农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法 所属技术领域
本发明涉及利用转基因方法生产丛生竹类， 尤其是利用农杆菌介导法生产大型丛 生竹类的方法， 属于植物转基因技术领域。 背景技术
目前， 竹类基因克隆及其遗传改良方面的研究尚处起步和探索阶段。在基因克隆 方面， 尽管相继在慈竹、 绿竹、 毛竹上克隆了调控竹木质素相关合成酶基因， 但未见在工业 纸浆用竹中成功进行遗传转化的研究报道。 原因是还未建立大型工业纸浆用竹遗传转化体 系， 制约了相关基因表达与调控的研究及其在竹遗传改良方面的应用。发明内容
针对上述问题， 本发明提供一种农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 农杆菌介导法生产大型丛生竹类的 方法， 包括如下步骤 ：
a. 愈伤组织诱导 ： 取竹种子成熟胚置于愈伤组织诱导培养基 MS2 上培养 2-3 周 后， 获得愈伤组织， 3-4 周后， 获得竹胚性愈伤组织 ；
b. 预培养 ： 将处于诱导后期的竹胚性愈伤组织转接至新鲜的愈伤组织诱导培养 基 MS2 中预培养 1 周 ；
c. 含有目的基因农杆菌的活化与重悬 ： 挑取含有目的质粒的农杆菌， 在含有 50mg/L 利福平和 100mg/L 卡那霉素的农杆菌培养基 YEB 上划线， 在 28℃培养箱中培养两 天； 挑取单菌落于另一新鲜的含有 50mg/L 利福平和 100mg/L 卡那霉素的农杆菌培养基 YEB 上继续培养两天 ； 在超净台中刮取农杆菌培养基 YEB 平板上的农杆菌于诱导液中重悬混 匀， 使 OD600 接近 0.2 ；
d. 侵染和共培养 ： 取经过预培养的竹胚性愈伤组织于诱导液中振荡 30min， 取出 竹胚性愈伤组织， 在无菌滤纸上吸干水分， 然后在含有乙酰丁香酮的共培养培养基上共培 养两天 ；
e. 筛选抗性愈伤组织 ： 取出竹胚性愈伤组织转接至含有 75mg/L 卡那霉素和 500mg/L 羧苄青霉素的抗性筛选培养基上筛选抗性愈伤组织 ；
f. 丛生芽分化和伸长 ： 将筛选到的抗性愈伤组织转入丛生芽分化培养基， 诱导丛 生芽 ；
g. 伸长丛生芽根的诱导 ： 取健壮丛生芽幼苗直接转入生根培养基生根 ； 幼苗在生 根培养基中生长 15-20 天， 诱导生根， 获得再生小植株 ；
h. 转化植株鉴定 ： 用 PCR 方法对上述获得的再生小植株进行检测， 确定外源基因 已经整合到竹子基因组 DNA 中， 确定转化小植株 ；
i. 幼苗移栽 ： 将上述转化小植株洗净培养基， 移入营养钵中， 利用人工喷水保持 环境湿度， 经过驯化炼苗 20-30 天后， 移栽入装有花园土、 直径为 30cm 的花盆中。
所述的步骤 a、 b 中，
愈伤组织诱导培养基 MS2 的配方为 ： MS+2， 4-D 2mg/L+KT0.2mg/L+IBA0.4mg/L， 蔗 糖 30g/L， 琼脂 7g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 c 中，
农杆菌培养基 YEB 的配方为 ： 细菌蛋白胨 5g/L， 酵母浸膏 1g/L， 牛肉浸膏 5g/L， MgSO4·7H2O 0.04g/L， 琼脂 16g/L， pH7.0 ；
诱导液为 ： MS2， 麦芽糖 30g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 d 中，
诱导液为 ： MS2， 麦芽糖 30g/L， pH5.6-5.8 ；
共培养培养基的配方为 ： MS2， 乙酰丁香酮 14.7mg/L， 麦芽糖 30g/L， 琼脂 7g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 e 中，
抗性筛选培养基的配方为 ： MS2， 卡那霉素 75mg/L， 羧苄青霉素 500mg/L， 蔗糖 30g/ L， 琼脂 7g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 f 中，
丛生芽分化培养基的配方为 ： MS+KT2.5mg/L+IAA 0.5mg/L， 卡那霉素 75mg/L， 羧 苄青霉素 500mg/L， 蔗糖 30g/L， 琼脂 7g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 g 中，
生根培养基的配方为 ： MS+NAA0.25mg/L+IBA 0.4mg/L， 羧苄青霉素 500mg/L， 蔗糖 30g/L， 琼脂 5g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 i 中，
营养钵中的配方为 ： 腐叶土∶石英砂∶土壤＝ 2 ∶ 1 ∶ 1 ；
培养条件为 ： 昼温度 25℃， 夜温度 18℃， 光照时间 14h/d。
本发明的有益效果是， 解决了大型丛生纸浆用竹难于进行遗传转化的问题。可以 有效抑制农杆菌对植物外植体所造成的污染， 缩短获得转基因植物的周期， 提高获得转基 因植物的几率。筛选一个月后即获得了抗性愈伤组织， 二至四个月可获得再生的转基因植 株。 转化效率高， 重复性好， 对大型丛生纸浆用竹遗传改良和竹功能基因组学研究等具有重 要的作用及广阔的应用前景。适用于慈竹、 梁山慈竹等大型丛生纸浆用竹的生产。 具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
农杆菌介导法生产大型丛生竹类的方法， 包括如下步骤 ：
a. 愈伤组织诱导 ： 取竹种子成熟胚置于愈伤组织诱导培养基 MS2 上培养 2-3 周 后， 获得愈伤组织， 3-4 周后， 获得竹胚性愈伤组织 ；
b. 预培养 ： 将处于诱导后期的竹胚性愈伤组织转接至新鲜的愈伤组织诱导培养 基 MS2 中预培养 1 周 ；
c. 含有目的基因农杆菌的活化与重悬 ： 挑取含有目的质粒的农杆菌， 在含有 50mg/L 利福平和 100mg/L 卡那霉素的农杆菌培养基 YEB 上划线， 在 28℃培养箱中培养两 天； 挑取单菌落于另一新鲜的含有 50mg/L 利福平和 100mg/L 卡那霉素的农杆菌培养基 YEB上继续培养两天 ； 在超净台中刮取农杆菌培养基 YEB 平板上的农杆菌于诱导液中重悬混 匀， 使 OD600 接近 0.2 ；
d. 侵染和共培养 ： 取经过预培养的竹胚性愈伤组织于诱导液中振荡 30min， 取出 竹胚性愈伤组织， 在无菌滤纸上吸干水分， 然后在含有乙酰丁香酮的共培养培养基上共培 养两天 ；
e. 筛选抗性愈伤组织 ： 取出竹胚性愈伤组织转接至含有 75mg/L 卡那霉素和 500mg/L 羧苄青霉素的抗性筛选培养基上筛选抗性愈伤组织 ；
f. 丛生芽分化和伸长 ： 将筛选到的抗性愈伤组织转入丛生芽分化培养基， 诱导丛 生芽 ；
g. 伸长丛生芽根的诱导 ： 取健壮丛生芽幼苗直接转入生根培养基生根 ； 幼苗在生 根培养基中生长 15-20 天， 诱导生根， 获得再生小植株 ；
h. 转化植株鉴定 ： 用 PCR 方法对上述获得的再生小植株进行检测， 确定外源基因 已经整合到竹子基因组 DNA 中， 确定转化小植株 ；
i. 幼苗移栽 ： 将上述转化小植株洗净培养基， 移入营养钵中， 利用人工喷水保持 环境湿度， 经过驯化炼苗 20-30 天后， 移栽入装有花园土、 直径为 30cm 的花盆中。 所述的步骤 a、 b 中，
愈伤组织诱导培养基 MS2 的配方为 ： MS+2， 4-D 2mg/L+KT0.2mg/L+IBA0.4mg/L， 蔗 糖 30g/L， 琼脂 7g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 c 中，
农杆菌培养基 YEB 的配方为 ： 细菌蛋白胨 5g/L， 酵母浸膏 1g/L， 牛肉浸膏 5g/L， MgSO4·7H2O 0.04g/L， 琼脂 16g/L， pH7.0 ；
诱导液为 ： MS2， 麦芽糖 30g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 d 中，
诱导液为 ： MS2， 麦芽糖 30g/L， pH5.6-5.8 ；
共培养培养基的配方为 ： MS2， 乙酰丁香酮 14.7mg/L， 麦芽糖 30g/L， 琼脂 7g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 e 中，
抗性筛选培养基的配方为 ： MS2， 卡那霉素 75mg/L， 羧苄青霉素 500mg/L， 蔗糖 30g/ L， 琼脂 7g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 f 中，
丛生芽分化培养基的配方为 ： MS+KT2.5mg/L+IAA 0.5mg/L， 卡那霉素 75mg/L， 羧 苄青霉素 500mg/L， 蔗糖 30g/L， 琼脂 7g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 g 中，
生根培养基的配方为 ： MS+NAA0.25mg/L+IBA 0.4mg/L， 羧苄青霉素 500mg/L， 蔗糖 30g/L， 琼脂 5g/L， pH5.6-5.8 ；
所述的步骤 i 中，
营养钵中的配方为 ： 腐叶土∶石英砂∶土壤＝ 2 ∶ 1 ∶ 1 ；
培养条件为 ： 昼温度 25℃， 夜温度 18℃， 光照时间 14h/d。
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