基酸取代、 添加或缺失。此外， 典型地， 在 CDR 区域中改变不超过一个、 两个、 三个、 四 个或五个残基。
本发明的经工程化的抗体包括在 VH 和 / 或 VL 中的构架残基中进行了修饰的那些， 例如， 以改善抗体的性质。典型地， 进行此类构架修饰， 以减少抗体的免疫原性。例如， 一种 方法是将一个或多个构架残基 “回复突变 (backmutated)” 成相应的种系序列。更具体地， 经历体细胞突变的抗体可含有不同于抗体所源于的种系序列的构架残基。 可通过将抗体构 架序列与抗体所源于的种系序列加以比较， 来鉴定此类残基。为将构架区序列返回至其种 系构型， 可通过， 例如， 位点定向诱变或 PCR 介导的诱变， 将体细胞突变 “回复突变” 成种系 序列。此类 “回复突变” 的抗体也是本发明所包括的。
另一类型的构架修饰包括对构架区内或者甚至一个或多个 CDR 区域内的一个或 多个残基加以突变， 以除去 T- 细胞表位， 由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法还被称为 “去免疫化” ， 在 Carr et al. 的美国专利公开号 20030153043 中对其有更详细的描述。
除了构架或 CDR 区域中进行的修饰之外， 或备选地， 可对本发明的抗体进行工程 化， 以在 Fc 区域内包括修饰， 典型地， 用于改变抗体的一种或多种功能性质， 例如， 血清半 寿期、 补体固定、 Fc 受体结合和 / 或抗原依赖性细胞毒性。此外， 本发明的抗体可被化学修 饰 ( 例如， 可向抗体连接一个或多个化学部分 )， 或被修饰以改变其糖基化， 再次改变抗体 的一种或多种功能性质。
在一种实施方式中， 对 CH1 的铰链区加以修饰， 使得铰链区的半胱氨酸残基的数 量被改变， 例如， 增加或减少。 该方法由 Bodmer et al. 进一步描述于美国专利号 5,677,425 中。CH1 的铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变， 以例如促进轻链和重链的装配， 或者增加 或减少抗体的稳定性。
在另一实施方式中， 抗体的 Fc 铰链区被突变， 以减少抗体的生物半寿期。更具体 地， 一个或多个氨基酸突变被引入 Fc 铰链片段的 CH2-CH3 结构域界面区域， 使得抗体较之 天然 Fc- 铰链结构域 SpA 结合而言具有受损的葡萄球菌蛋白 A(SpA) 结合。该手段在 Ward et al. 的美国专利号 6,165,745 中被更详细地描述。
在另一实施方式中， 抗体被修饰， 以增加其生物半寿期。多种方法是可能的。例 如， 美国专利号 6,277,375 描述了在 IgG 中增加其体内半寿期的如下突变 ： T252L、 T254S、 T256F。 或者， 为了增加生物半寿期， 可在 CH1 或 CL 区域中对抗体加以改变， 以含有取自 IgG 的 Fc 区域的 CH2 结构域的两个环的挽救受体结合表位， 如 Presta et al. 的美国专利号 5,869,046 和 6,121,022 所述。
在另外一些实施方式中， 通过用不同的氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改 变 Fc 区域， 以改变抗体的效应功能。例如， 可用不同的氨基酸残基置换一个或多个氨基酸， 使得抗体具有改变的针对效应配体的亲和性， 但是仍然保留亲本抗体的抗原结合能力。针 对其的亲和性被改变的效应配体可以是， 例如， Fc 受体或补体的 C1 组分。该方法在 Winter et al. 的美国专利号 5,624,821 和 5,648,260 中被更详细地描述。在另一个实施方式中， 可用不同的氨基酸残基置换选自氨基酸残基的一个或多个 氨基酸， 使得抗体具有改变的 C1q 结合和 / 或降低或消失的补体依赖性细胞毒性 (CDC)。 该 方法在 Idusogie et al. 的美国专利号 6,194,551 中更详细地描述。
在另一实施方式中， 对一个或多个氨基酸残基加以改变， 从而改变抗体的补体固 定能力。该方法在 Bodmer et al. 的 WO 94/29351 中被更详细地描述。
在另一实施方式中， 通过修饰一个或多个氨基酸， 对 Fc 区域加以修饰， 以增加抗 体介导抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的能力， 和 / 或增加抗体对 Fcγ 受体的亲和性。该方 法在 Presta 的 WO 00/42072 中被更进一步地描述。此外， 人 IgG1 上针对 FcγRl、 FeγRII、 FcγRIII 和 FeRn 的结合位点已被作图， 并且已经描述了具有改善的结合的变体 ( 见 Shields， R.L.et al.， 2001 J.Biol.Chem.276 ： 6591-6604)。
在再一种实施方式中， 对抗体的糖基化加以修饰。例如， 可产生非糖基化的抗体 ( 即， 所述抗体缺乏糖基化 )。可对糖基化加以改变， 例如以增加抗体对抗原的亲和性。可 例如通过改变抗体序列内一个或多个糖基化位点， 来完成此类碳水化合物修饰。 例如， 可进 行一个或多个氨基酸取代， 导致消除一个或多个可变区构架糖基化位点， 由此消除该位点 的糖基化。此类无糖基化可增加抗体对抗原的亲和性。此类方法在 Co et al. 的美国专利 号 5,714,350 和 6,350,861 中被更详细地描述。
此外或备选地， 产生具有改变的糖基化类型的抗体， 例如， 具有降低量的岩藻糖基 残基的岩藻糖基化不足的抗体， 或者具有增加的二分 GlcNac 结构的抗体。此类改变的糖 基化模式已被证实能增加抗体的 ADCC 能力。此类碳水化合物修饰可通过， 例如， 在具有改 变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。 具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中 被描述过， 其可用作为宿主细胞， 其中， 表达本发明的重组抗体， 由此产生具有改变的糖基 化的抗体。例如， Hang et al. 的 EP 1， 176,195 描述了具有功能破坏的 FUT8 基因 ( 其编 码岩藻糖基转移酶 ) 的细胞系， 使得在此类细胞系中表达的抗体展示出岩藻糖基化不足。 Presta 的 PCT Pub.WO 03/035835 描述了变体 CHO 细胞系 Lecl3 细胞， 其将岩藻糖连接到 Asn(297) 相连的碳水化合物上的能力降低， 还导致该宿主细胞中表达的抗体岩藻糖基化不 足 ( 还见 Shields， R.L.et al.， 2002 J.Biol.Chem.277 ： 26733-26740)。Umana et al. 的 WO 99/54342 描述了经工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶 ( 例如， β(1， 4)-N 乙酰葡糖 胺基转移酶 III(GnTIII)) 的细胞系， 使得经工程化的细胞系中表达的抗体展示出增加的 二分 GlcNac 结构， 这导致抗体增加的 ADCC 活性 ( 还见 Umana et al.， 1999Nat.Biotech.17 ： 176-180)。
本发明包括的对本文中抗体的另一修饰是聚乙二醇化。可对抗体聚乙二醇化， 以 例如增加抗体的生物 ( 例如血清 ) 半寿期。为对抗体进行聚乙二醇化， 典型地， 用聚乙二醇 (PEG)， 例如 PEG 的反应性酯或醛衍生物， 与抗体或其片段反应， 该反应在一个或多个 PEG 部 分与抗体或抗体片段连接的条件下进行。可使用反应性 PEG 分子 ( 或类似的反应性水溶性 聚合物 )， 通过酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。在本文中使用时， 术语 “聚乙二 醇” 意欲包括已被用于衍生化其它蛋白的任何形式的 PEG， 例如， 单 (C1-C10) 烷氧基或芳氧 基 - 聚乙二醇或聚乙二醇马来亚酰胺。在某些实施方式中， 将被聚乙二醇化的抗体是非糖 基化的抗体。用于对蛋白进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的， 其可应用于本发明的抗 体。见， 例如， Nishimura et al. 的 EP 0 154 316 和 Ishikawa et al. 的 EP 0 401 384。此外， 可通过引入非天然氨基酸， 在本发明的 TrkB 结合多肽的任何部分实现聚 乙二醇化。可通过 Deiters et al.， J Am Chem Soc125 ： 11782-11783， 2003 ； Wang and Schultz， Science 301 ： 964-967， 2003 ； Wang et al.， Science 292 ： 498-500， 2001 ； Zhang et al.， Science 303 ： 371-373， 2004 或美国专利号 7,083,970 描述的技术引入某些非天然 氨基酸。 简言之， 这些表达系统中的一些涉及位点定向诱变， 以向编码本发明的多肽的可读 框中引入无义密码子， 例如， 琥珀 TAG。然后再将此类表达载体引入可利用对引入的无义密 码子来说具有特异性的 tRNA 的宿主， 并装载选择的非天然氨基酸。对将部分与本发明的多 肽缀合的目的有益的特定的非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮化物侧链的那些。 然后可在 蛋白中这些选择的位点上对含有这些新的氨基酸的多肽进行聚乙二醇化。
对抗体进行工程化的方法
如上文所讨论的， 可使用抗 TrkB 抗体， 通过修饰全长重链和 / 或轻链序列、 VH 和 / 或 VL 序列或与其连接的恒定区来产生新的抗 TrkB 抗体。例如， 可将抗体的一个或多个 CDR 区域与已知的构架区和 / 或其它 CDRs 重组组合， 以产生新的、 经重组工程化的抗 TrkB 抗 体。其它类型的修饰包括前文章节中描述的那些。用于工程化方法的起始材料是 VH 和 / 或 VL 序列中的一条或多条或者其一个或多个 CDR 区域。为制造经工程化的抗体， 并不一定要 实际制备出具有 VH 和 / 或 VL 序列中的一条或多条或者其一个或多个 CDR 区域的抗体 ( 即， 作为蛋白质表达 )。而是， 用序列中含有的信息作为起始材料， 以制造源于原始序列的 “第 二代” 序列， 然后制备 “第二代” 序列， 并将其表达为蛋白质。
可使用标准分子生物学技术来制备和表达改变的抗体序列。 改变的抗体序列编码 的抗体是保留了其所源于的抗 TrkB 抗体的一种、 一些或全部功能性质的抗体， 所述功能性 质包括但不限于 ： 与 TrkB 特异性结合、 干扰 TrkB 结合神经营养蛋白 ( 例如 BDNF) 的能力以 及调节 TrkB 二聚化和在其细胞内结构域上酪氨酸残基自身磷酸化的能力， 如本文所述。可 使用本领域可获得的和 / 或本文描述的标准测定法 ( 例如 ELISAs) 来评估改变的抗体的功 能性质。
在本发明的对抗体进行工程化的方法的某些实施方式中， 在抗 TrkB 抗体编码序 列的全部或部分上随机或选择性引入突变， 可针对结合活性和 / 或其它功能性质 ( 与 TrkB 特异性结合、 干扰 TrkB 结合神经营养蛋白 ( 例如 BDNF) 的能力以及调节 TrkB 二聚化和在其 细胞内结构域上酪氨酸残基自身磷酸化的能力， 如本文所述 )， 对得到的经修饰的抗 TrkB 抗体加以筛选。突变方法在本领域中已有描述。例如， Short 的 PCT 公开 WO02/092780 描 述了使用饱和诱变、 合成连接装配或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。 或者， Lazar et al. 的 WO 03/074679 描述了使用计算机筛选方法来优化抗体的物理化学性质的方法。
非抗体 TrkB 激动性抗体
本发明还提供了展示出抗体的功能性质但是其构架和抗原结合部分源于其它多 肽 ( 例如并非是抗体基因编码的那些， 也不是抗体基因体内重组产生的那些的多肽 ) 的 TrkB 激动性抗体。这些结合分子的抗原结合结构域 ( 例如 TrkB 结合结构域 ) 是通过定向 进化方法产生的。见， 美国专利号 7,115,396。具有与抗体的可变结构域类似的总体折叠 (“免疫球蛋白样” 折叠 ) 的分子是合适的骨架蛋白。适合得到抗原结合分子的骨架蛋白包 括纤连蛋白或纤连蛋白二聚体、 生腱蛋白、 N- 钙黏着蛋白、 E- 钙黏着蛋白、 ICAM、 肌联蛋白、 GCSF- 受体、 细胞因子受体、 糖苷酶抑制剂、 抗生素色蛋白、 髓磷脂膜粘附分子 P0、 CD8、 CD4、CD2、 I 类 MHC、 T- 细胞抗原受体、 CD1、 C2 和 VCAM-1 的 I- 组结构域、 肌球蛋白结合蛋白 C 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 肌球蛋白结合蛋白 H 的 I- 组免疫球蛋白结构域、 端蛋白的 I- 组 免疫球蛋白结构域、 NCAM、 颤搐蛋白、 神经胶质蛋白、 生长激素受体、 促红细胞生成素受体、 促乳素受体、 干扰素 -γ 受体、 - 半乳糖苷酶 / 葡糖苷酸酶、 - 葡糖苷酸酶、 转谷氨酰胺酶、 T- 细胞抗原受体、 超氧化物歧化酶、 组织因子结构域、 细胞色素 F、 绿色荧光蛋白、 GroEL 或 奇甜蛋白。
非抗体结合分子的抗原结合结构域 ( 例如免疫球蛋白样折叠 ) 可具有小于 10kD 或大于 7.5kD 的分子量 ( 例如， 7.5-10kDa 之间的分子量 )。用于获得抗原结合结构域的蛋 白是天然存在的哺乳动物蛋白 ( 例如人蛋白 )， 较之其源于的蛋白的免疫球蛋白样折叠而 言， 抗原结合结构域包括多达 50％ ( 例如， 多达 34％、 25％、 20％或 15％ ) 的经突变的氨基 酸。具有免疫球蛋白样折叠的结构域通常由 50-150 个氨基酸 ( 例如， 40-60 个氨基酸 ) 构 成。
为产生非抗体结合分子， 产生克隆文库， 其中， 对骨架蛋白中形成抗原结合表面的 区域 ( 例如， 在位置和结构上与抗体可变结构域免疫球蛋白折叠的 CDRs 类似的区域 ) 中的 序列进行随机化。针对与感兴趣的抗原 ( 例如 TrkB) 的特异性结合以及针对其它功能 ( 例 如抑制 TrkB 的生物功能 )， 对文库克隆加以测试。 选择的克隆可用作为基础， 用于进一步的 随机化和选择， 以产生对抗原有更高亲和力的衍生物。选择方案的一个例子被描述于美国 专利号 6,207,446 中。 产生高度亲和性结合分子， 例如， 使用纤连蛋白 III 的第 10 个模块 (10Fn3) 作为骨 架。针对 10FN3 的三个 CDR 样环中的每一个， 在残基 23-29、 52-55 和 78-87 处构建文库。为 构建每种文库， 通过寡核苷酸合成对编码与每个 CDR 样区域重叠的序列的 DNA 区段随机化。 用于产生可选择 10Fn3 的文库的技术被描述于美国专利号 6,818,418 和 7,115,396 ； Roberts and Szostak， 1997Proc.Natl.Acad.Sci USA 94 ： 12297 ； 美国专利号 6,261,804 ； 美国专利 号 6,258,558 和 Szostak et al.WO98/31700 中。
非抗体结合分子可作为二聚体或多聚体产生， 以增加对靶抗原的亲合力。 例如， 抗 原结合结构域作为与抗体的恒定区 (Fc) 的融合物表达， 其形成 Fc-Fc 二聚体。见例如美国 专利号 7,115,396。
编码本发明的抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明的 TrkB 激动性抗体的核酸分子。核酸可存在 全细胞中、 细胞裂解物中， 或可以是经部分纯化的或基本上纯的形式的核酸。 当通过标准技 术 ( 包括碱 /SDS 处理、 CsCl 显带、 柱层析、 琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其它技术 ) 纯化 去除其它细胞组分或其它污染物， 例如， 其它细胞核酸或蛋白质时， 核酸就是 “经分离的” 或 “使得为基本上纯的” 。见 F.Ausubel， et al.， ed.1987 Current Protocols in Molecular Biology， Greene Publishing and Wiley Interscience， New York。 本发明的核酸可以是， 例如， DNA 或 RNA， 并且可以含有或可以不含内含子序列。在一种实施方式中， 核酸是 cDNA 分子。核酸可以存在于载体中， 例如噬菌体展示载体或重组质粒载体中。
可使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸。对于通过杂交瘤 ( 按照下文 进一步描述的， 从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤 ) 表达的抗体而言， 可通过标准 PCR 扩增或 eDNA 克隆技术， 获得编码通过杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的
eDNA。对于从免疫球蛋白基因文库 ( 例如使用噬菌体展示技术 ) 获得的抗体而言， 可从是 文库成员的多个噬菌体克隆回收编码抗体的核酸。
一旦获得了编码 VH 和 VL 区段的 DNA 片段， 可通过标准重组 DNA 技术， 对这些 DNA 片段进行进一步操作， 例如以将可变区基因转化为全长抗体链基因， 转化为 Fab 片段基因 或 scFv 基因。在这些操作中， 将编码 VL 或 VH 的 DNA 片段与另外的 DNA 分子或编码另外的 蛋白质的片段 ( 例如抗体恒定区或柔性接头 ) 有效连接。术语 “有效连接” 在本文上下文 中使用时意欲表示两条 DNA 片段以功能性方式相连， 例如， 使得两条 DNA 片段编码的氨基酸 序列保持符合读码框， 或者使得蛋白在想要的启动子的控制下表达。
可通过将编码 VH 的 DNA 与编码重链恒定区 (CH1、 CH2 和 CH3) 的另外的 DNA 分子有 效连接， 将编码 VH 区域的经分离的 DNA 转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是 本领域已知的 ( 见， 例如 Kabat et al.， 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest， Fifth Edition， U.S.Department of Health and Human Services， NIH Publication No.91-3242)， 包含这些区域的 DNA 片段可通过标准 PCR 扩增获得。重链恒定 区可以是 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA、 IgE、 IgM 或 IgD 恒定区。对于 Fab 片段重链基因而 言， 可将编码 VH 的 DNA 与仅编码重链 CH1 恒定区的另外的 DNA 分子有效连接。
可通过将编码 VL 的 DNA 与编码轻链恒定区 CL 的另外的 DNA 分子有效连接， 将 编码 VL 区域的经分离的 DNA 转化为全长轻链基因 ( 以及 Fab 轻链基因 )。人轻链恒定 区基因的序列是本领域已知的 ( 见， 例如 Kabat et al.， 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest， Fifth Edition， U.S.Department of Health and Human Services， NIH Publication No.91-3242)， 包含这些区域的 DNA 片段可通过标准 PCR 扩增 获得。轻链恒定区可以是 κ 或 λ 恒定区。
为产生 scFv 基因， 将编码 VH 和 VL 的 DNA 片段与编码柔性接头 ( 例如， 编码氨基酸 序列 (Gly4-Ser)3) 的另外的片段有效连接， 使得 VH 和 VL 序列可作为连续的单链蛋白表达， 其中 VL 和 VH 区域通过柔性接头相连 ( 见， 例如， Bird et al.， 1988Science 242 ： 423-426 ； Huston et al.， 1988Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5879-5883 ； McCafferty et al.， 1990Nature348 ： 552-554)。
单克隆抗体产生
可 通 过 多 种 技 术，包 括 传 统 单 克 隆 抗 体 方 法，例 如 Kohler 和 Milstein(1975Nature， 256 ： 495) 的标准体细胞杂交技术， 或使用文库展示方法， 例如噬菌 体展示， 来产生单克隆抗体 (mAbs)。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是已良好建立的方 法。免疫方案和用于分离经免疫的脾细胞用于融合的技术是本领域已知的。融合伴侣 ( 例 如鼠骨髓瘤细胞 ) 和融合步骤也是已知的。
可基于按照上文所述制备的鼠单克隆抗体的序列， 来制备本发明的嵌合或人源化 抗体。 可从感兴趣的鼠杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的 DNA， 并使用标准分子生物 学技术对其加以人工改造， 使其含有非鼠 ( 例如人 ) 免疫球蛋白序列。例如， 为产生嵌合抗 体， 可使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区相连 ( 见例如 Cabilly et al. 的美国 专利号 4,816,567)。为产生人源化抗体， 可使用本领域已知的方法， 将鼠 CDR 区域插入人 构架。见， 例如， 美国专利号 5,225,539 和美国专利号 5,530,101、 5,585,089、 5,693,762 和6,180,370。
在某实施方式中， 本发明的抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小 鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠， 来产生针对 TrkB 的此类人单克隆抗体。这些转基 因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称为 HuMAb 小鼠和 KM 小鼠的小鼠， 它们被合称为 “人 Ig 小鼠” 。
HuMAb 小鼠 (Medarex， Inc.) 含有人免疫球蛋白基因微基因座， 其编码未经重排 的人重 (μ 和 γ) 链和 K 轻链免疫球蛋白序列， 以及使得内源 μ 和 K 链基因座失活的靶 向突变 ( 见， 例如 Lonberg et al.， 1994Nature368(6474) ： 856-859)。因此， 小鼠展示出小 鼠 IgM 或 K 的降低的表达， 并且应答于免疫， 引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体 细胞突变， 产生高亲和性的人 IgGK 单克隆 (Lonberg， N.et al.， 1994supra ； reviewed in Lonberg， N.， 1994Handbook of Experimental Pharmacology113 ： 49-101 ； Lonberg， N.and Huszar， D.， 1995Intern.Rev.Immunol.13 ： 65-93 和 Harding， F.and Lonberg， N.， 1995Ann. N.Y.Acad.Sci.764 ： 536-546)。Taylor， L.et al.， 1992 Nucleic Acids Research 20 ： 6287-6295 ； Chen， J.et at.， 1993 International Immunology 5 ： 647-656 ； Tuaillon et al.， 1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94 ： 3720-3724 ； Choi et al.， 1993Nature Genetics 4： 117-123 ； Chen ， J.et al. ， 1993 EMBO J.12 ： 821-830 ； Tuaillon et al. ， 1994J. Immunol.152 ： 2912-2920 ； Taylor， L.et al.， 1994International Immunology 579-591 和 Fishwild， D.et al.， 1996Nature Biotechnology 14 ： 845-851 中进一步描述了 HuMAb 小 鼠的制备和使用以及此类小鼠携带的基因组修饰， 这些文献的所有内容都通过引用整体 明确并入本文。还见， Lonberg 和 Kay 的美国专利号 5,545,806、 5,569,825、 5,625,126、 5,633,425 、 5,789,650 、 5,877,397 、 5,661 ， 016 、 5,814,318 、 5,874,299 和 5,770,429 ； Surani et al. 的美国专利号 5,545,807 ； Lonberg and Kay 的 PCT 公开号 WO92103918、 WO 93/12227、 WO 94/25585、 WO 97113852、 WO 98/24884 和 WO 99/45962 ； 和 Korman et al. 的 PCT 公开号 WO 01/14424。
在另一实施方式中， 可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小 鼠， 例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠， 来产生本发明的人抗体。 此类小鼠在 本文中被称为 “KM 小鼠” ， 在 WO 02/43478 中有详细描述。
此外， 本领域中可获得表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物体系， 它们可用 于产生本发明的抗 TrkB 抗体。例如， 可使用被称为 (Abgenix， Inc.) 的备 选的转基因系统。 此类小鼠被描述于例如 Kucherlapati et al. 的美国专利号 5,939,598、 6,075,181、 6,114,598、 6， 150,584 和 6,162,963 中。 此外， 本领域中可获得表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物体系， 它们可 用于产生本发明的抗 TrkB 抗体。例如， 可使用携带人重链染色体和人轻链染色体两者的 小鼠， 它们被称为 “TC 小鼠” ； 此类小鼠描述于 Tomizuka et al.， 2000Proc.Natl.Acad. Sci.USA 97 ： 722-727 中。此外， 本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的奶牛 (Kuroiwa et al.， 2002Nature Biotechnology 20 ： 889-894)， 它们也可用于产生本发明的 TrkB 抗体。
还可使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法， 来制备本发明的 人单克隆抗体。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法是本领域中已经建立的。见例如
Ladner et al. 的美国专利号 5,223,409、 5,403,484 和 5,571,698 ； Dower et al 的美国专 利号 5,427,908 和 5,580,717 ； McCafferty et al. 的美国专利号 5,969,108 和 6,172,197 以 及 Griffiths et al. 的 美 国 专 利 号 5,885,793、 6,521,404、 6,544,731、 6,555,313、 6,582,915 和 6,593,081。筛选文库与全长 TrkB 或 TrkB 的特定表位的结合。
还可使用 SCID 小鼠 ( 已向其中重建了人免疫细胞， 使得免疫时可产生人抗体应 答 ) 来制备本发明的人单克隆抗体。此类小鼠被例如描述于 Wilson et al. 的美国专利号 5,476,996 和 5,698,767 中。
在人 Ig 小鼠中产生人单克隆抗体
可将在原核细胞 ( 例如大肠杆菌 ) 或真核细胞 ( 例如哺乳动物细胞， 例如 HEK293 细胞 ) 中表达的经纯化的重组人 TrkB 用作为抗原。可将蛋白与载体 ( 例如匙孔血蓝蛋白 (KLH)) 缀合。
使用 HuMab 转基因小鼠的 HCo7、 HCo12 和 HCo17 品种和转基因转染色体小鼠的 KM 品种 ( 每种都表达人抗体基因 )， 来制备 TrkB 的完全人单克隆抗体。在每种这些小鼠 品种中， 可按照 Chen et al.， 1993 EMBOJ.12 ： 811-820 所述， 纯合破坏内源小鼠 κ 轻链基 因， 以及可按照 WO01109187 的实施例 1 所述， 纯合破坏内源小鼠重链基因。这些小鼠品种 中的每种携带 κ 轻链转基因 KCo5， 如 Fishwild et al.， 1996Nature Biotechnology 14 ： 845-851 所述。HCo7 品种携带 HCo7 人重链转基因， 如美国专利号 5,545,806、 5,625,825 和 5,545,807 所述。HCo12 品种携带 HCo12 人重链转基因， 如 WO 01/09187 的实施例 2 所述。 HCo17 品种携带 HCo17 人重链转基因。KNM 品种含有 SC20 转染色体， 如 WO 02/43478 所述。
为产生针对 TrkB 的完全人单克隆抗体， 用经纯化的重组 TrkB、 TrkB 片段或其缀合 物 ( 例如 TrkB-KLH) 作为抗原， 对 HuMab 小鼠和 KM 小鼠加以免疫。用于 HuMab 小鼠的一般 免疫方案被描述于 Lonberg， N.et al.， 1994 Nature 368(6474) ： 856-859 ； Fishwild， D.et al.， 1996Nature Biotechnology 14 ： 845-851 和 WO 98/24884 中。首次输注抗原时， 小鼠 为 6-16 周龄。用抗原的经纯化的重组制备物 (5-50μg) 在腹膜腔内、 皮下 (Sc) 或通过足 垫注射免疫 HuMab 小鼠和 KM 小鼠。
用完全弗氏佐剂或 Ribi 佐剂中的抗原， 以腹膜内 (IP)、 皮下 (Sc) 或通过足垫 (FP) 的方式， 对转基因小鼠进行两次免疫， 接着用不完全弗氏佐剂或 Ribi 佐剂中的抗原， 进行 3-21 天的 IP、 Sc 或 FP 免疫 ( 可多达总共 11 次免疫 )。通过眼窝后采血， 监测免疫应 答。通过 ELISA 筛选血浆， 用具有足够抗 TrkB 人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。在处死 和移除脾脏前 3 天和 2 天， 用抗原对小鼠进行静脉内强化。典型地， 每种抗原进行 10-35 次 融合。针对每种抗原对若干打小鼠进行免疫。用 TrkB 对总共 82 只 HCo7、 HCo12、 HCo17 和 KM 小鼠品种进行免疫。
为选择产生结合 TrkB 的抗体的 HuMab 或 KM 小鼠， 按照 Fishwild，D.et al.， 1996 所述， 通过 ELISA 测试来自经免疫小鼠的血清。简言之， 用经纯化的重组 TrkB(1-2μg/ml， PBS 中 ) 以 50μl/ 孔包被微量滴定板， 4℃孵育过夜， 然后用 PBS/Tween(0.05％ ) 中的 5％ 鸡血清以 200μl/ 来封闭。将来自经 TrkB 免疫小鼠的血浆的稀释液加入到每个孔中， 在环 境温度孵育 1-2 小时。用 PBS/Tween 洗板， 然后用与辣根过氧化物酶 (HRP) 缀合的山羊抗 人 IgG Fc 多克隆抗体室温下孵育 1 小时。洗涤之后， 用 ABTS 底物 (Sigma， A-1888， 0.22mg/ ml) 处理板， 通过分光光度计在 OD 415-495 进行分析。 产生最高效价的抗 TrkB 抗体的小鼠的脾细胞被用于融合。进行融合， 通过 ELISA 测试杂交瘤上清液的抗 TrkB 活性。
基于标准方案， 用 PEG 将从 HuMab 小鼠和 KM 小鼠分离出的小鼠脾细胞融合至小 鼠骨髓瘤细胞系。然后针对抗原特异性抗体的产生， 对得到的杂交瘤加以筛选。用 50％ PEG(Sigma)， 将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与四分之一量的 SP2/0 非分 泌小鼠骨髓瘤细胞 (ATCC， CRL 1581) 融合。将细胞以 1x105/ 孔接种到平底微量滴定板上， 接着在选择培养基中孵育大约 2 周， 所述培养基含有 10％胎牛血清、 10％ P388D 1(ATCC， CRL TIB-63) 条件培养基、 DMEM 中的 3-5％ (IGEN)(Mediatech， CRL 10013， 具有 高葡萄糖、 L- 谷氨酰胺和丙酮酸钠 ) 加 5mM HEPES、 0.055mM 2- 巯基乙醇、 50g/ml 庆大霉素 和 lx HAT(Sigma， CRL P-7185)。大约 1-2 周后， 在用 HT 代替 HAT 的培养基中培养细胞。然 后通过 ELISA， 针对人抗 TrkB 单克隆 IgG 抗体来筛选各孔。 一旦出现广泛的杂交瘤生长， 在 10-14 天之后对培养基加以监测。对分泌抗体的杂交瘤重复涂板， 再次筛选， 如果仍然对人 IgG 呈阳性， 则通过有限稀释将抗 TrkB 单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的 亚克隆， 以在组织培养基中产生少量抗体， 用于进一步表征。
产生生产人单克隆抗体的杂交瘤
为产生生产本发明的人单克隆抗体的杂交瘤， 可从经免疫的小鼠分离脾和 / 或淋 巴结细胞， 将其与合适的永生细胞系 ( 例如小鼠骨髓瘤细胞系 ) 融合。可针对抗原特异性 抗体的生产， 对得到的杂交瘤加以筛选。例如， 可用 50％ PEG， 将来自经免疫小鼠的脾淋巴 细胞的单细胞悬浮液与六分之一数目的 P3X63-Ag8.653 非分泌小鼠骨髓瘤细胞 (ATCC， CRL 1580) 融合。将细胞以大约 2x 145 涂布于平底微量滴定板上， 接着在选择性培养基中进行 2 周孵育， 所述培养基含有 20％胎克隆血清、 18％ “653” 条件培养基、 5％ (IGEN)、 4mM L- 谷氨酰胺、 1mM 丙酮酸钠、 5mMHEPES、 0： 055mM 2- 巯基乙醇、 50 单位 /ml 青霉素、 50g/ ml 链霉素、 50g/ml 庆大霉素和 1X HAT(Sigma ； HAT 在融合后 24 小时加入 )。大约 2 周后， 可在用 HT 代替 HAT 的培养基中培养细胞。然后可通过 ELISA， 针对人单克隆 IgM 和 IgG 抗 体， 对各细胞加以筛选。一旦发生广泛的杂交瘤生长， 通常在 10-14 天后对培养基加以观 察。对分泌抗体的杂交瘤重复涂板， 再次筛选， 如果仍然对人 IgG 呈阳性， 则通过有限稀释 将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆， 以在组织培养基中产生少量 抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体， 可在两升旋转瓶中培养选择的杂交瘤， 用于单克隆抗体纯 化。过滤上清液， 浓缩， 之后用蛋白 A-Sepharose(Pharmacia， Piscataway， N.J.) 进行亲和 层析。可通过凝胶电泳和高效液相层析检查洗脱的 IgG， 以确保纯度。可将缓冲液交换进 PBS， 可使用 1.43 的消光系数， 通过 OD280 来测定浓度。单克隆抗体可等分， 并贮藏于 -80℃。
产生生产单克隆抗体的转染瘤
还可使用例如重组 DNA 技术和基因转染方法的组合 ( 如本领域已知的 )( 例如 Morrison， 1985Science 229 ： 1202)， 在宿主细胞转染瘤中生产本发明的抗体。
例如， 为表达抗体或其抗体片段， 可通过标准分子生物学技术 ( 例如使用表达感 兴趣的抗体的杂交瘤， 进行 PCR 扩增或 cDNA 克隆 )， 获得编码部分或全长轻链和重链的 DNAs， 并可将 DNAs 插入表达载体， 使得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在本文上下 文中， 术语 “有效连接” 意欲表示抗体基因连接进载体， 使得载体中的转录和翻译控制序列发挥其预期调节抗体基因的转录和翻译的功能。 选择与使用的表达宿主细胞相容的表达载 体和表达控制序列。 可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独的载体， 或者更典型地， 两 个基因插入相同表达载体。通过标准方法将抗体基因插入表达载体 ( 例如， 将抗体基因片 段与载体上的互补限制性位点连接， 或者如果不存在限制性位点的话， 进行平末端连接 )。 本文描述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因， 这可如 下实现 ： 将它们插入已经编码希望的同种型的重链恒定和轻链恒定区的表达载体， 使得 VH 区段与载体中的 CH 区段有效连接， 以及 VL 区段与载体中的 CL 区段有效连接。此外或备选 地， 重组表达载体可编码信号肽， 其协助抗体链从宿主细胞分泌。 抗体链基因可被克隆进载 体， 使得信号肽与抗体链基因的氨基末端以符合读码框的方式相连。信号肽可以是免疫球 蛋白信号肽或异源信号肽 ( 即， 来自非免疫球蛋白的信号肽 )。
除了抗体链基因之外， 本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中 表达的调控序列。术语 “调控序列” 意欲包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、 增强子 和其它表达控制元件 ( 例如聚腺苷化信号 )。此类调控序列例如被描述于 Goeddel(Gene Expression Technology.1990Methods in Enzymology 185， Academic Press， San Diego， CA) 中。 本领域技术人员将理解， 对表达载体的设计， 包括对调控序列的选择， 可根据下述因 素来进行， 例如， 对将被转化的宿主细胞的选择， 想要的蛋白的表达水平等等。用于哺乳动 物宿主细胞表达的调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件， 例如， 源于巨细胞病毒 (CMV)、 猿猴病毒 40(SV40)、 腺病毒 ( 例如腺病毒主要晚期启动子 (AdMLP)) 和多瘤病毒的启动子和 / 或增强子。或者， 可使用非病毒调控序列， 例如， 泛素启动子或 P- 珠蛋白启动子。另有， 由来自不同来源的序列构成的调控元件， 例如 SRa 启动子系统， 其 含有 SV40 早期启动子的序列和人 T 细胞白血病病毒 1 型的长末端重复 (Takebe et al.， 1988 Mol.Cell.Biol.8 ： 466-472)。
除了抗体链基因和调控序列之外， 本发明的重组表达载体可携带额外的序列， 例 如调控载体在宿主细胞中复制的序列 ( 例如， 复制起点 ) 和选择标记基因。选择标记基 因协助对已引入载体的宿主细胞的选择 ( 见， 例如美国专利号 4,399,216 ； 4,634,665 和 5,179,017， 全部都是 Axel et al. 的 )。例如， 典型地， 选择标记基因对引入载体的宿主细 胞赋予对药物， 例如 G418、 潮霉素或甲氨喋呤的抗性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶 (DHFR) 基因 ( 使用甲氨喋呤选择 / 扩增， 用于 dhfr- 宿主细胞 ) 和 neo 基因 ( 用于 G418 选 择 )。
为表达轻链和重链， 通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染进宿主细 胞。术语 “转染” 的多种形式意欲包括通常用于将外源 DNA 引入原核或真核宿主细胞的多 种技术， 例如电穿孔、 磷酸钙沉淀、 DEAE- 葡聚糖转染等等。理论上可以在原核或真核宿主 细胞中表达本发明的抗体。讨论了在真核细胞中特别是在哺乳动物宿主细胞中表达抗体， 因为此类真核细胞， 特别是哺乳动物细胞， 比原核细胞更易于装配和分泌经正确折叠的并 且具有免疫活性的抗体。已有报道称， 抗体基因的原核生物表达对于生产高产率的活性抗 体是无效的 (Boss and Wood， 1985Immunology Today6 ： 12-13)。
用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括 ： 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞 ( 包括 dhfr-CHO 细胞， Urlaub and Chasin， 1980Proc.Natl. Acad.Sci.USA 77 ： 4216-4220 描述的， 使用 DHFR 选择标记， 例如， 按照 Kaufman and Sharp， 1982Mol.Biol.159 ： 601-621所述 )， NS0 骨髓瘤细胞、 COS 细胞和 SP2 细胞。特别地， 使用 NS0 骨髓瘤细胞时， 另一表达 系统是 WO 87/04462、 WO 89/01036 和 EP 338,841 中显示的 GS 基因表达系统。当编码抗体 基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时， 通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗 体， 所述时间足以允许抗体在宿主细胞中表达或者抗体分泌进培养宿主细胞的培养基中。 可使用标准的蛋白质纯化方法， 从培养基中回收抗体。
双特异性分子
在另一方面， 本发明涉及包含本发明的 TrkB 激动剂抗体的双特异性分子 ( 例如， 抗 TrkB 抗体或其片段 )。本发明的 TrkB 激动性抗体可被衍生化至或连接至另外的功能分 子， 例如， 另外的肽或蛋白 ( 例如， 另外的抗体或受体的配体 )， 以产生与至少两个不同结合 位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的 TrkB 激动性抗体事实上可衍生化至或连接 至超过一个其它功能分子， 产生与超过两个不同结合位点和 / 或靶分子结合的多特异性分 子； 此类多特异性分子也意欲被本文使用的术语 “双特异性分子” 所包括。为产生本发明的 双特异性分子， 可将本发明的抗体与一个或多个其它结合分子 ( 例如另外的抗体、 抗体片 段、 肽或结合模拟物 ) 功能性相连 ( 例如通过化学偶联、 遗传融合、 非共价结合等等 )， 使得 产生双特异性分子。 因此， 本发明包括下述双特异性分子， 其包含对 TrkB 的至少一个第一结合特异性 和针对第二靶表位的第二结合特异性。
在一种实施方式中， 本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗 体或其抗体片段， 包括例如， Fab、 Fab’ 、 F(ab’ )2、 Fv 或单链 Fv。抗体还可以是轻链或重 链二聚体， 或者其任何最小片段， 例如 Fv， 或者单链构建体， 如 Ladner et al. 美国专利号 4,946,778 所述， 该文献的内容通过引用明确并入本文。
可通过使用本领域已知的方法缀合组成性的结合特异性来制备本发明的双特异 性分子。例如， 双特异性分子的每种结合特异性可分别产生， 然后互相缀合。当结合特异 性是蛋白质或肽时， 可使用多种偶联或交联试剂进行共价缀合。交联试剂的例子包括 A 蛋 白、 碳二亚胺、 N- 琥珀酰亚胺基 -S- 乙酰基 - 硫代乙酸酯 (SATA)、 5， 5’ - 二硫代二 (2- 硝 基苯甲酸 )(DTNB)、 邻 - 亚苯基二马来酰亚胺 (oPDM)、 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基 二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP) 和 4-(N- 马来酰亚胺基甲基 ) 环己烷 -l- 羧酸硫代琥珀酰亚胺 酯 ( 硫 代 -SMCC)( 见 例 如 Karpovsky et al.， 1984J.Exp.Med.160 ： 1686 ； Liu et al.， 1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 8648)。 其 它 方 法 包 括 Paulus， 1985 Behring Ins. 81-83 和 Glennie et al.， 1987J. Mitt.No.78， 118-132 ； Brennan et al.， 1985Science229 ： Immunol.139 ： 2367-2375 中描述的。缀合试剂是 SATA 和硫代 -SMCC， 两者都可从 Pierce Chemical Co. (Rockford， IL) 获得。
当结合特异性是抗体时， 可通过对两条重链 C- 末端铰链区的硫巯基键合来缀合 它们。在一个具体的实施方式中， 铰链区被修饰， 以在缀合前含有奇数个巯基残基， 例如一 个。
或者， 两个结合特异性可在相同载体中编码， 并在相同宿主细胞中表达并装配。 当 双特异性分子是 mAb x mAb、 mAb x Fab、 Fab x F(ab’ )2 或配体 x Fab 融合蛋白时， 该方法
特别有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子， 或 包含两个结合决定簇的单链双特异性抗体。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法被描述于例如美国专利号 5,260,203、 5,455,030、 4,881,175、 5,132,405、 5,091,513、 5,476,786、 5,013,653、 5,258,498 和 5,482,858 中。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定 (ELISA)、 放 射免疫测定 (REA)、 FACS 分析、 生物测定 ( 例如生长抑制 ) 或 Western 印迹测定来验证。这 些测定法每种通常通过利用带有对感兴趣的复合物特异的经标记试剂 ( 例如抗体 )， 来检 测特别感兴趣的蛋白 - 抗体复合物的存在。
药物组合物
在一个方面， 本发明提供了组合物， 例如药物组合物， 其中含有与可药用载体配制 的本发明的 TrkB 激动性抗体 ( 例如单克隆抗体， 或其抗原结合部分 ) 之一或组合。此类组 合物可包括 ( 例如两个或多个不同的 ) 结合分子之一或组合。例如， 本发明的药物组合物 可包含与靶抗原上的不同表位结合的或具有互补活性的抗体或试剂的组合。
本发明的药物组合物还可以组合疗法施用， 即， 与其它试剂组合。例如， 为治疗呼 吸病症， 组合疗法可包括与至少一种其它试剂组合的 TrkB 激动剂抗体。可用于组合疗法的 治疗试剂的例子包括但不限于去甲肾上腺素和 / 或 5- 羟色胺途径的小分子活化剂 ( 例如 三环类抗抑郁剂地昔帕明 (DMI)、 5- 羟色胺 1A 受体部分激动剂、 丁螺旋酮以及可能更具选 择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀 )、 前列腺素、 孕酮或 TrkB 活性的增强剂 ( 例如蛋白质酪 氨酸磷酸酶抑制剂 )。
在本文中使用时， “可药用载体” 包括生理相容的任何和全部的溶剂、 分散介质、 包 衣、 抗细菌和抗真菌剂、 等渗和吸收延迟剂等等。载体应当是适于口服、 腹膜内、 静脉内、 肌 内、 皮下、 肠胃外、 脊髓或表皮施用 ( 例如通过注射或输注 ) 的。取决于施用途径， 活性化合 物可包衣在材料中， 以保护化合物免遭酸的作用和可能使得化合物失活的其它自然条件。
本发明的药物组合物可包括一种或多种可药用盐。 “可药用盐” 指保持亲本化合物 的想要的生物活性并且不带来任何不想要的毒性作用的盐 ( 见例如 Berge， S.M.， et al.， 1977J.Pharm.Sci.66 ： 1-19)。此类盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源于 无毒无机酸 ( 例如盐酸、 硝酸、 磷酸、 硫酸、 氢溴酸、 氢碘酸、 磷酸等等 ) 以及源于无毒有机酸 ( 例如脂肪族单羧酸和二羧酸、 经苯基取代的链烷酸、 羟基链烷酸、 芳香族酸、 脂肪族和芳香 族磺酸等等 ) 的那些。碱加成盐包括源于碱土金属 ( 例如钠、 钾、 镁、 钙等等 ) 的那些以及 源于无毒有机胺 ( 例如 N， N’ - 二苄基乙二胺、 N- 甲基葡糖胺、 氯普鲁卡因、 胆碱、 二乙醇胺、 乙二胺、 普鲁卡因等等 ) 的那些。
本发明的药物组合物还可包括可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的例子包括 ： 水 可溶的抗氧化剂， 例如， 抗坏血酸、 半胱氨酸盐酸、 硫酸氢钠、 偏亚硫酸氢钠、 亚硫酸钠等等 ； 油溶性抗氧化剂， 例如 - 抗坏血酸棕榈酸酯、 丁羟基茴香醚 (BHA)、 二丁基羟基甲苯 (BHT)、 卵磷脂、 没食子酸丙酯、 α- 生育酚等等 ； 以及金属螯合剂， 例如柠檬酸、 乙二胺四乙酸 (EDTA)、 山梨糖醇、 酒石酸、 磷酸等等。
可用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的例子包括 ： 水、 乙醇、 多元醇 ( 例如甘油、 丙二醇、 聚乙二醇等等 ) 及其合适的混合物、 植物油 ( 例如橄榄油 ) 和 可注射有机酯 ( 例如油酸乙酯 )。可例如通过使用包衣材料， 例如卵磷脂， 在分散剂的情况 下通过保持需要的颗粒大小， 以及通过使用表面活性剂， 来保持合适的流动性。
这些组合物还可含有佐剂， 例如防腐剂、 润湿剂、 乳化剂和分散剂。预防微生物存在可通过上文的灭菌步骤以及通过向组合物中加入多种抗细菌和抗真菌试剂 ( 例如对羟 基苯甲酸酯、 氯代丁醇、 苯酚、 山梨酸等等 ) 两者来确保。还可能想要向组合物中加入等张 剂， 例如糖、 氯化钠等等。此外， 可通过包括进延迟吸收的试剂， 例如单硬脂酸铝和明胶， 来 实现可注射药物形式的延长吸收。
可药用载体包括无菌的水溶液或分散剂以及无菌粉末， 用于即制无菌可注射溶液 或分散剂。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除了与活性化合物 不相容的任何常规介质或试剂之外， 设想其用于本发明的药物组合物中。补充性的活性化 合物也可掺入组合物中。
治疗组合物典型地在生产和贮藏条件下应当是无菌并且稳定的。 组合物可配制为 溶液、 微乳液、 脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。 载体可以是含有例如水、 乙醇、 多 元醇 ( 例如甘油、 丙二醇和液体聚乙二醇等等 ) 的溶剂或分散介质及其合适的混合物。可 例如通过使用包衣， 例如卵磷脂， 在分散剂的情况下通过保持需要的颗粒大小， 以及通过使 用表面活性剂， 来保持合适的流动性。 在很多情况下， 可在组合物中加入等张剂， 例如糖、 多 元醇 ( 例如甘露醇、 山梨糖醇 ) 或氯化钠。可通过在组合物中包括进延迟吸收的试剂， 例如 单硬脂酸盐和明胶， 来实现可注射组合物的延长吸收。
可通过将需要量的活性化合物与上文列举的成分之一或组合 ( 如需要 ) 掺入合适 的溶剂， 接着进行微滤灭菌， 来制备无菌注射溶液。通常， 通过将活性化合物掺入含有基础 分散介质和来自上文列出的需要的其它成分的无菌载体， 来制备分散剂。在用于制备无菌 注射液的无菌粉末的情况下， 制备方法是真空干燥和冷冻干燥 ( 冻干 )， 其产生活性成分的 粉末， 再加上来自之前其经过滤灭菌的溶液的任何额外的想要的成分。
可与载体材料组合产生单剂量形式的活性成分的量根据被治疗的受试者以及特 定的施用模式而变化。 可与载体材料组合以产生单剂量形式的活性成分的量将通常是产生 治疗效果的组合物的量。通常， 以百分比计， 该量将在大约 0.01％至大约 99％的活性成分， 大约 0.1％至大约 70％， 或者大约 1％至大约 30％的活性成分， 与可药用载体组合。
调节剂量方案以提供最想要的应答 ( 例如治疗应答 )。例如， 可施用单次推注， 可 随时间施用若干分开的剂量， 或者剂量可按照治疗情况的紧急性成比例降低或增加。尤其 有利的是配制剂量单位形式的肠胃外组合物以易于施用和使得剂量均匀。 本文中使用的剂 量单位形式指物理上离散的单位， 适于被治疗的受试者用作为单一的剂量 ； 每个单位含有 经计算的预定量的活性化合物以与需要的药物载体结合产生想要的治疗效果。 用于本发明 的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特性质和想要获得的特定治疗效果以及配制此 类活性化合物用于治疗个体敏感性领域的内在限制决定， 并且直接依赖于它们。
示例性的治疗方案包括每周施用两次、 每周一次、 每两周一次或者每月一次。 用于 本发明的 TrkB 激动性抗体的剂量方案包括 ： 通过腹膜内施用， 1mg/kg 体重或 3mg/kg 体重， 其中使用下述剂量方案之一来给予抗体 ： 例如， 每周一次 1mg/kg 体重， 持续 4 周， 接着在剩 余治疗期保持每周一次 3mg/kg 体重。
在一些方法中， 同时施用具有不同结合特异性的两种或多种结合分子 ( 例如单克 隆抗体 )， 这种情况下， 施用的每种抗体的剂量都落在指出的范围内。TrkB 激动剂抗体通常 以多次施用。单次剂量间的间隔可以是， 例如， 每周、 每月、 每三个月或每年。如通过测量患 者中 TrkB 结合分子的血液水平所指示的， 间隔还可以是不规则的。在一些方法中， 对剂量加以调节， 以获得 TrkB 激动剂抗体合适的血浆浓度。
或者， TrkB 激动剂抗体可作为持续释放的制剂施用， 这种情况下需要较少频率的 施用。剂量和频率根据患者中 TrkB 激动剂抗体的半寿期变化。通常， 人抗体显示最长的半 寿期， 次之是人源化抗体、 嵌合抗体和非人抗体。 施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的 还是治疗性的而改变。在预防性应用中， 以相对不频繁的间隔在较长时间内施用相对低的 剂量。一些患者余生都持续接受治疗。在治疗性应用中， 一些时候需要以相对短的间隔施 用相对高的剂量， 直到疾病进展降低或者终止， 或者直到患者显示出疾病的症状部分或完 全减轻。之后， 可对患者施用预防性方案。
活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平可有所变化， 以获得能有效实 现针对特定患者、 组合物和施用方式而言想要的治疗应答并且对患者没有毒性的活性成分 量。 选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素， 包括利用的本发明特定组合物的活性， 或 其酯、 盐或酰胺， 施用途径， 施用时间， 利用的特定化合物的排泄速率， 治疗持续时间， 用于 与利用的特定组合物组合的其它药物、 化合物和 / 或材料， 被治疗的患者的年龄、 性别、 体 重、 状况、 一般健康情况和之前的医疗史以及医药领域公知的其他因素。
可使用本领域已知的数种方法中的一种或多种， 通过一种或多种施用途径来施用 本发明的组合物。如本领域技术人员将理解的， 施用途径和 / 或方式将根据想要的结果而 变化。本发明 TrkB 激动性抗体的施用途径包括静脉内、 肌内、 皮内、 腹膜内、 皮下、 脊髓内或 其它肠胃外施用途径， 例如通过注射或输注。短语 “肠胃外施用” 在本文中表示并非肠道和 局部施用的施用方式， 通常通过注射来进行， 其包括但不限于， 静脉内、 肌内、 动脉内、 鞘内、 囊内、 眶内、 心内、 皮内、 腹膜内、 经气管、 皮下、 角质层下、 关节内、 囊下、 蛛网膜下、 脊髓内、 硬膜外或胸骨内注射和输注。
或者， 本发明的 TrkB 激动性抗体可通过非肠胃外途径施用， 例如局部、 表皮或粘 膜施用途径， 例如， 鼻内、 口服、 阴道内、 直肠内、 舌下或局部。
可用将保护化合物免于快速释放的载体来制备活性化合物， 例如控释制剂， 包括 植入物、 经皮贴剂和微囊化递送系统。可使用可生物降解的、 生物相容的聚合物， 例如乙烯 乙酸乙烯酯、 聚酸酐、 聚乙醇酸、 胶原、 聚原酸酯和聚乳酸。 用于制备此类制剂的方法已申请 专利或是本领域技术人员通常已知的。 见， 例如 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems， J.R.Robinson， ed.， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1978。
可用本领域已知的医药装置来施用治疗组合物。例如， 在一种实施方式中， 本发 明的治疗组合物可用无针头皮下注射装置施用， 例如美国专利号 5,399,163、 5,383,851、 5,312,335、 5,064,413、 4,941,880、 4,790,824 或 4,596,556 所示的装置。可用于本发明的 公知的植入物和模块的例子包括 ： 美国专利号 4,487,603， 其示出了可植入的微输注泵， 用 于以受控速率分散药剂 ； 美国专利号 4,486,194， 其示出了用于通过皮肤施用药剂的治疗 设备 ； 美国专利号 4,447,233， 其示出了用于以精确输注速率递送药剂的药剂输注泵 ； 美国 专利号 4,447,224， 其示出了可变流速的可植入输注装置， 用于连续药物递送 ； 美国专利号 4,439,196， 其示出了具有多个腔室的渗透性药物递送系统 ； 以及美国专利号 4,475,196， 其示出了一种渗透性药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。很多其它此类植入物、 递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方式中， 可对本发明的 TrkB 激动性抗体加以配制， 以确保适当的体内分布。例如， 血脑屏障 (BBB) 排除了很多高度亲水的化合物。为确保本发明的治疗组 合物穿过 BBB( 如果需要的话 )， 可例如将其配制于脂质体中。关于生产脂质体的方法， 见例如美国专利号 4,522,811、 5,374,548 和 5,399,331。脂质体可包含选择性运输进特 定细胞或器官由此增强靶向药物递送的一种或多种部分 ( 见例如 V.V.Ranade， 1989J. Cline Pharmacol.29 ： 685)。 示 例 性 的 靶 向 部 分 包 括 ： 叶 酸 或 生 物 素 ( 见 例 如 Low et al. 的 U.S.Pat.5,416,016) ； 甘 露 糖 苷 (Umezawa et al.， 1988Biochem. Biophys.Res. Commun.153 ： 1038) ； 抗 体 (P.G.Bloeman et al.， 1995FEBS Lett.357 ： 140 ； M.Owais et al.， 1995Antimicrob.Agents Chernother.39 ： 180) ； 表 面 活 性 剂 A 蛋 白 受 体 (Briscoe et al.， 1995Am.J. Physiol.1233 ： 134) ； p120(Schreier et al.， 1994J.Biol.Chem.269 ： 9090) ； 还 见 K.Keinanen ； M.L.Laukkanen， 1994FEBSLett.346 ： 123 ； J.J.Killion ； I.J.Fidler， 1994Immunomethods 4 ： 273。
小鼠模型
Mecp2KO(Mecp2- 敲除 ) 雄性和 Mecp2HT( 杂合体 ) 雌性是用于研究雷特综合征 (RTT) 的非常有用的模型系统， 因为这些生物显示出与受到 RTT 影响的女童相似的症状。 Mecp2-KO 雄性在 4 周时成为有症状的， 展示出任何数量的下述症状 ： 生长下降 ； 降低的脑生 长和神经元大小 ； 震颤 ； 运动受损 ； 活动减退 ( 癫痫发作 ) ； 呼吸不规则 ； 增加的焦虑 ； 驼背 ； 刻板的前肢运动 ； 以及后肢抱握。
小鼠中的 Mecp2 缺陷已知与 BDNF 低内源水平相关， 并且破坏小鼠呼吸系统， 并且 具体地与去甲肾上腺素和 5- 羟色胺含量的进行性缺乏相关， 导致对延髓呼吸系统的错误 调控 (Viemari et al.， (2005)J Neuroscience ； 25 ： 11521)。所述破坏和呼吸困难显示比 在 Mecp2-KO 小鼠中程度要大。 在这些小鼠中观察到的中枢自主功能障碍包括 ： 进行性恶化 的呼吸失调 ( 不稳定的呼吸型式， 可变的周期和频繁的呼吸暂停 )， 导致在约 2 月龄时出现 致命呼吸骤停 ； 延长的心脏 QT 间隔 ； 以及脑干髓质中酪氨酸羟化酶、 去甲肾上腺素和 5- 羟 色胺的剧烈降低， 导致调节延髓呼吸网络的抑制性系统不平衡。
Mecp2HT 雌性显示出相似但是延迟的表型 ( 发病＝ 3 月 )， 其被削弱并且没有快 速恶化。它们能存活 9-12 个月。但是雌性 Mecp2-HT 也显示出下述特征的呼吸表型 ： 更 大的潮气量和肺容量， 呼吸抑制， 延长的呼吸暂停接着换气过度以及对缺氧的更强烈应答 (Bissonnette and Knopp， (2006)Pediatric Research ； 59 ： 513)。
本发明已被完整描述， 将通过下述实施例和权利要求 ( 阐述性而非进一步限制 ) 对其进行进一步阐述。本领域技术人员将认识到或者使用不超过常规的实验， 能够确定本 文所述的具体步骤的多种等同方案。此类等同方案也在本发明和权利要求的范围内。本申 请通篇中提到的所有参考文献， 包括公布的专利和公开的专利申请都通过引用并入本文。 实施例 实施例 1 ： 施用 TrkB 激动剂抗体 (C20) 至 Mecp2 小鼠
每周两次， 以 3mg/kg 体重的剂量， 向 4( 早期症状 ) 至 8 周 ( 晚期症状 ) 龄的 Mecp2-KO 和野生型雄性腹膜内给予 TrkB 激动剂抗体 (C20) 或盐水， 对动物测试 6 至 8 周。 每组测试 9-14 只小鼠， 总共四组 ( 施用盐水的野生型， 施用 mAb 的野生型， 施用盐水的敲除 动物以及施用 mAb 的敲除动物 )。Mecp2 敲除小鼠购自 Jackson Labs( 品系
Mecp2tm1.1Bird/J(#003890))。
如图 1A 所示， 当施用 TrkB 激动剂 mAb 时， 小鼠显示出体重降低。最顶上的线 ( 白 色方块示出数据点 ) 代表施用盐水的 Mecp2 野生型小鼠。次顶部的线 ( 黑色方块示出数据 点 ) 代表施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 野生型小鼠。次底部的线 ( 白色圆圈示出数据点 ) 代表施用盐水的 Mecp2 敲除小鼠。最底部的线 ( 黑色圆圈示出数据点 ) 代表施用 TrkB 激 动剂抗体的 Mecp2 敲除小鼠。如图 1A 所示， 当施用 TrkB 激动剂抗体时， Mecp2 小鼠在两种 情况下都减轻体重。
在测试中， 24 小时周期测量下， 6 周 ( 图 1B 左边 ) 和 8 周 ( 图 1B 右边 ) 时， 施用 TrkB 激动剂 mAb 的小鼠都显示出食物和水摄入的减少。
此外， 如图 1 所示， 当施用 TrkB 激动剂 mAb 时， 小鼠还显示出体重减轻。最顶上的 线 ( 白色方块示出数据点 ) 代表施用盐水的 Mecp2 野生型小鼠。次顶部的线 ( 黑色方块示 出数据点 ) 代表施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 野生型小鼠。次底部的线 ( 白色圆圈示出 数据点 ) 代表施用盐水的 Mecp2 敲除小鼠。最底部的线 ( 黑色圆圈示出数据点 ) 代表施用 TrkB 激动剂抗体的 Mecp2 敲除小鼠。如图 1 所示， 当施用 TrkB 激动剂抗体时， Mecp2 小鼠 在两种情况下都减轻体重。 此外， 施用 TrkB 激动剂 mAb 能改善受处理的 KO 小鼠的前肢和后肢握力强度。这 在图 2A 中展示， 其中， 方块示出的数据点代表用盐水 (SAL) 或 TrkB 激动剂抗体 C20 处理过 的野生型 (WT) 小鼠 ； 圆圈示出的数据点代表用盐水 (SAL) 或 TrkB 激动剂抗体 C20 处理过 的敲除 (KO) 小鼠。此外， 给予 TrkB 激动剂抗体的小鼠显示出体脂肪的降低以及瘦肉质含 量的上升。这在图 2B 中显示， 其中， 方块示出的数据点代表用盐水 (SAL) 或 TrkB 激动剂抗 体 C20 处理过的野生型 (WT) 小鼠 ； 圆圈示出的数据点代表用盐水 (SAL) 或 TrkB 激动剂抗 体 C20 处理过的敲除 (KO) 小鼠。
施用 TrkB 激动剂 mAb 还能增加 Mecp2-KO 小鼠的寿命。已知 Mecp2-KO 小鼠大概 在 8 至 10 周间死亡， 但给予 TrkB 激动剂 mAbs 时能够活得更长。这至少在图 3A 中显示， 其 中， 施用盐水的 KO 小鼠 (KO/SAL) 在 8-10 周龄左右死亡， 而给予 TrkB 激动剂 mAb 的 KO 小 鼠存活到 23 周龄 (KO/C20) ； 在图 3 中， 其中野生型小鼠被描述为 WT， 敲除小鼠被描述为 KO， TrkB 激动剂抗体被描述为 C20。如图 3 所示， TrkB 激动剂 mAb- 处理过的小鼠 (KO/MAB) 能 存活至盐水处理的 KO 小鼠年龄的至少两倍。Mecp2-KO 小鼠的致命呼吸失调被认为可通过 用 TrkB 激动剂抗体刺激延髓呼吸网络系统中表达的 TrkB 来挽救 ； 当 Mecp2 不存在和 / 或 突变时， 所述系统在小鼠和人类中被负面影响。
此外， TrkB 激动剂抗体被认为能接近延髓呼吸系统的神经元， 由此恢复 KO 小鼠的 酪氨酸羟化酶 ( 去甲肾上腺素合成的限速酶 )、 去甲肾上腺素和 5- 羟色胺的正常水平， 从 而预防呼吸缺陷以及延长寿命。已对这些呼吸和相关缺陷进行了研究， 它们与延髓呼吸系 统的去甲肾上腺素和 5- 羟色胺调节相关 (Viemari et al.， (2005)J Neuroscience ； 25 ： 11521)。用去甲肾上腺素再吸收抑制剂地昔帕明进行慢性治疗可挽救该表型， 并显著延长 Mecp2KO 小鼠的寿命 (Roux et al.(2007)Eur.J.Neuroscience ； 25 ： 1915)。或者， TrkB 激 动剂抗体被认为能与包含颈动脉体的神经元上的 TrkB 受体结合， 并重建被破坏的向脑 ( 即 皮质或下丘脑 ) 中高级功能的传递 ( 调节呼吸模式 )。最后， TrkB 激动剂抗体被认为作用 于结节性脑感受神经节的 TrkB 受体上， 并补偿该结构中报道的 BDNF 的减少， 其对于于心脏
呼吸内稳态来说是关键的 (Ogier et al.， (2007)J.Neuroscience ； 27 ： 10912)。
本发明方法中的 TrkB 激动剂抗体可以通过相同或相似的机制， 以相同方式发挥 作用 ( 例如， 可作用于重建这些神经递质在脑干延髓中的正常水平和平衡 )。用 [3H] 标记 的 TrkB 激动剂抗体进行放射成像可进一步验证这些发现， 并且可进一步阐明可能的机制。 如本文他处所述， 本发明方法的 TrkB 激动剂抗体在一些实施方式中可与地昔帕明组合用 于得到加性效果。
实施例 2 ： 向 Mecp2 小鼠施用 TrkB 激动剂抗体 (C20)
为测试呼吸暂停， 可使用 Buxco Research Systems 设计的系统进行全身体积描记 法。将有知觉的、 不受限的小鼠置于体积描记腔 ( 垂直的树脂玻璃筒， 直径 4 英寸， 高5英 寸 )。 保持空气流， 以确保新鲜空气恒定交换进腔， 提供食物、 垫层和水。 为精确评估呼吸暂 停的频率， 小鼠需要适应体积描记腔。一旦它们完全适应， 以多种间隔进行气道应答记录， 无须将动物从腔中移出。 适应期和记录期不应超过 2 小时 ； 因此， 小鼠将在腔中一次不超过 两小时。
在相同小鼠中， 以每周不超过两次进行体积描记记录。 一旦完成了体积描记记录， 将小鼠返回其自己的笼子。 如果在体积描记腔中小鼠显示出严重受限的呼吸或者明显的焦 虑病征， 可将它们从腔中移出并返回其自己的笼子。