用于不同亚型非小细胞肺癌分型的一种核酸适体及其筛选 方法 本申请是申请号为 200910083075.X、 申请日为 2009 年 04 月 28 日、 发明创造名称 为 “用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法” 的分案申请。技术领域
本发明涉及一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法。 背景技术 肺癌是最致命的癌症之一， 在组织学上分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌， 其中后 者占肺癌病例的 80％。非小细胞肺癌又分为腺癌， 鳞癌和大细胞癌三类亚型。腺癌作为一 种最主要的亚型， 占非小细胞肺癌的 40％。非小细胞肺癌的预后严重依赖于确诊时疾病 所处的分期， 按照现有的治疗水平， 病人的 5 年生存率从 I 期的 60％降到 IV 期的 1％。尽 管在肺癌的检测方法上取得了较大进展， 但目前仍有约 70％的病人在确诊时已处于肺癌晚 期。 对非小细胞肺癌不同亚型的治疗施加相似的治疗方法而没有考虑亚型之间的异质性是 影响非小细胞肺癌治疗效果的重要原因。尽管目前神经元特异性烯醇化酶、 细胞角蛋白片 段 21-1、 癌胚抗原、 糖类抗原等肿瘤标志物用于肺癌的检测和术后评估， 但是这些肿瘤标志 物对肺癌， 尤其是不同肺癌亚型的特异性和敏感性不够。非小细胞肺癌的分型和诊断仍主 要依靠细胞物理形态进行判断， 发展能从分子水平上反映非小细胞肺癌特征的新试剂， 并 用以进行亚型分类和早期诊断是降低非小细胞肺癌死亡率重要手段。
核酸适体 (Aptamer， 又称适配体， 适配子 ) 是能高亲和性、 高特异性的结合某种生 物靶标的单链寡核酸分子 (ssDNA 或 ssRNA)。 已报道核酸适体的靶标包括金属离子、 有机小 分子、 多肽、 蛋白质、 细胞甚至组织等。 核酸适体的分子识别功能与抗体类似， 但与抗体相比 具有很多优良的特性， 如无免疫原性、 容易合成与标记、 快速的穿透组织、 良好的代谢动力 学、 不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性， 在生物检测、 疾病诊断治疗等 领域具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选 方法。
本发明提供的核酸适体， 是含有序列表的序列 1 至序列 9 中任一所示的核苷酸的 DNA 片段。
所述核酸适体具体可为序列表的序列 1 至序列 16 中任一所示的 DNA 片段。
核酸适体 1 ： 5’ -CGCG TGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAG CGCG-3’ ； 见序列表的序列 10 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 1 ；
核酸适体 2 ： 5’ -CAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’ ； 见序列表的序列 2 ； 核 酸适体 3a ： 5’ -ATGCCAC AGTGGGGGGGTGGGTGG GTGGCAT-3’ ； 见序列表的序列 11 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 3 ；
核酸适体 3b ： 5’ -TCGGATGC TGGGTGGGGGGGAAGA GCATCCGA -3’ ； 见序列表的序列 12 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 4 ；
核酸适体 3c ： 5’ -CCACTAC GAGGGTGGGCGGGTGGA GTAGTGG-3’ ； 见序列表的序列 13 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 5 ；
核酸适体 3d ： 5’ -GATC GGTGGGTGGGGGGGTTGGA GATC -3’ ； 见序列表的序列 14 ； 其 中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 6 ；
核酸适体 3e ： 5’ -CGAACA GGTGGGTGGGTTGGGTGGAT TGTTCG-3’ ； 见序列表的序列 15 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 7 ；
核酸适体 3f ： 5’ -GATTAA GTGGGTGGGGGGGTGGAAG TTAATC-3’ ； 见序列表的序列 16 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 8 ；
核酸适体 4 ： 5’ -GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3’ ； 见序列 表的序列 9。
其中， 每条 DNA 序列中目标序列以外的核苷酸可用其它互补的核苷酸代替。
其中， 核酸适体 3a、 核酸适体 3b、 核酸适体 3c、 核酸适体 3d、 核酸适体 3e 和核酸适 体 3f， 包含一保守序列 G1T1GGGTGGGG2GGGT2G3GA。其中 G1 可以删除， T1 可被核苷酸 A 取代， G2 可以被核苷酸 C 或 TT 取代， T2 可以被核苷酸 A 取代， G3 可以被核苷酸 A 取代或删除。
还可将所述核酸适体进行修饰或改造， 得到所述核酸适体的衍生物， 所述核酸适 体的衍生物可为 ：
a) 将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸， 得到的与所述核酸适体具 有相同功能的核酸适体的衍生物。
b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰， 得到的与所述核酸适体具有相同 功能的核酸适体的衍生物。
c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架， 得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物。
d) 将核酸适体改造为肽核酸， 得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的 衍生物。
e) 将所述核酸适体连接上荧光、 放射性和治疗性物质后， 得到的与所述核酸适体 具有相同功能的核酸适体的衍生物。
本发明还保护所述核酸适体在不同亚型非小细胞肺癌细胞分型中的应用。
所述核酸适体与不同亚型的非小细胞肺癌细胞的亲和性不同。 将两者孵育后可得 到不同的结合信号， 从而可以通过单个核酸适体信号或多个核酸适体分子图谱的形式区分 非小细胞肺癌不同亚型。还可将所述核酸适体进行荧光标记， 然后对肺癌病人的组织切片 进行染色， 从而实现临床样本非小细胞肺癌不同亚型的区分。 当然， 在核酸适体与不同亚型 的非小细胞肺癌细胞的亲和性不同的基础上， 可以再现有技术的技术上选择任意方法， 对 不同亚型非小细胞肺癌细胞进行分型。
所述不同亚型的非小细胞肺癌细胞可为腺癌亚型细胞、 大细胞癌亚型细胞或鳞癌 亚型细胞。
所述腺癌亚型细胞具体可为 A549 细胞 ； 所述大细胞癌亚型细胞具体可为 HLAMP 细胞或 NCI-H460 细胞 ； 所述鳞癌亚型细胞具体可为 NCI-H520 细胞或 NCI-H157 细胞。
本发明还保护筛选述核酸适体的方法， 包括如下步骤 ： 用靶细胞对核酸文库进行 筛选， 得到与靶细胞特异结合的核酸适体 ； 所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库 ； 所述靶细胞为非小细胞肺癌细胞中的亚型细胞。
所述筛选的方法具体包括如下步骤 ：
(1) 以所述核酸文库为起始核酸文库 ；
(2) 将所述起始核酸文库的溶液与靶细胞孵育， 靶细胞与起始核酸文库中部分核 酸序列结合， 分离， 得到与靶细胞结合的核酸序列文库 ；
(3) 将所述与靶细胞结合的核酸序列文库的溶液与非靶细胞孵育， 分离去除与所 述非靶细胞结合的核酸序列， 得到与靶细胞特异结合的核酸序列 ；
(4) 得到核酸适体。
所述步骤 (2) 中， 还可包括如下步骤 ： 在得到与靶细胞结合的核酸序列文库后， PCR 扩增所述与靶细胞结合的核酸序列文库， 并制备成单链。
所述步骤 (3) 中， 还可包括如下步骤 ： 在得到与靶细胞特异结合的核酸序列后， PCR 扩增与靶细胞特异结合的核酸序列， 并制备成单链。
所述筛选的方法中， 在所述步骤 (3) 之后、 步骤 (4) 之前， 包括至少 1 次以下操作 ： 以所述与靶细胞特异结合的核酸序列为起始核酸文库， 重复步骤 (2) 和 (3)， 每次操作均以 前一次操作中得到的与靶细胞特异结合的核酸序列为起始核酸文库。
所述筛选方法中， 可每一轮筛选逐步增加筛选压力， 以增进核酸适体的富集程度。 所述增加筛选压力可为线性减少核酸序列文库和靶细胞的孵育时间和相应的线性增加核 酸序列文库与非靶细胞的孵育时间。
所述靶细胞具体可为腺癌亚型细胞 ； 所述非靶细胞具体可为大细胞癌亚型细胞。
肺癌的形成是一个多步的瘤形成过程。一些分子异常也伴随肿痛的形成而发生， 如一些分子在肿瘤中表达或过表达， 或发生改变。 利用本发明的核酸适体， 可在目前非小细 胞肺癌肿瘤标志物未知的情况下， 从分子响应信号而不是从细胞物理形貌上实现非小细胞 肺癌不同亚型的区分。 利用本发明的核酸适体， 对其结合靶标的鉴定， 将有利于非小细胞肺 癌不同亚型的肿瘤标志物的发现， 有利于非小细胞肺癌更早的诊断和更准确的分型， 有利 于发现肿瘤治疗新的药物作用靶点。 附图说明
图 1 为实施例 1 中核酸适体的随筛选轮次的富集过程 ； 峰形代表 A549 细胞与异硫 氰酸荧光素 (FITC) 标记文库， 和第 1 轮、 第 6 轮、 第 21 轮产物结合的情况
图 2 为应用四甲基罗丹明标记的核酸适体识别非小细胞肺癌组织切片的结果。 具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
腺癌 A549 细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所 / 中国协和医科大学基础医学院细胞中心， 产品目录号为 CCC0002。鳞癌 NCI-H520 细胞系购自中国医学科学院 基础医学研究所 / 中国协和医科大学基础医学院细胞中心， 产品目录号为 CCC0197。鳞癌 NCI-H157 细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所 / 中国协和医科大学基础医学院细 胞中心， 产品目录号为 CCC0113。大细胞癌 HLAMP 购自中山医科大学实验动物中心。大细胞 癌 NCI-H460 细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库， 产品目录号为 TCHu39。
实施例 1、 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体的筛选
一、 随机核酸文库的设计与合成
设计合成两端包含 20 个核苷酸、 中间包括 45 个核苷酸的随机核酸序列文库如下 ： 5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG(N45)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ 。
二、 核酸适体的筛选
将随机核酸文库溶于结合缓冲液中 (PBS， 150mM NaCl， 5mM MgCl2， 1mg/ml 酵母转 移 RNA)， 与肺腺癌细胞系 A549 细胞在冰上孵育 1 小时 ； 经洗涤缓冲溶液 (PBS， 150mMNaCl， 5mM MgCl2) 洗涤后， 将 A549 细胞刮离下来， 然后通过加热将与细胞表面结合的 DNA 解离 ； 解 离的 DNA 与大细胞肺癌细胞系 HLAMP 细胞冰上孵育 1 小时， 收集上清液并以其中的 DNA 为 模板， 利用引物 (FITC-5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ 和 Biotin-5’ -GTCACCAGCACGTCCATGA G-3’ ) 进行 PCR 扩增 ； 扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的 PCR 产物， 然后 利用 0.2M 的氢氧化钠使双链 DNA 变性解链， 收集 FITC 标记的 DNA 单链， 这些 DNA 单链脱盐 后用于下一轮筛选。 为了得到高亲和性的区分不同非小细胞不同亚型的核酸适体， 在筛选的过程中， 通过逐步减少 DNA 文库与靶细胞孵育的时间， 增加洗涤次数和洗涤时间以及与对照细胞孵 育的时间来增强筛选压力。核酸适体随筛选轮次的富集过程见图 1。
25 轮 筛 选 后， 以 筛 选 产 物 为 模 板 通 过 引 物 (5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’和 5’ -GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’ ) 进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物进行测序， 得到以下核酸适体序 列：
核酸适体 1 ： 5’ -CGCG TGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAG CGCG-3’ ；
核酸适体 2 ： 5’ -CAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’ ；
核酸适体 3a ： 5’ -ATGCCAC AGTGGGGGGGTGGGTGG GTGGCAT-3’ ；
核酸适体 3b ： 5’ -TCGGATGC TGGGTGGGGGGGAAGA GCATCCGA-3’ ；
核酸适体 3c ： 5’ -CCACTAC GAGGGTGGGCGGGTGGA GTAGTGG-3’ ；
核酸适体 3d ： 5’ -GATC GGTGGGTGGGGGGGTTGGA GATC-3’ ；
核酸适体 3e ： 5’ -CGAACA GGTGGGTGGGTTGGGTGGAT TGTTCG-3’ ；
核酸适体 3f ： 5’ -GATTAA GTGGGTGGGGGGGTGGAAG TTAATC-3’ ；
核酸适体 4 ： 5’ -GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3’ 。
将获得的核酸适体分别在 5’ 端标记荧光分子制成分子探针， 分别取 0、 5、 10、 20、 5 40、 80、 100、 120、 200nM 的分子探针溶液， 与 5×10 个肺腺癌细胞系 A549 细胞于冰上孵育 50 分钟后， 用结合缓冲液洗涤两遍， 然后用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度， 如细胞能结 合荧光标记的核酸适体， 则以荧光强度对探针浓度作图， 用公式 Y ＝ BmaxX/(Kd+X) 计算核 酸适体的平衡解离常数 Kd。结果表明， 核酸适体的平衡解离常数均在纳摩范围内。
实施例 2、 应用核酸适体对进行不同亚型的小细胞肺癌进行分型
用异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记实施例 1 得到的 4 条核酸适体。用异硫氰酸荧光 素 (FITC) 标记实施例 1 的随机核酸文库。
将培养的不同肿瘤细胞用 PBS 洗涤两次、 然后 0.02％ EDTA 处理 3 分钟、 再用 PBS 洗涤两次。
每种肿瘤细胞分别进行以下四组处理， 每个处理设置三个重复， 结果取平均值 ：
处理一 ： 通过细胞记数分别取 300,000 左右的细胞分散于结合缓冲溶液中， 然后 加入异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记核酸适体 1( 最终浓度为 100nM)。
处理二 ： 通过细胞记数分别取 300,000 左右的细胞分散于结合缓冲溶液中， 然后 加入异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记核酸适体 2( 最终浓度为 100nM)。
处理三 ： 通过细胞记数分别取 300,000 左右的细胞分散于结合缓冲溶液中， 然后 加入异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记核酸适体 3e( 最终浓度为 100nM)。
处理四 ： 通过细胞记数分别取 300,000 左右的细胞分散于结合缓冲溶液中， 然后 加入异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记核酸适体 4( 最终浓度为 100nM)。
四个处理的混合液在冰上孵育 50 分钟， 离心洗涤两次后利用流式细胞仪检测核 酸适体和不同肿瘤细胞结合情况。将细胞与 FITC 标记的随机文库孵育后做流式细胞仪检 测， 设定一荧光强度值大于 95％的细胞荧光强度做为流式细胞仪背景荧光值。以细胞与核 酸适体结合后荧光强度超过这一阈值的细胞百分数作为衡量核酸适体与细胞的结合能力 强弱 (0 ： ＜ 15％ ； +： 15-30％ ； ++ ： 30-65％ ； +++ ： 65-85％ ； ++++ ＞ 85％ )。
结果见表 1。 表 1 核酸适体对非小细胞肺癌不同亚型进行分型的流式细胞仪检测结果对于异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的核酸适体 1， 腺癌亚型的细胞与其结合后的荧 光强度高于阈值的细胞百分数有 65-85％， 大细胞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高 于阈值的细胞百分数有 15-30％， 鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度在阈值的细胞百
分数小于 15％ ； 对于异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的核酸适体 2， 腺癌亚型的细胞与其结合 后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 85％以上， 大细胞癌亚型的细胞与其结合后的荧光 强度高于阈值的细胞百分数有 30-65％， 鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值 的细胞百分数小于 15％； 对于异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的核酸适体 3e， 腺癌亚型的细胞 与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 85％以上， 大细胞癌亚型的细胞与其结合 后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 65-85％， 鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度 高于阈值的细胞百分数有 15-65％； 对于异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的核酸适体 4， 腺癌亚 型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 85％以上， 大细胞癌亚型的细胞 与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 65-85％， 鳞癌亚型的细胞与其结合后的 荧光强度高于阈值的细胞百分数小于 15％。
结果表明 ： 利用以上核酸适体与不同亚型非小细胞肺癌的结合强弱图谱均可实现 不同亚型非小细胞肺癌的区分。
实施例 3、 检测表 1 所列的核酸适体与肺癌组织切片的结合
来自不同肺癌患者志愿者的甲醛固定石蜡包埋的组织切片浸于二甲苯中室温脱 蜡 2 次， 每次 20 分钟， 随后浸于系列乙醇中水化 (100％， 两次， 每次 1 分钟 ； 95％乙醇， 1 次， 1 分钟 ； 70％乙醇， 1 次， 1 分钟 )。随后将水化的组织切片浸于缓冲溶液中 95℃加热 15 分 钟。待组织切片恢复室温后， 与含 20％胎牛血清和小牛胸腺 DNA 的结合缓冲液室温孵育 1 小时， 组织切片经洗涤后分别与四甲基罗丹名标记的核酸适体 (200nM) 在结合缓冲液中室 温孵育 1 小时。染色后用洗涤缓冲液洗涤组织切片 3 次， 待干后封片检测。 结果见图 2。
当三种非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记的核酸 适体 1 孵育后， 腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为 357.59， 而大细胞癌和鳞癌分别为 214.99 和 181.06。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记的 核酸适体 2 孵育后， 腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为 289.79， 而大细胞癌和鳞癌分别 为 220.05 和 182.20。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记 的核酸适体 3e 孵育后， 腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为 492.38， 而大细胞癌和鳞癌分 别为 203.48 和 212.54。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标 记的核酸适体 4 孵育后， 腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为 482.83， 而大细胞癌和鳞癌 分别为 219.33 和 218.31。
实验结果表明所得到的核酸适体能与肺腺癌高亲和性结合， 从而在临床上可用于 肺腺癌的检测和诊断。
本申请是申请号为 200910083075.X、 申请日为 2009 年 04 月 28 日、 发明创造名称 为 “用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法” 的分案申请。技术领域
本发明涉及一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选方法。 背景技术 肺癌是最致命的癌症之一， 在组织学上分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌， 其中后 者占肺癌病例的 80％。非小细胞肺癌又分为腺癌， 鳞癌和大细胞癌三类亚型。腺癌作为一 种最主要的亚型， 占非小细胞肺癌的 40％。非小细胞肺癌的预后严重依赖于确诊时疾病 所处的分期， 按照现有的治疗水平， 病人的 5 年生存率从 I 期的 60％降到 IV 期的 1％。尽 管在肺癌的检测方法上取得了较大进展， 但目前仍有约 70％的病人在确诊时已处于肺癌晚 期。 对非小细胞肺癌不同亚型的治疗施加相似的治疗方法而没有考虑亚型之间的异质性是 影响非小细胞肺癌治疗效果的重要原因。尽管目前神经元特异性烯醇化酶、 细胞角蛋白片 段 21-1、 癌胚抗原、 糖类抗原等肿瘤标志物用于肺癌的检测和术后评估， 但是这些肿瘤标志 物对肺癌， 尤其是不同肺癌亚型的特异性和敏感性不够。非小细胞肺癌的分型和诊断仍主 要依靠细胞物理形态进行判断， 发展能从分子水平上反映非小细胞肺癌特征的新试剂， 并 用以进行亚型分类和早期诊断是降低非小细胞肺癌死亡率重要手段。
核酸适体 (Aptamer， 又称适配体， 适配子 ) 是能高亲和性、 高特异性的结合某种生 物靶标的单链寡核酸分子 (ssDNA 或 ssRNA)。 已报道核酸适体的靶标包括金属离子、 有机小 分子、 多肽、 蛋白质、 细胞甚至组织等。 核酸适体的分子识别功能与抗体类似， 但与抗体相比 具有很多优良的特性， 如无免疫原性、 容易合成与标记、 快速的穿透组织、 良好的代谢动力 学、 不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性， 在生物检测、 疾病诊断治疗等 领域具有重要的应用前景。
核酸适体 (Aptamer， 又称适配体， 适配子 ) 是能高亲和性、 高特异性的结合某种生 物靶标的单链寡核酸分子 (ssDNA 或 ssRNA)。 已报道核酸适体的靶标包括金属离子、 有机小 分子、 多肽、 蛋白质、 细胞甚至组织等。 核酸适体的分子识别功能与抗体类似， 但与抗体相比 具有很多优良的特性， 如无免疫原性、 容易合成与标记、 快速的穿透组织、 良好的代谢动力 学、 不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性， 在生物检测、 疾病诊断治疗等 领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体及其筛选 方法。
本发明提供的核酸适体， 是含有序列表的序列 1 至序列 9 中任一所示的核苷酸的 DNA 片段。
所述核酸适体具体可为序列表的序列 1 至序列 16 中任一所示的 DNA 片段。
核酸适体 1 ： 5’ -CGCG TGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAG CGCG-3’ ； 见序列表的序列 10 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 1 ；
核酸适体 2 ： 5’ -CAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’ ； 见序列表的序列 2 ； 核 酸适体 3a ： 5’ -ATGCCAC AGTGGGGGGGTGGGTGG GTGGCAT-3’ ； 见序列表的序列 11 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 3 ；
核酸适体 3b ： 5’ -TCGGATGC TGGGTGGGGGGGAAGA GCATCCGA -3’ ； 见序列表的序列 12 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 4 ；
核酸适体 3c ： 5’ -CCACTAC GAGGGTGGGCGGGTGGA GTAGTGG-3’ ； 见序列表的序列 13 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 5 ；
核酸适体 3d ： 5’ -GATC GGTGGGTGGGGGGGTTGGA GATC -3’ ； 见序列表的序列 14 ； 其 中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 6 ；
核酸适体 3e ： 5’ -CGAACA GGTGGGTGGGTTGGGTGGAT TGTTCG-3’ ； 见序列表的序列 15 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 7 ；
核酸适体 3f ： 5’ -GATTAA GTGGGTGGGGGGGTGGAAG TTAATC-3’ ； 见序列表的序列 16 ； 其中加粗下划线标记的为目标序列， 见序列表的序列 8 ；
核酸适体 4 ： 5’ -GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3’ ； 见序列 表的序列 9。
其中， 每条 DNA 序列中目标序列以外的核苷酸可用其它互补的核苷酸代替。
其中， 核酸适体 3a、 核酸适体 3b、 核酸适体 3c、 核酸适体 3d、 核酸适体 3e 和核酸适 体 3f， 包含一保守序列 G1T1GGGTGGGG2GGGT2G3GA。其中 G1 可以删除， T1 可被核苷酸 A 取代， G2 可以被核苷酸 C 或 TT 取代， T2 可以被核苷酸 A 取代， G3 可以被核苷酸 A 取代或删除。
还可将所述核酸适体进行修饰或改造， 得到所述核酸适体的衍生物， 所述核酸适 体的衍生物可为 ：
a) 将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸， 得到的与所述核酸适体具 有相同功能的核酸适体的衍生物。
b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰， 得到的与所述核酸适体具有相同 功能的核酸适体的衍生物。
c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架， 得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物。
d) 将核酸适体改造为肽核酸， 得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的 衍生物。
e) 将所述核酸适体连接上荧光、 放射性和治疗性物质后， 得到的与所述核酸适体 具有相同功能的核酸适体的衍生物。
本发明还保护所述核酸适体在不同亚型非小细胞肺癌细胞分型中的应用。
所述核酸适体与不同亚型的非小细胞肺癌细胞的亲和性不同。 将两者孵育后可得 到不同的结合信号， 从而可以通过单个核酸适体信号或多个核酸适体分子图谱的形式区分 非小细胞肺癌不同亚型。还可将所述核酸适体进行荧光标记， 然后对肺癌病人的组织切片 进行染色， 从而实现临床样本非小细胞肺癌不同亚型的区分。 当然， 在核酸适体与不同亚型 的非小细胞肺癌细胞的亲和性不同的基础上， 可以再现有技术的技术上选择任意方法， 对 不同亚型非小细胞肺癌细胞进行分型。
所述不同亚型的非小细胞肺癌细胞可为腺癌亚型细胞、 大细胞癌亚型细胞或鳞癌 亚型细胞。
所述腺癌亚型细胞具体可为 A549 细胞 ； 所述大细胞癌亚型细胞具体可为 HLAMP 细胞或 NCI-H460 细胞 ； 所述鳞癌亚型细胞具体可为 NCI-H520 细胞或 NCI-H157 细胞。
本发明还保护筛选述核酸适体的方法， 包括如下步骤 ： 用靶细胞对核酸文库进行 筛选， 得到与靶细胞特异结合的核酸适体 ； 所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库 ； 所述靶细胞为非小细胞肺癌细胞中的亚型细胞。
所述筛选的方法具体包括如下步骤 ：
(1) 以所述核酸文库为起始核酸文库 ；
(2) 将所述起始核酸文库的溶液与靶细胞孵育， 靶细胞与起始核酸文库中部分核 酸序列结合， 分离， 得到与靶细胞结合的核酸序列文库 ；
(3) 将所述与靶细胞结合的核酸序列文库的溶液与非靶细胞孵育， 分离去除与所 述非靶细胞结合的核酸序列， 得到与靶细胞特异结合的核酸序列 ；
(4) 得到核酸适体。
所述步骤 (2) 中， 还可包括如下步骤 ： 在得到与靶细胞结合的核酸序列文库后， PCR 扩增所述与靶细胞结合的核酸序列文库， 并制备成单链。
所述步骤 (3) 中， 还可包括如下步骤 ： 在得到与靶细胞特异结合的核酸序列后， PCR 扩增与靶细胞特异结合的核酸序列， 并制备成单链。
所述筛选的方法中， 在所述步骤 (3) 之后、 步骤 (4) 之前， 包括至少 1 次以下操作 ： 以所述与靶细胞特异结合的核酸序列为起始核酸文库， 重复步骤 (2) 和 (3)， 每次操作均以 前一次操作中得到的与靶细胞特异结合的核酸序列为起始核酸文库。
所述筛选方法中， 可每一轮筛选逐步增加筛选压力， 以增进核酸适体的富集程度。 所述增加筛选压力可为线性减少核酸序列文库和靶细胞的孵育时间和相应的线性增加核 酸序列文库与非靶细胞的孵育时间。
所述靶细胞具体可为腺癌亚型细胞 ； 所述非靶细胞具体可为大细胞癌亚型细胞。
肺癌的形成是一个多步的瘤形成过程。一些分子异常也伴随肿痛的形成而发生， 如一些分子在肿瘤中表达或过表达， 或发生改变。 利用本发明的核酸适体， 可在目前非小细 胞肺癌肿瘤标志物未知的情况下， 从分子响应信号而不是从细胞物理形貌上实现非小细胞 肺癌不同亚型的区分。 利用本发明的核酸适体， 对其结合靶标的鉴定， 将有利于非小细胞肺 癌不同亚型的肿瘤标志物的发现， 有利于非小细胞肺癌更早的诊断和更准确的分型， 有利 于发现肿瘤治疗新的药物作用靶点。 附图说明
图 1 为实施例 1 中核酸适体的随筛选轮次的富集过程 ； 峰形代表 A549 细胞与异硫 氰酸荧光素 (FITC) 标记文库， 和第 1 轮、 第 6 轮、 第 21 轮产物结合的情况
图 2 为应用四甲基罗丹明标记的核酸适体识别非小细胞肺癌组织切片的结果。 具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
腺癌 A549 细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所 / 中国协和医科大学基础医学院细胞中心， 产品目录号为 CCC0002。鳞癌 NCI-H520 细胞系购自中国医学科学院 基础医学研究所 / 中国协和医科大学基础医学院细胞中心， 产品目录号为 CCC0197。鳞癌 NCI-H157 细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所 / 中国协和医科大学基础医学院细 胞中心， 产品目录号为 CCC0113。大细胞癌 HLAMP 购自中山医科大学实验动物中心。大细胞 癌 NCI-H460 细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库， 产品目录号为 TCHu39。
实施例 1、 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的核酸适体的筛选
一、 随机核酸文库的设计与合成
设计合成两端包含 20 个核苷酸、 中间包括 45 个核苷酸的随机核酸序列文库如下 ： 5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG(N45)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ 。
二、 核酸适体的筛选
将随机核酸文库溶于结合缓冲液中 (PBS， 150mM NaCl， 5mM MgCl2， 1mg/ml 酵母转 移 RNA)， 与肺腺癌细胞系 A549 细胞在冰上孵育 1 小时 ； 经洗涤缓冲溶液 (PBS， 150mMNaCl， 5mM MgCl2) 洗涤后， 将 A549 细胞刮离下来， 然后通过加热将与细胞表面结合的 DNA 解离 ； 解 离的 DNA 与大细胞肺癌细胞系 HLAMP 细胞冰上孵育 1 小时， 收集上清液并以其中的 DNA 为 模板， 利用引物 (FITC-5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ 和 Biotin-5’ -GTCACCAGCACGTCCATGA G-3’ ) 进行 PCR 扩增 ； 扩增后通过亲和素包被的葡聚糖珠分离生物素标记的 PCR 产物， 然后 利用 0.2M 的氢氧化钠使双链 DNA 变性解链， 收集 FITC 标记的 DNA 单链， 这些 DNA 单链脱盐 后用于下一轮筛选。 为了得到高亲和性的区分不同非小细胞不同亚型的核酸适体， 在筛选的过程中， 通过逐步减少 DNA 文库与靶细胞孵育的时间， 增加洗涤次数和洗涤时间以及与对照细胞孵 育的时间来增强筛选压力。核酸适体随筛选轮次的富集过程见图 1。
25 轮 筛 选 后， 以 筛 选 产 物 为 模 板 通 过 引 物 (5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’和 5’ -GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’ ) 进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物进行测序， 得到以下核酸适体序 列：
核酸适体 1 ： 5’ -CGCG TGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAG CGCG-3’ ；
核酸适体 2 ： 5’ -CAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3’ ；
核酸适体 3a ： 5’ -ATGCCAC AGTGGGGGGGTGGGTGG GTGGCAT-3’ ；
核酸适体 3b ： 5’ -TCGGATGC TGGGTGGGGGGGAAGA GCATCCGA-3’ ；
核酸适体 3c ： 5’ -CCACTAC GAGGGTGGGCGGGTGGA GTAGTGG-3’ ；
核酸适体 3d ： 5’ -GATC GGTGGGTGGGGGGGTTGGA GATC-3’ ；
核酸适体 3e ： 5’ -CGAACA GGTGGGTGGGTTGGGTGGAT TGTTCG-3’ ；
核酸适体 3f ： 5’ -GATTAA GTGGGTGGGGGGGTGGAAG TTAATC-3’ ；
核酸适体 4 ： 5’ -GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3’ 。
将获得的核酸适体分别在 5’ 端标记荧光分子制成分子探针， 分别取 0、 5、 10、 20、 5 40、 80、 100、 120、 200nM 的分子探针溶液， 与 5×10 个肺腺癌细胞系 A549 细胞于冰上孵育 50 分钟后， 用结合缓冲液洗涤两遍， 然后用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度， 如细胞能结 合荧光标记的核酸适体， 则以荧光强度对探针浓度作图， 用公式 Y ＝ BmaxX/(Kd+X) 计算核 酸适体的平衡解离常数 Kd。结果表明， 核酸适体的平衡解离常数均在纳摩范围内。
实施例 2、 应用核酸适体对进行不同亚型的小细胞肺癌进行分型
用异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记实施例 1 得到的 4 条核酸适体。用异硫氰酸荧光 素 (FITC) 标记实施例 1 的随机核酸文库。
将培养的不同肿瘤细胞用 PBS 洗涤两次、 然后 0.02％ EDTA 处理 3 分钟、 再用 PBS 洗涤两次。
每种肿瘤细胞分别进行以下四组处理， 每个处理设置三个重复， 结果取平均值 ：
处理一 ： 通过细胞记数分别取 300,000 左右的细胞分散于结合缓冲溶液中， 然后 加入异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记核酸适体 1( 最终浓度为 100nM)。
处理二 ： 通过细胞记数分别取 300,000 左右的细胞分散于结合缓冲溶液中， 然后 加入异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记核酸适体 2( 最终浓度为 100nM)。
处理三 ： 通过细胞记数分别取 300,000 左右的细胞分散于结合缓冲溶液中， 然后 加入异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记核酸适体 3e( 最终浓度为 100nM)。
处理四 ： 通过细胞记数分别取 300,000 左右的细胞分散于结合缓冲溶液中， 然后 加入异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记核酸适体 4( 最终浓度为 100nM)。
四个处理的混合液在冰上孵育 50 分钟， 离心洗涤两次后利用流式细胞仪检测核 酸适体和不同肿瘤细胞结合情况。将细胞与 FITC 标记的随机文库孵育后做流式细胞仪检 测， 设定一荧光强度值大于 95％的细胞荧光强度做为流式细胞仪背景荧光值。以细胞与核 酸适体结合后荧光强度超过这一阈值的细胞百分数作为衡量核酸适体与细胞的结合能力 强弱 (0 ： ＜ 15％ ； +： 15-30％ ； ++ ： 30-65％ ； +++ ： 65-85％ ； ++++ ＞ 85％ )。
结果见表 1。 表 1 核酸适体对非小细胞肺癌不同亚型进行分型的流式细胞仪检测结果对于异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的核酸适体 1， 腺癌亚型的细胞与其结合后的荧 光强度高于阈值的细胞百分数有 65-85％， 大细胞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高 于阈值的细胞百分数有 15-30％， 鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度在阈值的细胞百
分数小于 15％ ； 对于异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的核酸适体 2， 腺癌亚型的细胞与其结合 后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 85％以上， 大细胞癌亚型的细胞与其结合后的荧光 强度高于阈值的细胞百分数有 30-65％， 鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值 的细胞百分数小于 15％； 对于异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的核酸适体 3e， 腺癌亚型的细胞 与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 85％以上， 大细胞癌亚型的细胞与其结合 后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 65-85％， 鳞癌亚型的细胞与其结合后的荧光强度 高于阈值的细胞百分数有 15-65％； 对于异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的核酸适体 4， 腺癌亚 型的细胞与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 85％以上， 大细胞癌亚型的细胞 与其结合后的荧光强度高于阈值的细胞百分数有 65-85％， 鳞癌亚型的细胞与其结合后的 荧光强度高于阈值的细胞百分数小于 15％。
结果表明 ： 利用以上核酸适体与不同亚型非小细胞肺癌的结合强弱图谱均可实现 不同亚型非小细胞肺癌的区分。
实施例 3、 检测表 1 所列的核酸适体与肺癌组织切片的结合
来自不同肺癌患者志愿者的甲醛固定石蜡包埋的组织切片浸于二甲苯中室温脱 蜡 2 次， 每次 20 分钟， 随后浸于系列乙醇中水化 (100％， 两次， 每次 1 分钟 ； 95％乙醇， 1 次， 1 分钟 ； 70％乙醇， 1 次， 1 分钟 )。随后将水化的组织切片浸于缓冲溶液中 95℃加热 15 分 钟。待组织切片恢复室温后， 与含 20％胎牛血清和小牛胸腺 DNA 的结合缓冲液室温孵育 1 小时， 组织切片经洗涤后分别与四甲基罗丹名标记的核酸适体 (200nM) 在结合缓冲液中室 温孵育 1 小时。染色后用洗涤缓冲液洗涤组织切片 3 次， 待干后封片检测。 结果见图 2。
当三种非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记的核酸 适体 1 孵育后， 腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为 357.59， 而大细胞癌和鳞癌分别为 214.99 和 181.06。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记的 核酸适体 2 孵育后， 腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为 289.79， 而大细胞癌和鳞癌分别 为 220.05 和 182.20。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标记 的核酸适体 3e 孵育后， 腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为 492.38， 而大细胞癌和鳞癌分 别为 203.48 和 212.54。当非小细胞肺癌不同分型患者的组织切片分别与四甲基罗丹名标 记的核酸适体 4 孵育后， 腺癌亚型的组织切片的荧光强度值为 482.83， 而大细胞癌和鳞癌 分别为 219.33 和 218.31。
实验结果表明所得到的核酸适体能与肺腺癌高亲和性结合， 从而在临床上可用于 肺腺癌的检测和诊断。
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