基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法.pdf

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1、10申请公布号CN101948926A43申请公布日20110119CN101948926ACN101948926A21申请号201010299121222申请日20101002C12Q1/68200601G01N27/44720060171申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号72发明人杨立桃张大兵郭金超74专利代理机构上海交达专利事务所31201代理人王锡麟王桂忠54发明名称基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法57摘要一种生物基因检测技术领域的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，通过多重模板的合成、通用微滴PCR扩增以及毛细管凝胶电泳分析。

2、得以实现。本发明可做为生物学研究中高通量DNA分子分析的一种手段，对多个DNA分子同时进行检测，提高了分析的通量，极大的减少了宝贵的样品和试剂的消耗。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书10页附图3页CN101948929A1/1页21一种基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征在于，包括如下步骤第一步多重模板的合成将含有不同目标DNA分子的纯化DNA模板通过一个或几个常规复合PCR应用目标特异性引物进行预扩增，产生含有通用序列尾巴的多重模板；第二步通用微滴PCR扩增在通用微滴PCR中，使用一对与通用序列尾巴互补的通用引物在水油乳。

3、化剂中对纯化的复合PCR预扩产物进行微滴PCR扩增；第三步毛细管凝胶电泳分析根据目标序列的大小不同，应用毛细管凝胶电泳对纯化的微滴PCR扩增产物进行自动分离检测。2根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的纯化DNA模板是指应用DNA提取试剂盒，从原材料中分离纯化的获得的用于PCR扩增的基因组DNA。3根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的目标特异性引物是指长度为436NT的寡核苷酸链，由5端的通用序列尾巴和3端目标特异性互补序列组成，其3端的目标特异性序列部分与目标基因序列完全互补或者相同，5端的。

4、通用尾巴序列部分与通用引物序列相同。4根据权利要求3所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的通用引物是指长度为20NT的寡核苷酸链，正、反向通用引物分别与目标特异性引物的的5端相同。5根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的多重模板是指，通过复合PCR预扩增所产生的不同PCR产物的混合模板，其产物的两端分别含有一段来自目标特异性引物的通用序列尾巴。6根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的微滴是指，25摄氏度条件下，取1体积份的PCR反应混合液在15分钟内逐滴加入到。

5、2体积份的油表面活性剂混合物中，同时利用涡旋混合器进行混匀得到水油乳化剂，该水油乳化剂中微滴的直径在18M，每微升的水油乳化剂中包含3106到1107个微滴。7根据权利要求1或6所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的水油乳化剂的组分及其含量为1体积份的水相和2体积份的油相，其中的水相的组分为1KODPLUS反应缓冲液、10G/LBSA、15MMMGSO4、200MDNTP、400NM引物UNIF/R、52UKODPLUSDNA聚合酶、以及适量模板DNA分子；油相组分为SPAN8045V/V、TWEEN8004V/V、TRITONX100005V/V、矿物油9。

6、505V/V。8根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的PCR产物纯化是指应用PCR产物纯化试剂盒纯化复合PCR预扩增产物。9根据权利要求1所述的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，其特征是，所述的纯化是指微滴PCR完成后，收集相同反应的水油乳化剂16000G，并在室温环境下离心处理5分钟后取下层包含微滴PCR扩增产物的水相，并用PCR产物纯化试剂盒纯化该水相。权利要求书CN101948926ACN101948929A1/10页3基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法技术领域0001本发明涉及的是一种生物基因检测技术领。

7、域的检测方法，具体是一种基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法。背景技术0002高通量分析技术的发展为分子生物学中大量核酸分子的平行分析提供了一种有效的途径，目前广泛应用于医疗诊断、食品安全监控、以及环境监测等众多领域中。0003基于DNA的聚合酶链式反应PCR是目前应用最为广泛的核酸分子分析技术。基于DNA的PCR分析的特点在于它的特异性和灵敏性。目前高通量的检测方法主要是结合了一个或几个常规复合PCR扩增方法和高通量的扩增产物检测方法，或者直接应用复合PCR扩增方法进行检测。直接的复合PCR检测技术已经在成功的应用于许多领域中不同核酸分子的同时扩增，但是其只能用于少量核酸分子小。

8、于10个的平行扩增分析。复合PCR技术应用于更多不同核酸分子的高通量分析较难实现，主要是因为常规的复合PCR方法中存在两个主要缺陷一是大量的引物同时存在于一个体系，容易引起非特异性的扩增；二是，由于扩增效率的差异导致其中部分目标分子优先扩增。随着复合PCR中添加的引物对数增加，以及扩增的循环数的增加，这种缺陷带来的限制会表现的更加明显。0004组合了复合PCR扩增和芯片或毛细管电泳技术的方法，可极大地提高核酸DNA分子分析的通量。这种组合检测方法，通常的是在一个或几个复合PCR扩增后，应用高通量的DNA芯片或毛细管电泳进行快速、自动的产物检测，这可以同时对大量的样本平行地进行小型化、高通量和自。

9、动化分析。根据相关的报道，在12CM2的高密度芯片上可以形成大约106个分析位点，数千个目标可以同时进行检测。但是，目前应用DNA芯片技术分析成本比较高、操作步骤复杂、技术要求较高，而且大多数芯片具有目标特异性的特点，不同的应用领域需要设计不同的芯片进行目标分析。此外，由于目标分子仍然采用复合PCR方法进行扩增，扩增的通量必然受到复合PCR固有缺陷的限制，因此这种组合方法的广泛应用受到了一定的限制。一些新的组合了高通量的目标分子扩增技术和快速、自动的产物分离技术的方法成为目前高通量核酸DNA分子分析技术研究的重点。0005微滴PCRMICRODROPLETPCR技术是一种在乳化剂中进行的新型的。

10、、高效的高通量核酸DNA分子扩增技术。一般的，在微滴PCR中，单个DNA分子被分配到体积极小05FL到05NL的体积的微滴中，这允许在1微升的乳化剂中形成大约107个反应平行的进行扩增，消除了复合PCR的固有缺陷。提高了目标扩增的通量，同时减少了试剂和样品的消耗。然而，在微滴PCR中使用大量不同的引物同时进行多目标分析时，仍然具有一定的限制，因为在微滴形成的过程中，大量的引物的随机分配，使得每个微滴中的只含有相同的引物和相应的目标DNA分子是不可能的。当许多不同的引物存在微小的微滴中进行PCR扩增时，会产生类似于复合PCR扩增限制。因此，本发明建立了一种新的组合方法，首先应用一个或几个复合PC。

11、R，利用带有通用尾巴序列的特异性引物进行少数几个循环的预扩增，预扩增的产物两端分别会带有一段通用序列；随后在单一的微滴PCR方法中应用一对同通用序列尾说明书CN101948926ACN101948929A2/10页4巴互补的通用引物扩增所有的预扩增目标产物；最后，扩增PCR产物经过纯化后，应用毛细管电泳进行自动分离检测。这种组合检测方法可实现对大量的目标DNA分子同时进行高通量的扩增和检测。发明内容0006本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法，优化了MPICMULTIPLEXMICRODROPLETPCRIMPLEMENTEDCGE，基于。

12、毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法方法反应的体系和条件，评估了该方法的特异性和灵敏度，并在目前广为关注的转基因产品检测领域中应用本发明对样品中转基因成分进行了分析，确定了该分析方法的灵活性和可应用性。本发明可做为生物学研究中高通量DNA分子分析的一种手段，对多个DNA分子同时进行检测，提高了分析的通量，极大的减少了宝贵的样品和试剂的消耗。0007本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤0008第一步多重模板的合成将含有不同目标DNA分子的纯化DNA模板通过一个或几个常规复合PCR应用目标特异性引物进行预扩增，产生含有通用序列尾巴的多重模板；0009所述的纯化DNA模板是指。

13、应用DNA提取试剂盒，从原材料中分离纯化的获得的用于PCR扩增的基因组DNA。0010所述的目标特异性引物是指长度为436NT的寡核苷酸链，由5端的通用序列尾巴和3端目标特异性互补序列组成，其3端的目标特异性序列部分与目标基因序列完全互补或者相同，5端的通用尾巴序列部分与通用引物序列相同。0011所述的通用引物是指长度为20NT的寡核苷酸链，正、反向通用引物分别与目标特异性引物的的5端相同。0012所述的多重模板是指，通过复合PCR预扩增所产生的不同PCR产物的混合模板，其产物的两端分别含有一段来自目标特异性引物的通用序列尾巴。0013第二步通用微滴PCR扩增在通用微滴PCR中，使用一对与通用。

14、序列尾巴互补的通用引物在水油乳化剂中对纯化的复合PCR预扩产物进行微滴PCR扩增；0014所述的微滴是指，25摄氏度条件下，取1体积份的PCR反应混合液在15分钟时间段内逐滴加入到2体积份的油表面活性剂混合物中，同时利用涡旋混合器进行混匀得到水油乳化剂，该水油乳化剂中微滴的直径在18M，每微升的水油乳化剂中包含3106到1107个微滴。0015所述的水油乳化剂的组分及其含量为1体积份的水相和2体积份的油相，其中的水相的组分为1KODPLUS反应缓冲液、10G/LBSA、15MMMGSO4、200MDNTP、400NM引物UNIF/R、52UKODPLUSDNA聚合酶、以及适量模板DNA分子；油。

15、相组分为SPAN8045V/V、TWEEN8004V/V、TRITONX100005V/V、矿物油9505V/V。0016所述的纯化的复合PCR预扩产物是指复合PCR预扩增完成后，应用PCR产物纯化试剂盒纯化复合PCR预扩增产物。0017第三步毛细管凝胶电泳分析根据目标序列的大小不同，应用毛细管凝胶电泳对纯化的微滴PCR扩增产物进行自动分离检测。0018所述的纯化的微滴PCR扩增产物是指微滴PCR完成后，收集相同反应的水油乳化说明书CN101948926ACN101948929A3/10页5剂16000G，并在室温环境下离心5分钟后取下层包含微滴PCR扩增产物的水相，并用PCR产物纯化试剂盒纯。

16、化该水相。0019所述的毛细管凝胶电泳自动分离检测是指使用毛细管凝胶电泳仪对纯化的微滴PCR扩增产物进行分离检测。0020所述的毛细管凝胶电泳自动分离检测也指应用生产商提供的分析软件对毛细管凝胶电泳结果进行分析，根据不同片段大小的目标产物对应不同的出峰时间来鉴定微滴PCR扩增的产物。0021本发明设计了带有通用模板的目标特异性引物，引入了微滴PCR扩增方法忽然毛细管凝胶电泳PCR产物自动分析方法，使不同片段大小的DNA模板分子可独立地在微滴平行地进行扩增，极大地提高了分析的效率和通量。本发明中应用转基因作物的检测序列为目标，优化了MPIC方法的扩增体系和条件，明确了本发明的MPIC方法的灵活性。

17、和可适用性。本发明的方法具有高的通量、高的特异性和灵敏度，可至少分析24个不同的DNA目标序列，其检测灵敏度可达01。本发明所建立的高通量DNA分子分析方法提供了高通量、准确和灵敏地多目标DNA分析，适应了当前分子生物学研究中对多目标DNA进行高通量分析的要求，本发明不仅可应用于转基因成分的分析，也为其它领域中的DNA分子分析提供一个新的高通量分析的选择。0022附件说明0023图1为本发明方法示意图。0024图2为实施例MPIC方法同时分析24个不同的DNA目标的毛细管凝胶电泳图。0025图3为实施例检测不同基质中相同比例的24个转基因DNA目标序列的毛细管凝胶电泳图。0026图4为实施例模。

18、拟DNA样品分析的毛细管凝胶电泳图。具体实施方式0027下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。0028下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等分子克隆实验室手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0029实施例1应用本实施例的MPIC方法，检测来自14个转基因品系的24个DNA目标序列。0030第一步植物材料及其DNA提取0031转基因作物NK603玉米。

19、、GA21玉米、BT176玉米、BT11玉米、MIR604玉米、T25玉米、TC1507玉米、GTS4032大豆、RT73油菜、MON88913棉花、MON1445棉花、MON531棉花、OXY235油菜和华农一号番木瓜。0032非转基因作物小麦。0033植物DNA提取应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA，14种转基因的作物的DNA等量混合后同非转基说明书CN101948926ACN101948929A4/10页6因小麦DNA混合，每个转基因品系的DNA含量为16，此混合DNA作为本实例中进一步实验的模板。0034第二步通用引物设计。

20、0035本实施例中，选用几段非植物基因组DNA序列，首先对这几段DNA序列在一些公共数据库GENBANK、EMBL、DDBJ中进行序列比对，选择一段同植物DNA序列或一些转基因载体序列相似性差的序列，使用引物设计软件PRIMER50进行引物设计。0036所述的通用引物的正向序列为GCCTTGTTCTACCATTACGC；0037所述的通用引物的反向序列为TCAGCCACCTCTTTGTCCTT。0038第三步目标特异性引物设计0039目标特异性引物中目标特异性序列部分，可使用引物设计软件PRIMER50进行设计或参考相关的文献。本实施例中共设计或引用24对目标特异性引物，特异性扩增片段的大小在。

21、128BP610BP包含通用序列之间，扩增片段相互之间的序列长度最小差异为5BP0040第四步多重模板的合成0041应用相应的目标特异性引物，在3个常规复合PCR每个复合PCR中应用8对目标特异性引物中预扩增14个纯化的转基因品系基因组DNA的混合模板每个转基因品系的DNA含量为16。预扩增的PCR产物两端分别含有一段来自目标特异性引物的通用序列尾巴，即为微滴PCR扩增的多重模板。复合PCR预扩增引物混合液见表1；复合PCR预扩增体系见表2；复合PCR预扩增条件见表3。0042所述的14个纯化的转基因品系基因组DNA的混合模板是指应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物基因组D。

22、NA提取试剂盒从原材料中分离、纯化基因组DNA。0043表1复合PCR预扩增引物混合液00440045表2复合PCR预扩增体系说明书CN101948926ACN101948929A5/10页700460047表3复合PCR预扩增条件00480049第五步微滴制备00501油表面活性剂混合物制备005125条件下按表4的比例混合表中的试剂制备油表面活性剂混合物0052表4油表面活性剂混合物成分005300542水油乳化剂配制005525摄氏度条件下，取200L微滴PCR水相表5在15分钟内逐滴加入到400L通用微滴PCR油相油表面活性剂混合物中，同时利用VORTEXGENE2涡旋混合器进行混匀。。

23、加完后，继续混合5分钟，产生均匀的水油乳化剂。水油乳化剂中包含大小不等的微滴。0056表5通用微滴PCR水相成分说明书CN101948926ACN101948929A6/10页8005700580059第六步微滴PCR扩增0060取500L的水油乳化剂分装到平均分配到10个PCR管中，另外取50L微滴PCR水相直接加入PCR管中做为阴性对照。通用乳滴PCR扩增条件见表6。0061表6通用乳滴PCR扩增条件00620063第七步毛细管凝胶电泳检测微滴PCR产物0064本实施例中优化毛细管电泳的分离条件。使用QIAXCELDNAHIGHRESOLUTIONKIT，对样品进行分离检测。选用软件中提供。

24、的OH400分离方法，使用氮气进行加压；样品注射条件2000伏电压，时间20秒；样品分离条件6000伏电压，时间520秒。使用厂商提供的软件对毛细管凝胶电泳的结果进行分析，以鉴定MPIC检测的结果，结果分析中阳性阈值设置为最高峰值的5。目标特异性产物峰值高于此阈值的检测结果表明样品中含有此目标序列，目标特异性产物峰值低于此阈值的检测结果表明样品中不含有此目标序列。0065第八步结果分析0066应用本实施例的MPIC方法对14个转基因品系中含有的24个DNA目标BT176，BT11，TC1507，NK603，T25，MIR604，GA21，MON531，MON1445，MON88913，RT73。

25、，OXY235，RRS，HUANONGNO1，SSIIB，LECTIN，SAD1，CHY，TNOS，FMV35S，CP4EPSPS，CRYIAB，BAR和PRACT同时进行分析。24个目标分别应用预混合引物MIXA、MIXB和MIXC在3个8重PCR中进行预扩增；3个扩增产物混合纯化后，应用一对通用引物对进行微滴PCR扩增；随后扩增的产说明书CN101948926ACN101948929A7/10页9物进行毛细管凝胶电泳检测。毛细管凝胶电泳检测结果见图2，根据目标片段大小不同，不同的目标产物对应不同的出峰时间，所有的24个目标特异性序列可被同时地检测。这些结果表明使用本实施例的MPIC方法可以。

26、实现高通量的分析多个DNA目标核酸分子。0067实施例2MPIC方法检测不同基质中相同比例的24个转基因DNA目标序列0068第一步植物材料及其DNA提取0069转基因作物NK603玉米、GA21玉米、BT176玉米、BT11玉米、MIR604玉米、T25玉米、TC1507玉米、GTS4032大豆、RT73油菜、MON88913棉花、MON1445棉花、MON531棉花、OXY235油菜和HUANONGNO1番木瓜。0070非转基因作物玉米、大豆。0071植物DNA提取应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA，上述的14种转基因作物的D。

27、NA按照相同的质量比同非转基因玉米或大豆的DNA混合配制模拟的DNA样品评估本实施例方法的灵活性。样品中14种转基因品系的所占的质量比分别为015BT176、05RT73、025BT11、025TC1507、05HUANONGNO1、075MON531、025OXY235、025RRS、038NK603、02T25、013MON88913、01MIR604、075GA21、038MON1445。0072第二步通用引物设计0073本实施例中，选用几段非植物基因组DNA序列，首先对这几段DNA序列在一些公共数据库GENBANK、EMBL、DDBJ中进行序列比对，选择一段同植物DNA序列或一些转基因。

28、载体序列相似性差的序列，使用引物设计软件PRIMER50进行引物设计。0074所述的通用引物的正向序列为GCCTTGTTCTACCATTACGC；0075所述的通用引物的反向序列为TCAGCCACCTCTTTGTCCTT。0076第三步目标特异性引物设计0077目标特异性引物中目标特异性序列部分，可使用引物设计软件PRIMER50进行设计或参考相关的文献。本实施例中共设计或引用24对目标特异性引物，特异性扩增片段的大小在128BP610BP包含通用序列之间，扩增片段相互之间的序列长度最小差异为5BP0078第四步多重模板的合成0079应用相应的目标特异性引物，在3个常规复合PCR每个复合PCR。

29、中应用8对目标特异性引物中预扩增14个纯化的转基因品系基因组DNA的混合模板。预扩增的PCR产物两端分别含有一段来自目标特异性引物的通用序列尾巴，即为微滴PCR扩增的多重模板。复合PCR预扩增引物混合液见表1；复合PCR预扩增体系见表2；复合PCR预扩增条件见表3。0080所述的DNA纯化是指应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物基因组DNA提取试剂盒从原材料中分离、纯化基因组DNA。0081第五步微滴制备00821油表面活性剂混合物制备008325条件下按表4的比例混合表中的试剂制备油表面活性剂混合物00842水油乳化剂配制008525摄氏度条件下，取200L微滴PCR水相。

30、表5在15分钟内逐滴加入到400L说明书CN101948926ACN101948929A8/10页10通用微滴PCR油相油表面活性剂混合物中，同时利用VORTEXGENE2涡旋混合器进行混匀。加完后，继续混合5分钟，产生均匀的水油乳化剂。水油乳化剂中包含大小不等的微滴。0086第六步微滴PCR扩增0087取500L的水油乳化剂分装到平均分配到10个PCR管中，另外取50L微滴PCR水相直接加入PCR管中做为阴性对照。通用乳滴PCR扩增条件见表6。0088第七步毛细管凝胶电泳检测微滴PCR产物0089本实施例中优化毛细管电泳的分离条件。使用QIAXCELDNAHIGHRESOLUTIONKIT，。

31、对样品进行分离检测。选用软件中提供的OH400分离方法，使用氮气进行加压；样品注射条件2000伏电压，时间20秒；样品分离条件6000伏电压，时间520秒。使用厂商提供的软件对毛细管凝胶电泳的结果进行分析，以鉴定MPIC检测的结果，结果分析中阳性阈值设置为最高峰值的5。目标特异性产物峰值高于此阈值的检测结果表明样品中含有此目标序列，目标特异性产物峰值低于此阈值的检测结果表明样品中不含有此目标序列。0090第八步结果分析0091应用本实施例的MPIC方法对在不同基质中的相同质量比的14个转基因品系中进行分析，24个目标分别应用预混合引物MIXA、MIXB和MIXC在3个8重PCR中进行预扩增；3。

32、个扩增产物混合纯化后，应用一对通用引物对进行微滴PCR扩增；随后扩增的产物进行毛细管凝胶电泳检测。毛细管凝胶电泳检测结果见图3，图3A和3B分别MPIC方法检测玉米和大豆基质中24个转基因目标的结果，峰124分别为不同目标序列的特异性产物峰1SSIIB、2MON1445、3SAD1、4GA21、5PRACT、6MIR604、7CP4EPSPS、8TNOS、9CRYIAB、10LECTIN、11MON88913、12FMV35S、13T25、14CHY、15NK603、16RRS、17OXY235、18MON531、19HUANONGNO1、20BAR、21TC1507、22BT11、23RT7。

33、3、24BT176。根据目标片段大小不同，不同的目标产物对应不同的出峰时间，在以玉米或大豆为基质的DNA样品中所有的24个DNA目标都被特异性的扩增和检测，相对于其它的目标序列，严重过量的玉米或大豆内源基因序列并没有影响其它目标序列的扩增和检测，这些目标的检测峰值基本保持一致，这些结果表明使用本实施例的MPIC方法具有很好的灵活性。0092实施例3MPIC方法可应用性检测0093第一步植物材料及其DNA提取0094转基因作物NK603玉米、GA21玉米、BT176玉米、BT11玉米、MIR604玉米、T25玉米、TC1507玉米、GTS4032大豆、RT73油菜、MON88913棉花、MON1。

34、445棉花、MON531棉花、OXY235油菜和HUANONGNO1番木瓜。0095非转基因作物大豆、玉米。0096植物DNA提取应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA，14种转基因品系和非转基因大豆或玉米的DNA按不同质量比混合配制模拟的DNA样品进一步验证本实施例的MPIC方法可应用性，每个样品含有不同数目和比例的转基因目标表7。样品AE通过混合不同比例的转基因品系DNA同非转基因玉米DNA混合配制而成；样品F和样品H通过混合不同比例的转基因品系DNA同非转基因大豆DNA混合配制而成；样品G通过直接混合不同比例的转基因品系DNA配。

35、说明书CN101948926ACN101948929A9/10页11制而成。所有的DNA样品终浓度调整为20NG/L，分别取5L上述制备的DNA样品使用本实施例中的方法对10个模拟DNA样品进行分析，确定MPIC检测方法的可应用性。0097表7模拟DNA样品的转基因品系组成00980099第二步通用引物设计0100本实施例中，选用几段非植物基因组DNA序列，首先对这几段DNA序列在一些公共数据库GENBANK、EMBL、DDBJ中进行序列比对，选择一段同植物DNA序列或一些转基因载体序列相似性差的序列，使用引物设计软件PRIMER50进行引物设计。0101所述的通用引物的正向序列为GCCTTG。

36、TTCTACCATTACGC；0102所述的通用引物的反向序列为TCAGCCACCTCTTTGTCCTT。0103第三步目标特异性引物设计0104目标特异性引物中目标特异性序列部分，可使用引物设计软件PRIMER50进行设计或参考相关的文献。本实施例中共设计或引用24对目标特异性引物，特异性扩增片段的大小在128BP610BP包含通用序列之间，扩增片段相互之间的序列长度最小差异为5BP0105第四步多重模板的合成0106应用相应的目标特异性引物，在3个常规复合PCR每个复合PCR中应用8对目标特异性引物中预扩增14个纯化的转基因品系基因组DNA的混合样品样品AH。预扩增的PCR产物两端分别含有。

37、一段来自目标特异性引物的通用序列尾巴，即为微滴PCR扩增的多重模板。复合PCR预扩增引物混合液见表1；复合PCR预扩增体系见表2；复合PCR预扩增条件见表3。0107所述的DNA纯化是指应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物基因组DNA提取试剂盒从原材料中分离、纯化基因组DNA。0108第五步微滴制备说明书CN101948926ACN101948929A10/10页1201091油表面活性剂混合物制备011025条件下按表4的比例混合表中的试剂制备油表面活性剂混合物01112水油乳化剂配制011225摄氏度条件下，取200L微滴PCR水相表5在15分钟内逐滴加入到400L通用。

38、微滴PCR油相油表面活性剂混合物中，同时利用VORTEXGENE2涡旋混合器进行混匀。加完后，继续混合5分钟，产生均匀的水油乳化剂。水油乳化剂中包含大小不等的微滴。0113第六步微滴PCR扩增0114取500L的水油乳化剂分装到平均分配到10个PCR管中，另外取50L微滴PCR水相直接加入PCR管中做为阴性对照。通用乳滴PCR扩增条件见表6。0115第七步毛细管凝胶电泳检测微滴PCR产物0116本实施例中优化毛细管电泳的分离条件。使用QIAXCELDNAHIGHRESOLUTIONKIT，对样品进行分离检测。选用软件中提供的OH400分离方法，使用氮气进行加压；样品注射条件2000伏电压，时间。

39、20秒；样品分离条件6000伏电压，时间520秒。使用厂商提供的软件对毛细管凝胶电泳的结果进行分析，以鉴定MPIC检测的结果，结果分析中阳性阈值设置为最高峰值的5。目标特异性产物峰值高于此阈值的检测结果表明样品中含有此目标序列，目标特异性产物峰值低于此阈值的检测结果表明样品中不含有此目标序列。0117第八步结果分析。0118利用本实施例的方法分析了8个模拟混合DNA样品，评估MPIC方法的检测可应用性。每个混合的DNA样品含有不同品系和比例的转基因作物，单个转基因品系的含量范围在005到200之间。毛细管凝胶电泳检测结果见图4，AH分别为模拟样品AH的MPIC检测结果，峰124分别对应不同目标。

40、序列的特异性产物峰1SSIIB、2MON1445、3SAD1、4GA21、5PRACT、6MIR604、7CP4EPSPS、8TNOS、9CRYIAB、10LECTIN、11MON88913、12FMV35S、13T25、14CHY、15NK603、16RRS、17OXY235、18MON531、19HUANONGNO1、20BAR、21TC1507、22BT11、23RT73、24BT176。8个模拟的样品中仅有阳性的目标被特异地扩增，毛细管凝胶电泳中显示了相应的出峰时间，这些结果表明使用本实施例的MPIC方法可以实现实际样品中高通量的分析目标核酸分子，在模拟的DNA样品中可检测低至01的转。

41、基因目标。0119总之，本实施例建立了一种新的适合于生物学研究中DNA分子分析的一种高通量分析方法，本实施例的MPIC方法具有高的通量、高的特异性和灵敏度，可至少分析24个不同的目标序列，其检测灵敏度可达01。本实施例的MPIC方法具有很好的灵活性和高的性能，可以结合几个不同复合PCR方法和微滴PCR方法对多个DNA目标进行高通量和特异地扩增，不同的DNA目标可以独立地在微滴PCR中进行扩增而不受其它高浓度DNA目标的影响，可以实现实际样品中高通量的分析目标核酸分子。以本实施例所建立的高通量DNA适应了当前分子生物学研究中对多目标DNA进行高通量分析的要求，本实施例不仅可应用于转基因成分的分析，也为其它领域中的DNA分子分析提供一个新的高通量DNA分析的选择。说明书CN101948926ACN101948929A1/3页13图1图2说明书附图CN101948926ACN101948929A2/3页14图3说明书附图CN101948926ACN101948929A3/3页15图4说明书附图CN101948926A。