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1、10申请公布号CN101948878A43申请公布日20110119CN101948878ACN101948878A21申请号201010271671322申请日20100902C12P7/26200601C12N1/20200601C12R1/0120060171申请人南京工业大学地址210009江苏省南京市新模范马路5号72发明人徐虹戴小燕朱宏阳李莎冯小海74专利代理机构南京苏高专利商标事务所普通合伙32204代理人肖明芳54发明名称一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1,3二羟基丙酮中的应用57摘要本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1，3二羟基丙酮中的应用，所述的氧化葡萄糖酸杆菌其分类命名为氧。
2、化葡糖杆菌NH10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCCNO2709，保藏日期是2008年10月14日。本发明发现氧化葡糖杆菌NH10能够在高浓度的甘油浓度条件下高效的转化甘油产1，3二羟基丙酮，在本发明工艺条件下，甘油的转化率最高可达到997W/W，1，3二羟基丙酮的得率最高可达97，转化液中1，3二羟基丙酮浓度可达1662G/L，转化液中几乎不含其它的成分。本发明中的微生物菌株适用于二羟基丙酮的工业化生产。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN101948881A1/1页21一种氧化葡萄糖酸杆菌在制。
3、备1，3二羟基丙酮中的应用，所述的氧化葡萄糖酸杆菌其分类命名为氧化葡糖杆菌GLUCONOBACTEROXYDANSNH10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCCNO2709，保藏日期是2008年10月14日。2根据权利要求1所述的应用，其特征在于将菌株CGMCCNO2709接种于含碳源、氮源、甘油、无机盐和水的无菌培养基中进行培养，离心或超滤获得含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞，进而利用游离的或经固定化的含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞转化甘油生成1，3二羟基丙酮。3根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述培养基中，各组分用量为碳源用量为。
4、10100G/L，氮源用量110G/L，甘油用量40200G/L，无机盐用量为0110G/L，其余为水。4根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述培养基中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、山梨糖醇和淀粉水解液中的一种或多种，所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、NH42SO4和NH4CL中的一种或多种，所述无机盐为钠盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或多种。5根据权利要求2所述的应用，其特征在于将菌株CGMCCNO2709进行培养的条件是培养基的初始PH范围为4080，发酵温度2535，摇床转速100250R/MIN，培养2460H。6根据权利要求。
5、2所述的应用，其特征在于利用游离的含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞转化甘油生成1，3二羟基丙酮是将CGMCCNO2709细胞用40200G/L的甘油溶液悬浮，于试管或三角瓶中转化，转化时温度为2535，转化时间1660H，转速为150250R/MIN；或者将CGMCCNO2709细胞装入到含有1525L的40200G/L的甘油溶液的发酵罐中进行转化，发酵罐的通风量为0410VVM，搅拌转速为200800R/MIN，温度为2535，流加甘油维持发酵罐内甘油浓度为1015G/L，甘油总流加量至200300G/L时结束流加，总转化时间为1660H。7根据权利要求2所述的应用，其特征在于利用经。
6、固定化的含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞转化甘油生成1，3二羟基丙酮是将固定化的含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞装入鼓泡填充床式柱反应器中，该反应器以055ML/MIN的流速单向流加或循环连续流加30100G/L的甘油溶液，进行酶转化反应，反应温度2535，每批转化时间1224H。8根据权利要求1或7所述的应用，其特征在于固定化的细胞是采用海藻酸钙或卡拉胶作为固定化载体。权利要求书CN101948878ACN101948881A1/5页3一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1,3二羟基丙酮中的应用技术领域0001本发明属于发酵工程和酶工程技术领域，涉及一种产甘油脱氢酶的微生物氧化葡萄糖酸。
7、杆菌GLUCONOBACTEROXYDANS，以及将它用于生产二羟基丙酮的方法背景技术00021，3二羟基丙酮，或二羟基丙酮1，3DIHYDROXYAEETONE或DIHYDROXYACETONE，简写为DHA是最简单的三碳酮糖，是一种带有甜味的白色粉末状结晶，易溶于水、乙醇、丙酮等溶剂，其分子中含有两个羟基和一个酮基，化学性质活泼，是重要的医药、化学合成中间体及原料，在精细化工、食品工业和化妆品工业等多种行业发挥着重要的作用。0003生产DHA的方法有化学法和生物法两种，相比化学合成法高耗能，高污染，生物法则是一种比较低碳，环保的制备方法，因此研究的比较多的是生物法制备二羟基丙酮。其原理就是。
8、利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶或二羟基丙酮合成酶的作用将甘油转化为二羟基丙酮。其中用于生产二羟基丙酮的微生物有醋酸杆菌属ACETOBACTERUS4976589，葡萄糖酸杆菌属GLUCONOBACTERUS5770411，根霉属RHIZOPUSUS4576913，单孢丝菌属MICROMONOSPORAJP62210994，芽孢杆菌属BACILLUSJP2286089等。其中氧化葡萄糖酸杆菌GLUCONOBACTEROXYDANS，GOXYDANS研究的比较多，是工业发酵生产DHA的重要菌种。0004GOXYDANS是专性好氧的微生物，在催化甘油生成DHA的反应时以氧气为电子受体，因此氧气供应成。
9、为影响GOXYDANS转化甘油生产DHA的关键问题，除此之外底物甘油和产物DHA均会抑制菌体的生长和DHA的生产。为了解决这些问题研究人员通过改变生产DHA的生产方式，改进发酵设备等方法，如HEKMATBIOPROCESSBIOSYTENG，2003，26109116等通过改进发酵设备，将传统的补料分批发酵发展为重复补料分批发酵，最终使得DHA的产率提高75。而BAUERBIOPROCESSBIOSYTENG，2005，53743等通过进一步改良发酵设备，采用半连续双阶重复补料分批发酵法来解除底物和DHA的抑制作用，从而使得DHA的浓度最高可达220G/L，两阶段的转化率分分别为85和83。通。
10、过选择比较好的生产方式可以得到比较高产的DHA，这些方法应用到良好的菌种会使得DHA的产量更加高，华东理工大学CN101092604A利用基因工程技术在GOXYDANS中克隆表达了透明颤菌血红蛋白基因来提高细胞的摄氧率从而提高DHA的生长效率，但与原始菌相比，基因工程菌的稳定性较差，不适合于工业化生产。冯屏食品与发酵工业，2005，3162226等人利用醋酸杆菌静止细胞转化甘油生产DHA，甘油起始浓度为60G/L时，转化12批，9批期稳定，平均转化率为91，当甘油起始浓度增加为100G/L时，菌体稳定性下降，只能维持5批次。郑裕国CN101591681A等人利用外循环气升式反应器转化甘油产DH。
11、A，采用流加甘油至总浓度为300G/L，最终得到2004G/L的DHA，平均转化率为67。0005以上的方法中生产菌的转化率都较低，且不能耐受高浓度甘油，从而要采用其它的生产方式来提高产量，增加了工艺的难度和成本，不利于工业化生产。0006申请人于2009年2月20日申请了专利“一种氧化葡糖杆菌及利用其制备木酮糖说明书CN101948878ACN101948881A2/5页4的方法”申请号2009100245794，并公开了一株氧化葡糖杆菌GLUCONOBACTEROXYDANSNH10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，保藏单位地址中国北京市朝阳区大屯路，中国科。
12、学院微生物研究所。登记入册的编号是CGMCCNO2709，保藏日期是2008年10月14日。申请人发现上述菌株能够高效转化D阿拉伯糖醇生成D木酮糖。通过一个偶然的实验，申请人发现上述菌株能高产甘油脱氢酶，其可耐高浓度甘油并可高效率转化甘油制备1，3二羟基丙酮，并完成了本发明。发明内容0007本发明所要解决的技术问题是提供一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1，3二羟基丙酮中的新应用，该菌株为CGMCCNO2709。0008为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下0009一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1，3二羟基丙酮中的应用，所述的氧化葡萄糖酸杆菌其分类命名为氧化葡糖杆菌GLUCONOBACTEROXYD。
13、ANSNH10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCCNO2709，保藏日期是2008年10月14日。0010上述应用是将菌株CGMCCNO2709接种于含碳源、氮源、甘油、无机盐和水的无菌培养基中进行培养产酶，离心或超滤获得含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞，进而利用游离的或经固定化的含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞转化甘油生成1，3二羟基丙酮。0011具体来说上述方法包括产酶和转化两个阶段。0012产酶阶段0013将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCCNO2709斜面活化一天后斜面培养基成分除含有碳源、氮源等之外，还含有20G/L的琼脂，接种于含碳。
14、源、氮源、甘油、无机盐和水的无菌培养基中。碳源用量为10100G/L，氮源用量为110G/L，甘油用量为40200G/L，无机盐用量为0110G/L，其余为水。培养基中的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、山梨糖醇和淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、NH42SO4和NH4CL中的一种或多种；无机盐为钠盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或多种。培养基的初始PH范围为4080，发酵温度2535，摇床转速100250R/MIN，培养2460H，细胞湿重达20G/L，发酵液酶活达52103U/ML，然后离心或超滤获得含甘油脱氢酶的细胞，离心条。
15、件室温条件下，700012000R/MIN，1030MIN。采用超滤法时，所用超滤膜孔径00101M，操作压力0106MPA，超滤膜截流分子量为105106道尔顿。0014甘油脱氢酶酶活测定方法0015发酵液在8000R/MIN下离心10MIN收集细胞，用PH70的100MM的磷酸钾缓冲液洗涤3次每次洗涤之后在8000R/MIN，4离心10MIN。0016超声破碎将洗涤后的菌体悬浮在缓冲液中，超声破碎10MIN，工作强度为40，工作4MIN冰浴6MIN，随后在4下10000R/MIN离心15MIN，除去细胞碎片，所得上清液即为粗酶液。0017反应体系50MM磷酸钠缓冲液PH60，025MMDC。
16、IP2，6DICHLOROPHENOLINDOPHENOL，二氯酚靛酚，02M甘油，0325MMPMSPHENAZINEMETHOSULPHATE，硫酸甲说明书CN101948878ACN101948881A3/5页5酯吩嗪。30在600NM处测定吸光度的改变。在PH60的溶液中，DCIP的消光系数为108MM1。0018酶活定义0019一个酶活单位定义为在30、PH60条件下，一分钟内还原1MDICP所用的酶量。0020酶法转化阶段0021将游离的含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞用40200G/L的甘油溶液悬浮，于试管或三角瓶中转化，转化时温度为2535，转化时间1660H，转速为1。
17、50250R/MIN。或者将CGMCCNO2709细胞装入到含有1525L的40200G/L的甘油溶液的发酵罐中进行转化，发酵罐的通风量为0410VVM，搅拌转速为200800R/MIN，温度为2535，流加甘油维持发酵罐内甘油浓度为1015G/L，甘油总流加量至200300G/L以流加结束时发酵液体积计时结束流加，总转化时间为1660H。0022或者将固定化的含甘油脱氢酶的CGMCCNO2709细胞装入鼓泡填充床式柱反应器中，该反应器以055ML/MIN的流速单向流加或循环连续流加30100G/L的甘油溶液，进行酶转化反应，反应温度2535，每批转化时间1224H。通过调整流速，控制甘油的转。
18、化率在90100之间，收集流出液，浓缩结晶得到DHA。0023含甘油脱氢酶的细胞进行固定化的方法为配制13即1030G/L浓度的海藻酸钠，加入1025的细胞即每100ML海藻酸钠溶液中加入1025克的细胞，并添加510硅藻土即每升海藻酸钠溶液中加入50100克的硅藻土，再用浓度为14的CACL2溶液1040G/L将包埋材料海藻酸钠固定成型，以此作为酶源进行反应。除了海藻酸钠作为固定化载体包埋外，还可以用卡拉胶、甲壳素等载体包埋细胞。0024DHA的分析方法采用二苯胺显色法和高效液相色谱法进行。0025二苯胺显色法试剂包括二苯胺06G，冰醋酸54ML，98的浓硫酸6ML，将样品用去离子水稀释到适。
19、当的浓度，取05ML的稀释液置于20ML具塞试管内，加入45ML的二苯胺试剂，加塞密封后于沸水浴煮1530MIN，迅速用冷水冷却，以同样处理的去离子水对照，分光光度计中于615NM波长下比色，通过DHA与A615的标准曲线计算DHA的含量。0026高效液相色谱法将发酵液离心8000RPM，10MIN，上清液经022M针式滤膜过滤后进样。色谱柱AMINEXHPX87H，流动相004MOL/LH2SO4溶液，流速06ML/MIN，柱温60。检测器为紫外，波长215NM，利用DHA与峰面积的标准曲线计算DHA的含量。0027本发明的有益效果0028本发明中的微生物菌株氧化葡萄糖酸杆菌NH10CGMC。
20、CNO2709能在比较高浓度的甘油条件下将甘油转化为DHA，而且对甘油进行脱氢反应能力较强；利用氧化葡萄糖酸杆菌NH10生产DHA，在起始甘油浓度为120200G/L的条件下，甘油转化率最高可达997，DHA得率可达95，转化液中DHA浓度可达1662G/L，转化液中几乎不含其它成分，利于DHA的分离纯化，因此，氧化葡萄糖酸杆菌NH10CGMCCNO2709适用于DHA的工业化生产。具体实施方式0029根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实说明书CN101948878ACN101948881A4/5页6施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发。
21、明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。0030实施例10031斜面培养基葡萄糖30G/L，酵母膏5G/L，牛肉膏3G/L，琼脂20G/L。0032发酵培养基同摇瓶培养基山梨糖醇10G/L，甘油40G/L，酵母膏5G/L，牛肉膏3G/L，MGSO47H2O05G/L，CACO305G/L，起始PH为50，121灭菌15MIN。0033将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCCNO2709在斜面培养基30培养24H，后用接种环从斜面上接一环菌与摇瓶培养基中，30培养24H，摇瓶转速为200R/MIN，离心收集发酵液中的菌体，以游离细胞转化，称取15G离心后的湿细胞加入10ML100G/L的甘油溶。
22、液中细胞的添加量按每150G细胞转化1L100G/L的甘油溶液计，在30条件下，于200R/MIN的摇床上转化24H，反应结束后测定底物转化率和产物的浓度。甘油的转化率为995，DHA的产率为969G/L。0034实施例20035培养基成分同实施例1。将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCCNO2709在斜面培养基30培养24H，后用接种环从斜面上接一环菌与摇瓶培养基中，28培养30H，摇瓶转速为120R/MIN，离心收集发酵液中的菌体，PH70磷酸钾缓冲液洗涤两遍，称取15G离心后的湿细胞加入10ML160G/L的甘油溶液中细胞的添加量按每150G细胞转化1L160G/L的甘油溶液计，在28条件下，于1。
23、20R/MIN中摇床中转化生产DHA，转化48H，反应结束后测定底物的转化率和产物的浓度。甘油的转化率为97，DHA浓度为154G/L。实施例30036培养基成分同实施例1。将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCCNO2709在斜面培养基30培养24H，后用接种环从斜面上接一环菌与摇瓶培养基中，32培养40H，摇瓶转速为220R/MIN，离心收集发酵液中的菌体，PH70磷酸钾缓冲液洗涤两遍，称取15G离心后的湿细胞加入10ML200G/L的甘油溶液中细胞的添加量按每150G细胞转化1L200G/L的甘油溶液计，在30条件下，于200R/MIN中摇床中转化生产DHA，转化60H，反应结束后测定底物的转化率和。
24、产物的浓度。甘油的转化率为90，DHA产率为1662G/L。0037实施例40038斜面培养基同实施例1。0039发酵培养基葡萄糖10G/L，甘油40G/L，酵母膏25G/L，NH42SO420G/L，K2HPO401G/L，KH2PO409G/L，MGSO47H2O10G/L，CACL215G/L，PH80。0040将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCCNO2709在斜面培养基30培养24H，后用接种环从斜面上接一环菌与摇瓶培养基中，30培养24H，摇瓶转速为200R/MIN，离心收集发酵液中的菌体，PH70磷酸钾缓冲液洗涤两遍，称取75G离心后的湿细胞加入50ML100G/L的甘油溶液中，30条件下。
25、，200R/MIN中摇床进行重复批次转化生产DHA，即每转化24H后，离心收集菌体和发酵液，再次用50ML100G/L的甘油溶液悬浮，如此重复10批次，收集10次发酵液混合，测定底物的转化率和产物的浓度。甘油的平均转化率96，DHA平均得率为92，DHA总产量为46G，具体数据见表1。0041表1利用氧化葡萄糖酸杆菌CGMCCNO2709重复批次转化甘油产DHA0042说明书CN101948878ACN101948881A5/5页70043实施例50044斜面培养基同实施例1。0045发酵培养基蔗糖50G/L、玉米浆50G/L，蛋白胨50G/L，K2HPO420G/L，NH42HPO410G/。
26、L，MGSO40125G/L，甘油40G/L，PH70。0046将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCCNO2709在斜面培养基30培养24H，后用接种环从斜面上接一环菌到装有100ML的500ML的摇瓶中，接种2瓶30培养24H，摇瓶转速为200R/MIN，培养24H后接种到装有5L的75L的发酵罐中培养24H，离心收集菌体，菌体用PH70磷酸钾缓冲液洗涤两遍，称取225G湿细胞用15L浓度为60G/L的甘油溶液悬浮于3L的发酵中，通风量10VVM，搅拌转速600R/MIN，流加甘油维持发酵罐内甘油浓度为1015G/L，流加甘油总量至300G/L时停止流加流加结束时发酵液总体积2L，转化60H，检测发酵。
27、液中甘油的转化率和产物浓度。甘油的转化率为97，DHA的产量为564G，得率94。0047实施例60048斜面培养基同实施例1。0049发酵培养基果糖80G/L，甘油100G/L，酵母膏5G/L，MGSO47H2O05G/L，CACO305G/L，起始PH50，121灭菌15MIN。0050将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCCNO2709在斜面培养基30培养24H，后用接种环从斜面上接一环菌到装有100ML的500ML的摇瓶中，接种2瓶30培养24H，摇瓶转速为200R/MIN，培养24H后接种到装有5L的75L的发酵罐中培养24H，离心收集菌体，菌体用PH70磷酸钾缓冲液洗涤两遍。称取100G湿菌体。
28、，加无菌水100ML，于30水浴保温；称取10G卡拉胶，加无菌水200ML，充分浸泡，加热溶解。将两者迅速混合，铺平板，于4冰箱放置30MIN，凝固后切成222CM左右大小的颗粒，再于2MOL/LKCL溶液中浸泡30MIN，使其充分凝固。滤出颗粒用生理盐水洗涤23次，4保存备用。所得菌体形成固定化细胞300G，装入445CM的鼓泡填充床式柱反应器中，该反应器以1ML/MIN的流速单向流加100G/L的甘油溶液，通风量1VVM，30下进行酶转化，24H为一个批次。转化30D，转化100G/L的甘油溶液30L，得到甘油平均转化率为95，DHA产量为2700G，得率为90。说明书CN101948878A。