一种高效生产 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸的方法 技术领域 本发明涉及一种生产 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸的方法， 尤其是采用生物法高效生 产 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸的方法。
背景技术 L- 抗坏血酸 ( 简称 VC) 在体内发挥着重要的生理作用， 但其还原性强， 极不稳定， 这使得它在应用上受到了很大的限制。VC 的衍生物则大大提高了它的稳定性， 而不影响它 的生理功能。本专利就其衍生物之一 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸在糖基转移酶的作用下的生 物合成。
2-O- 葡萄糖基抗坏血酸是 L- 抗坏血酸的一种重要衍生物， 有着比 L- 抗坏血酸更 广泛的应用价值。1990 年日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现 2-O- 葡萄 糖基抗坏血酸 AA-2G， 并已确定大量合成这种维生素 C 衍生物的方法。目前， 能进行规模化 生产的也只有 Hayashibara 有限公司。
当前， 对 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸的研究主要集中于其生理功能。对于产量的提高 主要通过筛选能产糖基转移酶和优化发酵过程中的参数等来提高转化效率。曹新志 ( 曹新 志， 刘芳， 明红梅， 武玉娟 .2008. 酶法合成葡萄糖基 -L- 抗坏血酸的产酶条件及转化条件 优化， 农产品加工 . 学刊， 124 ： 19-24.) 提出了一种利用环糊精转移酶转化 L- 抗坏血酸和 β- 环糊精生成 - 葡萄糖基 L- 抗坏血酸的方法， 优化条件后其产量仅为 95.36mg/L。黄敏 ( 黄敏， 裘娟萍 .2004. 生物转化法生产 2-O-α-D- 吡喃型葡萄糖基 -L- 抗坏血酸的研究进 展， 工业微生物， 34 ： 41-44) 等通过对酶法生产葡萄糖基维生素 C 的产酶条件及转化条件的 优化得到 AA-2G 产量为 420mg/L。较低的产量影响了 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸的大规模生 产。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题是提供一种高效生产 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸的方 法。本发明利用环糊精葡萄糖苷转移酶高效的转化合成 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸的性质， 优 化生产工艺， 显著提高了 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸产量， 取得了意想不到的效果。
为解决上述技术问题， 本发明的技术方案为 ：
利用环糊精葡萄糖苷转移酶催化抗坏血酸与 β- 环糊精的混合溶液合成 2-O- 葡 萄糖基抗坏血酸。
所述催化参数为 ： pH 4.5-6.5 ； 温度为 ： 35℃ -45℃； 振荡速率 ： 100-250 转 / 分钟 ； 时间 ： 12-48h。
所述抗坏血酸与 β- 环糊精的混合溶液为 ： 抗坏血酸浓度 25-100g/L ； β- 环糊精 浓度 25-100g/L。
所述环糊精葡萄糖苷转移酶用量为 50-200U/mL。
所述环糊精葡萄糖苷转移酶来源于产环糊精葡萄糖苷转移酶菌株。所述菌株为软芽孢杆菌 (Peanibacillus macerans JFB05-01)， 保藏编号为 CCTCC NO ： M208063。
所述菌株为地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)。
本发明提供的技术方案以廉价的 β- 环糊精为底物， 降低了生产成本。利用环糊 精葡萄糖苷转移酶， 优化生产工艺， 使 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸产量提高了进 10 倍， 达到 8.5g/L， 取得了意想不到的效果。 具体实施方式
实施例 1Paenibacillus macerans 环糊精葡萄糖苷转移酶的制备
软 芽 孢 杆 菌 (Peanibacillus macerans JFB05-01)， 保 藏 编 号 为 CCTCC NO ： M 208063， 可在中国典型培养物保藏中心购买， 为本实验室提交菌株。 取一环斜面菌体接种至 装有 80mL 种子培养基的 500mI。三角瓶中培养， 摇床转速为 200r/min， 37℃培养 18h。将 培养好的种子培养液按照 10％ ( 体积比 ) 的接种量， 接种至装有 80mL 发酵培养基的 500mL 三角瓶中， 37℃发酵培养 24h， HYG II 型回转式恒温调速摇瓶柜的转速为 200r/min。停止 发酵后将发酵液经 12000r/min 离心 20min， 取上清即为粗酶。 种子培养基 (g*L-1) 组成为 ： 可溶性淀粉 40， 蛋白胨 25， 玉米浆 5， MgSO4· 7H2O 0.5， CaCl20.7， K2HPO4·3H2O 1， NaH2PO4·2H2O 2， NaNO32， pH 值 7.0。 -1
发酵培养基 (g*L ) 组成为 ： 玉米淀粉 20， 蛋白胨 5， 玉米浆浸出汁 5， 硫酸铵 8， K2HPO4·3H2O 1， NaH2PO4·12H2O 2， NaNO32， pH 值 7.0， 121℃灭菌 15min。
实施例 2Bacillus licheniformis 环糊精葡萄糖苷转移酶的制备
取一环斜面菌体接种至装有 40mL 种子培养基的 250mL。三角瓶中培养， 摇床转速 为 200r/min， 38℃培养 12h。将培养好的种子培养液按照 10％ ( 体积比 ) 的接种量， 接种至 三角瓶 (250mL) 装产酶培养基 40mL 中， 接种后于 38℃恒温振荡培养 96h 后， 4000r/min 离 心 20min， 上清液即为粗酶液。
种子培养基 (g*L-1) 组成为 ： 可溶性淀粉 10， 蛋白胨 5， 酵母膏 5， MgSO4·7H2O0.2， K2HPO4·3H2O 1， NaH2PO4·2H2O 1， NaCO35， pH 值 7.0， 121℃灭菌 15min。 -1
发酵培养基 (g*L ) 组成为 ： 可溶性淀粉 10， 蛋白胨 5， 酵母膏 5， MgSO4·7H2O0.2， K2HPO4·3H2O 1， NaH2PO4·2H2O 2， Na2CO32， pH 值 7.0， 121℃灭菌 15min。
实施例 3 合成 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸
将抗坏血酸与 β- 环糊精溶于 100mM 的醋酸缓冲中， 制备其混合溶液， 加入环糊精 葡萄糖苷转移酶粗酶液， 使抗坏血酸浓度为 50g/L， β- 环糊精浓度为 50g/L， 环糊精葡萄糖 苷转移酶浓度为 160U/mL。
调整 pH 为 5.5， 温度为 37℃， 避光避氧， 100 转 / 分钟振荡反应 24h。反应的过程 中取样， 利用 HPLC 检测 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸生成情况， 当反应到达 24h 时， 2-O- 葡萄糖 基产量达到 7g/L。
2-O- 葡萄糖基抗坏血酸测定方法 (HPLC 法 ) ：
液相仪 ： Agilent 1200 液相仪
色谱柱 ： Agilent SB-Aq
流速 ： 0.5mL/min
检测器 ： DAD
柱温 ： 25℃
检测波长 ： 238nm
流动相 ： 6.86g KH2PO4， 5mL 甲醇， 溶于 1000mL 超纯水， 用磷酸调 pH 至 2.0。
实施例 4 合成 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸
将抗坏血酸与 β- 环糊精溶于 100mM 的醋酸缓冲中， 制备其混合溶液， 加入环糊精 葡萄糖苷转移酶粗酶液， 使抗坏血酸浓度为 50g/L， β- 环糊精浓度为 25g/L， 环糊精葡萄糖 苷转移酶浓度为 100U/mL。
调整 pH 为 4.5， 温度为 45℃， 避光避氧， 150 转 / 分钟振荡反应 24h。反应的过程 中取样， 利用 HPLC 检测 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸生成情况， 当反应到达 24h 时， 2-O- 葡萄糖 基产量达到 7.5g/L。
2-O- 葡萄糖基抗坏血酸测定方法 (HPLC 法 ) 同实施例 3。
实施例合 5 成 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸
将抗坏血酸与 β- 环糊精溶于 100mM 的醋酸缓冲中， 制备其混合溶液， 加入环糊精 葡萄糖苷转移酶粗酶液， 使抗坏血酸浓度为 100g/L， β- 环糊精浓度为 100g/L， 环糊精葡萄 糖苷转移酶浓度为 200U/mL。
调整 pH 为 6.5， 温度为 35℃， 避光避氧， 250 转 / 分钟振荡反应 12h。反应的过程 中取样， 利用 HPLC 检测 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸生成情况， 当反应 12h 时， 2-O- 葡萄糖基产 量达到 8.5g/L。
2-O- 葡萄糖基抗坏血酸测定方法 (HPLC 法 ) 同实施例 3。
实施例合 6 成 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸
将抗坏血酸与 β- 环糊精溶于 100mM 的醋酸缓冲中， 制备其混合溶液， 加入环糊精 葡萄糖苷转移酶粗酶液， 使抗坏血酸浓度为 100g/L， β- 环糊精浓度为 100g/L， 环糊精葡萄 糖苷转移酶浓度为 50U/mL。
调整 pH 为 5， 温度为 38℃， 避光避氧， 150 转 / 分钟振荡反应 48h。反应的过程中 取样， 利用 HPLC 检测 2-O- 葡萄糖基抗坏血酸生成情况， 当反应到达 48h 时， 2-O- 葡萄糖基 产量达到 7g/L。
2-O- 葡萄糖基抗坏血酸测定方法 (HPLC 法 ) 同实施例 3。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。5