WDRPUH表位肽及包含它的疫苗.pdf

WDRPUH 表位肽及包含它的疫苗
    技术领域 本申请要求 2008 年 12 月 5 日提交的美国临时申请 No.61/200,962 和 2009 年 3 月 9 日提交的 61/209,704 的权益， 通过述及将其全部内容收入本文。
     本发明涉及生物科学领域， 更具体的说是癌症治疗领域。 具体而言， 本发明涉及作 为癌症疫苗极其有效的新肽， 及用于治疗和预防肿瘤的药物。
     发明背景
     已经证明， CD8 阳性细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 可识别主要组织相容性复合物 (MHC)I 类分子上出现的肿瘤相关抗原 (TAA) 衍生的表位肽， 然后杀死肿瘤细胞。从 TAA 的 第一个例子——黑素瘤抗原 (MAGE) 家族被发现起， 人们主要通过免疫学手段 (Boon T， Int J Cancer 1993 May 8， 54(2) ： 177-80 ； Boon T&van der Bruggen P， J Exp Med 1996Mar 1， 183(3) ： 725-9) 已经发现了许多其它 TAA。人们正在将这些 TAA 中的一些作为免疫治疗的 靶标进行临床开发。
     能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新 TAA 的鉴定保证了针对各种类型 癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发和临床应用 (Harris CC， J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16， 88(20) ： 1442-55 ； Butterfield LH et al.， Cancer Res 1999Jul 1， 59(13) ： 3134-42 ； Vissers JL et al.， Cancer Res 1999Nov 1， 59(21) ： 5554-9 ； van der Burg SH et al.， J Immunol 1996 May 1， 156(9) ： 3308-14 ； Tanaka F et al.， Cancer Res 1997 Oct 15， 57(20) ： 4465-8 ； Fujie T et al.， Int J Cancer 1999 Jan 18， 80(2) ： 169-72 ； Kikuchi M et al.， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3) ： 459-66 ； Oiso Met al.， Int J Cancer 1999May 5， 81(3) ： 387-94)。到此为止， 已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生 的肽进行临床试验的报告。不幸的是， 迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到较低的客 观应答率 (Belli F et al.， J Clin Oncol 2002Oct 15， 20(20) ： 4169-80 ； Coulie PG et al.， Immunol Rev 2002 Oct， 188 ： 33-42 ； Rosenberg SA et al.， Nat Med 2004Sep， 10(9) ： 909-15)。
     癌细胞增殖和存活不可缺少的 TAA 适合作为免疫疗法的靶标， 因为使用此类 TAA 可使广为记载的癌细胞的免疫逃避的风险最小化， 癌细胞的免疫逃避可归于因治疗驱动的 免疫选择而发生的 TAA 删除、 突变、 或下调。
     通过使用含有 23,040 种基因的全基因组 cDNA 微阵列的基因表达谱分析， WDRPUH 被鉴定为一种在肝细胞癌中上调的新型 WD 重复蛋白 (Silva et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55， WO 2003/104276)。已经报告含有 WD 重复的蛋白在广泛的生理功能中 发挥重要作用， 包括信号转导、 RNA 加工 (Bjorn et al.， Mol Cell Biol.1989 Sep ； 9(9) ： 3698-709)、 细胞骨架的重塑 (Vaisman et al.， Mol Gen Genet.1995 Apr 20 ； 247(2) ： 123-36)、 对囊泡运输的调节 (Pryer et al.， JCell Biol.1993 Feb ； 120(4) ： 865-75)、 和 细胞分裂 (Feldman et al.， Cell.1997 Oct17 ； 91(2) ： 221-30)。Northern 印迹分析显示， WDRPUH 在绝大部分肝细胞癌中以显著高水平过表达， 但是在除睾丸外的正常器官中则不表 达。 此外， 已经显示用 siRNA 遏制 WDRPUH 表达可显著抑制人肝细胞癌细胞系的生长 (Silva
     et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55， WO 2003/104276)。
     引用表
     专利文献
     [PTL 1]WO 2003/104276
     专利文献
     [NPL 1]Boon T， Int J Cancer 1993 May 8， 54(2) ： 177-80
     [NPL 2]Boon T&van der Bruggen P， J Exp Med 1996 Mar 1， 183(3) ： 725-9
     [NPL 3]Harris CC， J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16， 88(20)1442-55
     [NPL 4]Butterfield LH et al.， Cancer Res 1999 Jul 1， 59(13)， 3134-42
     [NPL 5]Vissers JL et al.， Cancer Res 1999 Nov 1， 59(21) ： 5554-9
     [NPL 6]van der Burg SH et al.， J Immunol 1996May 1， 156(9) ： 3308-14
     [NPL 7]Tanaka F et al.， Cancer Res 1997 Oct 15， 57(20) ： 4465-8
     [NPL 8]Fujie T et al.， Int J Cancer 1999 Jan 18， 80(2) ： 169-72
     [NPL 9]Kikuchi M et al.， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3) ： 459-66
     [NPL 10]Oiso M et al.， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3) ： 387-94
     [NPL 11]Belli F et al.， J Clin Oncol 2002 Oct 15， 20(20) ： 4169-80
     [NPL 12]Coulie PG et al.， Immunol Rev 2002 Oct， 188 ： 33-42
     [NPL 13]Rosenberg SA et al.， Nat Med 2004 Sep， 10(9) ： 909-15
     [NPL 14]Silva et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55
     [NPL 15]Bjorn et al.， Mol Cell Biol.1989 Sep ； 9(9) ： 3698-709
     [NPL 16]Vaisman et al.， Mol Gen Genet.1995 Apr 20 ； 247(2) ： 123-36)
     [NPL 17]Pryer et al.， J Cell Biol.1993 Feb ； 120(4) ： 865-75
     [NPL 18]Feldman et al.， Cell.1997 Oct 17 ； 91(2) ： 221-30
     发明概述
     本发明部分基于合适的免疫疗法靶标的发现。由于 TAA 一般被免疫系统察觉为 “自身” 并因此常常没有先天免疫原性， 适宜靶标的发现是极其重要的。如上所述， 在认识到 WDRPUH( 由 GenBank 登录号 NM 145054(SEQ IDNO ： 63) 的基因编码的 SEQ ID NO ： 64) 已经 被鉴定为在肝细胞癌的癌症组织中上调后， WDRPUH 成为免疫疗法的候选靶标。
     本发明至少部分基于 WDRPUH 的基因产物的拥有诱导对 WDRPUH 特异性的 CTL 的能 力的特定表位肽的鉴定。 如下文详细讨论的， 使用 WDRPUH 衍生的 HLA-A*2402 或 HLA-A*0201 结合候选肽刺激从健康供体获得的外周血单个核细胞 (PBMC)。 然后建立了具有针对经每一 种候选肽冲激的 HLA-A24 或 HLA-A2 阳性靶细胞的特异性细胞毒性的的 CTL 系。结果证明， 所述肽是能诱导针对在表面上表达 WDRPUH 的细胞的强而特异性的免疫应答的 HLA-A24 或 HLA-A2 限制表位肽。另外， 它指明， WDRPUH 具有强免疫原性， 而且它的表位是肿瘤免疫疗法 的有效靶标。
     因而， 本发明的一个目的是提供分离的与 HLA 抗原结合的肽， 该肽由 WDRPUH(SEQ ID NO ： 64) 或 WDRPUH 的片段组成。 此类肽预期具有 CTL 诱导能力且可用于离体诱导 CTL 或 用于给受试者施用以诱导抗癌症 ( 诸如肝细胞癌 ) 免疫应答。所述肽可以是九肽或十肽， 优选由选自 SEQ ID NO ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列组成， 并显示强 CTL 诱导能力。
     此外， 本发明涵盖经过修饰的肽， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61， 其中替代、 插入、 删除或添加了一个、 两个或几 个氨基酸， 只要经过修饰的肽保留原始的 CTL 诱导能力。
     本发明的又一个目的是提供分离的编码任何本发明肽的多核苷酸。 这些多核苷酸 可用于诱导具有 CTL 诱导能力的抗原表达细胞 (APC) 或用于给受试者施用以诱导针对本发 明肽， 并因此最终针对癌症的免疫应答。
     当对受试者施用时， 本发明的肽呈递在 APC 的表面上， 然后诱导靶向相应肽的 CTL。因此， 本发明的一个目的是提供含有任何本发明肽或多核苷酸的作用剂， 用于诱导 CTL。这些含有任何本发明肽或多核苷酸的作用剂可用于治疗和 / 或预防癌症， 诸如肝细胞 癌， 和 / 或防止其术后复发。如此， 本发明的又一个目的是提供用于治疗和 / 或预防癌症， 和 / 或防止其术后复发的药剂， 其含有任何本发明肽或多核苷酸。本发明的制剂或药剂也 可含有呈递任何本发明肽的 APC 或外来体作为活性组分， 作为本发明的肽或多核苷酸的替 代或补充。
     本发明的肽或多核苷酸具有诱导 APC 的能力， 所述 APC 在其表面上呈递 HLA 抗原 与本发明肽的复合物。例如， 诱导可通过使受试者衍生的 APC 与本发明的肽接触或向 APC 中导入编码本发明肽的多核苷酸来实现。此类 APC 具有针对靶肽的高 CTL 诱导能力， 而且 可用于癌症免疫疗法。 因此， 本发明的又一个目的是提供用于诱导具有 CTL 诱导能力的 APC 的方法和通过该方法获得的 APC。 本发明的又一个目的是提供用于诱导 CTL 的方法， 该方法包括共培养 CD8 阳性细 胞与在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体的步骤或向 T 细胞中导入多核苷酸的步骤， 该多核苷酸编码与本发明肽结合的 T 细胞受体 (TCR) 亚单位多肽。通过该方法获得的 CTL 可用于治疗和 / 或预防癌症， 诸如肝细胞癌。因此， 本发明的又一个目的是提供通过任何本 发明方法获得的 CTL。
     本发明的另一个目的是提供用于诱导抗癌症免疫应答的方法， 该方法包括施用含 有任何本发明 WDRPUH 多肽、 编码 WDRPUH 多肽的多核苷酸、 呈递 WDRPUH 多肽的外来体或 APC 的制剂的步骤。
     本发明可用于任何涉及 WDRPUH 过表达的疾病， 包括但不限于癌症， 特别是肝细胞 癌。
     要理解， 上面的发明概述和下面的详细描述都是例示性的实施方案， 而非限制本 发明或本发明的其它备选实施方案。
     附图简述
     在考虑本发明的附图简述和后面的详细描述及优选实施方案后， 本发明的各方面 和应用对于熟练技术人员会变得显而易见。
     图 1 包 括 一 系 列 照 片， 描 绘 用 WDRPUH 衍 生 肽 诱 导 的 CTL 的 IFN-γELISPOT 测 定 的 结 果。 用 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1) 刺 激 的 3 号 和 6 号 孔 (a)、用 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 刺激的 8 号孔 (b)、 用 WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3) 刺激的 2 号和 6 号孔 (c)、 用 WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO ： 4) 刺激的 1 号、 2 号和 5 号 孔 (d)、 用 WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 16) 刺激的 2 号、 3 号、 4 号、 6 号、 7 号和 8 号孔
     (e) 及用 WDRPUH-A24-10-40(SEQ ID NO ： 17) 刺激的 5 号、 6 号和 8 号孔 (f) 中的 CTL 分别 显示与对照相比强的 IFN-γ 生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立 CTL 系。在图 中，″ +″指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽冲激过。
     图 2 包 括 一 系 列 线 图，描 绘 用 IFN-γ ELISA 测 定 法 得 到 的 用 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1)(a) 、WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2)(b) 、 WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3)(c) 、WDRPUH-A24-9-339(SEQID NO ： 4)(d) 、 WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 16)(e) 和 WDRPUH-A24-10-40(SEQ ID NO ： 17)(f) 刺激的 CTL 系的 IFN-γ 生成。用每一种肽刺激而建立的 CTL 系都显示了与对照相比强的 IFN-γ 生成。在图中， ″ +″指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽 冲激过。
     图 3 由一幅线图组成， 描绘针对外源表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 的靶细胞的特异 性 CTL 活性。制备只用 HLA-A*2402 或只用全长 WDRPUH 基因转染的 COS7 细胞作为对照。 用 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 建立的 CTL 系显示了针对经 WDRPUH 和 HLA-A*2402 二者转染的 COS7 细胞的特异性 CTL 活性 ( 黑色菱形 )。相反， 没有检测到显著的针对表达 HLA-A*2402( 三角形 ) 或 WDRPUH( 圆形 ) 任一的靶细胞的特异性 CTL 活性。 图 4a-h 包括一系列照片， 描绘用 WDRPUH 衍生肽诱导的 CTL 的 IFN-γELISPOT 测 定 的 结 果。 用 WDRPUH-A2-9-39(SEQ ID NO ： 30) 刺 激 的 2 号 和 7 号 孔 (a)、用 WDRPUH-A2-9-407(SEQ ID NO ： 31) 刺 激 的 2 号 孔 (b)、 用 WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO ： 34) 刺 激 的 3 号 孔 (c)、 用 WDRPUH-A2-9-237(SEQ ID NO ： 36) 刺 激 的 6 号 孔 (d)、 用 WDRPUH-A2-9-543(SEQ ID NO ： 37) 刺激的 4 号孔 (e)、 用 WDRPUH-A2-10-570(SEQ ID NO ： 40) 刺激的 4 号孔 (f)、 用 WDRPUH-A2-10-263(SEQ ID NO ： 41) 刺激的 2 号和 8 号孔 (g)、 用 WDRPUH-A2-10-78(SEQ ID NO ： 45) 刺激的 5 号孔 (h) 中的 CTL 分别显示与对照相比强的 IFN-γ 生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立 CTL 系。在图中， ″ +″指示孔中的 细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽冲激过。
     图 4i-l 包括一系列照片， 描绘用 WDRPUH 衍生肽诱导的 CTL 的 IFN-γELISPOT 测定 的结果。 用 WDRPUH-A2-10-10(SEQ ID NO ： 49) 刺激的 2 号孔 (i)、 用 WDRPUH-A2-10-411(SEQ ID NO ： 55) 刺激的 6 号孔 (j)、 用 WDRPUH-A2-10-287(SEQ ID NO ： 57) 刺激的 7 号孔 (k) 和用 WDRPUH-A2-10-265(SEQ ID NO ： 61) 刺激的 6 号孔 (l) 中的 CTL 分别显示与对照相比 强的 IFN-γ 生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立 CTL 系。在图中， ″ +″指示孔 中的细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽冲激过。
     图 5a 和 b 由线图组成， 描绘用 IFN-γ ELISA 测定法检测到的用 SEQ ID NO ： 30(a) 和 SEQ ID NO ： 34(b) 刺激的 CLT 系的 IFN-γ 生成。用每一种肽刺激而建立的 CTL 系都显 示了与对照相比强的 IFN-γ 生成。在图中，″ + ″指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽冲激过。图 5c 和 5d 描绘从用 SEQ ID NO ： 30(c) 和 SEQ ID NO ： 34(d) 刺激的 CTL 系通过有限稀释而建立的 CTL 克隆的 IFN-γ 生成。此处显示的结果 证明通过用 SEQ ID NO ： 30(c) 和 SEQ ID NO ： 34(d) 刺激而建立的 CTL 克隆显示与对照相比 强的 IFN-γ 生成。在图中，″ +″指示孔中的靶细胞用 SEQ ID NO ： 30(c) 和 SEQ ID NO ： 34(d) 冲激过， 而″ -″指示靶细胞没有用任何肽冲激过。图 5e 由一幅线图组成， 描绘针对 外源表达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 的靶细胞的特异性 CTL 活性。制备只用 HLA-A*0201 或只
     用全长 WDRPUH 基因转染的 COS7 细胞作为对照。用 WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO ： 34) 建立 的 CTL 克隆显示了针对经 WDRPUH 和 HLA-A*0201 二者转染的 COS7 细胞的特异性 CTL 活性 ( 黑色菱形 )。相反， 没有检测到显著的针对表达 HLA-A*0201( 三角形 ) 或 WDRPUH( 圆形 ) 任一的靶细胞的特异性 CTL 活性。
     实施方案的描述
     现在描述优选的方法、 装置、 和材料， 不过在实施或检验本发明的实施方案时可使 用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而， 在描述本发明材料和 方法之前， 要理解本发明不限于特定大小、 性状、 尺度、 材料、 方法、 方案等， 因为它们可依照 例行实验和优化而变化。还要理解， 所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施 方案的目的， 而非意图限制本发明的范围， 本发明的范围只会由所附权利要求来限制。
     通过述及明确将本说明书中提到的每一篇出版物、 专利或专利申请的公开文本完 整收入本文。然而， 本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类 公开文本。
     如果有冲突， 以本说明书 ( 包括定义 ) 为准。此外， 材料、 方法和实例仅为举例说 明而不构成限制。 I. 定义
     如本文中使用的， 词语 “一个 / 种” 、 “该” 、 和 “所述” 意味着 “至少一个 / 种” ， 除非 另有明确说明。
     术语 “多肽” 、 “肽” 和 “蛋白质” 在本文中可互换使用， 指氨基酸残基的聚合物。该 术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在型残基 ( 诸如相 应的天然存在型氨基酸的人工化学模拟物 ) 的氨基酸聚合物， 以及天然存在型氨基酸聚合 物。
     如本文中使用的， 术语 “氨基酸” 指天然存在型和合成型氨基酸， 以及与天然存在 型氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。 天然存在型氨基酸指由遗传密码 编码的氨基酸， 以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸 ( 例如羟脯氨酸、 γ- 羧基谷氨酸、 和 O- 磷酸丝氨酸 )。短语 “氨基酸类似物” 指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学结 构 (α 碳与氢、 羧基、 氨基、 和 R 基团结合 ) 但具有经过修饰的 R 基团或经过修饰的主链的 化合物 ( 例如高丝氨酸、 正亮氨酸、 甲硫氨酸亚砜、 甲硫氨酸甲基锍 )。 短语 “氨基酸模拟物” 指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。
     氨基酸在本文中可以通过它们公知的三字母符号或 IUPAC-IUB 生物化学命名委 员会推荐的单字母符号来指称。
     术语 “多核苷酸” 、 “基因” 、 “核苷酸” 和 “核酸” 在本文中可互换使用， 除非另有明 确说明。
     除非另有定义， 术语 “癌症” 指过表达 WDRPUH 基因的癌症， 其实例包括但不限于肝 细胞癌。
     除非另有定义， 术语 “细胞毒性 T 淋巴细胞” 、 “细胞毒性 T 细胞” 和 “CTL” 在本文 中可互换使用， 而且除非另有明确说明， 指能够识别非自身细胞 ( 例如肿瘤细胞、 病毒感染 的细胞 ) 并诱导此类细胞死亡的 T 淋巴细胞亚群。
     除非另有定义， 术语 “HLA-A2” 包括亚型， 诸如 HLA-A0201 或 HLA-A0206。
     除非另有定义， 本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技 术人员的普遍理解相同的含义。
     II. 肽
     为了证明 WDRPUH 衍生的肽发挥被 CTL 所识别的抗原的功能， 对 WDRPUH(SEQ ID NO ： 64) 衍生的肽进行分析以确定它们是否为 HLA-A24( 它们是常见的 HLA 等位基因 ) 限 制性的抗原表位 (Date Y et al.， Tissue Antigens 47 ： 93-101， 1996 ； Kondo A et al.， J Immunol 155 ： 4307-12， 1995 ； Kubo RT et al.， J Immunol 152 ： 3913-24， 1994)。基于它们 对 HLA-A24 的结合亲和力来鉴定 WDRPUH 衍生的 HLA-A24 结合肽的候选者。下面的肽是候 选肽 ：
     WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1)，
     WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2)，
     WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3)，
     WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO ： 4)，
     WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 16)， 和
     WDRPUH-A24-10-40(SEQ ID NO ： 17)。
     基于它们对 HLA-A02 的结合亲和力来鉴定 WDRPUH 衍生的 HLA-A02 结合肽的候选 者。下面的肽是候选肽 ：
     WDRPUH-A2-9-39(SEQ ID NO ： 30)，
     WDRPUH-A2-9-407(SEQ ID NO ： 31)，
     WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO ： 34)，
     WDRPUH-A2-9-237(SEQ ID NO ： 36)，
     WDRPUH-A2-9-543(SEQ ID NO ： 37)，
     WDRPUH-A2-10-570(SEQ ID NO ： 40)，
     WDRPUH-A2-10-263(SEQ ID NO ： 41)，
     WDRPUH-A2-10-78(SEQ ID NO ： 45)，
     WDRPUH-A2-10-10(SEQ ID NO ： 49)，
     WDRPUH-A2-10-411(SEQ ID NO ： 55)，
     WDRPUH-A2-10-287(SEQ ID NO ： 57)， 和
     WDRPUH-A2-10-265(SEQ ID NO ： 61)。
     这些建立的 CTL 显示针对经相应肽冲激的靶细胞的强且特异性的 CTL 活性。本文 中的这些结果证明 WDRPUH 是被 CTL 识别的抗原， 而且这些肽可能是受 HLA-A24 或 HLA-A02 限制的 WDRPUH 表位肽。
     由于 WDRPUH 基因在诸如肝细胞癌的癌细胞中过表达， 而且在大多数正常器官中 不表达， 它是良好的免疫治疗靶标。因此， 本发明提供与 WDRPUH 的 CTL 识别表位对应的九 肽 ( 由九个氨基酸残基组成的肽 ) 和十肽 ( 由十个氨基酸残基组成的肽 )。本发明的肽的 特别优选例子包括那些由选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列组成的肽。
     一般而言， 可使用当前在互联网上可得的软件程序， 诸如 Parker KC et al.， J Immunol 1994 Jan 1， 152(1) ： 163-75 中记载的软件程序， 在计算机上 (in silico) 计算各种肽与 HLA 抗原之间的结合亲和力。可以如例如 Parker KC et al.， JImmunol 1994 Jan 1， 152(1) ： 163-75 ； 及 Kuzushima K et al.， Blood 2001， 98(6) ： 1872-81 等参考文献中所 述来测量与 HLA 抗原的结合亲和力。 例如 Journal of Immunological Methods， 1995， 185 ： 181-190 ； Protein Science， 2000， 9： 1838-1846 中记载了用于测定结合亲和力的方法。因 此， 能使用此类软件程序来选择对 HLA 抗原具有高结合亲和力的 WDRPUH 片段。如此， 本发 明涵盖由任何自 WDRPUH 衍生的片段组成的肽， 其结合使用此类已知程序鉴定的 HLA 抗原。 另外， 本发明的肽也可由全长 WDRPUH 组成。
     本发明的肽侧翼可以有额外的氨基酸残基， 只要所得的肽保留其 CTL 诱导能力。 本发明肽侧翼的具体氨基酸残基可以由任何种类的氨基酸组成， 只要它们不妨碍原始肽的 CTL 诱导能力。如此， 本发明还提供对 HLA 抗原具有结合亲和力且含有自 WDRPUH 衍生的氨 基酸序列的肽。此类肽通常小于约 40 个氨基酸， 常常小于约 20 个氨基酸， 通常小于约 15 个氨基酸。
     一般而言， 肽中一个、 两个、 或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能， 而且在 有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上， 已知有经过修饰的肽 ( 即由与 原始参照序列相比其中修饰 ( 即替代、 删除、 添加或插入 ) 一个、 两个或数个氨基酸残 基的氨基酸序列构成的肽 ) 保留原始肽的生物学活性 (Mark et al.， Proc Natl Acad Sci USA 1984， 81 ： 5662-6 ； Zoller 和 Smith， Nucleic Acids Res 1982， 10 ： 6487-500 ； Dalbadie-McFarland et al.， Proc Natl Acad Sci USA 1982， 79 ： 6409-13)。 因此， 在一个 实施方案中， 本发明的肽可既具有 CTL 诱导能力， 又具有选自 SEQ ID NO ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列中插入、 删除、 添加和 / 或替代一 个、 两个或甚至更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
     本领域技术人员认可， 改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个 别替代往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。 因此， 它们常常称作 “保守替代” 或 “保 守修饰” ， 其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似功能的修饰蛋白质。 提供功能上 相似的氨基酸的保守替代表是本领域公知的。 期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如 疏水性氨基酸 (A， I， L， M， F， P， W， Y， V)、 亲水性氨基酸 (R， D， N， C， E， Q， G， H， K， S， T)、 和具 有下面的共同官能团或特征的侧链 ： 脂肪族侧链 (G， A， V， L， I， P) ； 含羟基侧链 (S， T， Y) ； 含硫原子侧链 (C， M) ； 含羧酸和酰胺侧链 (D， N， E， Q) ； 含碱侧链 (R， K， H) ； 和含芳香族侧链 (H， F， Y， W)。另外， 下面的八组各自含有本领域公认互为保守替代的氨基酸 ：
     1) 丙氨酸 (A)， 甘氨酸 (G) ；
     2) 天冬氨酸 (D)， 谷氨酸 (E) ；
     3) 天冬酰胺 (N)， 谷氨酰胺 (Q) ；
     4) 精氨酸 (R)， 赖氨酸 (K) ；
     5) 异亮氨酸 (I)， 亮氨酸 (L)， 甲硫氨酸 (M)， 缬氨酸 (V) ；
     6) 苯丙氨酸 (F)， 酪氨酸 (Y)， 色氨酸 (W) ；
     7) 丝氨酸 (S)， 苏氨酸 (T) ； 和
     8) 半胱氨酸 (C)， 甲硫氨酸 (M)( 参见例如 Creighton， Proteins 1984)。
     此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。 然而， 本发明的肽不限于此， 可包括非保守 修饰， 只要经过修饰的肽保留原始肽的 CTL 诱导能力。 另外， 经过修饰的肽不应排除 WDRPUH的多态变体、 种间同源物、 和等位基因中的可诱导 CTL 的肽。
     为了保留必需的 CTL 诱导能力， 可修饰 ( 插入、 删除、 添加和 / 或替代 ) 少量 ( 例 如 1 个、 2 个或数个 ) 或小百分比的氨基酸。在本文中， 术语 “数个” 意味着 5 个或更少的氨 基酸， 例如 4 个、 3 个或更少。要修饰的氨基酸的百分比优选 20％或更少， 更优选 15％或更 少， 甚至更优选 10％或更少、 或者 1 至 5％。
     此外， 可在肽中替代、 插入、 删除和 / 或添加氨基酸残基以产生具有改良的结合亲 和力的修饰肽。当在免疫疗法的语境中使用时， 本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表 面上， 优选作为与 HLA 抗原的复合物。除了天然被展示的肽之外， 由于已经知道通过结合 HLA 抗原而被展示的肽的序列规律 (JImmunol 1994， 152 ： 3913 ； Immunogenetics 1995， 41 ： 178 ； J Immunol 1994， 155 ： 4307)， 可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。例 如， 可以用苯丙氨酸、 酪氨酸、 甲硫氨酸、 或色氨酸替代从 N 端起的第二个氨基酸， 和/或 用苯丙氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 色氨酸、 或甲硫氨酸替代 C 端氨基酸， 以提高 HLA-A24 结 合。如此， 本发明涵盖下述肽， 其具有选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16 和 17 的氨基酸序列， 其 中上述 SEQ ID NO 的氨基酸序列的从 N 端起第二个氨基酸被苯丙氨酸、 酪氨酸、 甲硫氨酸、 或色氨酸， 和肽替代， 和 / 或其中上述 SEQ ID NO 的氨基酸序列的 C 端氨基酸被苯丙氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 色氨酸、 或甲硫氨酸替代。另一方面， 具备高 HLA-A2 结合亲和力的肽从 N 端起的第二个氨基酸被替代为亮氨酸或甲硫氨酸， 及 C 端氨基酸被替代为缬氨酸或亮氨 酸。因此， 本发明涵盖这样的肽， 它们具有 SEQ ID No ： 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列， 其中从 N 端起的第二个氨基酸被替代为亮氨酸或甲硫氨酸， 和/或 其中 C 端氨基酸被替代为缬氨酸或亮氨酸。不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替代， 而且 可以在潜在 T 细胞受体 (TCR) 识别位置处引入替代。数项研究证明了具有氨基酸替代的 肽可等同于或好于原来， 例如 CAP1、 p53(264-272)、 Her-2/neu(369-377) 或 gp100(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57， 4570-4577， 1997， T.K.Hoffmann et al.JImmunol.(2002)Feb 1 ； 168(3) ： 1338-47.， S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52 ： 199-206 及 S.O.Dionne et al.Cancer Immunology， Immunotherapy(2004)53， 307-314)。
     本发明还涵盖向所述的肽的 N 和 / 或 C 端添加一个、 两个或几个氨基酸。本发明 也包括此类具有高 HLA 抗原结合亲和力且保留 CTL 诱导能力的经过修饰的肽。
     然而， 当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同 时， 可能诱导副作用， 诸如自身免疫性病症和 / 或针对特定物质的变应性症状。因此， 优选 的是， 首先利用可得的数据库实施同源性搜索， 以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸 序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比差 1 个或 2 个氨基酸的肽亦 不存在时， 可以修饰目标肽以提高其与 HLA 抗原的结合亲和力， 和 / 或提高其 CTL 诱导能 力， 而没有此类副作用的任何危险。
     虽然预期如上所述对 HLA 抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的， 但还是对以 高结合亲和力的存在作为指标而选出的候选肽进一步检查 CTL 诱导能力的存在。在本文 中， 短语 “CTL 诱导能力” 指肽在抗原呈递细胞 (APC) 上呈递时诱导 CTL 的能力。另外， “CTL 诱导能力” 包括肽诱导 CTL 活化、 CTL 增殖、 促进 CTL 溶解靶细胞、 和提高 CTL IFN-γ 生成 的能力。
     CTL 诱导能力的确认如下来实现， 诱导携带人 MHC 抗原的 APC( 例如 B- 淋巴细胞、巨噬细胞、 和树突细胞 (DC))， 或更具体地， 自人外周血单个核淋巴细胞衍生的 DC， 并在用 肽进行刺激后， 与 CD8 阳性细胞混合， 然后测量由 CTL 针对靶细胞生成和释放的 IFN-γ。 作为反应系统， 可使用已经制成的表达人 HLA 抗原的转基因动物 ( 例如 BenMohamed L， Krishnan R， Longmate J， Auge C， Low L， Primus J， Diamond DJ， Hum Immunol 2000Aug， 61(8) ： 764-79， Related Articles， Books， Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice ： dependence on HLA 51 classII restricted T(H)response 中记载的那些 )。例如， 可以用 Cr 等放射性标记靶 细胞， 并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者， CTL 诱导能力可以如下评 估： 测量在携带固定化肽的 APC 存在下由 CTL 生成和释放的 IFN-γ， 并使用抗 IFN-γ 单克 隆抗体显现培养基上的抑制区。
     作为如上所述地对肽的 CTL 诱导能力进行检验的结果， 发现具有选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的九肽或十肽展 现特别高的 CTL 诱导能力以及对 HLA 抗原的高结合亲和力。因此， 例示这些肽作为本发明 的优选实施方案。
     另外， 同源性分析的结果显示了这些肽与自任何其它已知人基因产物衍生的肽没 有显著同源性。 这意味着由于在免疫疗法中使用本发明的肽而引起未知的或不期望的免疫 应答的可能性较低。 因此， 同样从这个方面来说， 这些肽对于在癌症患者中引发针对 WDRPUH 的免疫力是优选的。 如此， 特别优选的本发明肽包括那些具有选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的肽。
     除上文所述修饰之外， 还可将本发明的肽连接至其它肽， 只要所得的肽保留原 始肽的必需的 CTL 诱导能力。合适肽的例子包括但不限于 ： 本发明的肽或自其它 TAA 衍 生的 CTL 可诱导肽。要置于肽之间的接头是本领域公知的， 而且包括但不限于例如 AAY (P.M.Dafearian et al.， J Trans Med 2007， 5： 26)、 AAA、 NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.， J Immunol.2000， 165 ： 7308-7315) 和 K(S.Ota et al.， Can Res.62， 1471-1476， K.S.Kawamura et al.， J Immunol.2002， 168 ： 5709-5715)。
     另外， 还可将本发明的肽连接至其它物质， 只要所得的肽保留原始肽的必需的 CTL 诱导能力。合适物质的例子包括但不限于 ： 肽、 脂质、 糖和糖链、 乙酰基、 天然的和合成的聚 合物、 等， 前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。肽可含有修饰， 诸如糖基化、 侧链氧 化、 或磷酸化等， 前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋 予额外的功能 ( 例如靶向功能和投递功能 ) 或稳定多肽。例如， 为了提高多肽的体内稳定 性， 本领域已知引入 D- 氨基酸、 氨基酸模拟物或非天然氨基酸 ； 此构思也可适用于本发明 多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如， 可使用肽酶和各种生物学介质 ( 诸如人 血浆和血清 ) 来测试稳定性 ( 参见例如 Verhoef et al.， EurJ Drug Metab Pharmacokin 1986， 11 ： 291-302)。
     如上所述， 有可能筛选或选择通过替代、 插入、 删除和 / 或添加一个、 两个或几个 氨基酸残基进行了修饰， 但仍具有与原始肽相比相同或更高的活性的肽。 如此， 本发明还提 供了用于筛选或选择具有与原始肽相比相同或更高活性的修饰肽的方法。例如， 此类方法 可包括下述步骤 ：
     a： 通过替代、 删除、 插入和 / 或添加来修饰本发明肽中的至少一个氨基酸残基 ；b： 测定修饰肽的活性 ； 并
     c： 选择被测定为具有与原始肽相比相同或更高活性的肽。
     本文中， 步骤 b 中要测定的活性可以是 MHC 结合活性、 APC 或 CTL 诱导能力、 和/或 细胞毒性活性。
     本文中， 本发明的肽也可以称为 “WDRPUH 肽” 或 “WDRPUH 多肽” 。
     III.WDRPUH 肽的制备
     本发明的肽可使用公知技术来制备。例如， 肽可以通过合成、 使用重组 DNA 技术或 化学合成来制备。可个别地合成本发明的肽， 或作为由两个或更多个肽构成的较长多肽来 合成本发明的肽。 然后可以分离， 即纯化所述肽， 使其基本上不含其它天然存在的宿主细胞 蛋白质及其片段或任何其它化学物质。
     可以根据选定的氨基酸序列， 借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的 常规肽合成法的例子包括但不限于 ：
     (i)Peptide Synthesis， Interscience， New York， 1966 ；
     (ii)The Proteins， Vol.2， Academic Press， New York， 1976 ；
     (iii)Peptide Synthesis( 日文 )， Maruzen Co.， 1975 ；
     (iv)Basics 和 Experiment of Peptide Synthesis( 日文 )， Maruzen Co.， 1985 ；
     (v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(in Japanese) ， Vol.14(peptide synthesis)， Hirokawa， 1991 ；
     (vi)WO99/67288 ； 和
     (vii)Barany G.&Merrifield R.B.， Peptides Vol.2，″ Solid Phase Peptide Synthesis″， Academic Press， New York， 1980， 100-118。
     或 者， 可借助任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽 ( 例如 Morrison J， J Bacteriology 1977， 132 ： 349-51 ； Clark-Curtiss&Curtiss， Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983， 101 ： 347-62)。 例如， 首先， 制备包含处于可表达形式 ( 例 如处于相当于启动子序列的调节序列下游 ) 的编码目标肽的多核苷酸的合适载体， 并转移 入合适宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外 生产肽。
     IV. 多核苷酸
     本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。 这些包括由天然存在型 WDRPUH 基因 (GenBank 登录号 NM_145697(SEQ ID NO ： 34)) 衍生的多核苷酸以及具有它们的经过保 守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中， 短语 “经过保守修饰的核苷酸序列” 指编码相 同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性， 对于任何给定蛋白质都有 极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如， 密码子 GCA、 GCC、 GCG、 和 GCU 都编码氨基酸丙 氨酸。 因此， 在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处， 该密码子可改变成任何相应所述密码 子， 而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是 “沉默变异” ， 是保守修饰变异的一种。本文 中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。 本领域普通技术人员 会认识到， 可以修饰核酸中的每一个密码子 (AUG 和 TGG 除外， AUG 在正常情况下是甲硫氨 酸的唯一密码子， 而 TGG 在正常情况下是色氨酸的唯一密码子 ) 以产生功能上相同的分子。 因而， 每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。本发明的多核苷酸可以由 DNA、 RNA、 及其衍生物构成。DNA 由碱基诸如 A、 T、 C、 和 G 合适地构成， 而 T 在 RNA 中被 U 替换。
     本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽， 其中它们之间有或无居间氨基酸序列存 在。例如， 居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点 ( 例如酶识别序 列 )。另外， 多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如， 多 核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸， 或者可以是具有标志基因等 等的表达载体 ( 质粒 )。 一般而言， 此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来 制备， 例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。
     重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如， 可以通过插入在转 染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者， 可借助 PCR 技术或通过在 合适宿主中的表达来扩增多核苷酸 ( 参见例如 Sambrook et al.， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， New York， 1989)。 或者， 可使用固相 技术来合成多核苷酸， 如 Beaucage SL&Iyer RP， Tetrahedron 1992， 48 ： 2223-311 ； Matthes et al.， EMBO J 1984， 3： 801-5 中记载的。
     V. 外来体 (exosomes)
     本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡， 这些外来体在它们的表面上呈递 本发明肽与 HLA 抗原之间形成的复合体。外来体可以通过， 例如在日本专利申请公表公报 平 11-510507 和 WO99/03499 中详细描述的方法来制备， 并可以用从治疗和 / 或预防针对的 患者获得的 APC 制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行预防 接种。
     复合体中包含的 HLA 抗原的类型必须与需要治疗和 / 或预防的受试者的 HLA 抗 原类型匹配。例如， 在日本人中， HLA-A24 和 HLA-A2， 特别是 HLA-A2402 和 HLA-A0201 或 HLA-A0206 是常见的， 因此它们适合于日本人患者的治疗。 使用在日本人和白种人中高表达 的 A24 或 A2 型对获得有效的结果是有利的， 而且亚型如 A2402、 A0201 或 A0206 等也是有用 的。通常， 在临床上， 预先对需要治疗的患者的 HLA 抗原类型进行检查， 这样就能够合适地 选择对特定抗原具有高水平的结合亲和性， 或藉由抗原呈递具有 CTL 诱导能力的肽。而且， 为了获得具备高的结合亲和性和 CTL 诱导能力的肽， 可以在天然存在型 WDRPUH 的部分肽的 氨基酸序列的基础上进行 1 个、 2 个或数个氨基酸的替代、 插入、 删除和 / 或添加。
     当将 A24 型 HLA 抗原用于本发明的外来体时， 可以使用具有选自 SEQ IDNo ： 1， 2， 3， 4， 16 和 17 的序列的肽。或者， 当将 A2 型 HLA 抗原用于本发明的外来体时， 可以使用具有 SEQ ID No ： 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 中任一序列的肽。
     VI. 抗原呈递细胞 (APC)
     本发明还提供在其表面上呈递在 HLA 抗原与本发明肽之间形成的复合物的分离 的 APC。APC 可衍生自要进行治疗和 / 或预防的患者， 而且可作为疫苗以它们自身或与其它 药物 ( 包括本发明的肽、 外来体、 或 CTL) 组合来施用。
     APC 不限于特定种类的细胞， 包括 DC、 Langerhans 细胞、 巨噬细胞、 B 细胞、 和活化 的 T 细胞， 已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原， 从而被淋巴细胞识别。由 于 DC 是 APC 中具有最强 CTL 诱导作用的代表性 APC， DC 可用作本发明的 APC。
     例如， 可通过自外周血单核细胞诱导 DC， 然后在体外、 离体或在体内用本发明的肽接触 ( 刺激 ) 它们来获得本发明的 APC。短语 “诱导 APC” 包括用本发明的肽或编码本发明 肽的核苷酸接触 ( 刺激 ) 细胞， 以在细胞的表面上呈递在 HLA 抗原与本发明肽之间形成的 复合物。 当对受试者施用本发明的肽时， 在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的 APC。 因 此， 可以通过在对受试者施用本发明的肽后自受试者收集 APC 来获得本发明的 APC。或者， 可以通过用本发明的肽接触自受试者收集的 APC 来获得本发明的 APC。
     可以将本发明的 APC 施用于受试者以在受试者中以它们自身或与其它药物 ( 包括 本发明的肽、 外来体或 CTL) 组合来诱导抗癌症免疫应答。例如， 离体施用可包括下述步骤 ：
     a： 自第一受试者收集 APC ；
     b： 用肽接触步骤 a 的 APC ； 并
     c： 对第二受试者施用步骤 b 的加载了所述肽的 APC。
     第一受试者和第二受试者可以是同一个体， 或者可以是不同个体。通过步骤 b 获 得的 APC 可作为疫苗施用来治疗和 / 或预防癌症， 包括肝细胞癌。另外， 本发明提供一种制 备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或工艺， 其中所述方法包括将本发明的肽与 药学可接受的载体混合或配制的步骤。
     依照本发明的一个方面， APC 具有高水平的 CTL 诱导能力。在术语 “高水平的 CTL 诱导能力” 中， 高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导 CTL 的肽接触的 APC 所实现的该 水平而言的。这样的具有高水平 CTL 诱导能力的 APC 可通过上文所述方法以及下述方法来 制备， 该方法包括在体外将含有本发明多核苷酸的基因转移至 APC 的步骤。所导入的基因 可以是 DNA 或 RNA 的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实 施的各种方法， 诸如可使用脂质体转染、 电穿孔、 和磷酸钙法。更具体的说， 可以如 Cancer Res 1996， 56 ： 5672-7 ； J Immunol 1998， 161 ： 5607-13 ； J Exp Med1996， 184 ： 465-72 ； 国际 公开文本 No.2000-509281 的已公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入 APC， 基因 在细胞中经历转录、 翻译、 等等， 然后得到的蛋白质经由呈递途径被 MHC I 类或 II 类加工并 呈递。
     VII. 细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL)
     被诱导的针对任何本发明肽的 CTL 可在体内加强靶向癌细胞的免疫应答， 并且因 此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此， 本发明还提供由任何本发明肽特异性诱导 或活化的、 分离的 CTL。
     此类 CTL 可通过下述步骤来获得 ： (1) 对受试者施用本发明的肽， 从该受试者收集 CTL ； (2) 在体外用本发明的肽接触 ( 刺激 ) 受试者衍生的 APC 和 CD8 阳性细胞、 或外周血 单核白细胞， 然后分离 CTL ； (3) 在体外用在其表面上呈递 HLA 抗原和本发明肽的复合物的 APC 或外来体接触 CD8 阳性细胞或外周血单个核白细胞， 然后分离 CTL ； 或 (4) 向 T 细胞中 导入编码与本发明肽结合的 T 细胞受体 (TCR) 亚单位多肽的基因。APC 或外来体可通过上 文所述方法来制备， 而且方法 (4) 在下文 “VIII.T 细胞受体 (TCR)” 一节下详述。
     可以从要治疗和 / 或预防的患者获得用呈递本发明肽的 APC 的刺激诱导的本发 明 CTL， 而且可以将其单独施用， 或者与其它药物 ( 包括本发明的肽或外来体 ) 组合施用以 调节效果。所得到的 CTL 特异性针对呈递本发明的肽， 例如与用于诱导的肽相同的肽的靶 细胞起作用。靶细胞可以是内源表达 WDRPUH 的细胞， 例如肝细胞癌， 或被 WDRPUH 基因转染 的细胞 ； 而且因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化 CTL 攻击的靶标。 VIII.T 细胞受体 (TCR)
     本发明还提供含有编码能够形成 T 细胞受体 (TCR) 的亚单位的多肽的核酸的组合 物， 及使用该组合物的方法。所述 TCR 亚单位具有形成赋予 T 细胞针对呈递本发明特定肽 的肿瘤细胞的特异性的 TCR 的能力。通过使用本领域已知的方法， 可鉴定出 TCR 的 α 和 β 链 ( 其作为用本发明的一种或多种肽诱导的 CTL 的 TCR 亚单位 ) 的核酸 (WO2007/032255 及 Morgan et al.， J Immunol， 171， 3288(2003))。例如， 优选用 PCR 方法来分析 TCR。用于 分析的 PCR 引物可以是例如但不限于
     作为 5′侧引物的 5′ -R 引物 (5′ -gtctaccaggcattcgcttcat-3′ )(SEQ ID NO ： 65) 和
     对 TCRα 链 C 区特异性的 3-TRa-C 引物 (5′ -tcagctggaccacagccgcagcgt-3′ ) (SEQ ID NO ： 66)，
     对 TCRβ 链 C1 区特异性的 3-TRb-C1 引物 (5 ′ -tcagaaatcctttctcttgac-3 ′ ) (SEQID NO ： 67) 或
     作 为 3 ′ 侧 引 物 的 对 TCRβ 链 C2 区 特 异 性 的 3-TRbeta-C2 引 物 (5′ -ctagcctctggaatcctttctctt-3′ )(SEQ ID NO ： 68)。
     衍生的 TCR 在体内和在体外能以高亲合力结合展示 WDRPUH 肽的靶细胞， 且任选介 导对呈递 WDRPUH 肽的靶细胞的有效杀伤。
     可将编码 TCR 亚单位的核酸掺入合适载体， 例如逆转录病毒载体。这些载体是本 领域公知的。有用的是， 可将核酸或含有它们的载体转移入 T 细胞， 例如来自患者的 T 细 胞。有利的是， 本发明提供一种即配即用型 (off-the-shelf) 组合物， 其容许快速修饰患者 自己的 T 细胞 ( 或其他哺乳动物的 T 细胞 ) 以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特 性的修饰型 T 细胞。
     特异性 TCR 是一种能够特异性识别本发明肽和 HLA 分子的复合物的受体， 当 TCR 在 T 细胞的表面上时， 给予 T 细胞针对靶细胞的特异性活性。对上述复合物的特异性识别 可通过任何已知方法来确认， 而且优选的方法包括但不限于使用 HLA 分子和本发明肽的四 聚物分析， 及 ELISPOT 测定法。通过实施 ELISPOT 测定法， 能确认在细胞表面上表达 TCR 的 T 细胞通过 TCR 来识别细胞， 而且信号在细胞内传输。当上文所述复合物存在于 T 细胞表 面上时， 该复合物可给予 T 细胞以细胞毒性活性的确认也可通过已知方法来进行。一种优 选的方法包括例如测定针对 HLA 阳性靶细胞的细胞毒性活性， 诸如铬释放测定法。还有， 本 发明提供通过用这样的核酸转导而制备的 CTL， 该核酸编码结合 HLA-A2 背景下的 WDRPUH 肽 ( 例如 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16 和 17) 及还有 HLA-A24 背景下的 SEQ ID No ： 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的肽的 TCR 亚单位多肽。经过转导的 CTL 能够在体内归 巢 (homing) 至癌细胞， 而且能在体外通过公知培养方法来扩增 ( 例如 Kawakami et al.， JImmunol.， 142， 3452-3461(1989))。本发明的 CTL 可用于形成在需要治疗或防护的患者中 治疗或预防癌症方面有用的免疫原性组合物 (WO2006/031221)。
     预防和防范包括降低来自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。 预防和防范可 发生于 “一级、 二级和三级预防水平” 。 一级预防和防范避免疾病的发生， 而二级和三级预防 和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病进展和症状出现以及降低已建立的疾病的负面影响
     的活动， 这通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来实现。 或者， 预防和防范包括广泛的预防 疗法， 它们旨在减轻特定病症的严重性， 例如降低肿瘤的增殖和转移、 降低血管发生。
     治疗和 / 或预防癌症， 和 / 或预防其手术后复发包括任何下述步骤， 诸如手术清除 癌细胞、 抑制癌性细胞生长、 肿瘤衰退或消退、 诱导癌症减退和遏制癌症发生、 肿瘤消退、 及 降低或抑制转移。癌症的有效治疗和 / 或预防降低患癌个体的死亡率并改善其预后， 降低 血液中肿瘤标志物的水平， 及减轻伴随癌症的可检测症状。 例如， 症状的减轻或改善构成有 效治疗和 / 或预防， 而且此类症状的减轻或改善包括 10％、 20％、 30％或更多降低， 或维持 病情稳定。
     IX. 药剂或药物组合物
     由于 WDRPUH 表达在肝细胞癌中与正常组织相比特异性升高 ( 上调 )(Silva et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55)， 本发明的肽或多核苷酸可用于治疗和 / 或预防 癌症或肿瘤， 和 / 或预防它们的手术后复发。因此， 本发明提供用于治疗和 / 或预防癌症或 肿瘤， 和 / 或预防它们的手术后复发的药剂， 其包括一种或多种本发明肽或多核苷酸作为 活性组分。或者， 可以在任何上述外来体或细胞诸如 APC 的表面上表达本发明的肽， 以用作 药剂或药物组合物。另外， 上述靶向任何本发明的肽的 CTL 也可用作本发明药剂或药物组 合物的活性组分。
     在另一个实施方案中， 本发明还提供选自下组的活性组分在制备用于治疗或预防 癌症或肿瘤的药物组合物或药剂中的用途 ：
     (a) 本发明的肽，
     (b) 处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，
     (c) 在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体， 和
     (d) 本发明的 CTL。
     或者， 本发明进一步提供用于治疗或预防癌症或肿瘤的选自下组的活性组分 ：
     (a) 本发明的肽，
     (b) 处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，
     (c) 在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体， 和
     (d) 本发明的 CTL。
     或者， 本发明进一步提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物组合物或药 剂的方法或工艺， 其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受载体与选自下组的活性 组分作为活性组分的步骤 ：
     (a) 本发明的肽，
     (b) 处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，
     (c) 在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体， 和
     (d) 本发明的 CTL。
     在另一个实施方案中， 本发明还提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物 组合物或药剂的方法或工艺， 其中该方法或工艺包括混合活性组分与药学或生理学可接受 载体的步骤， 其中所述活性组分选自下组 ：
     (a) 本发明的肽，
     (b) 处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c) 在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体， 和 (d) 本发明的 CTL。 或者， 本发明的药物组合物或药剂可用于防范癌症或肿瘤和 / 或预防其手术后复发。 本发明的药剂或药物组合物可用作疫苗。在本发明的语境中， 短语 “疫苗” ( 也称 作 “免疫原性组合物” ) 指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。
     本发明的药剂或药物组合物可用于在受试者或患者 ( 包括人和任何其它哺乳动 物， 包括但不限于小鼠、 大鼠、 豚鼠、 家兔、 猫、 犬、 绵羊、 山羊、 猪、 牛、 马、 猴、 狒狒、 和黑猩猩， 特别是商业上重要的动物或驯养的动物 ) 中治疗和 / 或预防癌症或肿瘤， 和 / 或预防其手 术后复发。
     依照本发明， 已经发现具有选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的肽是分别能诱导强且特异性免疫应答的 HLA-A24 或 HLA-A2 限制表位肽或候选者。 因此， 包括任何这些具有 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的肽的本发明药剂或药物组合物特别适 合于对其 HLA 抗原为 HLA-A24 或 HLA-A2 的受试者施用。 尤其， 含有具有 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16 和 17 的氨基酸序列的肽的制剂适合于 HLA-A24 类型的受试者施用， 而含有具有 SEQ ID No ： 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的肽的制剂适合于 HLA-A2 类 型的受试者施用。这同样适用于含有编码任何这些肽的多核苷酸 ( 即本发明的多核苷酸 ) 的药剂和组合物。
     要用本发明的药剂或药物组合物治疗的癌症或肿瘤不受限制， 包括其中涉及 WDRPUH 的所有种类的癌症或肿瘤， 例如肝细胞癌。
     除上述活性组分之外， 本发明的药剂或药物组合物还可含有其它具有诱导针对癌 性细胞的 CTL 的能力的肽、 编码所述其它肽的其它多核苷酸、 呈递所述其它肽的其它细胞 等等。在本文中， 其它具有诱导针对癌性细胞的 CTL 的能力的肽以癌症特异性抗原 ( 例如 已鉴定的 TAA) 为例， 但是不限于此。
     如果需要， 本发明的药剂或药物组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性组 分， 只要该物质不抑制活性组分例如任何本发明肽的抗肿瘤效果。 例如， 配制剂可包括抗炎 剂、 镇痛剂、 化疗剂、 诸如此类。 除了在药物自身中包括其它治疗性物质之外， 本发明的药物 还可以与一种或多种其它药理学作用剂顺序或同时施用。 药物和药理学作用剂的量取决于 例如所使用的药理学作用剂的类型、 所治疗的疾病、 及施用的时序安排和路径。
     应当理解， 除在本文中具体提及的组分之外， 本发明的药剂或药物组合物可包括 与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它制剂。
     在本发明的一个实施方案中， 本发明的药剂或药物组合物可包括在制品和试剂盒 中， 该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病 ( 例如癌症 ) 的病理状况的材料。制品 可包括任何本发明药剂的容器及标签。合适的容器包括瓶、 管形瓶、 和试管。容器可以用多 种材料制成， 诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该药剂或组合物用于治疗或预防一种 或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。
     除上文描述的容器之外， 包括本发明药剂或药物组合物的试剂盒还可任选进一步 包括第二容器， 其中装有药学可接受稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的
     其它材料， 包括其它缓冲液、 稀释剂、 滤器、 针头、 注射器、 和载有使用说明的包装插页。
     如果期望的话， 药剂或药物组合物可存在于药包或分配器装置中， 该药包或分配 器装置可装有一个或多个含有活性组分的单位剂型。 例如， 药包可包括金属或塑料箔， 诸如 泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。
     (1) 含有肽作为活性组分的药剂或药物组合物
     本发明的肽可以作为药剂或药物组合物直接施用， 或者如果必要， 通过常规配制 方法来配制。在后一种情况中， 除本发明的肽之外， 还可以视情况包括通常用于药物的载 体、 赋形剂、 等等， 没有特别限制。 此类载体的例子有灭菌水、 生理盐水、 磷酸盐缓冲液、 培养 基、 等等。另外， 药剂或药物组合物可在必要时含有稳定剂、 悬浮液、 防腐剂、 表面活性剂等 等。本发明的药剂或药物组合物可用于抗癌目的。
     本发明的肽可制备成由两种或更多种本发明肽构成的组合以在体内诱导 CTL。肽 组合可采取鸡尾酒的形式， 或者可使用标准技术彼此缀合。 例如， 可以将各个肽化学连接或 表达成为单一融合多肽序列。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的 肽， 肽被 HLA 抗原以高密度展示在 APC 上， 然后诱导出与所展示的肽与 HLA 抗原之间形成的 复合物特异性起反应的 CTL。或者， 可以给受试者施用这样的 APC ： 它们在其细胞表面上展 示任何本发明的肽， 可以通过用本发明的肽刺激来源于受试者的 APC( 如 DC) 而获得 ； 结果 在受试者中诱导 CTL， 从而可提高针对癌细胞的攻击性。
     包括本发明的肽作为活性组分、 用于治疗和 / 或预防癌症或肿瘤的药剂或药物组 合物还可包括已知可有效建立细胞免疫的佐剂。或者， 药剂或药物组合物可以与其它活性 组分一起施用， 或者通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起 ( 或顺序 ) 施用时增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中 记载的那些 (Clin Microbiol Rev1994， 7： 277-89)。 合适佐剂的例子包括但不限于磷酸铝、 氢氧化铝、 明矾、 霍乱毒素、 沙门氏菌毒素、 诸如此类。
     另外， 可方便地使用脂质体配制剂、 其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制 剂、 和其中脂质结合至肽的配制剂。
     在一些实施方案中， 本发明的药剂或药物组合物可进一步包括引发 (prime)CTL 的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的 CTL 的作用剂。例如， 可将棕榈 酸残基连接至赖氨酸残基的 ε- 和 α- 氨基， 然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在 胶束或颗粒中直接施用， 掺入脂质体， 或在佐剂中乳化。作为脂质引发 CTL 应答的另一个 例子， 大肠杆菌 (E.coli) 脂蛋白， 诸如三棕榈酰基 -S- 甘油基半胱氨酰 - 丝氨酰 - 丝氨 酸 (P3CSS)， 当与适宜的肽共价连接时， 可用来引发 CTL( 参见例如 Deres et al.， Nature 1989， 342 ： 561-4)。
     施用的方法可以是口服、 皮内、 皮下、 静脉内注射等等， 及系统施用或局部施用至 靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施， 或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量 可以依据要治疗的疾病、 患者的年龄、 重量、 施用的方法等等恰当加以调整， 通常是 0.001mg 至 1000mg， 例如 0.001mg 至 1000mg， 例如 0.1mg 至 10mg， 而且可以每少数天施用一次至每少 数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。
     (2) 含有多核苷酸作为活性组分的药剂或药物组合物
     本发明的药剂或药物组合物也可含有处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中， 短语 “处于可表达形式的” 意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成 诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中， 感兴趣的多核苷酸的核酸序列包 括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所 需的配置 ( 关于同源重组盒载体的描述参见例如 Thomas KR&Capecchi MR， Cell 1987， 51 ： 503-12)。参见例如 Wolff et al.， Science 1990， 247 ： 1465-8 ； 美国专利 No.5,580,859 ； 5,589,466 ； 5,804,566 ； 5,739,118 ； 5,736,524 ； 5,679,647 ； 及 WO 98/04720。基于 DNA 的 投递技术的例子包括 “裸 DNA” 、 易化 ( 布比卡因、 聚合物、 肽介导的 ) 投递、 阳离子脂质复合 物、 和颗粒介导的 (“基因枪” ) 或压力介导的投递 ( 参见例如美国专利 No.5,922,687)。
     本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主， 诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如牛痘病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。 在导入宿主后， 重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽， 并由此引发免疫应答。 可用于免疫接种 方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利 No.4,722,848。另一种载体是卡介苗 (BCG， Bacille Calmette Guerin)。BCG 载体记载于 Stover et al.， Nature 1991， 351 ： 456-60。 有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的， 例如腺病毒和腺伴随病 毒载体、 逆转录病毒载体、 伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi) 载体、 去毒炭疽毒素载体、 诸 如此类。 参见例如 Shata et al.， Mol Med Today 2000， 6： 66-71 ； Shedlocket al.， J Leukoc Biol 2000， 68 ： 793-806 ； Hipp et al.， In Vivo 2000， 14 ： 571-85。
     将多核苷酸投递入受试者可以是直接的， 其中受试者直接暴露于携带多核苷酸的 载体， 或者是间接的， 其中首先在体外用感兴趣多核苷酸转化细胞， 然后将细胞移植入受试 者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。
     关 于 基 因 疗 法 的 方 法 的 一 般 综 述 参 见 Goldspiel et al.， Clinical Pharmacy1993 ， 12 ： 488-505 ； Wu 和 Wu ， Biotherapy 1991 ， 3： 87-95 ； Tolstoshev ， Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993 ， 33 ： 573-96 ； Mulligan ， Science 1993 ， 260 ： 926-32 ； Morgan&Anderson， Ann Rev Biochem 1993， 62 ： 191-217 ； Trends in Biotechnology 1993， 11(5) ： 155-215。 重组 DNA 技术领域普遍知道的也可用于本发明的方法记载于 eds.Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley&Sons， NY， 1993 ； 及 Krieger， Gene Transfer 和 Expression， ALaboratory Manual， Stockton Press， NY， 1990。
     施用的方法可以是口服、 皮内、 皮下、 静脉内注射等等， 而且可使用系统施用或局 部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施， 或者通过多次施用来强化。可以依 据要治疗的疾病、 患者的年龄、 重量、 施用的方法等等恰当调整合适载体或经编码本发明肽 的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量， 而且通常是 0.001mg 至 1000mg， 例如 0.001mg 至 1000mg， 例如 0.1mg 至 10mg， 而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术 人员能恰当选择合适的剂量。
     X. 使用肽、 外来体、 APC 和 CTL 的方法
     本发明的肽和多核苷酸可用于诱导 APC 和 CTL。本发明的外来体和 APC 也可用于 诱导 CTL。肽、 多核苷酸、 外来体和 APC 可以与任何其它化合物组合使用， 只要该化合物不 抑制它们的 CTL 诱导能力。因此， 任何前文所述的本发明药剂或药物组合物均可用于诱导 CTL， 而且除它们之外， 那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导 APC， 如下文讨论的。
     (1) 诱导抗原呈递细胞 (APC) 的方法本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸来诱导具有高 CTL 诱导能力的 APC 的方 法。本发明的方法包括在体外、 离体或在体内用本发明的肽接触 APC 的步骤。例如， 离体用 肽接触 APC 的方法可包括下述步骤 ：
     a： 自受试者收集 APC ； 并
     b： 用肽接触步骤 a 的 APC。
     APC 不限于特定种类的细胞， 包括 DC、 Langerhans 细胞、 巨噬细胞、 B 细胞、 和活化 的 T 细胞， 已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原， 从而被淋巴细胞识别。优 选地， 由于 DC 是 APC 中具有最强 CTL 诱导能力的， 可使用 DC。任何本发明肽可以以它们自 身或与其它本发明肽组合使用。
     或者， 可如下诱导 APC， 即对受试者施用本发明肽以使肽与 APC 在体内接触， 并因 此在受试者的身体中诱导具有高 CTL 诱导能力的 APC。 如此， 本发明还涵盖为诱导 APC 而对 受试者施用本发明的肽。作为另一种方法， 可以以可表达形式对受试者施用本发明的多核 苷酸以表达本发明的肽， 并在体内使肽与 APC 接触。与使用本发明的肽类似， 在受试者的身 体中诱导具有高 CTL 诱导能力的 APC。 如此， 本发明还涵盖为了诱导 APC 而对受试者施用本 发明的多核苷酸。对于短语 “可表达形式” 的解释， 见 “IX. 药剂 (2) 含有多核苷酸作为活 性组分的药剂” 部分。
     另外， 本发明还涵盖将本发明的多肽导入 APC 以诱导具有 CTL 诱导能力的 APC。 例 如， 所述方法可包括下述步骤 ：
     a： 自受试者收集 APC ； 并
     b： 将编码本发明肽的多核苷酸导入收集的 APC。
     步骤 b 可如上文 “VI. 抗原呈递细胞” 部分中所述来实施。
     (2) 诱导 CTL 的方法
     另外， 本发明提供了使用本发明的肽、 多核苷酸、 或外来体或 APC 来诱导 CTL 的方 法。
     当本发明的肽、 多核苷酸、 APC、 或外来体被施用给受试者后， 受试者的身体中诱导 出 CTL 以增强靶向癌细胞的免疫应答。如此， 本发明的另一个目的是提供用于诱导 CTL 的 方法， 所述方法可包括对受试者施用本发明的肽、 多核苷酸、 APC 或外来体的步骤。
     或者， 也可离体诱导 CTL， 并在诱导后， 可将活化的 CTL 返还受试者。例如， 所述方 法可包括下述步骤 ：
     a： 自受试者收集 APC ；
     b： 用本发明的肽接触步骤 a 的 APC ； 并
     c： 将步骤 b 的 APC 与 CD8 阳性细胞共培养。
     上文步骤 c 中要与 CD8 阳性细胞共培养的 APC 也可通过将编码本发明肽的多核苷 酸转移入 APC 来制备， 如上文 “VI. 抗原呈递细胞” 部分所述 ； 但是不限于此， 而且任何在其 表面上有效呈递 HLA 抗原和本发明肽的复合物的 APC 均可用于本发明的方法。
     此类 APC 也可使用在其表面上呈递 HLA 抗原和本发明肽的复合物的外来体来代 替。即， 本发明用于诱导 CTL 的方法可包括共培养在其表面上呈递 HLA 抗原和本发明肽的 复合物的外来体的步骤。此类外来体可通过上文 “V. 外来体” 部分中描述的方法来制备。
     另外， 可通过将编码与本发明的肽结合的 TCR 亚单位的多核苷酸导入 CD8 阳性细胞来诱导 CTL。此类转导可如上文 “VIII.T 细胞受体 (TCR)” 部分中所述来实施。
     (3) 诱导免疫应答的方法
     本发明进一步提供了用于在受试者中诱导抗癌症免疫应答的方法。 所述方法包括 施用本发明的疫苗， 其包含 ：
     (a) 一种或多种本发明肽， 或其免疫学活性片段 ；
     (b) 一种或多种编码 (a) 的肽或免疫学活性片段的多核苷酸 ；
     (c) 一种或多种分离的本发明 CTL ； 或
     (d) 一种或多种分离的本发明抗原呈递细胞。
     在本发明中， 过表达 WDRPUH 的癌症可用这些活性组分来治疗。因而， 在施用包含 活性组分的疫苗或药物组合物之前， 优选确认要治疗的癌细胞或组织中的 WDRPUH 表达水 平与相同器官的正常细胞相比增强了。 如此， 在一个实施方案中， 本发明提供了用于治疗过 表达 WDRPUH 的癌症的方法， 所述方法可包括下述步骤 ：
     i) 测定自具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中的 WDRPUH 表达水 平；
     ii) 比较 WDRPUH 表达水平与正常对照 ； 并 iii) 对具有与正常对照相比过表达 WDRPUH 的癌症的受试者施用至少一种选自上 文所述 (a) 至 (d) 的成分。
     或者， 本发明还提供了包含至少一种选自上文所述 (a) 至 (d) 的成分的疫苗或药 物组合物， 其用于对具有过表达 WDRPUH 的癌症的受试者施用。换言之， 本发明进一步提供 了用于鉴定要用本发明 WDRPUH 多肽来治疗的受试者的方法， 所述方法可包括测定源自受 试者的癌细胞或组织中的 WDRPUH 表达水平的步骤， 其中该水平与该基因的正常对照水平 相比的升高指示该受试者具有可用本发明 WDRPUH 多肽来治疗的癌症。本发明的治疗癌症 的方法将在下面更加详细的加以叙述。
     需用本方法治疗的患者优选为哺乳动物。 哺乳动物的例子包括但不仅限于， 例如， 人类， 非人灵长类、 小鼠、 大鼠、 犬、 猫、 马以及牛。
     根据本发明， 测定在自受试者获得的癌细胞或组织中 WDRPUH 的表达水平。表达水 平可在转录产物 ( 核酸 ) 水平确定， 使用本领域熟知的方法。举例而言， 可通过杂交方法 ( 例如， Northern 杂交 ) 使用探针来定量 WDRPUH 的 mRNA。可在芯片或阵列上实施所述检 测。对检测 WDRPUH 的表达水平而言， 优选使用阵列。本领域技术人员可利用 WDRPUH 的序 列信息制备上述探针。举例而言， WDRPUH 的 cDNA 可用作探针。如需要， 所述探针可用合适 的标记物来标记， 所述标记物例如染料、 荧光物质和同位素， 且所述基因的表达水平可以作 为发生了杂交的标签的强度检测。
     进一步， WDRPUH 的转录产物 (SEQ ID NO ： 63) 可通过基于扩增的检测方法 ( 例如， RT-PCR) 使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因的可用的序列信息来制备。
     具体而言， 本方法所用的探针或引物在严格条件、 温和条件与低严格条件下与 WDRPUH 的 mRNA 杂交。如本文中所使用的， 短语 “严格 ( 杂交 ) 条件” 是指这样的条件， 在该 条件下， 探针或引物将与其靶序列杂交， 但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的， 在不同的环境下会不同。较长序列与较短序列相比在较高温度观察到特异杂交。一般地， 严格条件的温度应选择比特定序列在限定的离子强度和 pH 下的熔点 (Tm) 低大约 5℃。Tm
     是 ( 在限定的离子强度、 pH 和核酸浓度下 ) 平衡状态下有 50％的与靶序列互补的探针与靶 序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在， 因此在 Tm 下， 平衡时 50％的探针被占据。典 型地， 严格条件是这样的 ： 其中盐浓度小于大约 1.0M 钠离子， 典型地大约 0.01-1.0M 钠离子 ( 或其它盐 )， pH7.0-8.3， 温度对于较短的探针或引物 ( 例如 10-50 个核苷酸 ) 是至少大约 30℃， 用于较长的探针或引物是至少大约 60℃。 严格条件也可以通过添加去稳定剂， 例如甲 酰胺， 来实现。
     或者， 可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如， 可以确定 WDRPUH 蛋白 (SEQ ID NO ： 64) 的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法， 此类方法使用特异 识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且， 抗体的任何片段或修饰 ( 例 如嵌合抗体、 scFv、 Fab、 F(ab’ )2、 Fv 等 ) 均可用于检测， 只要该片段或经修饰抗体保留对 WDRPUH 蛋白的结合能力即可。 制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周 知的， 并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。
     作为另一种基于 WDRPUH 的翻译产物检测其基因的表达水平的方法， 可利用针对 WDRPUH 蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。意即， 观察到强染色表明所 述蛋白质存在量增加， 且同时表明 WDRPUH 基因的高表达水平。
     对于包括 WDRPUH 基因在内的靶基因， 如果其较之相应的靶基因的对照水平增加 了例如 10％， 25％或 50％的话， 或增加到超过 1.1 倍， 超过 1.5 倍， 超过 2.0 倍， 超过 5.0 倍， 超过 10 倍或者更多， 则可以认为其在癌细胞中的表达水平增加了。
     对照水平可以与癌细胞同时确定， 使用先前从疾病状态 ( 患癌或未患癌 ) 已知的 受试者收集和保存的样品。另外， 自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞 可用作正常对照。 或者， 对照水平可以借助统计方法， 根据通过分析先前测定的来自疾病状 态已知的受试者的样品的 WDRPUH 基因表达水平获得的结果加以确定。进一步， 对照水平可 以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。
     而且， 根据本发明的一个方面， 可以将生物样品中 WDRPUH 基因的表达水平与从多 个参考样品确定的多个对照水平比较。 优选地使用从来自与受试者衍生样品组织类型相似 的组织类型的参考样品确定的对照水平。 而且， 优选地， 使用具有已知的疾病状态的群体中 WDRPUH 基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如， 平均 值 +/-2S.D. 或平均值 +/-3S.D. 的范围可以用作标准值。
     在本发明的语境下， 从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作 “正常对照水 平” 。另一方面， 如果对照水平从癌性生物样品确定， 则称作 “癌对照水平” 。
     当 WDRPUH 基因的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似， 则受试者可诊断为具有要治疗的癌症。
     本发明还提供了用于确定能用本发明 WDRPUH 多肽来治疗的患有癌症的受试者的 试剂盒， 其亦可用于评价和 / 或监测癌症疗法功效。优选地， 所述癌症为肝细胞癌。更特别 地， 所述试剂盒优选包含至少一种在受试者衍生癌细胞中检测 WDRPUH 基因表达的试剂， 所 述试剂可选自下组 ：
     (a) 检测 WDRPUH 基因的 mRNA 的试剂 ；
     (b) 检测 WDRPUH 的蛋白质的试剂 ；
     (c) 检测 WDRPUH 的蛋白质的生物学活性的试剂。适于检测 WDRPUH 基因 mRNA 的试剂包括特异性结合或识别 WDRPUHmRNA 的核酸， 诸 如具有与 WDRPUH mRNA 的一部分互补的序列的寡核苷酸。 这类寡核苷酸的例子有对 WDRPUH mRNA 为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸。如果需 要， 检测 WDRPUHmRNA 的试剂可固定化在固体基质上。另外， 在所述试剂盒中可包括多于一 种检测 WDRPUH mRNA 的试剂。
     另一方面， 适于检测 WDRPUH 蛋白质的试剂包括针对 WDRPUH 蛋白质的抗体。 所述抗 体可为单克隆的或多克隆的。进一步， 任何所述抗体的片段或修饰 ( 例如， 嵌合抗体、 scFv、 Fab、 F(ab’ )2、 Fv 等等 ) 均可用作所述试剂， 只要所述片段或经修饰抗体保留与 WDRPUH 蛋 白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的， 且可在本发明中 使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步， 所述抗体可用能产生信号的分子通过直 接连接或简介标记技术进行标记。 标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在 本领域是众所周知的， 且本发明可使用任何标记物与方法。 另外， 在所述试剂盒中可包括多 于一种用于检测 WDRPUH 蛋白质的试剂。
     所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。举例而言， 从患有或没有癌症的受试者 获取的组织样品可用作有用的对照试剂。 本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户 角度而言期望的材料， 包括缓冲液、 稀释液、 滤器、 针头、 注射器和带有使用说明书 ( 例如， 书面的、 磁带、 CD-ROM 等等 ) 的装箱单。这些试剂之类的可标上标签包含在容器中。合适 的容器包括瓶、 管状瓶 (vials) 和试管。所述容器可用多种材料制造， 例如玻璃或塑料。
     作为本发明的一个实施方案， 当所述试剂是针对 WDRPUH mRNA 的探针时， 所述试剂 可固定化于固体基质上， 例如多孔条， 以形成至少一个检测位置。 所述多孔条的测量或检测 区域可包含多个位置， 每个都包含核酸 ( 探针 )。 测试条亦可包含阴性和 / 或阳性对照的位 置。此外， 对照位置可位于与测试条不同的条上。任选地， 不同的检测位置可包含不同量的 固定化核酸， 即， 在第一个检测位置上量较大而在后面的位置上量较小。 在加入测试样品之 后， 显示可检测信号位置的数目提供了在样品中存在的 WDRPUH mRNA 量的定量指征。所述 检测位置可设置成具有任何合适可检测的形状， 通常是横跨测试条宽度的条状或点状。
     本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照样品或 WDRPUH 标准样品。本发明的所 述阳性对照样品可通过收集 WDRPUH 阳性血液样品， 随后分析其 WDRPUH 水平来制备。此外， 可将纯化的 WDRPUH 蛋白或多核苷酸添加到不表达 WDRPUH 的细胞中以形成所述阳性样品， 或 WDRPUH 标准品。在本发明中， 纯化的 WDRPUH 可以是重组蛋白。例如， 阳性对照样品的 WDRPUH 水平大于截留值。
     提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发 明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。 实施例 材料和方法
     细胞系
     A24 淋巴母细胞样细胞系 (A24LCL) 通过借助 Epstein-Bar 病毒转化入 HLA-A24 阳 性人 B 淋巴细胞而建立。T2(HLA-A2)、 COS7、 非洲绿猴肾细胞系均购自 ATCC。
     WDRPUH 衍生的肽的候选者的选择
     使 用 结 合 预 测 软 件 ″ BIMAS ″ (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_ bind) 预 测 了 WDRPUH 衍 生 的 结 合 HLA-A*2402 和 HLA-A*0201 分 子 的 9 聚 物 和 10 聚 物 肽 (Parker et al.(J Immunol 1994， 152(1) ： 163-75)， Kuzushima et al.(Blood 2001， 98(6) ： 1872-81))。由 Sigma( 札幌， 日本 ) 或 Biosynthesis Inc.(Lewisville， TX) 依照 标准固相合成法合成了这些肽， 并通过反相高效液相层析 (HPLC) 进行了纯化。分别通过分 析性 HPLC 和质谱术分析测定了肽的纯度 ( ＞ 90％ ) 和身份。将肽以 20mg/ml 在二甲亚砜 (DMSO) 中溶解， 并保存于 -80℃。
     体外 CTL 诱导
     使用单核细胞衍生树突细胞 (DC) 作为抗原呈递细胞 (APC) 来诱导针对人白细 胞抗原 (HLA) 上呈递的肽的细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 应答。如别处 (Nakahara S et al.， Cancer Res 2003 Jul 15， 63(14) ： 4112-8) 所述在体外生成 DC。具体而言， 将用 Ficoll-Plaque(Pharmacia) 溶液自正常志愿者 (HLA-A*2402 阳性和 HLA-A*0201 阳性 ) 分 离的外周血单个核细胞 (PBMC) 通过粘附至塑料组织培养皿 (Becton Dickinson) 来加以 分离， 以将它们作为单核细胞级分富集。在含有 2％热灭活自体血清 (AS) 的 AIM-V 培养基 (Invitrogen) 中在 1000U/ml 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)(R&D System) 和 1000U/ml 白介素 (IL)-4(R&D System) 存在下培养富集了单核细胞的群体。 培养 7 天后， 将 经细胞因子诱导的 DC 在 AIM-V 培养基中在 3 微克 /mlβ2- 微球蛋白存在下用 20 微克 /ml 每一种合成肽于 37℃冲激 3 小时。所生成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达 DC 相关 分子， 诸如 CD80、 CD83、 CD86 和 HLA II 类 ( 数据未显示 )。
     然 后 将 这 些 经 肽 冲 激 的 DC 用 丝 裂 霉 素 C(MMC)(30 微 克 /ml， 30min) 或 X 辐 照 (20Gy) 灭活， 并以 1 ∶ 20 比例与用 CD8 阳性分离试剂盒 (Dynal) 通过正选择获得的自体 CD8+T 细胞混合。 在 48 孔板 (Corning) 中设立这些培养物 ； 每个孔在 0.5ml AIM-V/2％ AS 培 4 5 养基中含有 1.5x10 个经肽冲激的 DC、 3x10 个 CD8+T 细胞和 10ng/ml IL-7(R&D System)。 3 天后， 给这些培养物补充 IL-2(CHIRON) 至终浓度 20IU/ml。在第 7 天和第 14 天， 将T细 胞用经肽冲激的自体 DC 进一步刺激。每次遵循与上文所述相同的步骤来制备 DC。在第 21 天在第三轮肽刺激后测试针对经肽冲激的 A24LCL 或 T2 细胞的 CTL(Tanaka Het al.， Br J Cancer 2001 Jan 5， 84(1) ： 94-9 ； Umano Y et al.， Br J Cancer 2001 Apr20， 84(8) ： 1052-7 ； Uchida N et al.， Clin Cancer Res 2004 Dec 15， 10(24) ： 8577-86 ； Suda T et al.， Cancer Sci 2006 May， 97(5) ： 411-9 ； Watanabe T et al.， Cancer Sci 2005 Aug， 96(8) ： 498-506)。
     CTL 扩增规程
     使用与 Riddell 等人 (Walter EA et al.， N Engl J Med 1995 Oct 19， 333(16) ： 1038-44 ； Riddell SR et al.， Nat Med 1996 Feb， 2(2) ： 216-23) 记载的方法相似的方法 4 在培养中扩增 CTL。将总共 5x10 个 CTL 在 25ml AIM-V/5 ％ AS 培养基中悬浮， 其中有在 40ng/ml 抗 CD3 单克隆抗体 (Pharmingen) 存在下经丝裂霉素 C 灭活的两种人 B- 淋巴母细 胞样细胞系。启动培养后一天， 向培养物添加 120IU/ml IL-2。在第 5 天、 第 8 天和第 11 天给培养物补加新鲜的含有 30IU/ml IL-2 的 AIM-V/5％ AS 培养基 (Tanaka H et al.， Br J Cancer 2001 Jan 5， 84(1) ： 94-9 ； Umano Y et al.， Br J Cancer 2001 Apr 20， 84(8) ： 1052-7 ； Uchida N et al.， ClinCancer Res 2004 Dec 15， 10(24) ： 8577-86 ； Suda T etal.， Cancer Sci 2006 May， 97(5) ： 411-9 ； Watanabe T et al.， Cancer Sci 2005 Aug， 96(8) ： 498-506)。
     CTL 克隆的建立
     在 96 圆底微量滴定板 (Nalge Nunc International) 中进行稀释以获得 0.3、 1和 3 个 CTL/ 孔。在总体积为 150 微升 / 孔的含 5％ AS 的 AIM-V 培养基中， 将 CTL 与 1x104 个 细胞 / 孔的两种人 B- 淋巴母细胞样细胞系、 30ng/ml 的抗 CD3 抗体， 和 125U/ml 的 IL-2 一 起培养。10 天后向培养基中加入 50 微升 / 孔的 IL-2 以达到终浓度 125U/ml 的 IL-2。在 第 14 天测试 CTL 活性， 并使用如上所述的相同方法扩增 CTL 克隆 (Uchida N et al.， Clin Cancer Res 2004 Dec 15， 10(24) ： 8577-86 ； Suda T et al.， Cancer Sci 2006 May， 97(5) ： 411-9 ； Watanabe T et al.， Cancer Sci2005 Aug， 96(8) ： 498-506)。
     特异性 CTL 活性
     为了检查特异性 CTL 活性， 实施了干扰素 (IFN)-γ 酶联免疫斑点 (ELISPOT) 测定 法和 IFN-γ 酶联免疫吸附测定法 (ELISA)。 具体而言， 制备经肽冲激的 A24LCL(1x104/ 孔 ) 或 T2(1x104/ 孔 ) 作为刺激细胞。使用 48 孔中培养的细胞作为应答细胞。依照制造商推 荐的规程实施 IFN-γELISPOT 测定法和 IFN-γELISA 测定法。
     质粒转染
     通过 PCR 来扩增编码靶基因可读框、 HLA-A24 和 HLA-A*0201 的 cDNA。将 PCR 扩 增的靶基因产物和 HLA-A24 或 HLA-A*0201 克隆入 pIRES 载体 (Clontech Laboratories， Inc.， Cat.No.631605)。 使 用 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 依 照 制 造 商 推 荐 的 规 程 将 质 粒 转 染 入 COS7( 一 种 无 靶 基 因 和 HLA-A24 的 细 胞 系 )。 自 转 染 起 2 天 后， 用 4 Versene(Invitrogen) 收获经转染细胞， 并用作 CTL 活性测定法的靶细胞 (5X10 个细胞 / 孔 )。
     结果
     WDRPUH 衍生的 HLA-A24 和 HLA-A2 结合肽的预测
     表 1 以最高结合亲和力的次序显示 WDRPUH 的 HLA-A24 结合肽。选择并检查了总 共 25 种具有潜在 HLA-A24 结合能力的肽以确定表位肽 ( 表 1)。表 2 以最高结合亲和力的 次序显示 WDRPUH 的 HLA-A2 结合 9 聚物和 10 聚物肽。选择并检查了总共 37 种具有潜在 HLA-A2 结合能力的肽以确定表位肽 ( 表 2)。
     [ 表 1]
     通过 BIMAS 预测的衍生自 WDRPUH 的 HLA-A24 结合性肽
     肽名称 WDRPUH-A24-9 聚物 起始位置 40 314 509 339 氨基酸序列 IYPLGCTVL IYRVSFTDF CYHPEEFQI VFPFGTAEL 26 结合得分 300 120 60 33 SEQ ID NO. 1 2 3 4102307891 A CN 102307898 318 400 118 231 257 99 527 248 WDRPUH-A24-10 聚物 280 77 509 409 40 220 21 531 559 495 339 165 331
     说明书24 24 24 14.4 12 11.52 10.08 10 240 150 86.4 75 75 75 42 30.8 30 17.28 15 10 10 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2524/29 页SFTDFKETL AFAPETGRL AFSPNDLYL KMNPRTKLL RCLKMGGLL KNRELLARL AYWEVFDGT KFSLGVSAI GYKPIKKIQL EYIAsGQVTF CYHPeEFQH MYVInNAHRI IYPLgCTVLI FYLGtTTGDI GFNGhVPTGL VFDGtVIREL HFVTgGNDHL RNQMiLANTL VFPFgTAELF IFSRcRDEMF HFDAvEDIVF起始位置指自 WDRPUH N 端起的氨基酸残基数。 结合得分来自 “BIMAS” [ 表 2] 通过 BIMAS 预测的衍生自 WDRPUH 的 HLA-A2 结合性肽27102307891 A CN 102307898 肽名称 WDPRUH-A2-9 聚物 起始位置 59 499 553 231 39 407 264 193 288 116 237 543 WDPRUH-A2-10 聚物 94 499 570 263 155 498 305 78 610 86 325说明书结合得分 319.939 112.664 85.173 53.999 52.025 42.278 36.316 29.766 23.995 21.362 19.236 11.426 247.167 224.653 94.23 79.041 69.552 57.318 47.991 39.75 31.277 29.098 28.81425/29 页 SEQ ID NO. 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48氨基酸序列 FLQGHGNNV ILANTLFQC ITQEGVHFV KMNPRTKLL MIYPLGCTV RLMYVINNA LLVGSGAGL KIWPTECQT QLQGGITSI ALAFSPNDL KLLTDVGPA SLSGSINGM ILWDyKNREL ILANtLFQCV KVWDyNEGEV GLLVgSGAGL GLNVgNATNV MILAnTLFQC FLVGtEESHI YIASgQVTFM AILRwKYPYT FMGFkADIIL TLIAtCHFDA28102307891 A CN 102307898 10 560 108 374 221 231说明书28.121 27.995 24.075 22.24 19.742 18.837 49 50 51 52 53 5426/29 页QVAEIELDAV FVTGgNDHLV SLHKgKIEAL NMTChGIDFM YLGTtTGDIL KMNPrTKLLT411 51 287 326 437 338 265 117
     VINNaHRIGV AINTkEQNFL IQLQgGITSI LIATcHFDAV GEGEvRVWQI IVFPfGTAEL LVGSgAGLLV LAFSpNDLYL16.258 16.155 15.303 15.136 14.347 11.757 10.346 10.26455 56 57 58 59 60 61 62起始位置指自 WDRPUH N 端起的氨基酸残基数。
     结合得分来自 “BIMAS”
     源自 WDRPUH 的预测的 HLA-A*2402 限制型肽的 CTL 诱导和经 WDRPUH 衍生肽刺激 的 CTL 系的建立
     依照 “材料和方法” 中描述的方案产生了针对那些 WDRPUH 衍生的肽的 CTL。通过 IFN-γELISPOT 测定法来测定肽特异性 CTL 活性 ( 图 1a-f)。显示用 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1) 刺激的 3 号和 6 号孔 (a)、 用 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 刺激的 8 号孔 (b)、 用 WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3) 刺激的 2 号和 6 号孔 (c)、 用 WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO ： 4) 刺激的 1 号、 2 号和 5 号孔 (d)、 用 WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 16) 刺激的 2 号、 3 号、 4 号、 6 号、 7 号和 8 号孔 (e) 及用 WDRPUH-A24-10-40(SEQ ID NO ： 17) 刺激的 5 号、 6 号和 8 号孔 (f) 现出与对照孔相比强的 IFN-γ 生成。
     另外， 将用 SEQ ID NO ： 1 刺激的 6 号阳性孔、 用 SEQ ID NO ： 2 刺激的 8 号阳性孔、 用 SEQ ID NO ： 3 刺激的 2 号阳性孔、 用 SEQ ID NO ： 4 刺激的 5 号阳性孔、 用 SEQ ID NO ： 16 刺激的 4 号阳性孔及用 SEQ ID NO ： 17 刺激的 6 号阳性孔中的细胞扩增并建立为 CTL 系。 通过 IFN-γELISA 测定法测定了这些 CTL 系的 CTL 活性 ( 图 2a-f)。发现与未经肽冲激的靶细胞相比所有 CTL 系针对经相应肽冲激的靶细胞均展现出强的 IFN-γ 生成。另一方面， 用表 1 中显示的其它肽刺激未能建立 CTL 系， 尽管那些肽被预测为具有对 HLA-A*2402 的结 合活性 ( 数据未显示 )。结果， 6 种从 WDRPUH 衍生的肽被筛选为能够诱导强的 CTL 系的肽。
     针对内源表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 的靶细胞的特异性 CTL 活性
     对针对本发明肽产生的建成 CTL 系， 检查它们识别内源表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 分子的靶细胞的能力。 使用用相应肽产生的 CTL 系作为效应细胞测试了针对用全长 WDRPUH 和 HLA-A*2402 分子基因二者转染的 COS7 细胞 ( 外源表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 基因的 靶细胞的一种特异性模型 ) 的特异性 CTL 活性。制备了用全长 WDRPUH 或 HLA-A*2402 基 因转染的 COS7 细胞作为对照。在图 3 中， 经 SEQ ID NO ： 2 刺激的 CTL 针对表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 二者的 COS7 细胞显示出强的 CTL 活性。相反， 没有检测到显著的针对对照的 特异性 CTL 活性。因此， 这些数据清楚地证明 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 天然地与 HLA-A*2402 分子一起被加工和呈递在靶细胞的表面上， 并被 CTL 识别。这些结果指示这种 自 WDRPUH 衍生的肽可能适用于作为癌症疫苗用于具有表达 WDRPUH 的肿瘤的患者。
     源自 WDRPUH 的预测的 HLA-A*0201 限制型肽的 CTL 诱导
     依照 “材料和方法” 中描述的方案产生了识别自 WDRPUH 衍生的肽的 CTL。通过 IFN-γ ELISPOT 测定法来测定肽特异性 CTL 活性 ( 图 4a-4l)。用 WDRPUH-A2-9-39(SEQ ID NO ： 30) 刺 激 的 2 号 和 7 号 孔 (a)、 用 WDRPUH-A2-9-407(SEQ ID NO ： 31) 刺 激 的 2 号 孔 (b)、 用 WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO ： 34) 刺激的 3 号孔 (c)、 用 WDRPUH-A2-9-237(SEQ ID NO ： 36) 刺激的 6 号孔 (d)、 用 WDRPUH-A2-9-543(SEQ ID NO ： 37) 刺激的 4 号孔 (e)、 用 WDRPUH-A2-10-570(SEQ ID NO ： 40) 刺激的 4 号孔 (f)、 用 WDRPUH-A2-10-263(SEQ ID NO ： 41) 刺激的 2 号和 8 号孔 (g)、 用 WDRPUH-A2-10-78(SEQ ID NO ： 45) 刺激的 5 号孔 (h)、 用 WDRPUH-A2-10-10(SEQ ID NO ： 49) 刺 激 的 2 号 孔 (i)、 用 WDRPUH-A2-10-411(SEQ ID NO ： 55) 刺激的 6 号孔 (j)、 用 WDRPUH-A2-10-287(SEQ ID NO ： 57) 刺激的 7 号孔 (k) 及用 WDRPUH-A2-10-265(SEQ ID NO ： 61) 刺激的 6 号孔 (l) 展现出与对照孔相比强的 IFN-γ 生 成。另一方面， 用表 2 中显示的其它肽刺激未能检测到强的 IFN-γ 生成， 尽管这些肽被预 测为具有对 HLA-A*0201 的结合活性 ( 数据未显示 )。
     针对 WDRPUH 特异性肽的 CTL 系和克隆的建立
     对用 SEQ ID NO ： 30 刺激的 7 号孔和用 SEQ ID NO ： 34 刺激的 3 号孔中通过 IFN-γ ELISPOT 测定法显示出肽特异性 CTL 活性的细胞进行扩增并建立为 CTL 系。通过 IFN-γ ELISA 测定法来测定这些 CTL 系的 CTL 活性 ( 表 5a 和 5b)。这两种 CTL 系展现出针对经相 应肽冲激的靶细胞的与未经肽冲激的靶细胞相比强的 IFN-γ 生成。另外， 通过有限稀释自 CTL 系建立了 CTL 克隆， 并通过 IFN-γ ELISA 测定法测定了来自 CTL 克隆的针对经相应肽 冲激的靶细胞的 IFN-γ 生成。在图 5c 和 5d 中展现了来自经 SEQ ID NO ： 30 和 SEQ ID NO ： 34 刺激的 CTL 克隆的强的 IFN-γ 生成。
     针对外源表达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 的靶细胞的特异性 CTL 活性
     对 针 对 本 发 明 肽 产 生 的 建 成 CTL 克 隆， 检 查 它 们 识 别 内 源 表 达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 分子的靶细胞的能力。使用用相应肽产生的 CTL 系作为效应细胞测试了针 对用全长 WDRPUH 和 HLA-A*0201 分子基因二者转染的 COS7 细胞 ( 内源表达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 基因的靶细胞的一种特异性模型 ) 的特异性 CTL 活性。制备了用全长 WDRPUH或 HLA-A*0201 基因转染的 COS7 细胞作为对照。 在图 5e 中， 经 SEQ ID NO ： 34 刺激的 CTL 针 对表达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 二者的 COS7 细胞显示出强的 CTL 活性。相反， 没有检测到显 著的针对对照的特异性 CTL 活性。 这些数据清楚地证明 WDRPUH-A02-9-288(SEQ ID NO ： 34) 的肽与 HLA-A*0201 分子一起被内源加工和呈递在靶细胞的表面上， 并被 CTL 识别。这些结 果指示 WDRPUH-A02-9-288(SEQ ID NO ： 34) 可能适用于作为癌症疫苗用于具有表达 WDRPUH 的肿瘤的患者。
     对抗原肽的同源性分析
     经 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1) 、WDRPUH-A24-9-314(SEQ IDNO ： 2 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 9 - 5 0 9 ( S E Q I D N O ： 3 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 9 - 3 3 9 ( S E Q I D N O ： 4)、 WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 1 6 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 1 0 - 4 0 ( S E Q I D N O ： 17)、 WDRPUH-A02-9-39(SEQ ID NO ： 3 0 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 9 - 4 0 7 ( S E Q I D N O ： 31)、 WDRPUH-A02-9-288(SEQ ID NO ： 3 4 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 9 - 2 3 7 ( S E Q I D N O ： 36)、 WDRPUH-A02-9-543(SEQ ID NO ： 37) 、WDRPUH-A02-10-570(SEQ ID NO ： 40) 、 WDRPUH-A02-10-263(SEQ IDNO ： 4 1 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 1 0 - 7 8 ( S E Q I D N O ： 45)、 WDRPUH-A02-10-10(SEQID NO ： 4 9 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 1 0 - 4 1 1 ( S E Q I D N O ： 55)、 WDRPUH-A02-10-287(SEQ ID NO ： 57) 和 WDRPUH-A02-10-265(SEQ ID NO ： 61) 刺激的 CTL 显 示出显著的且特异性的 CTL 活性。这个结果可能是由于这些肽序列与已知可使人免疫系统 致敏的其它分子的衍生肽同源。
     为了排除这种可能性， 使用 BLAST 算法 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ blast.cgi) 使用这些肽序列作为检索项实施了同源性分析， 没有揭示具有显著同源性的 序列。同源性分析的结果指示 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1)、 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 、WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3) 、WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO ： 4 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 1 0 - 4 0 9 ( S E Q I D N O ： 1 6 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 1 0 - 4 0 ( S E Q I D N O ： 17) 、WDRPUH-A02-9-39(SEQ ID NO ： 30) 、WDRPUH-A02-9-407(SEQ ID NO ： 31) 、 WDRPUH-A02-9-288(SEQ ID NO ： 3 4 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 9 - 2 3 7 ( S E Q I D N O ： 36)、 WDRPUH-A02-9-543(SEQ ID NO ： 3 7 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 1 0 - 5 7 0 ( S E Q I D N O ： 40)、 WDRPUH-A02-10-263(SEQ ID NO ： 41) 、WDRPUH-A02-10-78(SEQ ID NO ： 45) 、 WDRPUH-A02-10-10(SEQ ID NO ： 49) 、WDRPUH-A02-10-411(SEQ ID NO ： 55) 、 WDRPUH-A02-10-287(SEQ ID NO ： 57) 和 WDRPUH-A02-10-265(SEQ ID NO ： 61) 的序列是独 特的， 因此， 就我们所知， 这些分子产生不期望的对某些无关分子的免疫学应答的可能性很 小。
     总之， 鉴定了新型 HLA-A24 和 A2 表位肽， 并证明了它们可应用于癌症免疫疗法。
     工业实用性
     本发明描述了新的 TAA， 特别是那些 WDRPUH 衍生的， 它们诱导强有力且特异性的 抗肿瘤免疫应答， 而且可以应用于癌症类型， 诸如肝细胞癌。此类 TAA 保证了进一步开发肽 疫苗接种策略在癌症中的临床应用。
     本发明涉及生物科学领域， 更具体的说是癌症治疗领域。 具体而言， 本发明涉及作 为癌症疫苗极其有效的新肽， 及用于治疗和预防肿瘤的药物。
     发明背景
     已经证明， CD8 阳性细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 可识别主要组织相容性复合物 (MHC)I 类分子上出现的肿瘤相关抗原 (TAA) 衍生的表位肽， 然后杀死肿瘤细胞。从 TAA 的 第一个例子——黑素瘤抗原 (MAGE) 家族被发现起， 人们主要通过免疫学手段 (Boon T， Int J Cancer 1993 May 8， 54(2) ： 177-80 ； Boon T&van der Bruggen P， J Exp Med 1996Mar 1， 183(3) ： 725-9) 已经发现了许多其它 TAA。人们正在将这些 TAA 中的一些作为免疫治疗的 靶标进行临床开发。
    能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新 TAA 的鉴定保证了针对各种类型 癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发和临床应用 (Harris CC， J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16， 88(20) ： 1442-55 ； Butterfield LH et al.， Cancer Res 1999Jul 1， 59(13) ： 3134-42 ； Vissers JL et al.， Cancer Res 1999Nov 1， 59(21) ： 5554-9 ； van der Burg SH et al.， J Immunol 1996 May 1， 156(9) ： 3308-14 ； Tanaka F et al.， Cancer Res 1997 Oct 15， 57(20) ： 4465-8 ； Fujie T et al.， Int J Cancer 1999 Jan 18， 80(2) ： 169-72 ； Kikuchi M et al.， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3) ： 459-66 ； Oiso Met al.， Int J Cancer 1999May 5， 81(3) ： 387-94)。到此为止， 已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生 的肽进行临床试验的报告。不幸的是， 迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到较低的客 观应答率 (Belli F et al.， J Clin Oncol 2002Oct 15， 20(20) ： 4169-80 ； Coulie PG et al.， Immunol Rev 2002 Oct， 188 ： 33-42 ； Rosenberg SA et al.， Nat Med 2004Sep， 10(9) ： 909-15)。
     癌细胞增殖和存活不可缺少的 TAA 适合作为免疫疗法的靶标， 因为使用此类 TAA 可使广为记载的癌细胞的免疫逃避的风险最小化， 癌细胞的免疫逃避可归于因治疗驱动的 免疫选择而发生的 TAA 删除、 突变、 或下调。
     通过使用含有 23,040 种基因的全基因组 cDNA 微阵列的基因表达谱分析， WDRPUH 被鉴定为一种在肝细胞癌中上调的新型 WD 重复蛋白 (Silva et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55， WO 2003/104276)。已经报告含有 WD 重复的蛋白在广泛的生理功能中 发挥重要作用， 包括信号转导、 RNA 加工 (Bjorn et al.， Mol Cell Biol.1989 Sep ； 9(9) ： 3698-709)、 细胞骨架的重塑 (Vaisman et al.， Mol Gen Genet.1995 Apr 20 ； 247(2) ： 123-36)、 对囊泡运输的调节 (Pryer et al.， JCell Biol.1993 Feb ； 120(4) ： 865-75)、 和 细胞分裂 (Feldman et al.， Cell.1997 Oct17 ； 91(2) ： 221-30)。Northern 印迹分析显示， WDRPUH 在绝大部分肝细胞癌中以显著高水平过表达， 但是在除睾丸外的正常器官中则不表 达。 此外， 已经显示用 siRNA 遏制 WDRPUH 表达可显著抑制人肝细胞癌细胞系的生长 (Silva
     癌细胞增殖和存活不可缺少的 TAA 适合作为免疫疗法的靶标， 因为使用此类 TAA 可使广为记载的癌细胞的免疫逃避的风险最小化， 癌细胞的免疫逃避可归于因治疗驱动的 免疫选择而发生的 TAA 删除、 突变、 或下调。
     通过使用含有 23,040 种基因的全基因组 cDNA 微阵列的基因表达谱分析， WDRPUH 被鉴定为一种在肝细胞癌中上调的新型 WD 重复蛋白 (Silva et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55， WO 2003/104276)。已经报告含有 WD 重复的蛋白在广泛的生理功能中 发挥重要作用， 包括信号转导、 RNA 加工 (Bjorn et al.， Mol Cell Biol.1989 Sep ； 9(9) ： 3698-709)、 细胞骨架的重塑 (Vaisman et al.， Mol Gen Genet.1995 Apr 20 ； 247(2) ： 123-36)、 对囊泡运输的调节 (Pryer et al.， JCell Biol.1993 Feb ； 120(4) ： 865-75)、 和 细胞分裂 (Feldman et al.， Cell.1997 Oct17 ； 91(2) ： 221-30)。Northern 印迹分析显示， WDRPUH 在绝大部分肝细胞癌中以显著高水平过表达， 但是在除睾丸外的正常器官中则不表 达。 此外， 已经显示用 siRNA 遏制 WDRPUH 表达可显著抑制人肝细胞癌细胞系的生长 (Silva
     et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55， WO 2003/104276)。
     引用表
     专利文献
     [PTL 1]WO 2003/104276
     专利文献
     [NPL 1]Boon T， Int J Cancer 1993 May 8， 54(2) ： 177-80
     [NPL 2]Boon T&van der Bruggen P， J Exp Med 1996 Mar 1， 183(3) ： 725-9
     [NPL 3]Harris CC， J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16， 88(20)1442-55
     [NPL 4]Butterfield LH et al.， Cancer Res 1999 Jul 1， 59(13)， 3134-42
     [NPL 5]Vissers JL et al.， Cancer Res 1999 Nov 1， 59(21) ： 5554-9
     [NPL 6]van der Burg SH et al.， J Immunol 1996May 1， 156(9) ： 3308-14
     [NPL 7]Tanaka F et al.， Cancer Res 1997 Oct 15， 57(20) ： 4465-8
     [NPL 8]Fujie T et al.， Int J Cancer 1999 Jan 18， 80(2) ： 169-72
     [NPL 9]Kikuchi M et al.， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3) ： 459-66
     [NPL 10]Oiso M et al.， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3) ： 387-94
     [NPL 11]Belli F et al.， J Clin Oncol 2002 Oct 15， 20(20) ： 4169-80
     [NPL 12]Coulie PG et al.， Immunol Rev 2002 Oct， 188 ： 33-42
     [NPL 13]Rosenberg SA et al.， Nat Med 2004 Sep， 10(9) ： 909-15
     [NPL 14]Silva et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55
     [NPL 15]Bjorn et al.， Mol Cell Biol.1989 Sep ； 9(9) ： 3698-709
     [NPL 16]Vaisman et al.， Mol Gen Genet.1995 Apr 20 ； 247(2) ： 123-36)
     [NPL 17]Pryer et al.， J Cell Biol.1993 Feb ； 120(4) ： 865-75
     [NPL 18]Feldman et al.， Cell.1997 Oct 17 ； 91(2) ： 221-30
     发明概述
     本发明部分基于合适的免疫疗法靶标的发现。由于 TAA 一般被免疫系统察觉为 “自身” 并因此常常没有先天免疫原性， 适宜靶标的发现是极其重要的。如上所述， 在认识到 WDRPUH( 由 GenBank 登录号 NM 145054(SEQ IDNO ： 63) 的基因编码的 SEQ ID NO ： 64) 已经 被鉴定为在肝细胞癌的癌症组织中上调后， WDRPUH 成为免疫疗法的候选靶标。
     本发明至少部分基于 WDRPUH 的基因产物的拥有诱导对 WDRPUH 特异性的 CTL 的能 力的特定表位肽的鉴定。 如下文详细讨论的， 使用 WDRPUH 衍生的 HLA-A*2402 或 HLA-A*0201 结合候选肽刺激从健康供体获得的外周血单个核细胞 (PBMC)。 然后建立了具有针对经每一 种候选肽冲激的 HLA-A24 或 HLA-A2 阳性靶细胞的特异性细胞毒性的的 CTL 系。结果证明， 所述肽是能诱导针对在表面上表达 WDRPUH 的细胞的强而特异性的免疫应答的 HLA-A24 或 HLA-A2 限制表位肽。另外， 它指明， WDRPUH 具有强免疫原性， 而且它的表位是肿瘤免疫疗法 的有效靶标。
     因而， 本发明的一个目的是提供分离的与 HLA 抗原结合的肽， 该肽由 WDRPUH(SEQ ID NO ： 64) 或 WDRPUH 的片段组成。 此类肽预期具有 CTL 诱导能力且可用于离体诱导 CTL 或 用于给受试者施用以诱导抗癌症 ( 诸如肝细胞癌 ) 免疫应答。所述肽可以是九肽或十肽， 优选由选自 SEQ ID NO ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列组成， 并显示强 CTL 诱导能力。
     此外， 本发明涵盖经过修饰的肽， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61， 其中替代、 插入、 删除或添加了一个、 两个或几 个氨基酸， 只要经过修饰的肽保留原始的 CTL 诱导能力。
     本发明的又一个目的是提供分离的编码任何本发明肽的多核苷酸。 这些多核苷酸 可用于诱导具有 CTL 诱导能力的抗原表达细胞 (APC) 或用于给受试者施用以诱导针对本发 明肽， 并因此最终针对癌症的免疫应答。
     当对受试者施用时， 本发明的肽呈递在 APC 的表面上， 然后诱导靶向相应肽的 CTL。因此， 本发明的一个目的是提供含有任何本发明肽或多核苷酸的作用剂， 用于诱导 CTL。这些含有任何本发明肽或多核苷酸的作用剂可用于治疗和 / 或预防癌症， 诸如肝细胞 癌， 和 / 或防止其术后复发。如此， 本发明的又一个目的是提供用于治疗和 / 或预防癌症， 和 / 或防止其术后复发的药剂， 其含有任何本发明肽或多核苷酸。本发明的制剂或药剂也 可含有呈递任何本发明肽的 APC 或外来体作为活性组分， 作为本发明的肽或多核苷酸的替 代或补充。
     本发明的肽或多核苷酸具有诱导 APC 的能力， 所述 APC 在其表面上呈递 HLA 抗原 与本发明肽的复合物。例如， 诱导可通过使受试者衍生的 APC 与本发明的肽接触或向 APC 中导入编码本发明肽的多核苷酸来实现。此类 APC 具有针对靶肽的高 CTL 诱导能力， 而且 可用于癌症免疫疗法。 因此， 本发明的又一个目的是提供用于诱导具有 CTL 诱导能力的 APC 的方法和通过该方法获得的 APC。 本发明的又一个目的是提供用于诱导 CTL 的方法， 该方法包括共培养 CD8 阳性细 胞与在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体的步骤或向 T 细胞中导入多核苷酸的步骤， 该多核苷酸编码与本发明肽结合的 T 细胞受体 (TCR) 亚单位多肽。通过该方法获得的 CTL 可用于治疗和 / 或预防癌症， 诸如肝细胞癌。因此， 本发明的又一个目的是提供通过任何本 发明方法获得的 CTL。
     本发明的另一个目的是提供用于诱导抗癌症免疫应答的方法， 该方法包括施用含 有任何本发明 WDRPUH 多肽、 编码 WDRPUH 多肽的多核苷酸、 呈递 WDRPUH 多肽的外来体或 APC 的制剂的步骤。
     本发明可用于任何涉及 WDRPUH 过表达的疾病， 包括但不限于癌症， 特别是肝细胞 癌。
     要理解， 上面的发明概述和下面的详细描述都是例示性的实施方案， 而非限制本 发明或本发明的其它备选实施方案。
     附图简述
     在考虑本发明的附图简述和后面的详细描述及优选实施方案后， 本发明的各方面 和应用对于熟练技术人员会变得显而易见。
     图 1 包 括 一 系 列 照 片， 描 绘 用 WDRPUH 衍 生 肽 诱 导 的 CTL 的 IFN-γELISPOT 测 定 的 结 果。 用 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1) 刺 激 的 3 号 和 6 号 孔 (a)、用 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 刺激的 8 号孔 (b)、 用 WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3) 刺激的 2 号和 6 号孔 (c)、 用 WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO ： 4) 刺激的 1 号、 2 号和 5 号 孔 (d)、 用 WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 16) 刺激的 2 号、 3 号、 4 号、 6 号、 7 号和 8 号孔
     (e) 及用 WDRPUH-A24-10-40(SEQ ID NO ： 17) 刺激的 5 号、 6 号和 8 号孔 (f) 中的 CTL 分别 显示与对照相比强的 IFN-γ 生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立 CTL 系。在图 中，″ +″指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽冲激过。
     图 2 包 括 一 系 列 线 图，描 绘 用 IFN-γ ELISA 测 定 法 得 到 的 用 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1)(a) 、WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2)(b) 、 WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3)(c) 、WDRPUH-A24-9-339(SEQID NO ： 4)(d) 、 WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 16)(e) 和 WDRPUH-A24-10-40(SEQ ID NO ： 17)(f) 刺激的 CTL 系的 IFN-γ 生成。用每一种肽刺激而建立的 CTL 系都显示了与对照相比强的 IFN-γ 生成。在图中， ″ +″指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽 冲激过。
     图 3 由一幅线图组成， 描绘针对外源表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 的靶细胞的特异 性 CTL 活性。制备只用 HLA-A*2402 或只用全长 WDRPUH 基因转染的 COS7 细胞作为对照。 用 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 建立的 CTL 系显示了针对经 WDRPUH 和 HLA-A*2402 二者转染的 COS7 细胞的特异性 CTL 活性 ( 黑色菱形 )。相反， 没有检测到显著的针对表达 HLA-A*2402( 三角形 ) 或 WDRPUH( 圆形 ) 任一的靶细胞的特异性 CTL 活性。 图 4a-h 包括一系列照片， 描绘用 WDRPUH 衍生肽诱导的 CTL 的 IFN-γELISPOT 测 定 的 结 果。 用 WDRPUH-A2-9-39(SEQ ID NO ： 30) 刺 激 的 2 号 和 7 号 孔 (a)、用 WDRPUH-A2-9-407(SEQ ID NO ： 31) 刺 激 的 2 号 孔 (b)、 用 WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO ： 34) 刺 激 的 3 号 孔 (c)、 用 WDRPUH-A2-9-237(SEQ ID NO ： 36) 刺 激 的 6 号 孔 (d)、 用 WDRPUH-A2-9-543(SEQ ID NO ： 37) 刺激的 4 号孔 (e)、 用 WDRPUH-A2-10-570(SEQ ID NO ： 40) 刺激的 4 号孔 (f)、 用 WDRPUH-A2-10-263(SEQ ID NO ： 41) 刺激的 2 号和 8 号孔 (g)、 用 WDRPUH-A2-10-78(SEQ ID NO ： 45) 刺激的 5 号孔 (h) 中的 CTL 分别显示与对照相比强的 IFN-γ 生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立 CTL 系。在图中， ″ +″指示孔中的 细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽冲激过。
     图 4i-l 包括一系列照片， 描绘用 WDRPUH 衍生肽诱导的 CTL 的 IFN-γELISPOT 测定 的结果。 用 WDRPUH-A2-10-10(SEQ ID NO ： 49) 刺激的 2 号孔 (i)、 用 WDRPUH-A2-10-411(SEQ ID NO ： 55) 刺激的 6 号孔 (j)、 用 WDRPUH-A2-10-287(SEQ ID NO ： 57) 刺激的 7 号孔 (k) 和用 WDRPUH-A2-10-265(SEQ ID NO ： 61) 刺激的 6 号孔 (l) 中的 CTL 分别显示与对照相比 强的 IFN-γ 生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立 CTL 系。在图中， ″ +″指示孔 中的细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽冲激过。
     图 5a 和 b 由线图组成， 描绘用 IFN-γ ELISA 测定法检测到的用 SEQ ID NO ： 30(a) 和 SEQ ID NO ： 34(b) 刺激的 CLT 系的 IFN-γ 生成。用每一种肽刺激而建立的 CTL 系都显 示了与对照相比强的 IFN-γ 生成。在图中，″ + ″指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过， 而″ -″指示细胞没有用任何肽冲激过。图 5c 和 5d 描绘从用 SEQ ID NO ： 30(c) 和 SEQ ID NO ： 34(d) 刺激的 CTL 系通过有限稀释而建立的 CTL 克隆的 IFN-γ 生成。此处显示的结果 证明通过用 SEQ ID NO ： 30(c) 和 SEQ ID NO ： 34(d) 刺激而建立的 CTL 克隆显示与对照相比 强的 IFN-γ 生成。在图中，″ +″指示孔中的靶细胞用 SEQ ID NO ： 30(c) 和 SEQ ID NO ： 34(d) 冲激过， 而″ -″指示靶细胞没有用任何肽冲激过。图 5e 由一幅线图组成， 描绘针对 外源表达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 的靶细胞的特异性 CTL 活性。制备只用 HLA-A*0201 或只
     用全长 WDRPUH 基因转染的 COS7 细胞作为对照。用 WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO ： 34) 建立 的 CTL 克隆显示了针对经 WDRPUH 和 HLA-A*0201 二者转染的 COS7 细胞的特异性 CTL 活性 ( 黑色菱形 )。相反， 没有检测到显著的针对表达 HLA-A*0201( 三角形 ) 或 WDRPUH( 圆形 ) 任一的靶细胞的特异性 CTL 活性。
     实施方案的描述
     现在描述优选的方法、 装置、 和材料， 不过在实施或检验本发明的实施方案时可使 用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而， 在描述本发明材料和 方法之前， 要理解本发明不限于特定大小、 性状、 尺度、 材料、 方法、 方案等， 因为它们可依照 例行实验和优化而变化。还要理解， 所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施 方案的目的， 而非意图限制本发明的范围， 本发明的范围只会由所附权利要求来限制。
     通过述及明确将本说明书中提到的每一篇出版物、 专利或专利申请的公开文本完 整收入本文。然而， 本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类 公开文本。
     如果有冲突， 以本说明书 ( 包括定义 ) 为准。此外， 材料、 方法和实例仅为举例说 明而不构成限制。 I. 定义
     如本文中使用的， 词语 “一个 / 种” 、 “该” 、 和 “所述” 意味着 “至少一个 / 种” ， 除非 另有明确说明。
     术语 “多肽” 、 “肽” 和 “蛋白质” 在本文中可互换使用， 指氨基酸残基的聚合物。该 术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在型残基 ( 诸如相 应的天然存在型氨基酸的人工化学模拟物 ) 的氨基酸聚合物， 以及天然存在型氨基酸聚合 物。
     如本文中使用的， 术语 “氨基酸” 指天然存在型和合成型氨基酸， 以及与天然存在 型氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。 天然存在型氨基酸指由遗传密码 编码的氨基酸， 以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸 ( 例如羟脯氨酸、 γ- 羧基谷氨酸、 和 O- 磷酸丝氨酸 )。短语 “氨基酸类似物” 指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学结 构 (α 碳与氢、 羧基、 氨基、 和 R 基团结合 ) 但具有经过修饰的 R 基团或经过修饰的主链的 化合物 ( 例如高丝氨酸、 正亮氨酸、 甲硫氨酸亚砜、 甲硫氨酸甲基锍 )。 短语 “氨基酸模拟物” 指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。
     氨基酸在本文中可以通过它们公知的三字母符号或 IUPAC-IUB 生物化学命名委 员会推荐的单字母符号来指称。
     术语 “多核苷酸” 、 “基因” 、 “核苷酸” 和 “核酸” 在本文中可互换使用， 除非另有明 确说明。
     除非另有定义， 术语 “癌症” 指过表达 WDRPUH 基因的癌症， 其实例包括但不限于肝 细胞癌。
     除非另有定义， 术语 “细胞毒性 T 淋巴细胞” 、 “细胞毒性 T 细胞” 和 “CTL” 在本文 中可互换使用， 而且除非另有明确说明， 指能够识别非自身细胞 ( 例如肿瘤细胞、 病毒感染 的细胞 ) 并诱导此类细胞死亡的 T 淋巴细胞亚群。
     除非另有定义， 术语 “HLA-A2” 包括亚型， 诸如 HLA-A0201 或 HLA-A0206。
     除非另有定义， 本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技 术人员的普遍理解相同的含义。
     II. 肽
     为了证明 WDRPUH 衍生的肽发挥被 CTL 所识别的抗原的功能， 对 WDRPUH(SEQ ID NO ： 64) 衍生的肽进行分析以确定它们是否为 HLA-A24( 它们是常见的 HLA 等位基因 ) 限 制性的抗原表位 (Date Y et al.， Tissue Antigens 47 ： 93-101， 1996 ； Kondo A et al.， J Immunol 155 ： 4307-12， 1995 ； Kubo RT et al.， J Immunol 152 ： 3913-24， 1994)。基于它们 对 HLA-A24 的结合亲和力来鉴定 WDRPUH 衍生的 HLA-A24 结合肽的候选者。下面的肽是候 选肽 ：
     WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1)，
     WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2)，
     WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3)，
     WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO ： 4)，
     WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 16)， 和
     WDRPUH-A24-10-40(SEQ ID NO ： 17)。
     基于它们对 HLA-A02 的结合亲和力来鉴定 WDRPUH 衍生的 HLA-A02 结合肽的候选 者。下面的肽是候选肽 ：
     WDRPUH-A2-9-39(SEQ ID NO ： 30)，
     WDRPUH-A2-9-407(SEQ ID NO ： 31)，
     WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO ： 34)，
     WDRPUH-A2-9-237(SEQ ID NO ： 36)，
     WDRPUH-A2-9-543(SEQ ID NO ： 37)，
     WDRPUH-A2-10-570(SEQ ID NO ： 40)，
     WDRPUH-A2-10-263(SEQ ID NO ： 41)，
     WDRPUH-A2-10-78(SEQ ID NO ： 45)，
     WDRPUH-A2-10-10(SEQ ID NO ： 49)，
     WDRPUH-A2-10-411(SEQ ID NO ： 55)，
     WDRPUH-A2-10-287(SEQ ID NO ： 57)， 和
     WDRPUH-A2-10-265(SEQ ID NO ： 61)。
     这些建立的 CTL 显示针对经相应肽冲激的靶细胞的强且特异性的 CTL 活性。本文 中的这些结果证明 WDRPUH 是被 CTL 识别的抗原， 而且这些肽可能是受 HLA-A24 或 HLA-A02 限制的 WDRPUH 表位肽。
     由于 WDRPUH 基因在诸如肝细胞癌的癌细胞中过表达， 而且在大多数正常器官中 不表达， 它是良好的免疫治疗靶标。因此， 本发明提供与 WDRPUH 的 CTL 识别表位对应的九 肽 ( 由九个氨基酸残基组成的肽 ) 和十肽 ( 由十个氨基酸残基组成的肽 )。本发明的肽的 特别优选例子包括那些由选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列组成的肽。
     一般而言， 可使用当前在互联网上可得的软件程序， 诸如 Parker KC et al.， J Immunol 1994 Jan 1， 152(1) ： 163-75 中记载的软件程序， 在计算机上 (in silico) 计算各种肽与 HLA 抗原之间的结合亲和力。可以如例如 Parker KC et al.， JImmunol 1994 Jan 1， 152(1) ： 163-75 ； 及 Kuzushima K et al.， Blood 2001， 98(6) ： 1872-81 等参考文献中所 述来测量与 HLA 抗原的结合亲和力。 例如 Journal of Immunological Methods， 1995， 185 ： 181-190 ； Protein Science， 2000， 9： 1838-1846 中记载了用于测定结合亲和力的方法。因 此， 能使用此类软件程序来选择对 HLA 抗原具有高结合亲和力的 WDRPUH 片段。如此， 本发 明涵盖由任何自 WDRPUH 衍生的片段组成的肽， 其结合使用此类已知程序鉴定的 HLA 抗原。 另外， 本发明的肽也可由全长 WDRPUH 组成。
     本发明的肽侧翼可以有额外的氨基酸残基， 只要所得的肽保留其 CTL 诱导能力。 本发明肽侧翼的具体氨基酸残基可以由任何种类的氨基酸组成， 只要它们不妨碍原始肽的 CTL 诱导能力。如此， 本发明还提供对 HLA 抗原具有结合亲和力且含有自 WDRPUH 衍生的氨 基酸序列的肽。此类肽通常小于约 40 个氨基酸， 常常小于约 20 个氨基酸， 通常小于约 15 个氨基酸。
     一般而言， 肽中一个、 两个、 或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能， 而且在 有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上， 已知有经过修饰的肽 ( 即由与 原始参照序列相比其中修饰 ( 即替代、 删除、 添加或插入 ) 一个、 两个或数个氨基酸残 基的氨基酸序列构成的肽 ) 保留原始肽的生物学活性 (Mark et al.， Proc Natl Acad Sci USA 1984， 81 ： 5662-6 ； Zoller 和 Smith， Nucleic Acids Res 1982， 10 ： 6487-500 ； Dalbadie-McFarland et al.， Proc Natl Acad Sci USA 1982， 79 ： 6409-13)。 因此， 在一个 实施方案中， 本发明的肽可既具有 CTL 诱导能力， 又具有选自 SEQ ID NO ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列中插入、 删除、 添加和 / 或替代一 个、 两个或甚至更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。
     本领域技术人员认可， 改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个 别替代往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。 因此， 它们常常称作 “保守替代” 或 “保 守修饰” ， 其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似功能的修饰蛋白质。 提供功能上 相似的氨基酸的保守替代表是本领域公知的。 期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如 疏水性氨基酸 (A， I， L， M， F， P， W， Y， V)、 亲水性氨基酸 (R， D， N， C， E， Q， G， H， K， S， T)、 和具 有下面的共同官能团或特征的侧链 ： 脂肪族侧链 (G， A， V， L， I， P) ； 含羟基侧链 (S， T， Y) ； 含硫原子侧链 (C， M) ； 含羧酸和酰胺侧链 (D， N， E， Q) ； 含碱侧链 (R， K， H) ； 和含芳香族侧链 (H， F， Y， W)。另外， 下面的八组各自含有本领域公认互为保守替代的氨基酸 ：
     1) 丙氨酸 (A)， 甘氨酸 (G) ；
     2) 天冬氨酸 (D)， 谷氨酸 (E) ；
     3) 天冬酰胺 (N)， 谷氨酰胺 (Q) ；
     4) 精氨酸 (R)， 赖氨酸 (K) ；
     5) 异亮氨酸 (I)， 亮氨酸 (L)， 甲硫氨酸 (M)， 缬氨酸 (V) ；
     6) 苯丙氨酸 (F)， 酪氨酸 (Y)， 色氨酸 (W) ；
     7) 丝氨酸 (S)， 苏氨酸 (T) ； 和
     8) 半胱氨酸 (C)， 甲硫氨酸 (M)( 参见例如 Creighton， Proteins 1984)。
     此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。 然而， 本发明的肽不限于此， 可包括非保守 修饰， 只要经过修饰的肽保留原始肽的 CTL 诱导能力。 另外， 经过修饰的肽不应排除 WDRPUH的多态变体、 种间同源物、 和等位基因中的可诱导 CTL 的肽。
     为了保留必需的 CTL 诱导能力， 可修饰 ( 插入、 删除、 添加和 / 或替代 ) 少量 ( 例 如 1 个、 2 个或数个 ) 或小百分比的氨基酸。在本文中， 术语 “数个” 意味着 5 个或更少的氨 基酸， 例如 4 个、 3 个或更少。要修饰的氨基酸的百分比优选 20％或更少， 更优选 15％或更 少， 甚至更优选 10％或更少、 或者 1 至 5％。
     此外， 可在肽中替代、 插入、 删除和 / 或添加氨基酸残基以产生具有改良的结合亲 和力的修饰肽。当在免疫疗法的语境中使用时， 本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表 面上， 优选作为与 HLA 抗原的复合物。除了天然被展示的肽之外， 由于已经知道通过结合 HLA 抗原而被展示的肽的序列规律 (JImmunol 1994， 152 ： 3913 ； Immunogenetics 1995， 41 ： 178 ； J Immunol 1994， 155 ： 4307)， 可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。例 如， 可以用苯丙氨酸、 酪氨酸、 甲硫氨酸、 或色氨酸替代从 N 端起的第二个氨基酸， 和/或 用苯丙氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 色氨酸、 或甲硫氨酸替代 C 端氨基酸， 以提高 HLA-A24 结 合。如此， 本发明涵盖下述肽， 其具有选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16 和 17 的氨基酸序列， 其 中上述 SEQ ID NO 的氨基酸序列的从 N 端起第二个氨基酸被苯丙氨酸、 酪氨酸、 甲硫氨酸、 或色氨酸， 和肽替代， 和 / 或其中上述 SEQ ID NO 的氨基酸序列的 C 端氨基酸被苯丙氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 色氨酸、 或甲硫氨酸替代。另一方面， 具备高 HLA-A2 结合亲和力的肽从 N 端起的第二个氨基酸被替代为亮氨酸或甲硫氨酸， 及 C 端氨基酸被替代为缬氨酸或亮氨 酸。因此， 本发明涵盖这样的肽， 它们具有 SEQ ID No ： 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列， 其中从 N 端起的第二个氨基酸被替代为亮氨酸或甲硫氨酸， 和/或 其中 C 端氨基酸被替代为缬氨酸或亮氨酸。不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替代， 而且 可以在潜在 T 细胞受体 (TCR) 识别位置处引入替代。数项研究证明了具有氨基酸替代的 肽可等同于或好于原来， 例如 CAP1、 p53(264-272)、 Her-2/neu(369-377) 或 gp100(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57， 4570-4577， 1997， T.K.Hoffmann et al.JImmunol.(2002)Feb 1 ； 168(3) ： 1338-47.， S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52 ： 199-206 及 S.O.Dionne et al.Cancer Immunology， Immunotherapy(2004)53， 307-314)。
     本发明还涵盖向所述的肽的 N 和 / 或 C 端添加一个、 两个或几个氨基酸。本发明 也包括此类具有高 HLA 抗原结合亲和力且保留 CTL 诱导能力的经过修饰的肽。
     然而， 当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同 时， 可能诱导副作用， 诸如自身免疫性病症和 / 或针对特定物质的变应性症状。因此， 优选 的是， 首先利用可得的数据库实施同源性搜索， 以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸 序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比差 1 个或 2 个氨基酸的肽亦 不存在时， 可以修饰目标肽以提高其与 HLA 抗原的结合亲和力， 和 / 或提高其 CTL 诱导能 力， 而没有此类副作用的任何危险。
     虽然预期如上所述对 HLA 抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的， 但还是对以 高结合亲和力的存在作为指标而选出的候选肽进一步检查 CTL 诱导能力的存在。在本文 中， 短语 “CTL 诱导能力” 指肽在抗原呈递细胞 (APC) 上呈递时诱导 CTL 的能力。另外， “CTL 诱导能力” 包括肽诱导 CTL 活化、 CTL 增殖、 促进 CTL 溶解靶细胞、 和提高 CTL IFN-γ 生成 的能力。
     CTL 诱导能力的确认如下来实现， 诱导携带人 MHC 抗原的 APC( 例如 B- 淋巴细胞、巨噬细胞、 和树突细胞 (DC))， 或更具体地， 自人外周血单个核淋巴细胞衍生的 DC， 并在用 肽进行刺激后， 与 CD8 阳性细胞混合， 然后测量由 CTL 针对靶细胞生成和释放的 IFN-γ。 作为反应系统， 可使用已经制成的表达人 HLA 抗原的转基因动物 ( 例如 BenMohamed L， Krishnan R， Longmate J， Auge C， Low L， Primus J， Diamond DJ， Hum Immunol 2000Aug， 61(8) ： 764-79， Related Articles， Books， Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice ： dependence on HLA 51 classII restricted T(H)response 中记载的那些 )。例如， 可以用 Cr 等放射性标记靶 细胞， 并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者， CTL 诱导能力可以如下评 估： 测量在携带固定化肽的 APC 存在下由 CTL 生成和释放的 IFN-γ， 并使用抗 IFN-γ 单克 隆抗体显现培养基上的抑制区。
     作为如上所述地对肽的 CTL 诱导能力进行检验的结果， 发现具有选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的九肽或十肽展 现特别高的 CTL 诱导能力以及对 HLA 抗原的高结合亲和力。因此， 例示这些肽作为本发明 的优选实施方案。
     另外， 同源性分析的结果显示了这些肽与自任何其它已知人基因产物衍生的肽没 有显著同源性。 这意味着由于在免疫疗法中使用本发明的肽而引起未知的或不期望的免疫 应答的可能性较低。 因此， 同样从这个方面来说， 这些肽对于在癌症患者中引发针对 WDRPUH 的免疫力是优选的。 如此， 特别优选的本发明肽包括那些具有选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的肽。
     除上文所述修饰之外， 还可将本发明的肽连接至其它肽， 只要所得的肽保留原 始肽的必需的 CTL 诱导能力。合适肽的例子包括但不限于 ： 本发明的肽或自其它 TAA 衍 生的 CTL 可诱导肽。要置于肽之间的接头是本领域公知的， 而且包括但不限于例如 AAY (P.M.Dafearian et al.， J Trans Med 2007， 5： 26)、 AAA、 NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.， J Immunol.2000， 165 ： 7308-7315) 和 K(S.Ota et al.， Can Res.62， 1471-1476， K.S.Kawamura et al.， J Immunol.2002， 168 ： 5709-5715)。
     另外， 还可将本发明的肽连接至其它物质， 只要所得的肽保留原始肽的必需的 CTL 诱导能力。合适物质的例子包括但不限于 ： 肽、 脂质、 糖和糖链、 乙酰基、 天然的和合成的聚 合物、 等， 前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。肽可含有修饰， 诸如糖基化、 侧链氧 化、 或磷酸化等， 前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋 予额外的功能 ( 例如靶向功能和投递功能 ) 或稳定多肽。例如， 为了提高多肽的体内稳定 性， 本领域已知引入 D- 氨基酸、 氨基酸模拟物或非天然氨基酸 ； 此构思也可适用于本发明 多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如， 可使用肽酶和各种生物学介质 ( 诸如人 血浆和血清 ) 来测试稳定性 ( 参见例如 Verhoef et al.， EurJ Drug Metab Pharmacokin 1986， 11 ： 291-302)。
     如上所述， 有可能筛选或选择通过替代、 插入、 删除和 / 或添加一个、 两个或几个 氨基酸残基进行了修饰， 但仍具有与原始肽相比相同或更高的活性的肽。 如此， 本发明还提 供了用于筛选或选择具有与原始肽相比相同或更高活性的修饰肽的方法。例如， 此类方法 可包括下述步骤 ：
     a： 通过替代、 删除、 插入和 / 或添加来修饰本发明肽中的至少一个氨基酸残基 ；b： 测定修饰肽的活性 ； 并
     c： 选择被测定为具有与原始肽相比相同或更高活性的肽。
     本文中， 步骤 b 中要测定的活性可以是 MHC 结合活性、 APC 或 CTL 诱导能力、 和/或 细胞毒性活性。
     本文中， 本发明的肽也可以称为 “WDRPUH 肽” 或 “WDRPUH 多肽” 。
     III.WDRPUH 肽的制备
     本发明的肽可使用公知技术来制备。例如， 肽可以通过合成、 使用重组 DNA 技术或 化学合成来制备。可个别地合成本发明的肽， 或作为由两个或更多个肽构成的较长多肽来 合成本发明的肽。 然后可以分离， 即纯化所述肽， 使其基本上不含其它天然存在的宿主细胞 蛋白质及其片段或任何其它化学物质。
     可以根据选定的氨基酸序列， 借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的 常规肽合成法的例子包括但不限于 ：
     (i)Peptide Synthesis， Interscience， New York， 1966 ；
     (ii)The Proteins， Vol.2， Academic Press， New York， 1976 ；
     (iii)Peptide Synthesis( 日文 )， Maruzen Co.， 1975 ；
     (iv)Basics 和 Experiment of Peptide Synthesis( 日文 )， Maruzen Co.， 1985 ；
     (v)Development of Pharmaceuticals(second volume)(in Japanese) ， Vol.14(peptide synthesis)， Hirokawa， 1991 ；
     (vi)WO99/67288 ； 和
     (vii)Barany G.&Merrifield R.B.， Peptides Vol.2，″ Solid Phase Peptide Synthesis″， Academic Press， New York， 1980， 100-118。
     或 者， 可借助任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽 ( 例如 Morrison J， J Bacteriology 1977， 132 ： 349-51 ； Clark-Curtiss&Curtiss， Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983， 101 ： 347-62)。 例如， 首先， 制备包含处于可表达形式 ( 例 如处于相当于启动子序列的调节序列下游 ) 的编码目标肽的多核苷酸的合适载体， 并转移 入合适宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外 生产肽。
     IV. 多核苷酸
     本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。 这些包括由天然存在型 WDRPUH 基因 (GenBank 登录号 NM_145697(SEQ ID NO ： 34)) 衍生的多核苷酸以及具有它们的经过保 守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中， 短语 “经过保守修饰的核苷酸序列” 指编码相 同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性， 对于任何给定蛋白质都有 极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如， 密码子 GCA、 GCC、 GCG、 和 GCU 都编码氨基酸丙 氨酸。 因此， 在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处， 该密码子可改变成任何相应所述密码 子， 而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是 “沉默变异” ， 是保守修饰变异的一种。本文 中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。 本领域普通技术人员 会认识到， 可以修饰核酸中的每一个密码子 (AUG 和 TGG 除外， AUG 在正常情况下是甲硫氨 酸的唯一密码子， 而 TGG 在正常情况下是色氨酸的唯一密码子 ) 以产生功能上相同的分子。 因而， 每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。本发明的多核苷酸可以由 DNA、 RNA、 及其衍生物构成。DNA 由碱基诸如 A、 T、 C、 和 G 合适地构成， 而 T 在 RNA 中被 U 替换。
     本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽， 其中它们之间有或无居间氨基酸序列存 在。例如， 居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点 ( 例如酶识别序 列 )。另外， 多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如， 多 核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸， 或者可以是具有标志基因等 等的表达载体 ( 质粒 )。 一般而言， 此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来 制备， 例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。
     重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如， 可以通过插入在转 染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者， 可借助 PCR 技术或通过在 合适宿主中的表达来扩增多核苷酸 ( 参见例如 Sambrook et al.， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory， New York， 1989)。 或者， 可使用固相 技术来合成多核苷酸， 如 Beaucage SL&Iyer RP， Tetrahedron 1992， 48 ： 2223-311 ； Matthes et al.， EMBO J 1984， 3： 801-5 中记载的。
     V. 外来体 (exosomes)
     本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡， 这些外来体在它们的表面上呈递 本发明肽与 HLA 抗原之间形成的复合体。外来体可以通过， 例如在日本专利申请公表公报 平 11-510507 和 WO99/03499 中详细描述的方法来制备， 并可以用从治疗和 / 或预防针对的 患者获得的 APC 制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行预防 接种。
     复合体中包含的 HLA 抗原的类型必须与需要治疗和 / 或预防的受试者的 HLA 抗 原类型匹配。例如， 在日本人中， HLA-A24 和 HLA-A2， 特别是 HLA-A2402 和 HLA-A0201 或 HLA-A0206 是常见的， 因此它们适合于日本人患者的治疗。 使用在日本人和白种人中高表达 的 A24 或 A2 型对获得有效的结果是有利的， 而且亚型如 A2402、 A0201 或 A0206 等也是有用 的。通常， 在临床上， 预先对需要治疗的患者的 HLA 抗原类型进行检查， 这样就能够合适地 选择对特定抗原具有高水平的结合亲和性， 或藉由抗原呈递具有 CTL 诱导能力的肽。而且， 为了获得具备高的结合亲和性和 CTL 诱导能力的肽， 可以在天然存在型 WDRPUH 的部分肽的 氨基酸序列的基础上进行 1 个、 2 个或数个氨基酸的替代、 插入、 删除和 / 或添加。
     当将 A24 型 HLA 抗原用于本发明的外来体时， 可以使用具有选自 SEQ IDNo ： 1， 2， 3， 4， 16 和 17 的序列的肽。或者， 当将 A2 型 HLA 抗原用于本发明的外来体时， 可以使用具有 SEQ ID No ： 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 中任一序列的肽。
     VI. 抗原呈递细胞 (APC)
     本发明还提供在其表面上呈递在 HLA 抗原与本发明肽之间形成的复合物的分离 的 APC。APC 可衍生自要进行治疗和 / 或预防的患者， 而且可作为疫苗以它们自身或与其它 药物 ( 包括本发明的肽、 外来体、 或 CTL) 组合来施用。
     APC 不限于特定种类的细胞， 包括 DC、 Langerhans 细胞、 巨噬细胞、 B 细胞、 和活化 的 T 细胞， 已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原， 从而被淋巴细胞识别。由 于 DC 是 APC 中具有最强 CTL 诱导作用的代表性 APC， DC 可用作本发明的 APC。
     例如， 可通过自外周血单核细胞诱导 DC， 然后在体外、 离体或在体内用本发明的肽接触 ( 刺激 ) 它们来获得本发明的 APC。短语 “诱导 APC” 包括用本发明的肽或编码本发明 肽的核苷酸接触 ( 刺激 ) 细胞， 以在细胞的表面上呈递在 HLA 抗原与本发明肽之间形成的 复合物。 当对受试者施用本发明的肽时， 在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的 APC。 因 此， 可以通过在对受试者施用本发明的肽后自受试者收集 APC 来获得本发明的 APC。或者， 可以通过用本发明的肽接触自受试者收集的 APC 来获得本发明的 APC。
     可以将本发明的 APC 施用于受试者以在受试者中以它们自身或与其它药物 ( 包括 本发明的肽、 外来体或 CTL) 组合来诱导抗癌症免疫应答。例如， 离体施用可包括下述步骤 ：
     a： 自第一受试者收集 APC ；
     b： 用肽接触步骤 a 的 APC ； 并
     c： 对第二受试者施用步骤 b 的加载了所述肽的 APC。
     第一受试者和第二受试者可以是同一个体， 或者可以是不同个体。通过步骤 b 获 得的 APC 可作为疫苗施用来治疗和 / 或预防癌症， 包括肝细胞癌。另外， 本发明提供一种制 备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或工艺， 其中所述方法包括将本发明的肽与 药学可接受的载体混合或配制的步骤。
     依照本发明的一个方面， APC 具有高水平的 CTL 诱导能力。在术语 “高水平的 CTL 诱导能力” 中， 高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导 CTL 的肽接触的 APC 所实现的该 水平而言的。这样的具有高水平 CTL 诱导能力的 APC 可通过上文所述方法以及下述方法来 制备， 该方法包括在体外将含有本发明多核苷酸的基因转移至 APC 的步骤。所导入的基因 可以是 DNA 或 RNA 的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实 施的各种方法， 诸如可使用脂质体转染、 电穿孔、 和磷酸钙法。更具体的说， 可以如 Cancer Res 1996， 56 ： 5672-7 ； J Immunol 1998， 161 ： 5607-13 ； J Exp Med1996， 184 ： 465-72 ； 国际 公开文本 No.2000-509281 的已公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入 APC， 基因 在细胞中经历转录、 翻译、 等等， 然后得到的蛋白质经由呈递途径被 MHC I 类或 II 类加工并 呈递。
     VII. 细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL)
     被诱导的针对任何本发明肽的 CTL 可在体内加强靶向癌细胞的免疫应答， 并且因 此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此， 本发明还提供由任何本发明肽特异性诱导 或活化的、 分离的 CTL。
     此类 CTL 可通过下述步骤来获得 ： (1) 对受试者施用本发明的肽， 从该受试者收集 CTL ； (2) 在体外用本发明的肽接触 ( 刺激 ) 受试者衍生的 APC 和 CD8 阳性细胞、 或外周血 单核白细胞， 然后分离 CTL ； (3) 在体外用在其表面上呈递 HLA 抗原和本发明肽的复合物的 APC 或外来体接触 CD8 阳性细胞或外周血单个核白细胞， 然后分离 CTL ； 或 (4) 向 T 细胞中 导入编码与本发明肽结合的 T 细胞受体 (TCR) 亚单位多肽的基因。APC 或外来体可通过上 文所述方法来制备， 而且方法 (4) 在下文 “VIII.T 细胞受体 (TCR)” 一节下详述。
     可以从要治疗和 / 或预防的患者获得用呈递本发明肽的 APC 的刺激诱导的本发 明 CTL， 而且可以将其单独施用， 或者与其它药物 ( 包括本发明的肽或外来体 ) 组合施用以 调节效果。所得到的 CTL 特异性针对呈递本发明的肽， 例如与用于诱导的肽相同的肽的靶 细胞起作用。靶细胞可以是内源表达 WDRPUH 的细胞， 例如肝细胞癌， 或被 WDRPUH 基因转染 的细胞 ； 而且因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化 CTL 攻击的靶标。 VIII.T 细胞受体 (TCR)
     本发明还提供含有编码能够形成 T 细胞受体 (TCR) 的亚单位的多肽的核酸的组合 物， 及使用该组合物的方法。所述 TCR 亚单位具有形成赋予 T 细胞针对呈递本发明特定肽 的肿瘤细胞的特异性的 TCR 的能力。通过使用本领域已知的方法， 可鉴定出 TCR 的 α 和 β 链 ( 其作为用本发明的一种或多种肽诱导的 CTL 的 TCR 亚单位 ) 的核酸 (WO2007/032255 及 Morgan et al.， J Immunol， 171， 3288(2003))。例如， 优选用 PCR 方法来分析 TCR。用于 分析的 PCR 引物可以是例如但不限于
     作为 5′侧引物的 5′ -R 引物 (5′ -gtctaccaggcattcgcttcat-3′ )(SEQ ID NO ： 65) 和
     对 TCRα 链 C 区特异性的 3-TRa-C 引物 (5′ -tcagctggaccacagccgcagcgt-3′ ) (SEQ ID NO ： 66)，
     对 TCRβ 链 C1 区特异性的 3-TRb-C1 引物 (5 ′ -tcagaaatcctttctcttgac-3 ′ ) (SEQID NO ： 67) 或
     作 为 3 ′ 侧 引 物 的 对 TCRβ 链 C2 区 特 异 性 的 3-TRbeta-C2 引 物 (5′ -ctagcctctggaatcctttctctt-3′ )(SEQ ID NO ： 68)。
    衍生的 TCR 在体内和在体外能以高亲合力结合展示 WDRPUH 肽的靶细胞， 且任选介 导对呈递 WDRPUH 肽的靶细胞的有效杀伤。
     可将编码 TCR 亚单位的核酸掺入合适载体， 例如逆转录病毒载体。这些载体是本 领域公知的。有用的是， 可将核酸或含有它们的载体转移入 T 细胞， 例如来自患者的 T 细 胞。有利的是， 本发明提供一种即配即用型 (off-the-shelf) 组合物， 其容许快速修饰患者 自己的 T 细胞 ( 或其他哺乳动物的 T 细胞 ) 以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特 性的修饰型 T 细胞。
     特异性 TCR 是一种能够特异性识别本发明肽和 HLA 分子的复合物的受体， 当 TCR 在 T 细胞的表面上时， 给予 T 细胞针对靶细胞的特异性活性。对上述复合物的特异性识别 可通过任何已知方法来确认， 而且优选的方法包括但不限于使用 HLA 分子和本发明肽的四 聚物分析， 及 ELISPOT 测定法。通过实施 ELISPOT 测定法， 能确认在细胞表面上表达 TCR 的 T 细胞通过 TCR 来识别细胞， 而且信号在细胞内传输。当上文所述复合物存在于 T 细胞表 面上时， 该复合物可给予 T 细胞以细胞毒性活性的确认也可通过已知方法来进行。一种优 选的方法包括例如测定针对 HLA 阳性靶细胞的细胞毒性活性， 诸如铬释放测定法。还有， 本 发明提供通过用这样的核酸转导而制备的 CTL， 该核酸编码结合 HLA-A2 背景下的 WDRPUH 肽 ( 例如 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16 和 17) 及还有 HLA-A24 背景下的 SEQ ID No ： 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的肽的 TCR 亚单位多肽。经过转导的 CTL 能够在体内归 巢 (homing) 至癌细胞， 而且能在体外通过公知培养方法来扩增 ( 例如 Kawakami et al.， JImmunol.， 142， 3452-3461(1989))。本发明的 CTL 可用于形成在需要治疗或防护的患者中 治疗或预防癌症方面有用的免疫原性组合物 (WO2006/031221)。
     预防和防范包括降低来自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。 预防和防范可 发生于 “一级、 二级和三级预防水平” 。 一级预防和防范避免疾病的发生， 而二级和三级预防 和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病进展和症状出现以及降低已建立的疾病的负面影响
     的活动， 这通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来实现。 或者， 预防和防范包括广泛的预防 疗法， 它们旨在减轻特定病症的严重性， 例如降低肿瘤的增殖和转移、 降低血管发生。
     治疗和 / 或预防癌症， 和 / 或预防其手术后复发包括任何下述步骤， 诸如手术清除 癌细胞、 抑制癌性细胞生长、 肿瘤衰退或消退、 诱导癌症减退和遏制癌症发生、 肿瘤消退、 及 降低或抑制转移。癌症的有效治疗和 / 或预防降低患癌个体的死亡率并改善其预后， 降低 血液中肿瘤标志物的水平， 及减轻伴随癌症的可检测症状。 例如， 症状的减轻或改善构成有 效治疗和 / 或预防， 而且此类症状的减轻或改善包括 10％、 20％、 30％或更多降低， 或维持 病情稳定。
     IX. 药剂或药物组合物
     由于 WDRPUH 表达在肝细胞癌中与正常组织相比特异性升高 ( 上调 )(Silva et al.， Neoplasia 2005 Apr ； 7(4) ： 348-55)， 本发明的肽或多核苷酸可用于治疗和 / 或预防 癌症或肿瘤， 和 / 或预防它们的手术后复发。因此， 本发明提供用于治疗和 / 或预防癌症或 肿瘤， 和 / 或预防它们的手术后复发的药剂， 其包括一种或多种本发明肽或多核苷酸作为 活性组分。或者， 可以在任何上述外来体或细胞诸如 APC 的表面上表达本发明的肽， 以用作 药剂或药物组合物。另外， 上述靶向任何本发明的肽的 CTL 也可用作本发明药剂或药物组 合物的活性组分。
     在另一个实施方案中， 本发明还提供选自下组的活性组分在制备用于治疗或预防 癌症或肿瘤的药物组合物或药剂中的用途 ：
     (a) 本发明的肽，
     (b) 处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，
     (c) 在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体， 和
     (d) 本发明的 CTL。
     或者， 本发明进一步提供用于治疗或预防癌症或肿瘤的选自下组的活性组分 ：
     (a) 本发明的肽，
     (b) 处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，
     (c) 在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体， 和
     (d) 本发明的 CTL。
     或者， 本发明进一步提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物组合物或药 剂的方法或工艺， 其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受载体与选自下组的活性 组分作为活性组分的步骤 ：
     (a) 本发明的肽，
     (b) 处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，
     (c) 在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体， 和
     (d) 本发明的 CTL。
     在另一个实施方案中， 本发明还提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物 组合物或药剂的方法或工艺， 其中该方法或工艺包括混合活性组分与药学或生理学可接受 载体的步骤， 其中所述活性组分选自下组 ：
     (a) 本发明的肽，
     (b) 处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c) 在其表面上呈递本发明肽的 APC 或外来体， 和 (d) 本发明的 CTL。 或者， 本发明的药物组合物或药剂可用于防范癌症或肿瘤和 / 或预防其手术后复发。 本发明的药剂或药物组合物可用作疫苗。在本发明的语境中， 短语 “疫苗” ( 也称 作 “免疫原性组合物” ) 指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。
     本发明的药剂或药物组合物可用于在受试者或患者 ( 包括人和任何其它哺乳动 物， 包括但不限于小鼠、 大鼠、 豚鼠、 家兔、 猫、 犬、 绵羊、 山羊、 猪、 牛、 马、 猴、 狒狒、 和黑猩猩， 特别是商业上重要的动物或驯养的动物 ) 中治疗和 / 或预防癌症或肿瘤， 和 / 或预防其手 术后复发。
     依照本发明， 已经发现具有选自 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的肽是分别能诱导强且特异性免疫应答的 HLA-A24 或 HLA-A2 限制表位肽或候选者。 因此， 包括任何这些具有 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16， 17， 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的肽的本发明药剂或药物组合物特别适 合于对其 HLA 抗原为 HLA-A24 或 HLA-A2 的受试者施用。 尤其， 含有具有 SEQ ID No ： 1， 2， 3， 4， 16 和 17 的氨基酸序列的肽的制剂适合于 HLA-A24 类型的受试者施用， 而含有具有 SEQ ID No ： 30， 31， 34， 36， 37， 40， 41， 45， 49， 55， 57 和 61 的氨基酸序列的肽的制剂适合于 HLA-A2 类 型的受试者施用。这同样适用于含有编码任何这些肽的多核苷酸 ( 即本发明的多核苷酸 ) 的药剂和组合物。
     要用本发明的药剂或药物组合物治疗的癌症或肿瘤不受限制， 包括其中涉及 WDRPUH 的所有种类的癌症或肿瘤， 例如肝细胞癌。
     除上述活性组分之外， 本发明的药剂或药物组合物还可含有其它具有诱导针对癌 性细胞的 CTL 的能力的肽、 编码所述其它肽的其它多核苷酸、 呈递所述其它肽的其它细胞 等等。在本文中， 其它具有诱导针对癌性细胞的 CTL 的能力的肽以癌症特异性抗原 ( 例如 已鉴定的 TAA) 为例， 但是不限于此。
     如果需要， 本发明的药剂或药物组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性组 分， 只要该物质不抑制活性组分例如任何本发明肽的抗肿瘤效果。 例如， 配制剂可包括抗炎 剂、 镇痛剂、 化疗剂、 诸如此类。 除了在药物自身中包括其它治疗性物质之外， 本发明的药物 还可以与一种或多种其它药理学作用剂顺序或同时施用。 药物和药理学作用剂的量取决于 例如所使用的药理学作用剂的类型、 所治疗的疾病、 及施用的时序安排和路径。
     应当理解， 除在本文中具体提及的组分之外， 本发明的药剂或药物组合物可包括 与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它制剂。
     在本发明的一个实施方案中， 本发明的药剂或药物组合物可包括在制品和试剂盒 中， 该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病 ( 例如癌症 ) 的病理状况的材料。制品 可包括任何本发明药剂的容器及标签。合适的容器包括瓶、 管形瓶、 和试管。容器可以用多 种材料制成， 诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该药剂或组合物用于治疗或预防一种 或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。
     除上文描述的容器之外， 包括本发明药剂或药物组合物的试剂盒还可任选进一步 包括第二容器， 其中装有药学可接受稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的
     其它材料， 包括其它缓冲液、 稀释剂、 滤器、 针头、 注射器、 和载有使用说明的包装插页。
     如果期望的话， 药剂或药物组合物可存在于药包或分配器装置中， 该药包或分配 器装置可装有一个或多个含有活性组分的单位剂型。 例如， 药包可包括金属或塑料箔， 诸如 泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。
     (1) 含有肽作为活性组分的药剂或药物组合物
     本发明的肽可以作为药剂或药物组合物直接施用， 或者如果必要， 通过常规配制 方法来配制。在后一种情况中， 除本发明的肽之外， 还可以视情况包括通常用于药物的载 体、 赋形剂、 等等， 没有特别限制。 此类载体的例子有灭菌水、 生理盐水、 磷酸盐缓冲液、 培养 基、 等等。另外， 药剂或药物组合物可在必要时含有稳定剂、 悬浮液、 防腐剂、 表面活性剂等 等。本发明的药剂或药物组合物可用于抗癌目的。
     本发明的肽可制备成由两种或更多种本发明肽构成的组合以在体内诱导 CTL。肽 组合可采取鸡尾酒的形式， 或者可使用标准技术彼此缀合。 例如， 可以将各个肽化学连接或 表达成为单一融合多肽序列。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的 肽， 肽被 HLA 抗原以高密度展示在 APC 上， 然后诱导出与所展示的肽与 HLA 抗原之间形成的 复合物特异性起反应的 CTL。或者， 可以给受试者施用这样的 APC ： 它们在其细胞表面上展 示任何本发明的肽， 可以通过用本发明的肽刺激来源于受试者的 APC( 如 DC) 而获得 ； 结果 在受试者中诱导 CTL， 从而可提高针对癌细胞的攻击性。
     包括本发明的肽作为活性组分、 用于治疗和 / 或预防癌症或肿瘤的药剂或药物组 合物还可包括已知可有效建立细胞免疫的佐剂。或者， 药剂或药物组合物可以与其它活性 组分一起施用， 或者通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起 ( 或顺序 ) 施用时增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中 记载的那些 (Clin Microbiol Rev1994， 7： 277-89)。 合适佐剂的例子包括但不限于磷酸铝、 氢氧化铝、 明矾、 霍乱毒素、 沙门氏菌毒素、 诸如此类。
     另外， 可方便地使用脂质体配制剂、 其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制 剂、 和其中脂质结合至肽的配制剂。
     在一些实施方案中， 本发明的药剂或药物组合物可进一步包括引发 (prime)CTL 的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的 CTL 的作用剂。例如， 可将棕榈 酸残基连接至赖氨酸残基的 ε- 和 α- 氨基， 然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在 胶束或颗粒中直接施用， 掺入脂质体， 或在佐剂中乳化。作为脂质引发 CTL 应答的另一个 例子， 大肠杆菌 (E.coli) 脂蛋白， 诸如三棕榈酰基 -S- 甘油基半胱氨酰 - 丝氨酰 - 丝氨 酸 (P3CSS)， 当与适宜的肽共价连接时， 可用来引发 CTL( 参见例如 Deres et al.， Nature 1989， 342 ： 561-4)。
     施用的方法可以是口服、 皮内、 皮下、 静脉内注射等等， 及系统施用或局部施用至 靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施， 或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量 可以依据要治疗的疾病、 患者的年龄、 重量、 施用的方法等等恰当加以调整， 通常是 0.001mg 至 1000mg， 例如 0.001mg 至 1000mg， 例如 0.1mg 至 10mg， 而且可以每少数天施用一次至每少 数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。
     (2) 含有多核苷酸作为活性组分的药剂或药物组合物
     本发明的药剂或药物组合物也可含有处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中， 短语 “处于可表达形式的” 意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成 诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中， 感兴趣的多核苷酸的核酸序列包 括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所 需的配置 ( 关于同源重组盒载体的描述参见例如 Thomas KR&Capecchi MR， Cell 1987， 51 ： 503-12)。参见例如 Wolff et al.， Science 1990， 247 ： 1465-8 ； 美国专利 No.5,580,859 ； 5,589,466 ； 5,804,566 ； 5,739,118 ； 5,736,524 ； 5,679,647 ； 及 WO 98/04720。基于 DNA 的 投递技术的例子包括 “裸 DNA” 、 易化 ( 布比卡因、 聚合物、 肽介导的 ) 投递、 阳离子脂质复合 物、 和颗粒介导的 (“基因枪” ) 或压力介导的投递 ( 参见例如美国专利 No.5,922,687)。
     本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主， 诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如牛痘病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。 在导入宿主后， 重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽， 并由此引发免疫应答。 可用于免疫接种 方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利 No.4,722,848。另一种载体是卡介苗 (BCG， Bacille Calmette Guerin)。BCG 载体记载于 Stover et al.， Nature 1991， 351 ： 456-60。 有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的， 例如腺病毒和腺伴随病 毒载体、 逆转录病毒载体、 伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhi) 载体、 去毒炭疽毒素载体、 诸 如此类。 参见例如 Shata et al.， Mol Med Today 2000， 6： 66-71 ； Shedlocket al.， J Leukoc Biol 2000， 68 ： 793-806 ； Hipp et al.， In Vivo 2000， 14 ： 571-85。
     将多核苷酸投递入受试者可以是直接的， 其中受试者直接暴露于携带多核苷酸的 载体， 或者是间接的， 其中首先在体外用感兴趣多核苷酸转化细胞， 然后将细胞移植入受试 者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。
     关 于 基 因 疗 法 的 方 法 的 一 般 综 述 参 见 Goldspiel et al.， Clinical Pharmacy1993 ， 12 ： 488-505 ； Wu 和 Wu ， Biotherapy 1991 ， 3： 87-95 ； Tolstoshev ， Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993 ， 33 ： 573-96 ； Mulligan ， Science 1993 ， 260 ： 926-32 ； Morgan&Anderson， Ann Rev Biochem 1993， 62 ： 191-217 ； Trends in Biotechnology 1993， 11(5) ： 155-215。 重组 DNA 技术领域普遍知道的也可用于本发明的方法记载于 eds.Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley&Sons， NY， 1993 ； 及 Krieger， Gene Transfer 和 Expression， ALaboratory Manual， Stockton Press， NY， 1990。
     施用的方法可以是口服、 皮内、 皮下、 静脉内注射等等， 而且可使用系统施用或局 部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施， 或者通过多次施用来强化。可以依 据要治疗的疾病、 患者的年龄、 重量、 施用的方法等等恰当调整合适载体或经编码本发明肽 的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量， 而且通常是 0.001mg 至 1000mg， 例如 0.001mg 至 1000mg， 例如 0.1mg 至 10mg， 而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术 人员能恰当选择合适的剂量。
     X. 使用肽、 外来体、 APC 和 CTL 的方法
     本发明的肽和多核苷酸可用于诱导 APC 和 CTL。本发明的外来体和 APC 也可用于 诱导 CTL。肽、 多核苷酸、 外来体和 APC 可以与任何其它化合物组合使用， 只要该化合物不 抑制它们的 CTL 诱导能力。因此， 任何前文所述的本发明药剂或药物组合物均可用于诱导 CTL， 而且除它们之外， 那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导 APC， 如下文讨论的。
     (1) 诱导抗原呈递细胞 (APC) 的方法本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸来诱导具有高 CTL 诱导能力的 APC 的方 法。本发明的方法包括在体外、 离体或在体内用本发明的肽接触 APC 的步骤。例如， 离体用 肽接触 APC 的方法可包括下述步骤 ：
     a： 自受试者收集 APC ； 并
     b： 用肽接触步骤 a 的 APC。
     APC 不限于特定种类的细胞， 包括 DC、 Langerhans 细胞、 巨噬细胞、 B 细胞、 和活化 的 T 细胞， 已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原， 从而被淋巴细胞识别。优 选地， 由于 DC 是 APC 中具有最强 CTL 诱导能力的， 可使用 DC。任何本发明肽可以以它们自 身或与其它本发明肽组合使用。
     或者， 可如下诱导 APC， 即对受试者施用本发明肽以使肽与 APC 在体内接触， 并因 此在受试者的身体中诱导具有高 CTL 诱导能力的 APC。 如此， 本发明还涵盖为诱导 APC 而对 受试者施用本发明的肽。作为另一种方法， 可以以可表达形式对受试者施用本发明的多核 苷酸以表达本发明的肽， 并在体内使肽与 APC 接触。与使用本发明的肽类似， 在受试者的身 体中诱导具有高 CTL 诱导能力的 APC。 如此， 本发明还涵盖为了诱导 APC 而对受试者施用本 发明的多核苷酸。对于短语 “可表达形式” 的解释， 见 “IX. 药剂 (2) 含有多核苷酸作为活 性组分的药剂” 部分。
     另外， 本发明还涵盖将本发明的多肽导入 APC 以诱导具有 CTL 诱导能力的 APC。 例 如， 所述方法可包括下述步骤 ：
     a： 自受试者收集 APC ； 并
     b： 将编码本发明肽的多核苷酸导入收集的 APC。
     步骤 b 可如上文 “VI. 抗原呈递细胞” 部分中所述来实施。
     (2) 诱导 CTL 的方法
     另外， 本发明提供了使用本发明的肽、 多核苷酸、 或外来体或 APC 来诱导 CTL 的方 法。
     当本发明的肽、 多核苷酸、 APC、 或外来体被施用给受试者后， 受试者的身体中诱导 出 CTL 以增强靶向癌细胞的免疫应答。如此， 本发明的另一个目的是提供用于诱导 CTL 的 方法， 所述方法可包括对受试者施用本发明的肽、 多核苷酸、 APC 或外来体的步骤。
     或者， 也可离体诱导 CTL， 并在诱导后， 可将活化的 CTL 返还受试者。例如， 所述方 法可包括下述步骤 ：
     a： 自受试者收集 APC ；
     b： 用本发明的肽接触步骤 a 的 APC ； 并
     c： 将步骤 b 的 APC 与 CD8 阳性细胞共培养。
     上文步骤 c 中要与 CD8 阳性细胞共培养的 APC 也可通过将编码本发明肽的多核苷 酸转移入 APC 来制备， 如上文 “VI. 抗原呈递细胞” 部分所述 ； 但是不限于此， 而且任何在其 表面上有效呈递 HLA 抗原和本发明肽的复合物的 APC 均可用于本发明的方法。
     此类 APC 也可使用在其表面上呈递 HLA 抗原和本发明肽的复合物的外来体来代 替。即， 本发明用于诱导 CTL 的方法可包括共培养在其表面上呈递 HLA 抗原和本发明肽的 复合物的外来体的步骤。此类外来体可通过上文 “V. 外来体” 部分中描述的方法来制备。
     另外， 可通过将编码与本发明的肽结合的 TCR 亚单位的多核苷酸导入 CD8 阳性细胞来诱导 CTL。此类转导可如上文 “VIII.T 细胞受体 (TCR)” 部分中所述来实施。
     (3) 诱导免疫应答的方法
     本发明进一步提供了用于在受试者中诱导抗癌症免疫应答的方法。 所述方法包括 施用本发明的疫苗， 其包含 ：
     (a) 一种或多种本发明肽， 或其免疫学活性片段 ；
     (b) 一种或多种编码 (a) 的肽或免疫学活性片段的多核苷酸 ；
     (c) 一种或多种分离的本发明 CTL ； 或
     (d) 一种或多种分离的本发明抗原呈递细胞。
     在本发明中， 过表达 WDRPUH 的癌症可用这些活性组分来治疗。因而， 在施用包含 活性组分的疫苗或药物组合物之前， 优选确认要治疗的癌细胞或组织中的 WDRPUH 表达水 平与相同器官的正常细胞相比增强了。 如此， 在一个实施方案中， 本发明提供了用于治疗过 表达 WDRPUH 的癌症的方法， 所述方法可包括下述步骤 ：
     i) 测定自具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中的 WDRPUH 表达水 平；
     ii) 比较 WDRPUH 表达水平与正常对照 ； 并 iii) 对具有与正常对照相比过表达 WDRPUH 的癌症的受试者施用至少一种选自上 文所述 (a) 至 (d) 的成分。
     或者， 本发明还提供了包含至少一种选自上文所述 (a) 至 (d) 的成分的疫苗或药 物组合物， 其用于对具有过表达 WDRPUH 的癌症的受试者施用。换言之， 本发明进一步提供 了用于鉴定要用本发明 WDRPUH 多肽来治疗的受试者的方法， 所述方法可包括测定源自受 试者的癌细胞或组织中的 WDRPUH 表达水平的步骤， 其中该水平与该基因的正常对照水平 相比的升高指示该受试者具有可用本发明 WDRPUH 多肽来治疗的癌症。本发明的治疗癌症 的方法将在下面更加详细的加以叙述。
     需用本方法治疗的患者优选为哺乳动物。 哺乳动物的例子包括但不仅限于， 例如， 人类， 非人灵长类、 小鼠、 大鼠、 犬、 猫、 马以及牛。
     根据本发明， 测定在自受试者获得的癌细胞或组织中 WDRPUH 的表达水平。表达水 平可在转录产物 ( 核酸 ) 水平确定， 使用本领域熟知的方法。举例而言， 可通过杂交方法 ( 例如， Northern 杂交 ) 使用探针来定量 WDRPUH 的 mRNA。可在芯片或阵列上实施所述检 测。对检测 WDRPUH 的表达水平而言， 优选使用阵列。本领域技术人员可利用 WDRPUH 的序 列信息制备上述探针。举例而言， WDRPUH 的 cDNA 可用作探针。如需要， 所述探针可用合适 的标记物来标记， 所述标记物例如染料、 荧光物质和同位素， 且所述基因的表达水平可以作 为发生了杂交的标签的强度检测。
     进一步， WDRPUH 的转录产物 (SEQ ID NO ： 63) 可通过基于扩增的检测方法 ( 例如， RT-PCR) 使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因的可用的序列信息来制备。
     具体而言， 本方法所用的探针或引物在严格条件、 温和条件与低严格条件下与 WDRPUH 的 mRNA 杂交。如本文中所使用的， 短语 “严格 ( 杂交 ) 条件” 是指这样的条件， 在该 条件下， 探针或引物将与其靶序列杂交， 但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的， 在不同的环境下会不同。较长序列与较短序列相比在较高温度观察到特异杂交。一般地， 严格条件的温度应选择比特定序列在限定的离子强度和 pH 下的熔点 (Tm) 低大约 5℃。Tm
     是 ( 在限定的离子强度、 pH 和核酸浓度下 ) 平衡状态下有 50％的与靶序列互补的探针与靶 序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在， 因此在 Tm 下， 平衡时 50％的探针被占据。典 型地， 严格条件是这样的 ： 其中盐浓度小于大约 1.0M 钠离子， 典型地大约 0.01-1.0M 钠离子 ( 或其它盐 )， pH7.0-8.3， 温度对于较短的探针或引物 ( 例如 10-50 个核苷酸 ) 是至少大约 30℃， 用于较长的探针或引物是至少大约 60℃。 严格条件也可以通过添加去稳定剂， 例如甲 酰胺， 来实现。
     或者， 可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如， 可以确定 WDRPUH 蛋白 (SEQ ID NO ： 64) 的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法， 此类方法使用特异 识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且， 抗体的任何片段或修饰 ( 例 如嵌合抗体、 scFv、 Fab、 F(ab’ )2、 Fv 等 ) 均可用于检测， 只要该片段或经修饰抗体保留对 WDRPUH 蛋白的结合能力即可。 制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周 知的， 并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。
     作为另一种基于 WDRPUH 的翻译产物检测其基因的表达水平的方法， 可利用针对 WDRPUH 蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。意即， 观察到强染色表明所 述蛋白质存在量增加， 且同时表明 WDRPUH 基因的高表达水平。
     对于包括 WDRPUH 基因在内的靶基因， 如果其较之相应的靶基因的对照水平增加 了例如 10％， 25％或 50％的话， 或增加到超过 1.1 倍， 超过 1.5 倍， 超过 2.0 倍， 超过 5.0 倍， 超过 10 倍或者更多， 则可以认为其在癌细胞中的表达水平增加了。
     对照水平可以与癌细胞同时确定， 使用先前从疾病状态 ( 患癌或未患癌 ) 已知的 受试者收集和保存的样品。另外， 自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞 可用作正常对照。 或者， 对照水平可以借助统计方法， 根据通过分析先前测定的来自疾病状 态已知的受试者的样品的 WDRPUH 基因表达水平获得的结果加以确定。进一步， 对照水平可 以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。
     而且， 根据本发明的一个方面， 可以将生物样品中 WDRPUH 基因的表达水平与从多 个参考样品确定的多个对照水平比较。 优选地使用从来自与受试者衍生样品组织类型相似 的组织类型的参考样品确定的对照水平。 而且， 优选地， 使用具有已知的疾病状态的群体中 WDRPUH 基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如， 平均 值 +/-2S.D. 或平均值 +/-3S.D. 的范围可以用作标准值。
     在本发明的语境下， 从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作 “正常对照水 平” 。另一方面， 如果对照水平从癌性生物样品确定， 则称作 “癌对照水平” 。
     当 WDRPUH 基因的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似， 则受试者可诊断为具有要治疗的癌症。
     本发明还提供了用于确定能用本发明 WDRPUH 多肽来治疗的患有癌症的受试者的 试剂盒， 其亦可用于评价和 / 或监测癌症疗法功效。优选地， 所述癌症为肝细胞癌。更特别 地， 所述试剂盒优选包含至少一种在受试者衍生癌细胞中检测 WDRPUH 基因表达的试剂， 所 述试剂可选自下组 ：
     (a) 检测 WDRPUH 基因的 mRNA 的试剂 ；
     (b) 检测 WDRPUH 的蛋白质的试剂 ；
     (c) 检测 WDRPUH 的蛋白质的生物学活性的试剂。适于检测 WDRPUH 基因 mRNA 的试剂包括特异性结合或识别 WDRPUHmRNA 的核酸， 诸 如具有与 WDRPUH mRNA 的一部分互补的序列的寡核苷酸。 这类寡核苷酸的例子有对 WDRPUH mRNA 为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸。如果需 要， 检测 WDRPUHmRNA 的试剂可固定化在固体基质上。另外， 在所述试剂盒中可包括多于一 种检测 WDRPUH mRNA 的试剂。
     另一方面， 适于检测 WDRPUH 蛋白质的试剂包括针对 WDRPUH 蛋白质的抗体。 所述抗 体可为单克隆的或多克隆的。进一步， 任何所述抗体的片段或修饰 ( 例如， 嵌合抗体、 scFv、 Fab、 F(ab’ )2、 Fv 等等 ) 均可用作所述试剂， 只要所述片段或经修饰抗体保留与 WDRPUH 蛋 白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的， 且可在本发明中 使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步， 所述抗体可用能产生信号的分子通过直 接连接或简介标记技术进行标记。 标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在 本领域是众所周知的， 且本发明可使用任何标记物与方法。 另外， 在所述试剂盒中可包括多 于一种用于检测 WDRPUH 蛋白质的试剂。
     所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。举例而言， 从患有或没有癌症的受试者 获取的组织样品可用作有用的对照试剂。 本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户 角度而言期望的材料， 包括缓冲液、 稀释液、 滤器、 针头、 注射器和带有使用说明书 ( 例如， 书面的、 磁带、 CD-ROM 等等 ) 的装箱单。这些试剂之类的可标上标签包含在容器中。合适 的容器包括瓶、 管状瓶 (vials) 和试管。所述容器可用多种材料制造， 例如玻璃或塑料。
     作为本发明的一个实施方案， 当所述试剂是针对 WDRPUH mRNA 的探针时， 所述试剂 可固定化于固体基质上， 例如多孔条， 以形成至少一个检测位置。 所述多孔条的测量或检测 区域可包含多个位置， 每个都包含核酸 ( 探针 )。 测试条亦可包含阴性和 / 或阳性对照的位 置。此外， 对照位置可位于与测试条不同的条上。任选地， 不同的检测位置可包含不同量的 固定化核酸， 即， 在第一个检测位置上量较大而在后面的位置上量较小。 在加入测试样品之 后， 显示可检测信号位置的数目提供了在样品中存在的 WDRPUH mRNA 量的定量指征。所述 检测位置可设置成具有任何合适可检测的形状， 通常是横跨测试条宽度的条状或点状。
     本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照样品或 WDRPUH 标准样品。本发明的所 述阳性对照样品可通过收集 WDRPUH 阳性血液样品， 随后分析其 WDRPUH 水平来制备。此外， 可将纯化的 WDRPUH 蛋白或多核苷酸添加到不表达 WDRPUH 的细胞中以形成所述阳性样品， 或 WDRPUH 标准品。在本发明中， 纯化的 WDRPUH 可以是重组蛋白。例如， 阳性对照样品的 WDRPUH 水平大于截留值。
     提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发 明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。 实施例 材料和方法
     细胞系
     A24 淋巴母细胞样细胞系 (A24LCL) 通过借助 Epstein-Bar 病毒转化入 HLA-A24 阳 性人 B 淋巴细胞而建立。T2(HLA-A2)、 COS7、 非洲绿猴肾细胞系均购自 ATCC。
     WDRPUH 衍生的肽的候选者的选择
     使 用 结 合 预 测 软 件 ″ BIMAS ″ (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_ bind) 预 测 了 WDRPUH 衍 生 的 结 合 HLA-A*2402 和 HLA-A*0201 分 子 的 9 聚 物 和 10 聚 物 肽 (Parker et al.(J Immunol 1994， 152(1) ： 163-75)， Kuzushima et al.(Blood 2001， 98(6) ： 1872-81))。由 Sigma( 札幌， 日本 ) 或 Biosynthesis Inc.(Lewisville， TX) 依照 标准固相合成法合成了这些肽， 并通过反相高效液相层析 (HPLC) 进行了纯化。分别通过分 析性 HPLC 和质谱术分析测定了肽的纯度 ( ＞ 90％ ) 和身份。将肽以 20mg/ml 在二甲亚砜 (DMSO) 中溶解， 并保存于 -80℃。
     体外 CTL 诱导
     使用单核细胞衍生树突细胞 (DC) 作为抗原呈递细胞 (APC) 来诱导针对人白细 胞抗原 (HLA) 上呈递的肽的细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 应答。如别处 (Nakahara S et al.， Cancer Res 2003 Jul 15， 63(14) ： 4112-8) 所述在体外生成 DC。具体而言， 将用 Ficoll-Plaque(Pharmacia) 溶液自正常志愿者 (HLA-A*2402 阳性和 HLA-A*0201 阳性 ) 分 离的外周血单个核细胞 (PBMC) 通过粘附至塑料组织培养皿 (Becton Dickinson) 来加以 分离， 以将它们作为单核细胞级分富集。在含有 2％热灭活自体血清 (AS) 的 AIM-V 培养基 (Invitrogen) 中在 1000U/ml 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)(R&D System) 和 1000U/ml 白介素 (IL)-4(R&D System) 存在下培养富集了单核细胞的群体。 培养 7 天后， 将 经细胞因子诱导的 DC 在 AIM-V 培养基中在 3 微克 /mlβ2- 微球蛋白存在下用 20 微克 /ml 每一种合成肽于 37℃冲激 3 小时。所生成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达 DC 相关 分子， 诸如 CD80、 CD83、 CD86 和 HLA II 类 ( 数据未显示 )。
     然 后 将 这 些 经 肽 冲 激 的 DC 用 丝 裂 霉 素 C(MMC)(30 微 克 /ml， 30min) 或 X 辐 照 (20Gy) 灭活， 并以 1 ∶ 20 比例与用 CD8 阳性分离试剂盒 (Dynal) 通过正选择获得的自体 CD8+T 细胞混合。 在 48 孔板 (Corning) 中设立这些培养物 ； 每个孔在 0.5ml AIM-V/2％ AS 培 4 5 养基中含有 1.5x10 个经肽冲激的 DC、 3x10 个 CD8+T 细胞和 10ng/ml IL-7(R&D System)。 3 天后， 给这些培养物补充 IL-2(CHIRON) 至终浓度 20IU/ml。在第 7 天和第 14 天， 将T细 胞用经肽冲激的自体 DC 进一步刺激。每次遵循与上文所述相同的步骤来制备 DC。在第 21 天在第三轮肽刺激后测试针对经肽冲激的 A24LCL 或 T2 细胞的 CTL(Tanaka Het al.， Br J Cancer 2001 Jan 5， 84(1) ： 94-9 ； Umano Y et al.， Br J Cancer 2001 Apr20， 84(8) ： 1052-7 ； Uchida N et al.， Clin Cancer Res 2004 Dec 15， 10(24) ： 8577-86 ； Suda T et al.， Cancer Sci 2006 May， 97(5) ： 411-9 ； Watanabe T et al.， Cancer Sci 2005 Aug， 96(8) ： 498-506)。
     CTL 扩增规程
     使用与 Riddell 等人 (Walter EA et al.， N Engl J Med 1995 Oct 19， 333(16) ： 1038-44 ； Riddell SR et al.， Nat Med 1996 Feb， 2(2) ： 216-23) 记载的方法相似的方法 4 在培养中扩增 CTL。将总共 5x10 个 CTL 在 25ml AIM-V/5 ％ AS 培养基中悬浮， 其中有在 40ng/ml 抗 CD3 单克隆抗体 (Pharmingen) 存在下经丝裂霉素 C 灭活的两种人 B- 淋巴母细 胞样细胞系。启动培养后一天， 向培养物添加 120IU/ml IL-2。在第 5 天、 第 8 天和第 11 天给培养物补加新鲜的含有 30IU/ml IL-2 的 AIM-V/5％ AS 培养基 (Tanaka H et al.， Br J Cancer 2001 Jan 5， 84(1) ： 94-9 ； Umano Y et al.， Br J Cancer 2001 Apr 20， 84(8) ： 1052-7 ； Uchida N et al.， ClinCancer Res 2004 Dec 15， 10(24) ： 8577-86 ； Suda T etal.， Cancer Sci 2006 May， 97(5) ： 411-9 ； Watanabe T et al.， Cancer Sci 2005 Aug， 96(8) ： 498-506)。
     CTL 克隆的建立
     在 96 圆底微量滴定板 (Nalge Nunc International) 中进行稀释以获得 0.3、 1和 3 个 CTL/ 孔。在总体积为 150 微升 / 孔的含 5％ AS 的 AIM-V 培养基中， 将 CTL 与 1x104 个 细胞 / 孔的两种人 B- 淋巴母细胞样细胞系、 30ng/ml 的抗 CD3 抗体， 和 125U/ml 的 IL-2 一 起培养。10 天后向培养基中加入 50 微升 / 孔的 IL-2 以达到终浓度 125U/ml 的 IL-2。在 第 14 天测试 CTL 活性， 并使用如上所述的相同方法扩增 CTL 克隆 (Uchida N et al.， Clin Cancer Res 2004 Dec 15， 10(24) ： 8577-86 ； Suda T et al.， Cancer Sci 2006 May， 97(5) ： 411-9 ； Watanabe T et al.， Cancer Sci2005 Aug， 96(8) ： 498-506)。
     特异性 CTL 活性
     为了检查特异性 CTL 活性， 实施了干扰素 (IFN)-γ 酶联免疫斑点 (ELISPOT) 测定 法和 IFN-γ 酶联免疫吸附测定法 (ELISA)。 具体而言， 制备经肽冲激的 A24LCL(1x104/ 孔 ) 或 T2(1x104/ 孔 ) 作为刺激细胞。使用 48 孔中培养的细胞作为应答细胞。依照制造商推 荐的规程实施 IFN-γELISPOT 测定法和 IFN-γELISA 测定法。
     质粒转染
     通过 PCR 来扩增编码靶基因可读框、 HLA-A24 和 HLA-A*0201 的 cDNA。将 PCR 扩 增的靶基因产物和 HLA-A24 或 HLA-A*0201 克隆入 pIRES 载体 (Clontech Laboratories， Inc.， Cat.No.631605)。 使 用 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 依 照 制 造 商 推 荐 的 规 程 将 质 粒 转 染 入 COS7( 一 种 无 靶 基 因 和 HLA-A24 的 细 胞 系 )。 自 转 染 起 2 天 后， 用 4 Versene(Invitrogen) 收获经转染细胞， 并用作 CTL 活性测定法的靶细胞 (5X10 个细胞 / 孔 )。
     结果
     WDRPUH 衍生的 HLA-A24 和 HLA-A2 结合肽的预测
     表 1 以最高结合亲和力的次序显示 WDRPUH 的 HLA-A24 结合肽。选择并检查了总 共 25 种具有潜在 HLA-A24 结合能力的肽以确定表位肽 ( 表 1)。表 2 以最高结合亲和力的 次序显示 WDRPUH 的 HLA-A2 结合 9 聚物和 10 聚物肽。选择并检查了总共 37 种具有潜在 HLA-A2 结合能力的肽以确定表位肽 ( 表 2)。
     [ 表 1]
     通过 BIMAS 预测的衍生自 WDRPUH 的 HLA-A24 结合性肽
     肽名称 WDRPUH-A24-9 聚物 起始位置 40 314 509 339 氨基酸序列 IYPLGCTVL IYRVSFTDF CYHPEEFQI VFPFGTAEL 26 结合得分 300 120 60 33 SEQ ID NO. 1 2 3 4102307891 A CN 102307898 318 400 118 231 257 99 527 248 WDRPUH-A24-10 聚物 280 77 509 409 40 220 21 531 559 495 339 165 331
    
    
    
    
    说明书24 24 24 14.4 12 11.52 10.08 10 240 150 86.4 75 75 75 42 30.8 30 17.28 15 10 10 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2524/29 页SFTDFKETL AFAPETGRL AFSPNDLYL KMNPRTKLL RCLKMGGLL KNRELLARL AYWEVFDGT KFSLGVSAI GYKPIKKIQL EYIAsGQVTF CYHPeEFQH MYVInNAHRI IYPLgCTVLI FYLGtTTGDI GFNGhVPTGL VFDGtVIREL HFVTgGNDHL RNQMiLANTL VFPFgTAELF IFSRcRDEMF HFDAvEDIVF起始位置指自 WDRPUH N 端起的氨基酸残基数。 结合得分来自 “BIMAS” [ 表 2] 通过 BIMAS 预测的衍生自 WDRPUH 的 HLA-A2 结合性肽27102307891 A CN 102307898 肽名称 WDPRUH-A2-9 聚物 起始位置 59 499 553 231 39 407 264 193 288 116 237 543 WDPRUH-A2-10 聚物 94 499 570 263 155 498 305 78 610 86 325说明书结合得分 319.939 112.664 85.173 53.999 52.025 42.278 36.316 29.766 23.995 21.362 19.236 11.426 247.167 224.653 94.23 79.041 69.552 57.318 47.991 39.75 31.277 29.098 28.81425/29 页 SEQ ID NO. 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48氨基酸序列 FLQGHGNNV ILANTLFQC ITQEGVHFV KMNPRTKLL MIYPLGCTV RLMYVINNA LLVGSGAGL KIWPTECQT QLQGGITSI ALAFSPNDL KLLTDVGPA SLSGSINGM ILWDyKNREL ILANtLFQCV KVWDyNEGEV GLLVgSGAGL GLNVgNATNV MILAnTLFQC FLVGtEESHI YIASgQVTFM AILRwKYPYT FMGFkADIIL TLIAtCHFDA28102307891 A CN 102307898 10 560 108 374 221 231说明书28.121 27.995 24.075 22.24 19.742 18.837 49 50 51 52 53 5426/29 页QVAEIELDAV FVTGgNDHLV SLHKgKIEAL NMTChGIDFM YLGTtTGDIL KMNPrTKLLT411 51 287 326 437 338 265 117
    VINNaHRIGV AINTkEQNFL IQLQgGITSI LIATcHFDAV GEGEvRVWQI IVFPfGTAEL LVGSgAGLLV LAFSpNDLYL16.258 16.155 15.303 15.136 14.347 11.757 10.346 10.26455 56 57 58 59 60 61 62起始位置指自 WDRPUH N 端起的氨基酸残基数。
     结合得分来自 “BIMAS”
     源自 WDRPUH 的预测的 HLA-A*2402 限制型肽的 CTL 诱导和经 WDRPUH 衍生肽刺激 的 CTL 系的建立
     依照 “材料和方法” 中描述的方案产生了针对那些 WDRPUH 衍生的肽的 CTL。通过 IFN-γELISPOT 测定法来测定肽特异性 CTL 活性 ( 图 1a-f)。显示用 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1) 刺激的 3 号和 6 号孔 (a)、 用 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 刺激的 8 号孔 (b)、 用 WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3) 刺激的 2 号和 6 号孔 (c)、 用 WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO ： 4) 刺激的 1 号、 2 号和 5 号孔 (d)、 用 WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 16) 刺激的 2 号、 3 号、 4 号、 6 号、 7 号和 8 号孔 (e) 及用 WDRPUH-A24-10-40(SEQ ID NO ： 17) 刺激的 5 号、 6 号和 8 号孔 (f) 现出与对照孔相比强的 IFN-γ 生成。
     另外， 将用 SEQ ID NO ： 1 刺激的 6 号阳性孔、 用 SEQ ID NO ： 2 刺激的 8 号阳性孔、 用 SEQ ID NO ： 3 刺激的 2 号阳性孔、 用 SEQ ID NO ： 4 刺激的 5 号阳性孔、 用 SEQ ID NO ： 16 刺激的 4 号阳性孔及用 SEQ ID NO ： 17 刺激的 6 号阳性孔中的细胞扩增并建立为 CTL 系。 通过 IFN-γELISA 测定法测定了这些 CTL 系的 CTL 活性 ( 图 2a-f)。发现与未经肽冲激的靶细胞相比所有 CTL 系针对经相应肽冲激的靶细胞均展现出强的 IFN-γ 生成。另一方面， 用表 1 中显示的其它肽刺激未能建立 CTL 系， 尽管那些肽被预测为具有对 HLA-A*2402 的结 合活性 ( 数据未显示 )。结果， 6 种从 WDRPUH 衍生的肽被筛选为能够诱导强的 CTL 系的肽。
     针对内源表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 的靶细胞的特异性 CTL 活性
     对针对本发明肽产生的建成 CTL 系， 检查它们识别内源表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 分子的靶细胞的能力。 使用用相应肽产生的 CTL 系作为效应细胞测试了针对用全长 WDRPUH 和 HLA-A*2402 分子基因二者转染的 COS7 细胞 ( 外源表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 基因的 靶细胞的一种特异性模型 ) 的特异性 CTL 活性。制备了用全长 WDRPUH 或 HLA-A*2402 基 因转染的 COS7 细胞作为对照。在图 3 中， 经 SEQ ID NO ： 2 刺激的 CTL 针对表达 WDRPUH 和 HLA-A*2402 二者的 COS7 细胞显示出强的 CTL 活性。相反， 没有检测到显著的针对对照的 特异性 CTL 活性。因此， 这些数据清楚地证明 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 天然地与 HLA-A*2402 分子一起被加工和呈递在靶细胞的表面上， 并被 CTL 识别。这些结果指示这种 自 WDRPUH 衍生的肽可能适用于作为癌症疫苗用于具有表达 WDRPUH 的肿瘤的患者。
     源自 WDRPUH 的预测的 HLA-A*0201 限制型肽的 CTL 诱导
     依照 “材料和方法” 中描述的方案产生了识别自 WDRPUH 衍生的肽的 CTL。通过 IFN-γ ELISPOT 测定法来测定肽特异性 CTL 活性 ( 图 4a-4l)。用 WDRPUH-A2-9-39(SEQ ID NO ： 30) 刺 激 的 2 号 和 7 号 孔 (a)、 用 WDRPUH-A2-9-407(SEQ ID NO ： 31) 刺 激 的 2 号 孔 (b)、 用 WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO ： 34) 刺激的 3 号孔 (c)、 用 WDRPUH-A2-9-237(SEQ ID NO ： 36) 刺激的 6 号孔 (d)、 用 WDRPUH-A2-9-543(SEQ ID NO ： 37) 刺激的 4 号孔 (e)、 用 WDRPUH-A2-10-570(SEQ ID NO ： 40) 刺激的 4 号孔 (f)、 用 WDRPUH-A2-10-263(SEQ ID NO ： 41) 刺激的 2 号和 8 号孔 (g)、 用 WDRPUH-A2-10-78(SEQ ID NO ： 45) 刺激的 5 号孔 (h)、 用 WDRPUH-A2-10-10(SEQ ID NO ： 49) 刺 激 的 2 号 孔 (i)、 用 WDRPUH-A2-10-411(SEQ ID NO ： 55) 刺激的 6 号孔 (j)、 用 WDRPUH-A2-10-287(SEQ ID NO ： 57) 刺激的 7 号孔 (k) 及用 WDRPUH-A2-10-265(SEQ ID NO ： 61) 刺激的 6 号孔 (l) 展现出与对照孔相比强的 IFN-γ 生 成。另一方面， 用表 2 中显示的其它肽刺激未能检测到强的 IFN-γ 生成， 尽管这些肽被预 测为具有对 HLA-A*0201 的结合活性 ( 数据未显示 )。
     针对 WDRPUH 特异性肽的 CTL 系和克隆的建立
     对用 SEQ ID NO ： 30 刺激的 7 号孔和用 SEQ ID NO ： 34 刺激的 3 号孔中通过 IFN-γ ELISPOT 测定法显示出肽特异性 CTL 活性的细胞进行扩增并建立为 CTL 系。通过 IFN-γ ELISA 测定法来测定这些 CTL 系的 CTL 活性 ( 表 5a 和 5b)。这两种 CTL 系展现出针对经相 应肽冲激的靶细胞的与未经肽冲激的靶细胞相比强的 IFN-γ 生成。另外， 通过有限稀释自 CTL 系建立了 CTL 克隆， 并通过 IFN-γ ELISA 测定法测定了来自 CTL 克隆的针对经相应肽 冲激的靶细胞的 IFN-γ 生成。在图 5c 和 5d 中展现了来自经 SEQ ID NO ： 30 和 SEQ ID NO ： 34 刺激的 CTL 克隆的强的 IFN-γ 生成。
     针对外源表达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 的靶细胞的特异性 CTL 活性
     对 针 对 本 发 明 肽 产 生 的 建 成 CTL 克 隆， 检 查 它 们 识 别 内 源 表 达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 分子的靶细胞的能力。使用用相应肽产生的 CTL 系作为效应细胞测试了针 对用全长 WDRPUH 和 HLA-A*0201 分子基因二者转染的 COS7 细胞 ( 内源表达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 基因的靶细胞的一种特异性模型 ) 的特异性 CTL 活性。制备了用全长 WDRPUH或 HLA-A*0201 基因转染的 COS7 细胞作为对照。 在图 5e 中， 经 SEQ ID NO ： 34 刺激的 CTL 针 对表达 WDRPUH 和 HLA-A*0201 二者的 COS7 细胞显示出强的 CTL 活性。相反， 没有检测到显 著的针对对照的特异性 CTL 活性。 这些数据清楚地证明 WDRPUH-A02-9-288(SEQ ID NO ： 34) 的肽与 HLA-A*0201 分子一起被内源加工和呈递在靶细胞的表面上， 并被 CTL 识别。这些结 果指示 WDRPUH-A02-9-288(SEQ ID NO ： 34) 可能适用于作为癌症疫苗用于具有表达 WDRPUH 的肿瘤的患者。
     对抗原肽的同源性分析
     经 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1) 、WDRPUH-A24-9-314(SEQ IDNO ： 2 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 9 - 5 0 9 ( S E Q I D N O ： 3 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 9 - 3 3 9 ( S E Q I D N O ： 4)、 WDRPUH-A24-10-409(SEQ ID NO ： 1 6 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 1 0 - 4 0 ( S E Q I D N O ： 17)、 WDRPUH-A02-9-39(SEQ ID NO ： 3 0 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 9 - 4 0 7 ( S E Q I D N O ： 31)、 WDRPUH-A02-9-288(SEQ ID NO ： 3 4 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 9 - 2 3 7 ( S E Q I D N O ： 36)、 WDRPUH-A02-9-543(SEQ ID NO ： 37) 、WDRPUH-A02-10-570(SEQ ID NO ： 40) 、 WDRPUH-A02-10-263(SEQ IDNO ： 4 1 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 1 0 - 7 8 ( S E Q I D N O ： 45)、 WDRPUH-A02-10-10(SEQID NO ： 4 9 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 1 0 - 4 1 1 ( S E Q I D N O ： 55)、 WDRPUH-A02-10-287(SEQ ID NO ： 57) 和 WDRPUH-A02-10-265(SEQ ID NO ： 61) 刺激的 CTL 显 示出显著的且特异性的 CTL 活性。这个结果可能是由于这些肽序列与已知可使人免疫系统 致敏的其它分子的衍生肽同源。
     为了排除这种可能性， 使用 BLAST 算法 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ blast.cgi) 使用这些肽序列作为检索项实施了同源性分析， 没有揭示具有显著同源性的 序列。同源性分析的结果指示 WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO ： 1)、 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO ： 2) 、WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO ： 3) 、WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO ： 4 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 1 0 - 4 0 9 ( S E Q I D N O ： 1 6 ) 、W D R P U H - A 2 4 - 1 0 - 4 0 ( S E Q I D N O ： 17) 、WDRPUH-A02-9-39(SEQ ID NO ： 30) 、WDRPUH-A02-9-407(SEQ ID NO ： 31) 、 WDRPUH-A02-9-288(SEQ ID NO ： 3 4 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 9 - 2 3 7 ( S E Q I D N O ： 36)、 WDRPUH-A02-9-543(SEQ ID NO ： 3 7 ) 、W D R P U H - A 0 2 - 1 0 - 5 7 0 ( S E Q I D N O ： 40)、 WDRPUH-A02-10-263(SEQ ID NO ： 41) 、WDRPUH-A02-10-78(SEQ ID NO ： 45) 、 WDRPUH-A02-10-10(SEQ ID NO ： 49) 、WDRPUH-A02-10-411(SEQ ID NO ： 55) 、 WDRPUH-A02-10-287(SEQ ID NO ： 57) 和 WDRPUH-A02-10-265(SEQ ID NO ： 61) 的序列是独 特的， 因此， 就我们所知， 这些分子产生不期望的对某些无关分子的免疫学应答的可能性很 小。
     总之， 鉴定了新型 HLA-A24 和 A2 表位肽， 并证明了它们可应用于癌症免疫疗法。
     工业实用性
     本发明描述了新的 TAA， 特别是那些 WDRPUH 衍生的， 它们诱导强有力且特异性的 抗肿瘤免疫应答， 而且可以应用于癌症类型， 诸如肝细胞癌。此类 TAA 保证了进一步开发肽 疫苗接种策略在癌症中的临床应用。
     虽然参照其具体实施方案详细地描述了本发明， 但是要理解， 上面的描述本质上 是例示性的和解释性的， 而且意图例示本发明及其优选实施方案。 经由常规实验， 本领域技 术人员会容易地认识到， 可以对本发明进行各种变化和修饰， 而不偏离本发明的精神和范围。如此， 本发明意图并非由上文描述， 而是由所附权利要求及其等同方案来限定。32102307891 A CN 102307898
    序列表1/18 页
     33102307891 A CN 102307898序列表2/18 页
    34102307891 A CN 102307898序列表3/18 页
    35102307891 A CN 102307898序列表4/18 页
    36102307891 A CN 102307898序列表5/18 页
    37102307891 A CN 102307898序列表6/18 页
    38102307891 A CN 102307898序列表7/18 页
    39102307891 A CN 102307898序列表8/18 页
    40102307891 A CN 102307898序列表9/18 页
    41102307891 A CN 102307898序列表10/18 页
    42102307891 A CN 102307898序列表11/18 页
    43102307891 A CN 102307898序列表12/18 页
    44102307891 A CN 102307898序列表13/18 页
    45102307891 A CN 102307898序列表14/18 页
    46102307891 A CN 102307898序列表15/18 页
    47102307891 A CN 102307898序列表16/18 页
    48102307891 A CN 102307898序列表17/18 页
    49102307891 A CN 102307898序列表18/18 页