一种水通道蛋白基因在构建与 Hpa1Xoo 相互作用的互作载 体中的应用 技术领域 本发明属于生物技术领域， 涉及一种水通道蛋白基因在构建与 Hpa1Xoo 相互作用的 互作载体中的应用。
发明背景
水通道蛋白 (aquaporin， AQP) 是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子和一些 小分子溶质的膜内在蛋白， 属于 MIP(major intrinsic protein) 超家族， 分子量在 23 ～ 31ku。AQP1 蛋白就是一个存在于哺乳动物中的只传输水分子的典型水通道蛋白。根据 N、 C 端序列保守性， 相继鉴定出拟南芥水通道蛋白 PIP1 和 PIP2。到目前为止， 在拟南芥、 烟 草、 玉米、 豌豆、 水稻、 大麦叶表皮、 滨藜、 番茄跟、 甜菜贮藏组织、 西葫芦种子及向日葵下胚 轴薄壁细胞等多种植物中都发现了水通道蛋白， 并且真细菌、 古生菌、 真菌和动物等生物中 也有 AQP 的存在。另外， 从蛋白数据库中也发现了大量 AQP 的同源物， 它广泛存在于单子叶 和双子叶植物、 C3 和 C4 代谢植物中。根据氨基酸序列的同源性分析， 它们可能也是 AQP。 越来越多的研究表明， 植物中往往存在多个 AQP 同源物且含量丰富， 有时甚至是细胞膜的 一个主要成分。如菜豆子叶中含丰富的 α-TIP 同源物， 约占细胞可抽提总蛋白的 2％ ； 在 拟南芥中， PIP1 蛋白占叶与根质膜蛋白的 1％以上 ； 菠菜叶肉细胞中含丰富的质膜 AQP， 占 其质膜总蛋白的 20％。水通道蛋白有不同的孔结构， 能转运活性氧、 气体和一些代谢产物。 harpins 能激活植物生长和防卫反应信号通路， 但是植物中一个 harpin 蛋白在一个信号通 路中是如何被识别的？一个特定 harpin 的植物受体是什么？这个信号是如何被转导到细 胞内的？能把细菌效应蛋白， 特别是 III 型效应子从植物细胞外转运到细胞内的植物转位 子是什么？目前都还不清楚。
近年来， 随着分子生物学技术的迅速发展， 研究蛋白质与蛋白质互作的方法也越 来越多， 体内实验如普通的 Y2H、 MYTH、 荧光共振能量转移、 BiFC 和蛋白质片段互补技术等， 体外实验如免疫共沉淀、 Pull-down assay 和表面等离子共振等。
酵母双杂交系统是一个在生物学领域具有划时代意义的研究方法， 由 Fields 和 Song 等首先在研究真核基因的转录调控起始过程中建立的。 因其具有简便、 灵敏、 高效以及 能反应不同蛋白质间在活细胞内的相互作用等特点， 因此在基因功能的研究中得到了广泛 的应用。 其基本原理是真核生物转录的起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分 割开的结构域， 即 DNA 结合域 (DNA-binding domain， BD) 与转录激活域 (Transcriptional activation domain， AD)(Fields and Song， 1989)。 这两个结构域各具功能， 互不影响， 单独 的 BD 虽然能和启动子结合， 但不能激活转录。一个完整的激活特定基因表达的激活因子必 须同时含有这两个结构域， 否则无法完成激活功能。所以可将编码已知蛋白质 ( 常称为诱 饵蛋白质， bait protein) 的基因与 BD 融合， 在酵母中表达产生融合蛋白质称为 BD-Bait ； 编码未知蛋白 ( 常称为捕获蛋白质， prey protein) 的基因与 AD 融合， 并在酵母中表达产 生另一融合蛋白称为 AD-Prey。把这两种融合蛋白共表达于宿主细胞中， 如果这两个蛋白 能发生相互作用， AD 与 BD 就会形成一个完整的转录激活因子， 并激活相应的报告基因的表
达。反之， 如果待测蛋白间不发生相互作用， 则 BD 和 AD 不能结合， 报告基因的转录也就不 能被激活。如果将 Prey 换成基因文库， 即可直接从基因文库中筛选到能与 Bait 相互作用 蛋白的基因。
膜酵母双杂交 (membrane yeast two hybrid) 利用的原理十分巧妙， 应用到了 分离泛素系统 (split-ubiquitin)， 将 “诱饵” (bait) 即一个完整的膜蛋白， 融合到泛素的 C 末端 ( 这部分的泛素与一个转录激活因子相连 )， 而 “猎物” 或靶蛋白 (prey or target protein) 则融合在泛素的另一半上， bait 和 prey 的相互作用就会让这两部分的泛素重新 构成泛素， 从而被一种特异性的蛋白酶 ( 泛素专一性蛋白酶， UBPs) 剪切， 释放出转录激活 因子， 这个转录因子转移到细胞核上， 开启报告基因的表达。DUAL membrane(Stagljar et al.， 1998 ； Thaminy et al.， 2003) 体系利用切割 - 泛素机制来验证一个完整的膜蛋白与另 一个蛋白 ( 完整的膜蛋白或可溶性蛋白 ) 的互作。因为自然状态下这种互作是在膜上检测 到的， 所以与普通的 Y2H 相比这个方法更符合生理学的状态， 普通的 Y2H 仅仅能验证完整膜 蛋白的亚结构域与其他蛋白质的互作， 并且互作发生核内。
pulldown assay， 是研究蛋白质互作的一种体外测定技术， 通常用来对 Y2H 试验结 果进行验证， 即验证两个已知蛋白之间的互作。这种技术准确可靠， 可以弥补 Y2H 假阳性偏 高的缺陷。Pulldown 免疫电泳试验的技术关键在于亲和吸附， 使用谷胱甘肽亲和树脂吸附 两种互作蛋白中的一种蛋白 ( 称为诱饵蛋白 )， 捕获与之互作的另一种蛋白 ( 称为猎物蛋 白 )。 其基本原理是将诱饵蛋白 -GST( 谷胱甘肽巯基转移酶， glutathione S-transferase) 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上， 作为与猎物蛋白亲和的支撑物。将猎物蛋白溶 液过柱， 可从中捕获与之相互作用的猎物蛋白， 洗脱结合物后通过 SDS-PAGE 电泳分析， 从 而证实两种蛋白间的相互作用或者筛选相应的目的蛋白。 “诱饵蛋白” 和 “捕获蛋白” 均可 通过细胞裂解物、 纯化的蛋白、 表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 此方法简单易 行， 操作方便。
双分子荧光互补 (Bimolecular fluorescence complementation， BiFC) 是检测生 物体内或体外蛋白质互作的一项新技术。研究发现， GFP 或 YFP 序列有 10 个位点可以任意 插入外源片段而不影响荧光活性。根据这一特性， 将 GFP 或 YFP 在特定位点裂解为无荧光 N N 活性的两个片段， 即 N 端片段 (GFP 或 YFP ) 和 C 端片段 (GFPC 或 YFPC)。将两个可能发生 互作的待测蛋白质基因序列分别与 GFPN 或 YFPN 和 GFPC 或 YFPC 基因序列连接， 分别构建到 合适的载体上， 同时转化生物细胞， 在转化的细胞中共同表达， 待测的两个蛋白分别与 GFPN 或 YFPN 和 GFPC 或 YFPC 形成融合蛋白。如果 GFPN 或 YFPN 和 GFPC 或 YFPC 能够相互靠近， 形 成荧光蛋白生色团重新发出荧光， 则表明这两个蛋白发生了互作。
FM 染料是亲脂类复合物， 广泛应用于细胞膜和囊泡化的研究。FM 染料溶于水之 后， 对细胞无毒， 并且不发荧光， 但是与细胞膜结合后， 嵌入细胞膜的外层， 发出强烈的荧 光。这种膜标签的方法已被用于选择性地观测真核细胞和海胆卵的细胞膜， 并研究真核细 胞和细菌的内吞和胞吞作用， 植物细胞的囊泡运输以及枯草杆菌的孢子形成。在积极释放 神经递质的神经元中， 这些染料嵌入再生的突触囊泡内， 神经末梢被染上明亮的颜色。 FM464[N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-diethylaminophenylhexatrienyl)pyridinium dibromide] 是一种吡啶二溴化物， 属于苯乙烯类染料。FM 4-64 与质膜双层结合后不能被 动扩散进入细胞内部， 必须通过主动运输的方式进行跨膜运输。目前 FM 4-64 已逐步在动植物、 微生物基因的亚细胞定位， 胞吞胞吐、 囊泡运输等相关研究中得到应用。 发明内容 本发明的目的是提供水通道蛋白基因 PIP1 ； 4 的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现 ：
SEQ ID NO.1 所示的水通道蛋白基因 PIP1 ； 4 在构建其表达产物与 Hpa1Xoo 蛋白相 互作用的互作载体中的应用。
所述的互作载体优选酵母双杂交系统中使用的重组载体 pGBKT7::PIP1 ； 4， 该重 组载体是通过以拟南芥生态型 Col-0 基因组 DNA 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.6 和 SEQ ID No.7 克隆 SEQ ID NO.1 所示的 PIP1 ； 4 基因， 经 Nde I/BamH I 双酶切后插 入到 pGBKT7 质粒的 Nde I/BamH I 酶切位点之间所得。
所述的互作载体优选酵母双杂交系统中使用的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4， 该重 组载体是通过以拟南芥生态型 Col-0 基因组 DNA 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.6 和 SEQ ID No.7 克隆 SEQ ID NO.1 所示的 PIP1 ； 4 基因， 经 Nde I/BamH I 双酶切后插 入到 pGADT7 质粒的 Nde I/BamH I 酶切位点之间所得。
所述的互作载体优选膜酵母双杂交系统中使用的重组载体 pBT3-N::PIP1 ； 4， 该 重组载体是通过以所述的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.12 和 SEQ ID No.13 克隆得到 PIP1 ； 4 基因， Sfi I 酶切后连接到 pPR3-N 质粒的 Sfi I 酶切位点所得。
所述的互作载体优选膜酵母双杂交系统中使用的重组载体 pBT3-N::PIP1 ； 4， 该 重组载体是通过以所述的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.14 和 SEQ ID No.15 克隆得到 PIP1 ； 4 基因， Sfi I 酶切后连接到 pBT3-STE 质粒的 Sfi I 酶切位点所得。
所述的互作载体优选 Pull-down assay 中使用的表达水通道蛋白 PIP1 ； 4 的重组 载体 pPICZ-A::PIP1 ； 4， 该重组载体是通过以权利要求 3 所述的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.16 和 SEQ ID No.17 克隆得到 PIP1 ； 4 基因， 经 EcoR I/Kpn I 酶切后连接到酵母胞内表达载体 pPICZ-A 上的 EcoR I/Kpn I 酶切位点之间 所得。
所述的互作载体为 Pull-down assay 中使用的表达水通道蛋白 PIP1 ； 4 的重组载 体 pPICZα-A::PIP1 ； 4， 该重组载体是通过以所述的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4 为模板， 利 用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.18 和 SEQ ID No.19 克隆得到 PIP1 ； 4 基因， 经 EcoR I/ Kpn I 酶切后连接到酵母胞外分泌表达载体 pPICZα-A 上的 EcoR I/Kpn I 酶切位点之间所 得。
所 述 的 互 作 载 体 优 选 BiFC 杂 交 系 统 中 使 用 的 重 组 载 体 pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YN， 该重组载体是以 pPLV17 为模板， 以 SEQ ID No.24 和 SEQ ID No.25 为引物扩增黄色 荧光蛋白氮末端序列 YN， 将所得的 YN 使用 Xba I 和 Pst I 进行酶切并插入到 pCAMBIA1301 相应的酶切位点获得 pCAMBIA1301::YN 载体 ； 以拟南芥生态型 Col-0 基因组 DNA 为模板， 以 SEQ ID No.28 和 SEQ ID No.29 为引物扩增 PIP1 ； 4， 将扩增的到得 PIP1 ； 4 基因使用 Kpn I 和 BamH I 双酶切后插入到 pCAMBIA1301::YN 载体的 Kpn I 和 BamH I 酶切位点间得到的。
有益效果 ： 本发明通过酵母双杂交系统、 膜酵母双杂交、 pulldown assay、 双分子 荧光互补等蛋白质互作技术， 得到植物水通道蛋白 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 之间的相互作用关 系。 因此 SEQ ID NO.1 所示的水通道蛋白基因 PIP1 ； 4 可应用于构建其表达产物与 Hpa1Xoo 相互作用的互作载体。
已有的研究证明， harpins 能激活植物生长和防卫反应信号通路， 但是植物中一个 harpin 蛋白在一个信号通路中是如何被识别的？一个特定 harpin 的植物受体是什么？这 个信号是如何被转导到细胞内的？能把细菌效应蛋白， 特别是 III 型效应子从植物细胞外 转运到细胞内的植物转位子是什么？目前都还不清楚。通过筛选拟南芥的 cDNA 库， 发现 Hpa1Xoo 可以与水通道蛋白具有互作关系。而水通道蛋白与植物体的很多生理反应相关。 本发明试图通过构建 PIP1 ； 4 与 Hpa1xoo 的互作载体， 来揭示这两种蛋白的相互关系， 也为 PIP1 ； 4 以后的研究提供物质条件。 附图说明 图 1pGADT7::PIP1 ； 4、 pGBKT7::PIP1 ； 4 载体示意图
ADH1 promoter ： ADH1 基 因 启 动 子， SV40 NLS ： SV40 核 定 位 信 号， GAL4 AD ： GAL4 激 活 序 列 ； T7 promoter ： T7 启 动 子 序 列 ； ADH1 terminator ： ADH1 基 因 终 止 子 ； T7 terminator ： T7 基因终止子 ； GAL4 DNA-BD ： GAL4 基因 DNA 结合序列。
图 2 酵母双杂交系统 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 验证。
A.pGADT7::PIP1 ； 4 与 pGBKT7::Hpa1Xoo 杂 交 结 果 ； B.pGBKT7::PIP1 ； 4 与 pGADT7::Hpa1Xoo 杂 交 结 果 ； C.pGADT7::PIP1 ； 4 与 pGBKT7::ΔNT 杂 交 结 果 ； C.pGBKT7::PIP1 ； 4 与 pGADT7::ΔNT 杂交结果 ； PCL1 ： 阳性对照 ； T71am ： 阴性对照 ； Hpa1 ： Hpa1Xoo。蓝色代表具有相互作用， 无色代表不具有相互作用。
图 3pBT3-N::PIP1 ； 4， pBT3-STE::PIP1 ； 4 载体示意图
pBT3-N-PIP1 ； 4： pBT3-N::PIP1 ； 4； pBT3-SET-PIP1 ； 4： pBT3-SET::PIP1 ； 4； pBT3-N-Hpa1Xoo/ΔNT ： pBT3-N::Hpa1Xoo/ΔNT ； LEU2 ： LEU2 gene from S.cerevisiae ； KanR ： 卡那霉素抗性基因 ； LexA-VP16 ： LexA-VP16 转录因子 ； CUB ： 泛素炭末端序列 ； sfi I ： sfi I 酶切位点 ； Amp ： 氨苄青霉素抗性基因 ； NubG ： 突变泛素氮末端序列 ； HA-tag ： 六个组氨酸标 签。
图 4 膜酵母双杂交验证 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 的互作验证
SD-trp-leu ： 色氨酸和亮氨酸缺失 SD 培养基 ； SD-trp-leu-his ： 色氨酸、 亮氨酸和 组氨酸缺失 SD 培养基 ； SD-trp-leu-his-ade ： 色氨酸、 亮氨酸、 组氨酸和腺嘌呤缺失 SD 培 养基 ； Cub， 泛素的 C 端部分 ； NubG， 泛素 N 端部分 NubI 的突变体， 即 NubI 的 3′端异亮氨酸 替换为甘氨酸。PIP1 ； 4-Cub 与 NubG 以及 APP-Cub 与 NubG-Hpa1Xoo 组合后， 没有酵母菌落的 生长 ； Hpa1 ： Hpa1Xoo 蛋白。
图 5pPICZ-A::PIP1 ； 4 和 pPICZα-A::PIP1 ； 4 载体示意图
图 a 表 示 以 GST 标 记 的 Hpa1Xoo 及 其 N- 末 端 缺 失 的 ΔNT 为 诱 饵，构 建 pET41::Hpa1Xoo 和 pET41::ΔNT 的示意图 ；
图 b 表示以 PIP1 ； 4 为猎物， 构建 pPICZ-A::PIP1 ； 4、 pPICZα-A::PIP1 ； 4、 的示意 图， 并且 PIP1 ； 4 的后面加有 His-tag。
图 6Pull-down assay 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
“+” 洗脱液中含有这种物质， “-” 代表不含有这种物质， 条带代表 ： 洗脱液中含有这 种物质并可以被 His 抗体检测出， 出现两个条带代表 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 具有互作效应。
图 7pCAMBIA1301::PIP1 ； 4 : : Y N 、p C A M B I A 1 3 0 1 : : H p a 1 X o o : : Y C 和 pCAMBIA1301::ΔNT::YC 载体示意图，
pCAMBIA1301-PIP1 ； 4-YFPN ： pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YFPN ； pCAMBIA1301-Hpa1Xoo/ c C ΔNT-YFP ： pCAMBIA1301::Hpa1Xoo::YFPC/p AMBIA1301::ΔNT::YFPC ； 35SP ： CaMV35S 启 N C 动子 ； RSIAT ： 连接肽 ； YFP ： 黄色荧光蛋白氮末端序列 ； YFP ： 绿色荧光蛋白碳末端序列 ； Nostmt ： NOS 基因终止子序列 ； Kpn I， BamH I， Xba I， Pst I ： 限制性内切酶。
图 8 拟南芥原生质上的 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
拟 南 芥 原 生 质 体 上 BiFC 验 证 Hpa1Xoo 和 PIP1 ； 4 进 行 互 作， 表 现 出 绿 色 荧 光， Visible light ： 可见光 ； 545-580 ： 波 长 为 545-580nm 的 发 射 光 波 长 ； 583 ： 激发光波长 583nm ； 527 ： 激发光波长 527nm ； 460-490 ： 发射光波长 460-490nm。
图 9 拟南芥叶片上的 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
拟南芥叶片上 BiFC 验证 Hpa1Xoo 和 PIP1 ； 4 进行互作， 表现出黄色荧光， Visible light ： 可见光 ； 545-580 ： 波长为 545-580nm 的发射光波长 ； 583 ： 激发光波长 583nm ； 527 ： 激发光波长 527nm ； 460-490 ： 发射光波长 460-490nm。 图 10FM 4-64 产生的荧光与互作蛋白产生荧光的叠加
膜特异性染料 FM4-64 产生的荧光与互作蛋白产生荧光的叠加验证 Hpa1Xoo 和 PIP1 ； 4 互作， 并且互作发生在细胞膜上。叠合后的荧光表现出橙色荧光， Visible light ： 可见光 ； 545-580 ： 波长为 545-580nm 的发射光波长 ； 583 ： 激发光波长 583nm ； 527 ： 激发光波 长 527nm ； 460-490 ： 发射光波长 460-490nm。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明， 将有助于本领域的普通技术人员理解本发 明， 但不以任何形式限制本发明。
实施例 1 酵母双杂交系统载体构建
用 ExTaq 酶 (takara 购买 ) 从水稻细菌性条斑病菌基因组 DNA 中用 PCR 方法扩 增 Hpa1Xoo 及其 Hpa1Xoo 蛋白 N 末端 53 个氨基酸缺失后的序列—— ΔNT， 从拟南芥生态型 Col-0( 种子在 http://www.arabidopsis.org- 购买， 生长至两片叶 ) 基因组 DNA 中扩增 PIP1 ； 4(SEQ ID No.1)， 扩增引物见表 1， 扩增条件如下 ： Hpa1Xoo ： 95℃， 5min ； 95℃， 30sec， 55 ℃， 45sec， 72 ℃， 1.5min， 30cycles ； 72 ℃， 10min ； ΔNT ： 95 ℃， 5min ； 95 ℃， 30sec， 55 ℃， 45sec， 72 ℃， 1min， 30cycles ； 72 ℃， 10min ； PIP1 ； 4： 95 ℃， 5min ； 95 ℃， 1min， 57 ℃， 45sec， 72℃， 2min， 30cycles ； 72℃， 10min。
利 用 TA 克 隆 的 方 法，把 Hpa1Xoo、 ΔNT 和 PIP1 ； 4 克 隆 到 pMD19-T simple vector(takara 公司购买 ) 上， 挑选阳性克隆， 送样测序并保存阳性克隆， 测序正确后， 提取 阳性克隆的质粒， 用 Nde I 和 BamH I(takara 购买 ) 双酶切质粒， 获得 Hpa1Xoo、 ΔNT 和 PIP1 ； 4 片段， 切胶回收目的片段 ； 同时提取 pGBKT7 和 pGADT7 质粒 (Clontech Laboratories， Inc. 公司购买 )， 经 Nde I/BamH I 酶切， 切胶回收载体片段， T4 连接酶 (takara 购买 ) 分别连接为 pGADT7::PIP1 ； 4、 pGBKT7::Hpa1Xoo、 pGBKT7::ΔNT、 pGADT7::Hpa1Xoo、 pGADT7::ΔNT 和 pGBKT7::PIP1 ； 4( 如图 1)， 转化 DH5α( 生兴公司购买 )， 37℃过夜培养， 挑取单克隆摇菌 培养， 提质粒， 酶切验证， 保存阳性克隆。
表 1 基因克隆的相关参数和条件
实施例 2 酵母双杂交系统验证
提取 pCL1、 pGADT7-T、 pGBKT7-53、 pGBKT7-Lam(Clontech Laboratories， Inc. 公司 购买 )， pGADT7::PIP1 ； 4、 pGBKT7::Hpa1Xoo、 pGBKT7::ΔNT、 pGADT7::Hpa1Xoo、 pGADT7::ΔNT
和 pGBKT7::PIP1 ； 4 的质粒。 具 体 方 法 按 照 Clontech Laboratories， Inc.Yeast Protocols Handbook FOR RESEARCH USE ONLY PT3024-1 上 的 方 法 验 证。 使 用 菌 株 为 酵 母 Y190(Clontech Laboratories， Inc.Yeast Protocols Handbook FOR RESEARCH USE ONLY PT3 024-1)。
先在一个培养皿中铺一张普通灭菌滤纸， 再加 2.5-5.0ml Z buffer/X-gal 溶液 ( 见 Yeast Protocols Handbook) 将滤纸润湿 ； 然后将显色滤纸 (Whatman 5# 滤纸或 Grade 410 滤纸 ) 剪成长方形， 放在培养皿中， 加少量灭菌水润湿， 用牙签挑取菌落轻轻在滤纸上 划线， 直接液氮冷冻 10 秒钟， 取出室温融化， 放在预先准备好的滤纸上， 避免在两层滤纸间 产生气泡。做好标记后， 放在 30℃或室温下， 定期检查蓝色菌落的出现情况。一般 8 小时之 内变蓝的可初步定位阳性克隆如图 2。蓝色代表具有相互作用， 无色代表不具有相互作用。 从图上可以看出蛋白 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 和 ΔNT 都具有互作效应。
实施例 3 膜酵母双杂交系统 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 载体的构建
使 用 实 施 例 1 中 获 得 pGADT7::PIP1 ； 4、 pGBKT7::Hpa1Xoo、 pGBKT7::ΔNT 为 模 板， 使用表 2 的引物， 其中 PIP1 ； 4 基因分别使用 1PIP1 ； 4 和 2PIP1 ； 4 引物对进行扩增， 扩增条件为 ： 95 ℃， 5min ； 95 ℃， 50sec， 61 ℃， 45sec， 72 ℃， 1min， 30cycles ； 72 ℃， 10min， 扩 增产物通过 TA 克隆的方式克隆到 pMD19-T simple vector(takara 公司 ) 上， 挑选阳性 克隆， 送样测序并保存阳性克隆， 测序正确后， 提取阳性克隆的质粒， Sfi I 酶切 (takara 公 司 )， 切胶回收目的片段 ； 将 上 述 使 用 1PIP1 ； 4、 2PIP1 ； 4 扩增得到的克隆产物分别 连 接 到 pBT3-N、 pBT3-STE 质 粒 (Dualsystems Biotech 公 司 ) 获 得 pBT3-N::PIP1 ； 4， pBT3-STE::PIP1 ； 4( 如图 3) ； Hpa1Xoo 和 ΔNT 扩增条件为 ： 95 ℃， 5min ； 95 ℃， 50sec， 59 ℃，
72 ℃， 10min。扩增产物通过 TA 克隆的方式克隆到 pMD19-T 45sec， 72 ℃， 1min， 30cycles ； simple vector(takara 公司购买 ) 上， 挑选阳性克隆， 送样测序并保存阳性克隆， 测序正确 后， 提取阳性克隆的质粒， Sfi I 酶切 (takara 公司购买 )， 切胶回收目的片段 ； 提取 pPR3-N质粒 (Dualsystems Biotech 公司 )， Sfi I 酶切， T4 连接酶连接获得 pPR3-N::Hpa1Xoo， pPR3-N::ΔNT， 转化 DH5α， 37℃过夜培养， 挑取单克隆摇菌， 提质粒， 酶切验证， 保存阳性克 隆。
表 2 基因克隆的相关参数和条件
实施例 4 膜酵母双杂交验证 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 的互作
按 照 Dualsystems Biotech 公 司 DUALmembrane pairwise interaction kit PO1501 用 户 手 册 的 方 式 将 把 构 建 好 的 载 体 pBT3-N::PIP1 ； 4， pBT3-STE::PIP1 ； 4， pPR3-N::Hpa1Xoo， pPR3-N::ΔNT 利用 DUALmembrane pairwise interaction kit PO1501 用 户手册的方法转入酵母菌株 NMY51。获得含有以上载体的酵母菌株克隆。
挑 取 以 上 获 得 含 有 重 组 质 粒 的 酵 母 菌 克 隆， 按 照 DUALmembrane pairwise interaction kitPO1501 用户手册上面的方式进行蛋白表达验证。发现获得 bait 和 prey 蛋白。
按照 DUALmembrane pairwise interaction kit PO1501 用户手册上面的方式验 证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作， 发现实验组上出现大量的克隆 ( 如图 4)。说明与 PIP1 ； 4与 Hpa1Xoo 发生互作， 所得载体具有功能。
实施例 5 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作载体的构建
使 用 表 3 中 的 引 物， 按 照 实 施 例 3 的 方 式 将 HpalXoo、 ΔNT、 PIP1 ； 4 连接到 pET-41a(+)、 pPICZ-A、 pPICZα-A 上分别获得 pET-41a(+)::Hpa1Xoo 和 pET-41a(+)::ΔNT， pPICZ-A::PIP1 ； 4 和 pPICZα-A::PIP1 ； 4。
表 3 基因克隆的相关参数和条件
A 该 PCR 产 物 通 过 酶 切 位 点 连 接 至 酵 母 胞 内 表 达 载 体 pPICZ-A 上， 得到 pPICZ-A::PIP1 ； 4， 用于在酵母胞内表达 PIP1 ； 4 蛋白。
B 该 PCR 产物通过酶切位点连接至酵母胞外分泌表达载体 pPICZα-A 上， 得到 pPICZα-A::PIP1 ； 4， 用于胞外泌出表达 PIP1 ； 4 蛋白。
实施例 6 Pull-down assay 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
通 过 热 击 法 将 带 有 目 的 基 因 的 表 达 质 粒 pET-41a(+)::Hpa1Xoo 和 pET-41a(+)::ΔNT 转化至宿主菌 BL21 中 ( 转化方法参见 《分子克隆》 第三版 )。 通过 PCR 扩 增验证阳性克隆后， 按照如下方法对蛋白进行诱导表达。 挑取单菌落接种到含有 1‰卡那霉 素的 LB 液体培养基中， 37℃， 220rpm 振荡过夜培养。 之后以 1％的接菌量转接到含有相同抗 按照终浓度为 1mM( 可 生素的 LB 液体培养基中， 相同条件继续培养至 OD600 值达 0.5 左右， 以调整浓度 ) 加入 IPTG(Isopropyl-D-thiogalactopyranoside)( 生兴 ) 诱导。在蛋白诱 导表达过程中， 大肠杆菌的培养温度、 摇床转速以及诱导时间都可以根据具体情况进行调 整， 一般情况为 37℃， 220rpm， 3h。然后， 6000rpm， 4℃离心 10min 收集菌体， 无菌水重悬洗 涤 2 遍， 用摇菌量 1/20 体积无菌水悬浮菌体， 加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟 (phenylmethyl sulfonyl fluoride， PMSF)( 生兴 ) 至终浓度 1.0mM， 冰浴 10min。然后在冰浴中超声波破 碎细胞。破碎输出功率根据不同情况而定， 破碎周期为破碎 4s， 暂停 3s， 如此反复， 直至菌 液澄清。最后 4℃， 12,000rpm 离心 10min， 保留上清液， 冻存于 -80℃冰箱， 以备后续的蛋白 电泳或生物活性测定。
PIP1 ； 4 蛋 白 的 表 达 使 用 实 施 例 5 构 建 的 真 核 表 达 系 统 (pPICZ-A::PIP1 ； 4 和 pPICZα-A::PIP1 ； 4)，使 用 酵 母 菌 产 生 表 达 蛋 白，方 法 按 照 Invitrogen Corporation(Catalog no.K1740-01) 所示， 获得 PIP1 ； 4 蛋白。
按照王云鹏 (2009 年， 博士论文， 烟草控制表皮毛发育的因子 NtTTG1 和控制营养 生长的因子 NtARP1 对过敏反应与抗病性的调控作用 ) 的方法进行 PIP1 ； 4 蛋白与 Hpa1Xoo 互作的验证， 发现这两个蛋白有互作效应 ( 如图 6)。 “+” 洗脱液中含有这种物质， “-” 代表 不含有这种物质， 条带代表 ： 洗脱液中含有这种物质并可以被 His 抗体检测出， 出现两个条 带代表 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 具有互作效应。将 ΔNT 和 Hpa1Xoo 分别挂柱， 然后使用 PIP1 ； 4 进行洗脱。
实施例七 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 互作载体的构建 N
首先构建 pCAMBIA1301::YFP 和 pCAMBIA1301::YFPC 载体。以 pPLV17 为模板， 扩 N C 增 YFP ( 黄色荧光蛋白氮末端序列 ) 和 YFP ( 黄色荧光蛋白碳末端序列 )， 引物见表 4， 扩 N C 增方法和条件同实施例 1， 将所得的 YFP 和 YFP ， 使用 Xba I 和 Pst I 进行酶切并插入到 pCAMBIA1301 相应的酶切位点获得 pCAMBIA1301::YFPN、 pCAMBIA1301::YFPC。
按照实施例 1 的方式， 使用表 4 中的引物扩增 PIP1 ； 4， ΔNT， Hpa1Xoo， 扩增产物
分 别 使 用 Kpn I 和 BamH I 双 酶 切 后 插 入 到 pCAMBIA1301::YFPN 和 pCAMBIA1301::YFPC 载 体 的 Kpn I 和 BamH I 酶 切 位 点 间，分 别 获 得 pCAMBIA 1301::PIP1 ； 4::YFPN、 pCAMBIA1301::Hpa1Xoo::YFPC 和 pCAMBIA 1301::ΔNT::YFPC 重组载体。最后将构建好的 pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YFPN、 pCAMBIA 1301::Hpa1Xoo::YFPC 和 pCAMBIA 1301::ΔNT::YFPC 载体转入农杆菌 EHA105 菌株内， 于 -80℃冰箱保存， 以备后用。
表 4 基因克隆的相关参数和条件
实施例 8 拟南芥原生质上的 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
选择 3-4 周拟南芥完全扩展的长势好的叶片， 从叶片的中部把叶片切成宽度为 0.5-1mm， 边缘无碎的叶片细条， 把切好的叶片放在干净的白纸上， 轻轻地用镊子把切好的 叶片放入 Enzyme solution 溶液中， 完全浸入。黑暗中， 真空抽取 30min。继续在 Enzyme solution 中消化， 不要摇动， 常温下， 黑暗中， 至少 3h。 消化 3h 后， 大部分的原生质体被释放 出来。 显微镜下， 观察 Enzyme solution 中释放的原生质体 ； 拟南芥叶肉中原生质体的大小 约为 30-50um。 过滤前， 为了除去没消化的叶片组织用等体积的 W5 solution 稀释含有原生 质体的酶液。 用水洗一个干净的 75-um 的血液尼龙过滤网 ( 过滤网保存于 95％ ethanol)。 然后用 W5 solution 润湿这个过滤网， 过滤包含有原生质体的酶液， 至 30ml 的管中。离心， 100g， 5min。用枪头吸取上清， 然后用 W5solution 轻轻地重悬原生质体团粒。离心， 100g， 5min。用枪头吸取上清， 然后用 W5solution 轻轻地重悬原生质体团粒， 弱光条件下， 置于冰 上， 30min。 冰浴后原生质体已沉淀， 将上清轻轻吸走， 加入适量的 MMG solution， 轻轻悬浮。 将准备好的高质量的质粒加入 2ml 的 Eppendorf 管中， 再加入 200μl 的原生质体， 轻轻地 充分混匀。 加入 220μl PEG-calcium transfection solution( 加之前再次轻晃 Eppendorf 管 )， 轻轻颠倒混匀， 室温下， 培养 15min。加入 800μl W5solution， 轻轻颠倒混匀， 离心， 100g， 5min。吸走上清， 加入 1ml W5solution， 轻轻颠倒混匀， 弱光室温放置过夜。进行原 4与 生质体的荧光观察 ( 如图 8)。绿光代表具有相互作用。从图上可以看出蛋白 PIP1 ； Hpa1Xoo 具有互作效应。
本实施例中部分试剂配方如下 ：
Enzyme solution ： 含有 20mM 2- 吗啉乙磺酸 (pH 5.7)( 生兴 )、 1.5％ (wt/vol) 纤 维素酶 R10( 丁贝生物 )， 0.4％ (wt/vol) 离析酶 R10( )( 丁贝生物 )、 0.4M 甘露醇 ( 丁贝 生物 ) 和 20mMKCl( 丁贝生物 )。55℃， 水浴 10min， 冷却到室温 (25℃ )， 再加入 10mMCaCl2、 1-5mM 巯基乙醇 (optional)( 丁贝生物 ) 和 0.1％ BSA( 丁贝生物 )。是否加 1-5mM 巯基乙 醇应根据实验的需要 ； 加入纤维素酶和离析酶之前， MES 溶液应在 70℃加热 3-5min， 最终的 液体应是澄清的浅棕色 ； 用 0.45um 滤器过滤最终的酶液 ； 每次使用的 Enzyme solution 应 该是新鲜的。
W5 solution ： 含有 2mM 2- 吗啉乙磺酸 (pH 5.7)、 154mMNaCl、 125mMCaCl2 和 5mM KCl。室温保存。
MMG solution ： 含有 4mM 2- 吗啉乙磺酸 (pH 5.7)、 0.4M mannito l 和 15mMMgCl2。 室温保存。
PEG-calcium transfection solution ： 包含 20-40％ (wt/vol)PEG4000( 丁贝生 物 )、 0.2M 甘露醇和 100mM CaCl2( 丁贝生物 )。
实施例 9 拟南芥叶片上的 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作 N
挑 选 含 有 pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YFP ， pCAMBIA1301::Hpa1Xoo::YFPC 和 pCAMBIA1301::ΔNT::YFPC 载体的农杆菌克隆至 YEB 中， 28℃， 过夜摇菌 ； 4,000×g， 15min， 用 1ml 的 AS 培养液重悬沉淀物， OD600 ＝ 0.7-0.8( 每个叶片大约 1ml) ； 将分别含有载体 N C pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YFP ， pCAMBIA1301::Hpa1Xoo/ΔNT::YFP ， 以 及 P19(Invitrogen 公司 ) 的三个菌株按照 OD 值 1 ∶ 1 ∶ 1 进行混合制备成悬液 ( 每个叶片 3ml)， 放置 2-4h ； 向 拟南芥叶片上洒水， 每个组合使用一颗植株。 每颗植株注射 2 或 3 个叶片。 在拟南芥的叶片 背面注射混合液。 叶的表面都要被注射到。 用 ZEISS LSM700 激光共聚焦显微镜观察拟南芥 叶片的荧光。 互作蛋白产生的的黄色荧光发射波长为 460-490nm， 激发波长为 527nm。 同时， 分别观察了黑白视野下和红光视野下的拟南芥叶片， 红光视野下， 发射波长为 545-580nm， 激发波长为 583-nm。 注射 1-3d 后， 每天都观察， 观察的部位为表皮细胞层的下叶面， 也可以 直接看整个叶片， 荧光一般能保持 6d( 如图 9)。 黄色代表具有相互作用， 否则不具有相互作 用。从图上可以看出蛋白 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 具有互作效应。
实施例 10 FM 4-64 产生的荧光与互作蛋白产生荧光的叠加
发明背景
水通道蛋白 (aquaporin， AQP) 是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子和一些 小分子溶质的膜内在蛋白， 属于 MIP(major intrinsic protein) 超家族， 分子量在 23 ～ 31ku。AQP1 蛋白就是一个存在于哺乳动物中的只传输水分子的典型水通道蛋白。根据 N、 C 端序列保守性， 相继鉴定出拟南芥水通道蛋白 PIP1 和 PIP2。到目前为止， 在拟南芥、 烟 草、 玉米、 豌豆、 水稻、 大麦叶表皮、 滨藜、 番茄跟、 甜菜贮藏组织、 西葫芦种子及向日葵下胚 轴薄壁细胞等多种植物中都发现了水通道蛋白， 并且真细菌、 古生菌、 真菌和动物等生物中 也有 AQP 的存在。另外， 从蛋白数据库中也发现了大量 AQP 的同源物， 它广泛存在于单子叶 和双子叶植物、 C3 和 C4 代谢植物中。根据氨基酸序列的同源性分析， 它们可能也是 AQP。 越来越多的研究表明， 植物中往往存在多个 AQP 同源物且含量丰富， 有时甚至是细胞膜的 一个主要成分。如菜豆子叶中含丰富的 α-TIP 同源物， 约占细胞可抽提总蛋白的 2％ ； 在 拟南芥中， PIP1 蛋白占叶与根质膜蛋白的 1％以上 ； 菠菜叶肉细胞中含丰富的质膜 AQP， 占 其质膜总蛋白的 20％。水通道蛋白有不同的孔结构， 能转运活性氧、 气体和一些代谢产物。 harpins 能激活植物生长和防卫反应信号通路， 但是植物中一个 harpin 蛋白在一个信号通 路中是如何被识别的？一个特定 harpin 的植物受体是什么？这个信号是如何被转导到细 胞内的？能把细菌效应蛋白， 特别是 III 型效应子从植物细胞外转运到细胞内的植物转位 子是什么？目前都还不清楚。
近年来， 随着分子生物学技术的迅速发展， 研究蛋白质与蛋白质互作的方法也越 来越多， 体内实验如普通的 Y2H、 MYTH、 荧光共振能量转移、 BiFC 和蛋白质片段互补技术等， 体外实验如免疫共沉淀、 Pull-down assay 和表面等离子共振等。
酵母双杂交系统是一个在生物学领域具有划时代意义的研究方法， 由 Fields 和 Song 等首先在研究真核基因的转录调控起始过程中建立的。 因其具有简便、 灵敏、 高效以及 能反应不同蛋白质间在活细胞内的相互作用等特点， 因此在基因功能的研究中得到了广泛 的应用。 其基本原理是真核生物转录的起始位点特异转录激活因子通常具有两个彼此可分 割开的结构域， 即 DNA 结合域 (DNA-binding domain， BD) 与转录激活域 (Transcriptional activation domain， AD)(Fields and Song， 1989)。 这两个结构域各具功能， 互不影响， 单独 的 BD 虽然能和启动子结合， 但不能激活转录。一个完整的激活特定基因表达的激活因子必 须同时含有这两个结构域， 否则无法完成激活功能。所以可将编码已知蛋白质 ( 常称为诱 饵蛋白质， bait protein) 的基因与 BD 融合， 在酵母中表达产生融合蛋白质称为 BD-Bait ； 编码未知蛋白 ( 常称为捕获蛋白质， prey protein) 的基因与 AD 融合， 并在酵母中表达产 生另一融合蛋白称为 AD-Prey。把这两种融合蛋白共表达于宿主细胞中， 如果这两个蛋白 能发生相互作用， AD 与 BD 就会形成一个完整的转录激活因子， 并激活相应的报告基因的表
达。反之， 如果待测蛋白间不发生相互作用， 则 BD 和 AD 不能结合， 报告基因的转录也就不 能被激活。如果将 Prey 换成基因文库， 即可直接从基因文库中筛选到能与 Bait 相互作用 蛋白的基因。
膜酵母双杂交 (membrane yeast two hybrid) 利用的原理十分巧妙， 应用到了 分离泛素系统 (split-ubiquitin)， 将 “诱饵” (bait) 即一个完整的膜蛋白， 融合到泛素的 C 末端 ( 这部分的泛素与一个转录激活因子相连 )， 而 “猎物” 或靶蛋白 (prey or target protein) 则融合在泛素的另一半上， bait 和 prey 的相互作用就会让这两部分的泛素重新 构成泛素， 从而被一种特异性的蛋白酶 ( 泛素专一性蛋白酶， UBPs) 剪切， 释放出转录激活 因子， 这个转录因子转移到细胞核上， 开启报告基因的表达。DUAL membrane(Stagljar et al.， 1998 ； Thaminy et al.， 2003) 体系利用切割 - 泛素机制来验证一个完整的膜蛋白与另 一个蛋白 ( 完整的膜蛋白或可溶性蛋白 ) 的互作。因为自然状态下这种互作是在膜上检测 到的， 所以与普通的 Y2H 相比这个方法更符合生理学的状态， 普通的 Y2H 仅仅能验证完整膜 蛋白的亚结构域与其他蛋白质的互作， 并且互作发生核内。
pulldown assay， 是研究蛋白质互作的一种体外测定技术， 通常用来对 Y2H 试验结 果进行验证， 即验证两个已知蛋白之间的互作。这种技术准确可靠， 可以弥补 Y2H 假阳性偏 高的缺陷。Pulldown 免疫电泳试验的技术关键在于亲和吸附， 使用谷胱甘肽亲和树脂吸附 两种互作蛋白中的一种蛋白 ( 称为诱饵蛋白 )， 捕获与之互作的另一种蛋白 ( 称为猎物蛋 白 )。 其基本原理是将诱饵蛋白 -GST( 谷胱甘肽巯基转移酶， glutathione S-transferase) 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上， 作为与猎物蛋白亲和的支撑物。将猎物蛋白溶 液过柱， 可从中捕获与之相互作用的猎物蛋白， 洗脱结合物后通过 SDS-PAGE 电泳分析， 从 而证实两种蛋白间的相互作用或者筛选相应的目的蛋白。 “诱饵蛋白” 和 “捕获蛋白” 均可 通过细胞裂解物、 纯化的蛋白、 表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 此方法简单易 行， 操作方便。
双分子荧光互补 (Bimolecular fluorescence complementation， BiFC) 是检测生 物体内或体外蛋白质互作的一项新技术。研究发现， GFP 或 YFP 序列有 10 个位点可以任意 插入外源片段而不影响荧光活性。根据这一特性， 将 GFP 或 YFP 在特定位点裂解为无荧光 N N 活性的两个片段， 即 N 端片段 (GFP 或 YFP ) 和 C 端片段 (GFPC 或 YFPC)。将两个可能发生 互作的待测蛋白质基因序列分别与 GFPN 或 YFPN 和 GFPC 或 YFPC 基因序列连接， 分别构建到 合适的载体上， 同时转化生物细胞， 在转化的细胞中共同表达， 待测的两个蛋白分别与 GFPN 或 YFPN 和 GFPC 或 YFPC 形成融合蛋白。如果 GFPN 或 YFPN 和 GFPC 或 YFPC 能够相互靠近， 形 成荧光蛋白生色团重新发出荧光， 则表明这两个蛋白发生了互作。
FM 染料是亲脂类复合物， 广泛应用于细胞膜和囊泡化的研究。FM 染料溶于水之 后， 对细胞无毒， 并且不发荧光， 但是与细胞膜结合后， 嵌入细胞膜的外层， 发出强烈的荧 光。这种膜标签的方法已被用于选择性地观测真核细胞和海胆卵的细胞膜， 并研究真核细 胞和细菌的内吞和胞吞作用， 植物细胞的囊泡运输以及枯草杆菌的孢子形成。在积极释放 神经递质的神经元中， 这些染料嵌入再生的突触囊泡内， 神经末梢被染上明亮的颜色。 FM464[N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-diethylaminophenylhexatrienyl)pyridinium dibromide] 是一种吡啶二溴化物， 属于苯乙烯类染料。FM 4-64 与质膜双层结合后不能被 动扩散进入细胞内部， 必须通过主动运输的方式进行跨膜运输。目前 FM 4-64 已逐步在动植物、 微生物基因的亚细胞定位， 胞吞胞吐、 囊泡运输等相关研究中得到应用。 发明内容 本发明的目的是提供水通道蛋白基因 PIP1 ； 4 的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现 ：
SEQ ID NO.1 所示的水通道蛋白基因 PIP1 ； 4 在构建其表达产物与 Hpa1Xoo 蛋白相 互作用的互作载体中的应用。
所述的互作载体优选酵母双杂交系统中使用的重组载体 pGBKT7::PIP1 ； 4， 该重 组载体是通过以拟南芥生态型 Col-0 基因组 DNA 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.6 和 SEQ ID No.7 克隆 SEQ ID NO.1 所示的 PIP1 ； 4 基因， 经 Nde I/BamH I 双酶切后插 入到 pGBKT7 质粒的 Nde I/BamH I 酶切位点之间所得。
所述的互作载体优选酵母双杂交系统中使用的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4， 该重 组载体是通过以拟南芥生态型 Col-0 基因组 DNA 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.6 和 SEQ ID No.7 克隆 SEQ ID NO.1 所示的 PIP1 ； 4 基因， 经 Nde I/BamH I 双酶切后插 入到 pGADT7 质粒的 Nde I/BamH I 酶切位点之间所得。
所述的互作载体优选膜酵母双杂交系统中使用的重组载体 pBT3-N::PIP1 ； 4， 该 重组载体是通过以所述的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.12 和 SEQ ID No.13 克隆得到 PIP1 ； 4 基因， Sfi I 酶切后连接到 pPR3-N 质粒的 Sfi I 酶切位点所得。
所述的互作载体优选膜酵母双杂交系统中使用的重组载体 pBT3-N::PIP1 ； 4， 该 重组载体是通过以所述的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.14 和 SEQ ID No.15 克隆得到 PIP1 ； 4 基因， Sfi I 酶切后连接到 pBT3-STE 质粒的 Sfi I 酶切位点所得。
所述的互作载体优选 Pull-down assay 中使用的表达水通道蛋白 PIP1 ； 4 的重组 载体 pPICZ-A::PIP1 ； 4， 该重组载体是通过以权利要求 3 所述的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4 为模板， 利用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.16 和 SEQ ID No.17 克隆得到 PIP1 ； 4 基因， 经 EcoR I/Kpn I 酶切后连接到酵母胞内表达载体 pPICZ-A 上的 EcoR I/Kpn I 酶切位点之间 所得。
所述的互作载体为 Pull-down assay 中使用的表达水通道蛋白 PIP1 ； 4 的重组载 体 pPICZα-A::PIP1 ； 4， 该重组载体是通过以所述的重组载体 pGADT7::PIP1 ； 4 为模板， 利 用特异性上、 下游引物 SEQ ID No.18 和 SEQ ID No.19 克隆得到 PIP1 ； 4 基因， 经 EcoR I/ Kpn I 酶切后连接到酵母胞外分泌表达载体 pPICZα-A 上的 EcoR I/Kpn I 酶切位点之间所 得。
所 述 的 互 作 载 体 优 选 BiFC 杂 交 系 统 中 使 用 的 重 组 载 体 pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YN， 该重组载体是以 pPLV17 为模板， 以 SEQ ID No.24 和 SEQ ID No.25 为引物扩增黄色 荧光蛋白氮末端序列 YN， 将所得的 YN 使用 Xba I 和 Pst I 进行酶切并插入到 pCAMBIA1301 相应的酶切位点获得 pCAMBIA1301::YN 载体 ； 以拟南芥生态型 Col-0 基因组 DNA 为模板， 以 SEQ ID No.28 和 SEQ ID No.29 为引物扩增 PIP1 ； 4， 将扩增的到得 PIP1 ； 4 基因使用 Kpn I 和 BamH I 双酶切后插入到 pCAMBIA1301::YN 载体的 Kpn I 和 BamH I 酶切位点间得到的。
有益效果 ： 本发明通过酵母双杂交系统、 膜酵母双杂交、 pulldown assay、 双分子 荧光互补等蛋白质互作技术， 得到植物水通道蛋白 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 之间的相互作用关 系。 因此 SEQ ID NO.1 所示的水通道蛋白基因 PIP1 ； 4 可应用于构建其表达产物与 Hpa1Xoo 相互作用的互作载体。
已有的研究证明， harpins 能激活植物生长和防卫反应信号通路， 但是植物中一个 harpin 蛋白在一个信号通路中是如何被识别的？一个特定 harpin 的植物受体是什么？这 个信号是如何被转导到细胞内的？能把细菌效应蛋白， 特别是 III 型效应子从植物细胞外 转运到细胞内的植物转位子是什么？目前都还不清楚。通过筛选拟南芥的 cDNA 库， 发现 Hpa1Xoo 可以与水通道蛋白具有互作关系。而水通道蛋白与植物体的很多生理反应相关。 本发明试图通过构建 PIP1 ； 4 与 Hpa1xoo 的互作载体， 来揭示这两种蛋白的相互关系， 也为 PIP1 ； 4 以后的研究提供物质条件。 附图说明 图 1pGADT7::PIP1 ； 4、 pGBKT7::PIP1 ； 4 载体示意图
ADH1 promoter ： ADH1 基 因 启 动 子， SV40 NLS ： SV40 核 定 位 信 号， GAL4 AD ： GAL4 激 活 序 列 ； T7 promoter ： T7 启 动 子 序 列 ； ADH1 terminator ： ADH1 基 因 终 止 子 ； T7 terminator ： T7 基因终止子 ； GAL4 DNA-BD ： GAL4 基因 DNA 结合序列。
图 2 酵母双杂交系统 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 验证。
A.pGADT7::PIP1 ； 4 与 pGBKT7::Hpa1Xoo 杂 交 结 果 ； B.pGBKT7::PIP1 ； 4 与 pGADT7::Hpa1Xoo 杂 交 结 果 ； C.pGADT7::PIP1 ； 4 与 pGBKT7::ΔNT 杂 交 结 果 ； C.pGBKT7::PIP1 ； 4 与 pGADT7::ΔNT 杂交结果 ； PCL1 ： 阳性对照 ； T71am ： 阴性对照 ； Hpa1 ： Hpa1Xoo。蓝色代表具有相互作用， 无色代表不具有相互作用。
图 3pBT3-N::PIP1 ； 4， pBT3-STE::PIP1 ； 4 载体示意图
pBT3-N-PIP1 ； 4： pBT3-N::PIP1 ； 4； pBT3-SET-PIP1 ； 4： pBT3-SET::PIP1 ； 4； pBT3-N-Hpa1Xoo/ΔNT ： pBT3-N::Hpa1Xoo/ΔNT ； LEU2 ： LEU2 gene from S.cerevisiae ； KanR ： 卡那霉素抗性基因 ； LexA-VP16 ： LexA-VP16 转录因子 ； CUB ： 泛素炭末端序列 ； sfi I ： sfi I 酶切位点 ； Amp ： 氨苄青霉素抗性基因 ； NubG ： 突变泛素氮末端序列 ； HA-tag ： 六个组氨酸标 签。
图 4 膜酵母双杂交验证 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 的互作验证
SD-trp-leu ： 色氨酸和亮氨酸缺失 SD 培养基 ； SD-trp-leu-his ： 色氨酸、 亮氨酸和 组氨酸缺失 SD 培养基 ； SD-trp-leu-his-ade ： 色氨酸、 亮氨酸、 组氨酸和腺嘌呤缺失 SD 培 养基 ； Cub， 泛素的 C 端部分 ； NubG， 泛素 N 端部分 NubI 的突变体， 即 NubI 的 3′端异亮氨酸 替换为甘氨酸。PIP1 ； 4-Cub 与 NubG 以及 APP-Cub 与 NubG-Hpa1Xoo 组合后， 没有酵母菌落的 生长 ； Hpa1 ： Hpa1Xoo 蛋白。
图 5pPICZ-A::PIP1 ； 4 和 pPICZα-A::PIP1 ； 4 载体示意图
图 a 表 示 以 GST 标 记 的 Hpa1Xoo 及 其 N- 末 端 缺 失 的 ΔNT 为 诱 饵，构 建 pET41::Hpa1Xoo 和 pET41::ΔNT 的示意图 ；
图 b 表示以 PIP1 ； 4 为猎物， 构建 pPICZ-A::PIP1 ； 4、 pPICZα-A::PIP1 ； 4、 的示意 图， 并且 PIP1 ； 4 的后面加有 His-tag。
图 6Pull-down assay 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
“+” 洗脱液中含有这种物质， “-” 代表不含有这种物质， 条带代表 ： 洗脱液中含有这 种物质并可以被 His 抗体检测出， 出现两个条带代表 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 具有互作效应。
图 7pCAMBIA1301::PIP1 ； 4 : : Y N 、p C A M B I A 1 3 0 1 : : H p a 1 X o o : : Y C 和 pCAMBIA1301::ΔNT::YC 载体示意图，
pCAMBIA1301-PIP1 ； 4-YFPN ： pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YFPN ； pCAMBIA1301-Hpa1Xoo/ c C ΔNT-YFP ： pCAMBIA1301::Hpa1Xoo::YFPC/p AMBIA1301::ΔNT::YFPC ； 35SP ： CaMV35S 启 N C 动子 ； RSIAT ： 连接肽 ； YFP ： 黄色荧光蛋白氮末端序列 ； YFP ： 绿色荧光蛋白碳末端序列 ； Nostmt ： NOS 基因终止子序列 ； Kpn I， BamH I， Xba I， Pst I ： 限制性内切酶。
图 8 拟南芥原生质上的 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
拟 南 芥 原 生 质 体 上 BiFC 验 证 Hpa1Xoo 和 PIP1 ； 4 进 行 互 作， 表 现 出 绿 色 荧 光， Visible light ： 可见光 ； 545-580 ： 波 长 为 545-580nm 的 发 射 光 波 长 ； 583 ： 激发光波长 583nm ； 527 ： 激发光波长 527nm ； 460-490 ： 发射光波长 460-490nm。
图 9 拟南芥叶片上的 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
拟南芥叶片上 BiFC 验证 Hpa1Xoo 和 PIP1 ； 4 进行互作， 表现出黄色荧光， Visible light ： 可见光 ； 545-580 ： 波长为 545-580nm 的发射光波长 ； 583 ： 激发光波长 583nm ； 527 ： 激发光波长 527nm ； 460-490 ： 发射光波长 460-490nm。 图 10FM 4-64 产生的荧光与互作蛋白产生荧光的叠加
膜特异性染料 FM4-64 产生的荧光与互作蛋白产生荧光的叠加验证 Hpa1Xoo 和 PIP1 ； 4 互作， 并且互作发生在细胞膜上。叠合后的荧光表现出橙色荧光， Visible light ： 可见光 ； 545-580 ： 波长为 545-580nm 的发射光波长 ； 583 ： 激发光波长 583nm ； 527 ： 激发光波 长 527nm ； 460-490 ： 发射光波长 460-490nm。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明， 将有助于本领域的普通技术人员理解本发 明， 但不以任何形式限制本发明。
实施例 1 酵母双杂交系统载体构建
用 ExTaq 酶 (takara 购买 ) 从水稻细菌性条斑病菌基因组 DNA 中用 PCR 方法扩 增 Hpa1Xoo 及其 Hpa1Xoo 蛋白 N 末端 53 个氨基酸缺失后的序列—— ΔNT， 从拟南芥生态型 Col-0( 种子在 http://www.arabidopsis.org- 购买， 生长至两片叶 ) 基因组 DNA 中扩增 PIP1 ； 4(SEQ ID No.1)， 扩增引物见表 1， 扩增条件如下 ： Hpa1Xoo ： 95℃， 5min ； 95℃， 30sec， 55 ℃， 45sec， 72 ℃， 1.5min， 30cycles ； 72 ℃， 10min ； ΔNT ： 95 ℃， 5min ； 95 ℃， 30sec， 55 ℃， 45sec， 72 ℃， 1min， 30cycles ； 72 ℃， 10min ； PIP1 ； 4： 95 ℃， 5min ； 95 ℃， 1min， 57 ℃， 45sec， 72℃， 2min， 30cycles ； 72℃， 10min。
利 用 TA 克 隆 的 方 法，把 Hpa1Xoo、 ΔNT 和 PIP1 ； 4 克 隆 到 pMD19-T simple vector(takara 公司购买 ) 上， 挑选阳性克隆， 送样测序并保存阳性克隆， 测序正确后， 提取 阳性克隆的质粒， 用 Nde I 和 BamH I(takara 购买 ) 双酶切质粒， 获得 Hpa1Xoo、 ΔNT 和 PIP1 ； 4 片段， 切胶回收目的片段 ； 同时提取 pGBKT7 和 pGADT7 质粒 (Clontech Laboratories， Inc. 公司购买 )， 经 Nde I/BamH I 酶切， 切胶回收载体片段， T4 连接酶 (takara 购买 ) 分别连接为 pGADT7::PIP1 ； 4、 pGBKT7::Hpa1Xoo、 pGBKT7::ΔNT、 pGADT7::Hpa1Xoo、 pGADT7::ΔNT 和 pGBKT7::PIP1 ； 4( 如图 1)， 转化 DH5α( 生兴公司购买 )， 37℃过夜培养， 挑取单克隆摇菌 培养， 提质粒， 酶切验证， 保存阳性克隆。
表 1 基因克隆的相关参数和条件
实施例 2 酵母双杂交系统验证
提取 pCL1、 pGADT7-T、 pGBKT7-53、 pGBKT7-Lam(Clontech Laboratories， Inc. 公司 购买 )， pGADT7::PIP1 ； 4、 pGBKT7::Hpa1Xoo、 pGBKT7::ΔNT、 pGADT7::Hpa1Xoo、 pGADT7::ΔNT
和 pGBKT7::PIP1 ； 4 的质粒。 具 体 方 法 按 照 Clontech Laboratories， Inc.Yeast Protocols Handbook FOR RESEARCH USE ONLY PT3024-1 上 的 方 法 验 证。 使 用 菌 株 为 酵 母 Y190(Clontech Laboratories， Inc.Yeast Protocols Handbook FOR RESEARCH USE ONLY PT3 024-1)。
先在一个培养皿中铺一张普通灭菌滤纸， 再加 2.5-5.0ml Z buffer/X-gal 溶液 ( 见 Yeast Protocols Handbook) 将滤纸润湿 ； 然后将显色滤纸 (Whatman 5# 滤纸或 Grade 410 滤纸 ) 剪成长方形， 放在培养皿中， 加少量灭菌水润湿， 用牙签挑取菌落轻轻在滤纸上 划线， 直接液氮冷冻 10 秒钟， 取出室温融化， 放在预先准备好的滤纸上， 避免在两层滤纸间 产生气泡。做好标记后， 放在 30℃或室温下， 定期检查蓝色菌落的出现情况。一般 8 小时之 内变蓝的可初步定位阳性克隆如图 2。蓝色代表具有相互作用， 无色代表不具有相互作用。 从图上可以看出蛋白 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 和 ΔNT 都具有互作效应。
实施例 3 膜酵母双杂交系统 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 载体的构建
使 用 实 施 例 1 中 获 得 pGADT7::PIP1 ； 4、 pGBKT7::Hpa1Xoo、 pGBKT7::ΔNT 为 模 板， 使用表 2 的引物， 其中 PIP1 ； 4 基因分别使用 1PIP1 ； 4 和 2PIP1 ； 4 引物对进行扩增， 扩增条件为 ： 95 ℃， 5min ； 95 ℃， 50sec， 61 ℃， 45sec， 72 ℃， 1min， 30cycles ； 72 ℃， 10min， 扩 增产物通过 TA 克隆的方式克隆到 pMD19-T simple vector(takara 公司 ) 上， 挑选阳性 克隆， 送样测序并保存阳性克隆， 测序正确后， 提取阳性克隆的质粒， Sfi I 酶切 (takara 公 司 )， 切胶回收目的片段 ； 将 上 述 使 用 1PIP1 ； 4、 2PIP1 ； 4 扩增得到的克隆产物分别 连 接 到 pBT3-N、 pBT3-STE 质 粒 (Dualsystems Biotech 公 司 ) 获 得 pBT3-N::PIP1 ； 4， pBT3-STE::PIP1 ； 4( 如图 3) ； Hpa1Xoo 和 ΔNT 扩增条件为 ： 95 ℃， 5min ； 95 ℃， 50sec， 59 ℃，
72 ℃， 10min。扩增产物通过 TA 克隆的方式克隆到 pMD19-T 45sec， 72 ℃， 1min， 30cycles ； simple vector(takara 公司购买 ) 上， 挑选阳性克隆， 送样测序并保存阳性克隆， 测序正确 后， 提取阳性克隆的质粒， Sfi I 酶切 (takara 公司购买 )， 切胶回收目的片段 ； 提取 pPR3-N质粒 (Dualsystems Biotech 公司 )， Sfi I 酶切， T4 连接酶连接获得 pPR3-N::Hpa1Xoo， pPR3-N::ΔNT， 转化 DH5α， 37℃过夜培养， 挑取单克隆摇菌， 提质粒， 酶切验证， 保存阳性克 隆。
表 2 基因克隆的相关参数和条件
实施例 4 膜酵母双杂交验证 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 的互作
按 照 Dualsystems Biotech 公 司 DUALmembrane pairwise interaction kit PO1501 用 户 手 册 的 方 式 将 把 构 建 好 的 载 体 pBT3-N::PIP1 ； 4， pBT3-STE::PIP1 ； 4， pPR3-N::Hpa1Xoo， pPR3-N::ΔNT 利用 DUALmembrane pairwise interaction kit PO1501 用 户手册的方法转入酵母菌株 NMY51。获得含有以上载体的酵母菌株克隆。
挑 取 以 上 获 得 含 有 重 组 质 粒 的 酵 母 菌 克 隆， 按 照 DUALmembrane pairwise interaction kitPO1501 用户手册上面的方式进行蛋白表达验证。发现获得 bait 和 prey 蛋白。
按照 DUALmembrane pairwise interaction kit PO1501 用户手册上面的方式验 证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作， 发现实验组上出现大量的克隆 ( 如图 4)。说明与 PIP1 ； 4与 Hpa1Xoo 发生互作， 所得载体具有功能。
实施例 5 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作载体的构建
使 用 表 3 中 的 引 物， 按 照 实 施 例 3 的 方 式 将 HpalXoo、 ΔNT、 PIP1 ； 4 连接到 pET-41a(+)、 pPICZ-A、 pPICZα-A 上分别获得 pET-41a(+)::Hpa1Xoo 和 pET-41a(+)::ΔNT， pPICZ-A::PIP1 ； 4 和 pPICZα-A::PIP1 ； 4。
表 3 基因克隆的相关参数和条件
A 该 PCR 产 物 通 过 酶 切 位 点 连 接 至 酵 母 胞 内 表 达 载 体 pPICZ-A 上， 得到 pPICZ-A::PIP1 ； 4， 用于在酵母胞内表达 PIP1 ； 4 蛋白。
B 该 PCR 产物通过酶切位点连接至酵母胞外分泌表达载体 pPICZα-A 上， 得到 pPICZα-A::PIP1 ； 4， 用于胞外泌出表达 PIP1 ； 4 蛋白。
实施例 6 Pull-down assay 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
通 过 热 击 法 将 带 有 目 的 基 因 的 表 达 质 粒 pET-41a(+)::Hpa1Xoo 和 pET-41a(+)::ΔNT 转化至宿主菌 BL21 中 ( 转化方法参见 《分子克隆》 第三版 )。 通过 PCR 扩 增验证阳性克隆后， 按照如下方法对蛋白进行诱导表达。 挑取单菌落接种到含有 1‰卡那霉 素的 LB 液体培养基中， 37℃， 220rpm 振荡过夜培养。 之后以 1％的接菌量转接到含有相同抗 按照终浓度为 1mM( 可 生素的 LB 液体培养基中， 相同条件继续培养至 OD600 值达 0.5 左右， 以调整浓度 ) 加入 IPTG(Isopropyl-D-thiogalactopyranoside)( 生兴 ) 诱导。在蛋白诱 导表达过程中， 大肠杆菌的培养温度、 摇床转速以及诱导时间都可以根据具体情况进行调 整， 一般情况为 37℃， 220rpm， 3h。然后， 6000rpm， 4℃离心 10min 收集菌体， 无菌水重悬洗 涤 2 遍， 用摇菌量 1/20 体积无菌水悬浮菌体， 加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟 (phenylmethyl sulfonyl fluoride， PMSF)( 生兴 ) 至终浓度 1.0mM， 冰浴 10min。然后在冰浴中超声波破 碎细胞。破碎输出功率根据不同情况而定， 破碎周期为破碎 4s， 暂停 3s， 如此反复， 直至菌 液澄清。最后 4℃， 12,000rpm 离心 10min， 保留上清液， 冻存于 -80℃冰箱， 以备后续的蛋白 电泳或生物活性测定。
PIP1 ； 4 蛋 白 的 表 达 使 用 实 施 例 5 构 建 的 真 核 表 达 系 统 (pPICZ-A::PIP1 ； 4 和 pPICZα-A::PIP1 ； 4)，使 用 酵 母 菌 产 生 表 达 蛋 白，方 法 按 照 Invitrogen Corporation(Catalog no.K1740-01) 所示， 获得 PIP1 ； 4 蛋白。
按照王云鹏 (2009 年， 博士论文， 烟草控制表皮毛发育的因子 NtTTG1 和控制营养 生长的因子 NtARP1 对过敏反应与抗病性的调控作用 ) 的方法进行 PIP1 ； 4 蛋白与 Hpa1Xoo 互作的验证， 发现这两个蛋白有互作效应 ( 如图 6)。 “+” 洗脱液中含有这种物质， “-” 代表 不含有这种物质， 条带代表 ： 洗脱液中含有这种物质并可以被 His 抗体检测出， 出现两个条 带代表 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 具有互作效应。将 ΔNT 和 Hpa1Xoo 分别挂柱， 然后使用 PIP1 ； 4 进行洗脱。
实施例七 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 互作载体的构建 N
首先构建 pCAMBIA1301::YFP 和 pCAMBIA1301::YFPC 载体。以 pPLV17 为模板， 扩 N C 增 YFP ( 黄色荧光蛋白氮末端序列 ) 和 YFP ( 黄色荧光蛋白碳末端序列 )， 引物见表 4， 扩 N C 增方法和条件同实施例 1， 将所得的 YFP 和 YFP ， 使用 Xba I 和 Pst I 进行酶切并插入到 pCAMBIA1301 相应的酶切位点获得 pCAMBIA1301::YFPN、 pCAMBIA1301::YFPC。
按照实施例 1 的方式， 使用表 4 中的引物扩增 PIP1 ； 4， ΔNT， Hpa1Xoo， 扩增产物
分 别 使 用 Kpn I 和 BamH I 双 酶 切 后 插 入 到 pCAMBIA1301::YFPN 和 pCAMBIA1301::YFPC 载 体 的 Kpn I 和 BamH I 酶 切 位 点 间，分 别 获 得 pCAMBIA 1301::PIP1 ； 4::YFPN、 pCAMBIA1301::Hpa1Xoo::YFPC 和 pCAMBIA 1301::ΔNT::YFPC 重组载体。最后将构建好的 pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YFPN、 pCAMBIA 1301::Hpa1Xoo::YFPC 和 pCAMBIA 1301::ΔNT::YFPC 载体转入农杆菌 EHA105 菌株内， 于 -80℃冰箱保存， 以备后用。
表 4 基因克隆的相关参数和条件
实施例 8 拟南芥原生质上的 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作
选择 3-4 周拟南芥完全扩展的长势好的叶片， 从叶片的中部把叶片切成宽度为 0.5-1mm， 边缘无碎的叶片细条， 把切好的叶片放在干净的白纸上， 轻轻地用镊子把切好的 叶片放入 Enzyme solution 溶液中， 完全浸入。黑暗中， 真空抽取 30min。继续在 Enzyme solution 中消化， 不要摇动， 常温下， 黑暗中， 至少 3h。 消化 3h 后， 大部分的原生质体被释放 出来。 显微镜下， 观察 Enzyme solution 中释放的原生质体 ； 拟南芥叶肉中原生质体的大小 约为 30-50um。 过滤前， 为了除去没消化的叶片组织用等体积的 W5 solution 稀释含有原生 质体的酶液。 用水洗一个干净的 75-um 的血液尼龙过滤网 ( 过滤网保存于 95％ ethanol)。 然后用 W5 solution 润湿这个过滤网， 过滤包含有原生质体的酶液， 至 30ml 的管中。离心， 100g， 5min。用枪头吸取上清， 然后用 W5solution 轻轻地重悬原生质体团粒。离心， 100g， 5min。用枪头吸取上清， 然后用 W5solution 轻轻地重悬原生质体团粒， 弱光条件下， 置于冰 上， 30min。 冰浴后原生质体已沉淀， 将上清轻轻吸走， 加入适量的 MMG solution， 轻轻悬浮。 将准备好的高质量的质粒加入 2ml 的 Eppendorf 管中， 再加入 200μl 的原生质体， 轻轻地 充分混匀。 加入 220μl PEG-calcium transfection solution( 加之前再次轻晃 Eppendorf 管 )， 轻轻颠倒混匀， 室温下， 培养 15min。加入 800μl W5solution， 轻轻颠倒混匀， 离心， 100g， 5min。吸走上清， 加入 1ml W5solution， 轻轻颠倒混匀， 弱光室温放置过夜。进行原 4与 生质体的荧光观察 ( 如图 8)。绿光代表具有相互作用。从图上可以看出蛋白 PIP1 ； Hpa1Xoo 具有互作效应。
本实施例中部分试剂配方如下 ：
Enzyme solution ： 含有 20mM 2- 吗啉乙磺酸 (pH 5.7)( 生兴 )、 1.5％ (wt/vol) 纤 维素酶 R10( 丁贝生物 )， 0.4％ (wt/vol) 离析酶 R10( )( 丁贝生物 )、 0.4M 甘露醇 ( 丁贝 生物 ) 和 20mMKCl( 丁贝生物 )。55℃， 水浴 10min， 冷却到室温 (25℃ )， 再加入 10mMCaCl2、 1-5mM 巯基乙醇 (optional)( 丁贝生物 ) 和 0.1％ BSA( 丁贝生物 )。是否加 1-5mM 巯基乙 醇应根据实验的需要 ； 加入纤维素酶和离析酶之前， MES 溶液应在 70℃加热 3-5min， 最终的 液体应是澄清的浅棕色 ； 用 0.45um 滤器过滤最终的酶液 ； 每次使用的 Enzyme solution 应 该是新鲜的。
W5 solution ： 含有 2mM 2- 吗啉乙磺酸 (pH 5.7)、 154mMNaCl、 125mMCaCl2 和 5mM KCl。室温保存。
MMG solution ： 含有 4mM 2- 吗啉乙磺酸 (pH 5.7)、 0.4M mannito l 和 15mMMgCl2。 室温保存。
PEG-calcium transfection solution ： 包含 20-40％ (wt/vol)PEG4000( 丁贝生 物 )、 0.2M 甘露醇和 100mM CaCl2( 丁贝生物 )。
实施例 9 拟南芥叶片上的 BiFC 验证 Hpa1Xoo 与 PIP1 ； 4 的互作 N
挑 选 含 有 pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YFP ， pCAMBIA1301::Hpa1Xoo::YFPC 和 pCAMBIA1301::ΔNT::YFPC 载体的农杆菌克隆至 YEB 中， 28℃， 过夜摇菌 ； 4,000×g， 15min， 用 1ml 的 AS 培养液重悬沉淀物， OD600 ＝ 0.7-0.8( 每个叶片大约 1ml) ； 将分别含有载体 N C pCAMBIA1301::PIP1 ； 4::YFP ， pCAMBIA1301::Hpa1Xoo/ΔNT::YFP ， 以 及 P19(Invitrogen 公司 ) 的三个菌株按照 OD 值 1 ∶ 1 ∶ 1 进行混合制备成悬液 ( 每个叶片 3ml)， 放置 2-4h ； 向 拟南芥叶片上洒水， 每个组合使用一颗植株。 每颗植株注射 2 或 3 个叶片。 在拟南芥的叶片 背面注射混合液。 叶的表面都要被注射到。 用 ZEISS LSM700 激光共聚焦显微镜观察拟南芥 叶片的荧光。 互作蛋白产生的的黄色荧光发射波长为 460-490nm， 激发波长为 527nm。 同时， 分别观察了黑白视野下和红光视野下的拟南芥叶片， 红光视野下， 发射波长为 545-580nm， 激发波长为 583-nm。 注射 1-3d 后， 每天都观察， 观察的部位为表皮细胞层的下叶面， 也可以 直接看整个叶片， 荧光一般能保持 6d( 如图 9)。 黄色代表具有相互作用， 否则不具有相互作 用。从图上可以看出蛋白 PIP1 ； 4 与 Hpa1Xoo 具有互作效应。
实施例 10 FM 4-64 产生的荧光与互作蛋白产生荧光的叠加
将实施例 9 中获得的可以发射荧光的拟南芥叶片浸入 FM 4-64 染料 ( 南京丁贝生 物 ) 中， 冰上放置一分钟， 用 ZEISS LSM700 激光共聚焦显微镜观察 FM 4-64 与细胞膜结合 后产生的荧光及其与互作蛋白产生的荧光的叠加。FM 4-64 与膜结合后产生的红色荧光发 射波长为 734nm， 激发波长为 558-nm。互作蛋白产生的的黄色荧光发射波长为 460-490nm， 激发波长为 527nm。同时， 我们也观察了黑白视野下的拟南芥原生质体和叶片的荧光 ( 如 图 10)。桔黄色代表具有相互作用， 否则不具有相互作用。从图上可以看出蛋白 PIP1 ； 4与 Hpa1Xoo 具有互作效应。12102304542 A CN 102304548
序列表1/9 页13102304542 A CN 102304548
序列表2/9 页
14102304542 A CN 102304548序列表3/9 页
15102304542 A CN 102304548序列表4/9 页
16102304542 A CN 102304548序列表5/9 页
17102304542 A CN 102304548序列表6/9 页
18102304542 A CN 102304548序列表7/9 页
19102304542 A CN 102304548序列表8/9 页
20102304542 A CN 102304548序列表9/9 页