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1、10申请公布号CN101948764A43申请公布日20110119CN101948764ACN101948764A21申请号201010171338522申请日20100513CGMCCNO362120100201C12N1/20200601C12P13/02200601C12R1/3820060171申请人江苏科技大学地址212003江苏省镇江市梦溪路2号72发明人吴福安王俊梁垚陈明胜方水琴吕荣斌74专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人楼高潮54发明名称产冠菌素桑丁香假单胞菌株及其发酵生产冠菌素的方法57摘要本发明公开了一种产冠菌素桑丁香假单胞菌株及其发酵生产冠菌素的方。
2、法。发明中涉及的一株桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌已保藏，保藏日期为2010年2月1日，保藏登记号为CGMCCNO3621。桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413的高温32产冠菌素活性。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN101948766A1/1页21一株桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年2月1日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理。
3、委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO3621。2利用权利要求1所述的桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株发酵生产冠菌素的方法，其特征在于利用桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株进行发酵产冠菌素培养在温度2540的培养基中接菌，摇瓶培养114天得发酵液，发酵培养基的PH7580，培养基质量百分比为磷酸氢二钾0206、磷酸二氢钾00506、氯化铵00105、七水合硫酸镁000101、葡萄糖015，氯化高铁115M；在18下培养，发酵514天所得发酵液，经HPLC均检测到冠菌素生成；在32下培养，发酵3天所得发酵。
4、液，经HPLC检测到冠菌素生成。3利用权利要求1所述的桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株发酵生产冠菌素的方法，其特征在于在温度2540的培养基中接菌，所述培养基的PH7580，培养基质量百分比为磷酸氢二钾0206、磷酸二氢钾00506、氯化铵00105、七水合硫酸镁000101、葡萄糖015，氯化高铁115M，于温度32好气培养1天，变温至18发酵2天，取发酵液经HPLC检测到冠菌素生成。权利要求书CN101948764ACN101948766A1/4页3产冠菌素桑丁香假单胞菌株及其发酵生产冠菌素的方法一、技术领域0001本发明属于微生物技术领域，尤其。
5、涉及一株产冠菌素桑丁香假单胞菌株M413及其发酵生产冠菌素的方法。二、背景技术0002现有技术冠菌素CORONATINE，COR，C18H25NO4于1977年首次由ICHIHARA等从丁香假单胞菌绛红致病变种PSEUDOMONASSYINGAEPVATROPURPUREA的培养液中分离获得。冠菌素由两个特殊的部分构成，即双环羧酸，称为冠面酸CORONAFACICACID，简称CFA和环丙基氨基酸，称为冠氨酸CORONAMICACID，简称CMA。0003冠菌素作为新型的多功能复合型植物激素，具有着极其广泛的功能与应用前景。不仅与生长发育有关，并且与植物自身防御系统有着重大的关联。它能够调控生。
6、长、抑制衰老、促进细胞分化、提高叶绿素含量和植物抗逆性提高抗旱性、抗寒性、抗盐性，生物活性比茉莉酸C12H18O3JASMONICACID，JA高10010000倍。还可以促进多种植物次级代谢产物的生产，如大豆抗毒素和类黄酮，水稻田灭草提高水稻叶中的樱花素和二萜内酯A含量，它们对稻田杂草有较高的抑制活性，抗肿瘤药物红豆杉紫杉醇的产生，改善烟草品质等，总之，COR应用浓度低，并且诱导次生物质产量大大提高，具有其他生长调节物质所无法比拟的优势，有进一步研究的价值和开发潜力。0004目前对于冠菌素的生产研究大多集中于发酵法生产，早期人们虽然建立了化学合成冠菌素的方法，取得了冠菌素生产研究历史上里程碑。
7、式的成功，不过除了理论研究上的意义之外，其极低的产率与高昂的代价，使得人们对于通过化学合成法获得大量冠菌素的设想落空，因此人们开始关注发酵法获得大量冠菌素的研究，进展迅速。如日本北海道大学市原狄民等1998用发酵法从250升发酵液中得到冠菌索、冠菌酸和冠烷酸共200毫克其中冠菌素60毫克；张国栋2003发酵两次共得到发酵液约300升，提取获得结晶成品1克左右和部分母液，总数约13克母液折成成品计。其他少有大规模发酵的报道，吴晓玉等在培养基中添加适量锰离子可促进菌株的生长及其冠毒素产量提高。吴慧玲等诱变得2株在常温下产生冠菌素的突变株MFB132和MFB141。该突变株发酵温度由18上升到28，。
8、MFB141的冠菌素产量达到3766MG/L。因此，采用发酵法生产冠菌素是工业化生产的可行方法。0005不过，以往报道的产冠菌素菌株生产COR的发酵过程均需在低温28下进行，因此低温发酵成为其工业化生产的瓶颈。因为利用大规模发酵法发酵生产COR就必定会产生大量热量，而降温设备造成成本昂贵，利用化学法合成又无法满足大规模应用的需求，因此，寻找合适的耐高温产冠菌素菌株是工业化大规模生产冠菌素的基础。本专利首次从桑树的桑疫病组织中分离致病菌桑丁香假单胞菌，并在高温培养条件32下检测到冠菌素产生，说明了其高温条件下的产冠菌素活性。一方面，传统的产冠菌素菌株报道的产冠菌素活性范围在28以下，本菌株首次突。
9、破了这一温度限制，虽然产量不高，但作为良好的出发菌株，有助于突破长期以来困扰冠菌素大规模发酵的低温限制性因素，为相关的应说明书CN101948764ACN101948766A2/4页4用于研究奠定的基础；另一方面，本专利提供的菌种作为桑树的桑疫病致病菌，其产冠菌素特性的发现对于揭示桑疫病传播和流行机理提供了重大线索，对于我国蚕桑产业的健康发展有着至关重要的意义。三、发明内容0006技术问题针对以上问题，本发明分离筛选桑疫病致病菌桑丁香假单胞菌，并分别在首次从发酵液中分离检测到冠菌素，经过发酵条件优化，可使之表现稳定的产冠菌素能力。0007技术方案一株桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRI。
10、NGAEPVMORIM413菌株，保藏日期为2010年2月1日，保藏登记号为CGMCCNO3621。桑丁香假单胞菌M413的筛选和发酵条件的优化。在温度2540的培养基中接菌，摇瓶培养114天得发酵液，所述培养基的PH7580，培养基质量百分比为磷酸氢二钾0206、磷酸二氢钾00506、氯化铵00105、七水合硫酸镁000101、葡萄糖015，氯化高铁115M；18下7天32下3天取发酵液，NAOH调节发酵液PH至912，乙酸乙酯反复萃取两次，取水相，再调节PH至25，乙酸乙酯萃取两次，取有机相，减压蒸馏致结晶，以甲醇溶解，得冠菌素甲醇溶液。0008有益效果本发明的微生物分类命名为桑丁香假单胞。
11、菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏单位地址中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。保藏编号是CGMCCNO3621，保藏时间是2010年2月1日。0009本发明首次从桑疫病组织中分离致病菌桑丁香假单胞菌，并发现其产冠菌素特性，且在高温32下检测到冠菌素产生，说明了其高温条件下的产冠菌素活性。一方面，传统的产冠菌素菌株报道的产冠菌素活性范围在28以下，本菌株首次突破了这一温度限制，为大规模工业化生产提供了一种新的出发菌株，有助于突破长期以来困扰冠菌素大规模发酵的低温限制性因素，为相关的应。
12、用研究奠定了基础；另一方面，作为桑疫病致病菌，其产冠菌素特性的发现对于揭示桑疫病传播和流行机理提供了重大线索，对于我国蚕桑产业的健康发展有着至关重要的意义。0010本发明菌株桑丁香假单胞菌系从桑疫病发病部位中分离得到，观察分析了该菌形态特征、培养特征、生理特性及代谢特征，结果表明该菌株具有以下特征1形态学特征生长迅速，长成的菌落白色，正反面颜色均一，呈圆形，鼻涕状见附图1，革兰氏染色为阴性见附图2；2培养特征利用标准LB培养基，与优化HSC培养基均能正常生长，3生理特征对碳源、氮源及温度有广泛的适应性，易培养；4代谢特征将该菌液体扩大培养后应用HPLC分析发现，其在18和32条件下均有冠菌素产。
13、生。四、附图说明0011图1为桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株经培养的形态学特征；0012图2为桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株经革兰氏染色结果。说明书CN101948764ACN101948766A3/4页5五、具体实施方式0013下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。0014实施例10015本实施例说明桑丁。
14、香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株的筛选过程。0016采集染桑疫病桑枝和叶片，捣碎放入50ML无菌水的锥形瓶中，加入20颗左右的玻璃珠，剧烈震荡20MIN，使组织完全捣碎，静置。在每只50ML无菌水的三角瓶中加入1ML土壤样品悬浮液，放入恒温振荡培养箱培养，37下培养2天。0017取悬液涂布于初筛MG平板培养基上，进行产酶菌株的初筛。每升初筛培养基的组分为蛋白胨50G，甘露醇50G，谷氨酸钠115G，生物素00001G，磷酸氢二钾025G，氯化钠01G，七水合硫酸镁01G，琼脂11G。温度32，培养时间16天。挑选产生菌落较大的菌株20株，接种到KINGB。
15、斜面培养基。KINGB培养基基本配方，每升组分为蛋白胨200G，磷酸氢二钾15G，七水合硫酸镁15G，琼脂15G，PH7202；使用方法称取基本配方38G，加入蒸馏水1L，并加入10ML甘油，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管5ML，制成斜面。32斜面培养过夜，接种至HSC培养基，HSC培养基基本配方，每升组分为磷酸氢二钾41G、磷酸二氢钾36G、氯化铵1G、七水合硫酸镁02G、氯化高铁2M、葡萄糖20G，18度培养七天，取发酵液经HPLC检测。0018HPLC法的检测条件为0019色谱柱ALLTIMAC18150MM46MM；流动相05G/L磷酸甲醇4060，V/V；检测波长230NM；。
16、流速1ML/MIN；柱温30；进样量20L。0020实施例20021本实施例说明桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413菌株利用标准LB培养基于18下的产冠菌素活性。0022每升培养基组成蛋白胨10G，酵母浸膏5G，氯化钠10G，将桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413以1的接种量接种于培养基中，于温度18好气培养7天，取发酵液经HPLC检测，浓度为054MG/L。0023实施例30024本实施例的方法与实施例2相同，改用优化HSC培养基培养，检测其产冠菌素活性。0025每升培养基组成磷酸氢二钾41G、磷酸二氢钾36G、氯化铵1。
17、G、七水合硫酸镁02G、氯化高铁2M、葡萄糖20G，将桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413以1的接种量接种于培养基中，于温度18好气培养7天，取发酵液经HPLC检测，浓度为2MG/L。0026实施例40027本实施例的方法与实施例3相同，改变温度至32度，检测其产冠菌素活性。说明书CN101948764ACN101948766A4/4页60028每升培养基组成磷酸氢二钾41G、磷酸二氢钾36G、氯化铵1G、七水合硫酸镁02G、氯化高铁2M、葡萄糖20G，将桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413以1的接种量接种于培养基中，于温度32好气培养3天，取发酵液经HPLC检测，浓度为0003MG/L。0029实施例50030本实施例的方法与实施例3相同，改变温度及发酵时间，检测其产冠菌素活性。0031每升培养基组成磷酸氢二钾41G、磷酸二氢钾36G、氯化铵1G、七水合硫酸镁02G、氯化高铁2M、葡萄糖20G，将桑丁香假单胞菌PSEUDOMONASSYRINGAEPVMORIM413以1的接种量接种于培养基中，于温度32好气培养1天，变温至18发酵2天，取发酵液经HPLC检测，浓度为35MG/L。说明书CN101948764ACN101948766A1/1页7图1图2说明书附图CN101948764A。