用于将合成气和其他碳源转化成有用产品的微生物和方法 本申请主张 2007 年 12 月 16 日提交的美国临时申请序列号 No.61/138,108 的优 先权， 其全部内容以引用的方式并入本文。
发明背景
本发明总体上涉及能够将甲醇、 合成气体和其他气态碳源转化成较高价值化学品 的生物合成方法和有机体。 更具体而言， 本发明涉及能够生产商用化学品如异丙醇、 4- 羟基 丁酸酯和 1， 4- 丁二醇的非天然存在的有机体。
增加的廉价灵活性和容易获得原料以及最小化对化学品生产的环境影响对于可 持续发展的化学工业是有益的。 原料灵活性依赖于可以访问和使用各种材料作为化工生产 的主要材料的引入方法。
异丙醇 (IPA) 是一种无色、 易燃液体， 与大多数溶剂混合完全， 包括水。 IPA 的最大 用途是作为溶剂， 包括众所周知的但很小使用的 “外用酒精” ， 这是一种 IPA 和水的混合物。 作为溶剂， IPA 在许多日常产品中发现， 如涂料、 油漆、 稀释剂、 油墨、 粘合剂、 通用清洁剂、 消 毒剂、 化妆品、 盥洗用品、 除冰剂和药品。低级 IPA 也用于发动机油中。第二个最大作用是 作为异丙胺 ( 例如在农产品中 )、 异丙醚和异丙酯生产的化工中间体。
异丙醇经由两种石化路线生产。 主要过程需要在有或没有硫酸催化作用下利用丙 烯的水合。其次， IPA 经由丙酮的氢化生产， 这是在苯酚和环氧丙烷生产中形成的副产品。 高价位的丙烯目前在整个化学中正推动成本上升利润下降， 因而正需要低成本原料的扩大 范围。
4- 羟基丁酸 (4- 羟基丁酸酯、 4- 羟基丁酸酯、 4-HB) 是 4- 碳羧酸， 已作为各种商品 和特种化学品中构建块的工业潜力物。 特别地， 4-HB 有可能作为进入 1， 4- 丁二醇系列化学 品的新切入点， 其中包括溶剂、 树脂、 聚合物前体和特种化学品。
BDO 是一种用于高性能聚合物、 溶剂和精细化学品生产的有价值化学品。 它是生产 其他高价值化学品的基础， 如四氢呋喃 (THF) 和 γ- 丁内酯 (GBL)。BDO 的用途包括 (1) 聚 合物， (2)THF 衍生物， 和 (3)GBL 衍生物。在聚合物的情况下， BDO 是一种聚对苯二甲酸乙二 醇酯 (PBT) 生产的共聚单体。PBT 是一种由诸如杜邦公司和通用电气公司生产的中性能工 程热塑性塑料， 其用在汽车、 电器、 供水系统和小家电中。当转化成 THF 时， 和随后转化成聚 四亚甲基醚二醇 (PTMEG) 时， 氨纶和莱卡纤维和服装产业被添加到服务市场。在生产聚酯 醚 (COPE) 时， PTMEG 也与 BDO 相结合。COPES 是高模量弹性体， 具有优良的机械性能和耐油 性 / 耐环境性， 从而允许它们在极端高和低的温度下操作。 PTMEG 和 BDO 还可制造经由标准 挤出、 压延和成型设备加工的热塑性聚氨酯， 其特征在于其出色的韧性和耐磨性， 从 BDO 生 产的 GBL 提供制造吡咯烷酮的原料， 以及服务于农药市场应用本身。吡咯烷酮用作高性能 溶剂， 用于增加在电子行业中使用的提取过程以及用在药物生产中。
BDO 由两种主要石化路线生产， 几个路线也投入商业运营中。 一条路线涉及乙炔与 甲醛的反应， 然后氢化。最近， 已经提出涉及将丁烷或丁二烯氧化成马来酸酐， 然后氢化的 BDO 过程。BDO 几乎唯一用作合成其他化学品和聚合物的中间体。
合成气体 ( 合成气 ) 是主要由 H2 和 CO 组成的混合物， 可经由气化任何有机原料
( 例如煤、 煤油、 天然气、 生物质或有机废物 ) 来获得。已经开发出众多气化方法， 且大部分 设计是基于在高温 (500-1500℃ ) 下部分氧化 ( 其中限制氧气含量以避免完全燃烧 ) 有机 物质以提供作为例如 0.5 ∶ 1-3 ∶ 1H2/CO 混合物的合成气。有时添加蒸汽以增加氢气含 量， 这通常伴随着经水煤气变换反应增加 CO2 产量。
现今， 煤是用于工业生产合成气的主要底物， 而煤通常用于加热和供能， 并且用作 甲醇和液态烃的费托合成 (Fischer-Tropsch synthesis) 的原料。许多大型化学和能源公 司大规模地利用煤气化方法， 并在工业上应用这种技术。
总的来说， 在世界上几乎任何地点， 从包括煤、 生物质、 废物、 聚合物等在内的众多 物质有成本效益地生产合成气的技术当前是存在的。生物质气化技术正在进行商业实践， 尤其是用于热量和能量产生。
虽然可以获得利用合成气的有机体， 但一般来说， 这类有机体的特征不清楚且不 是非常适用于商业开发。例如， 梭菌和相关细菌是严格厌氧菌， 无法耐受高浓度的某些产 物 ( 例如丁醇 )， 因此限制了滴定度和商业化潜力。梭菌还产生很多种产物， 这在获得期望 产物方面带来了分离问题。 最后， 用于操作梭菌基因的灵巧基因工具的开发尚处在初期， 因 此， 它们目前不能容易地经受快速基因工程以便改进期望产物的产率或生产特征。 因此， 需要开发可利用合成气或其他气态碳源来产生期望化学品和燃料的微生物 和其使用方法。 更具体而言， 需要开发用于合成气利用的微生物， 其也具有现有的有效基因 工具， 使其能够经受快速工程改造而以有用的速率和数量产生有价值产物。本发明满足这 种需求并且也提供相关优点。
发明内容
在一些方面， 本发明提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编码异丙 醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径， 所述外源核酸足量表达以产生异丙醇。异丙 醇途径酶包括琥珀酰 -CoA:3- 酮酸 -CoA 转移酶。
在其他方面， 本发明提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编码 4- 羟 基丁酸酯途径酶的至少一种外源核酸的 4- 羟基丁酸酯途径， 所述外源核酸足量表达以产 生 4- 羟基丁酸酯。4- 羟基丁酸酯途径酶包括乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 3- 羟基丁酰 -CoA 脱 氢酶、 巴豆酸酶、 巴豆酰 -CoA 水合酶、 4- 羟基丁酰 -CoA 转移酶、 磷酸转 -4- 羟基丁酰酶和 4- 羟基丁酸酯激酶。
在其他方面， 本发明提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编码 1， 4- 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸的 1， 4- 丁二醇途径， 所述外源核酸足量表达以产生 1， 4- 丁二醇。1， 4- 丁二醇途径酶包括乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 3- 羟基丁酰 -CoA 脱氢酶、 巴 豆酸酶、 巴豆酰 -CoA 水合酶、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原酶 ( 醇形成型 )、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原 酶 ( 醛形成型 ) 和 1， 4- 丁二醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰 -CoA 途径酶的至 少一种外源核酸的乙酰 -CoA 途径， 所述外源核酸足量表达以产生乙酰 -CoA。乙酰 -CoA 途 径酶包括类咕啉蛋白、 甲基四氢叶酸 : 类咕啉蛋白甲基转移酶、 类咕啉铁硫蛋白、 镍蛋白装 配蛋白、 铁氧还蛋白、 乙酰 -CoA 合成酶、 一氧化碳脱氢酶、 丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶 和氢化酶。
在其他方面， 本发明提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编码 1，4- 丁二醇途径酶的至少一种外源核酸的 1， 4- 丁二醇途径， 所述外源核酸足量表达以产生 1， 4- 丁二醇。1， 4- 丁二醇途径酶包括乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 3- 羟基丁酰 -CoA 脱氢酶、 巴 豆酸酶、 巴豆酰 -CoA 水合酶、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原酶 ( 醇形成型 )、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原 酶 ( 醛形成型 ) 和 1， 4- 丁二醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰 -CoA 途径酶的至 少一种外源核酸的乙酰 -CoA 途径， 所述外源核酸足量表达以产生乙酰 -CoA。乙酰 -CoA 途 径酶包括乙酰 -CoA 合成酶、 甲酸酯脱氢酶、 甲酰四氢叶酸合成酶、 次甲基四氢叶酸环化水 解酶、 亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。
在其他方面， 本发明提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编码异丙 醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径， 所述外源核酸足量表达以产生异丙醇。异丙 醇途径酶包括乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 乙酰乙酰 -CoA: 乙酸酯 :CoA 转移酶、 乙酰乙酸酯脱羧 酶和异丙醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰 -CoA 途径酶的至少一种外源核酸， 所 述外源核酸足量表达以产生乙酰 -CoA。乙酰 -CoA 途径酶包括甲醇甲基转移酶、 类咕啉蛋 白、 甲基四氢叶酸 : 类咕啉蛋白甲基转移酶、 类咕啉铁硫蛋白、 镍蛋白装配蛋白、 铁氧还蛋 白、 乙酰 -CoA 合成酶、 一氧化碳脱氢酶、 丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
在其他方面， 本发明提供一种产生异丙醇的方法， 其包括培养具有异丙醇途径的 非天然存在的微生物有机体。所述途径包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸， 所述 外源核酸在用于产生异丙醇的条件和足够时间下足量表达以产生异丙醇。 异丙醇途径包括 琥珀酰 -CoA:3- 酮酸 -CoA 转移酶。 在其他方面， 本发明提供一种产生 4- 羟基丁酸酯的方法， 其包括培养具有 4- 羟基 丁酸酯途径的非天然存在的微生物有机体。所述途径包含编码 4- 羟基丁酸酯途径酶的至 少一种外源核酸， 所述外源核酸在用于产生 4- 羟基丁酸酯的条件和足够时间下足量表达 以产生 4- 羟基丁酸酯。4- 羟基丁酸酯途径酶包括乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 3- 羟基丁酰 -CoA 脱氢酶、 巴豆酸酶、 巴豆酰 -CoA 水合酶、 4- 羟基丁酰 -CoA 转移酶、 磷酸转 -4- 羟基丁酰酶和 4- 羟基丁酸酯激酶。
在其他方面， 本发明提供一种产生 1， 4- 丁二醇的方法， 其包括培养具有 1， 4- 丁二 醇途径的非天然存在的微生物有机体。所述途径包含编码 1， 4- 丁二醇途径酶的至少一种 外源核酸， 所述外源核酸在用于产生 1， 4- 丁二醇的条件和足够时间下足量表达以产生 1， 4- 丁二醇。1， 4- 丁二醇途径包含乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 3- 羟基丁酰 -CoA 脱氢酶、 巴豆酸 酶、 巴豆酰 -CoA 水合酶、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原酶 ( 醇形成型 )、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原酶 ( 醛形成型 ) 和 1， 4- 丁二醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰 -CoA 途径酶的至少 一种外源核酸的乙酰 -CoA 途径， 所述外源核酸足量表达以产生乙酰 -CoA。乙酰 -CoA 途径 酶包括类咕啉蛋白、 甲基四氢叶酸 : 类咕啉蛋白甲基转移酶、 类咕啉铁硫蛋白、 镍蛋白装配 蛋白、 铁氧还蛋白、 乙酰 -CoA 合成酶、 一氧化碳脱氢酶、 丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和 氢化酶。
最后， 在一些方面， 本发明提供一种产生 1， 4- 丁二醇的方法， 其包括培养具有 1， 4- 丁二醇途径的非天然存在的微生物有机体。所述途径包含编码 1， 4- 丁二醇途径酶的至 少一种外源核酸， 所述外源核酸在用于产生 1， 4- 丁二醇的条件和足够时间下足量表达以 产生 1， 4- 丁二醇。1， 4- 丁二醇途径包含乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 3- 羟基丁酰 -CoA 脱氢酶、 巴豆酸酶、 巴豆酰 -CoA 水合酶、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原酶 ( 醇形成型 )、 4- 羟基丁酰 -CoA 还
原酶 ( 醛形成型 ) 和 1， 4- 丁二醇脱氢酶。所述有机体还包含具有编码乙酰 -CoA 途径酶的 至少一种外源核酸的乙酰 -CoA 途径， 所述外源核酸足量表达以产生乙酰 -CoA。乙酰 -CoA 途径酶包括乙酰 -CoA 合成酶、 甲酸酯脱氢酶、 甲酰四氢叶酸合成酶、 次甲基四氢叶酸环化 水解酶、 亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。 附图说明 图 1 显示乙酸酯和乙醇的 Wood-Ljungdahl 途径和形成路径。能够在合成气体上 生长的有机体典型地独有的转化有 ： 1)CO 脱氢酶， 2) 氢化酶， 3) 能量守恒氢化酶 (ECH)， 和 4) 双功能 CO 脱氢酶 / 乙酰 -CoA 合成酶。将氢氧化成 2[H] 或用 H2O 将 CO 氧化成 CO2， 2[H] 提供将 CO2 还原成甲酸酯、 将次甲基 - 四氢叶酸 ( 次甲基 -THF) 还原成亚甲基四氢叶酸 ( 亚 甲基 -THF)、 将亚甲基 -THF 还原成甲基四氢叶酸 ( 甲基 -THF) 以及将 CO2 还原成 CO 的还原 当量。
图 2A 显示完全 Wood-Ljungdahl 途径， 用于将包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体转化为 乙酰 -CoA， 乙酰 -CoA 随后被转化为细胞物质和例如乙醇或乙酸酯等产物。图 2B 显示合成 代谢途径， 其用于将包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体和甲醇转化为乙酰 -CoA 并进一步转化为 异丙醇。图 2C 显示合成代谢途径， 其用于将包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体和甲醇转化为乙 酰 -CoA 并进一步转化为 4- 羟基丁酸酯。图 2D 显示合成代谢途径， 其用于将包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体和甲醇转化为乙酰 -CoA 并进一步转化为 1， 4- 丁二醇。 在图 2A-D 中， 可经工程 改造为生产宿主的特异性酶促转化被编号。缩写 ： 10FTHF ： 10- 甲酰四氢叶酸， 5MTHF ： 5- 甲 基四氢叶酸， ACTP ： 乙酰磷酸， CFeSp ： 类咕啉铁硫蛋白， FOR ： 甲酸酯， MeOH ： 甲醇， METHF ： 亚 甲基四氢叶酸， MLTHF ： 次甲基四氢叶酸， THF ： 四氢叶酸。
图 3A 显示合成代谢途径， 其用于将包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体和甲醇转化为乙 酰 -CoA 并进一步转化为异丙醇。图 3B 显示合成代谢途径， 其用于将包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体和甲醇转化为乙酰 -CoA 并进一步转化为 4- 羟基丁酸酯。图 3C 显示合成代谢途径， 其用于将包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体和甲醇转化为乙酰 -CoA 并进一步转化为 1， 4- 丁二 醇。 在图 3A-C 中， 可经工程改造为生产宿主的特异性酶促转化被编号。 缩写 ： 10FTHF ： 10- 甲 酰四氢叶酸， 5MTHF ： 5- 甲基四氢叶酸， ACTP ： 乙酰磷酸， CFeSp ： 类咕啉铁硫蛋白， FOR ： 甲酸 酯， MeOH ： 甲醇， METHF ： 亚甲基四氢叶酸， MLTHF ： 次甲基四氢叶酸， THF ： 四氢叶酸。
图 4 显示 10 微克 ACS90( 泳道 1)、 ACS91( 泳道 2)、 Mta98/99( 泳道 3 和 4) 的细胞提 取物、 大小标准物 ( 泳道 5) 和热乙酸穆尔氏菌 (M.thermoacetica)CODH(Moth_1202/1203) 或 Mtr(Mo th 1197) 蛋 白 的 对 照 (50、 150、 250、 350、 450、 500、 750、 900 和 1000ng) 的 Western 印迹。
图 5 显示甲基紫精分析中使用的试管。空白在右侧， 含有还原的甲基紫精的试管 在左侧。每个试管上的塞子和真空脂用于保持反应是厌氧性的。
图 6 显示对于将 CH3 从加入的 CH3-THF 转移到纯化的热乙酸穆尔氏菌类咕啉蛋白 而进行分析的 ACS90 细胞提取物的谱图。
图 7 显示重组大肠杆菌 (E.coli)MG1655 在 37℃下在 N2 和 CO 中 36hr 的厌氧性生 长。从左到右显示 ： 空白载体、 ACS90 和 ACS91。
具体实施方式
本发明部分地涉及非天然存在的微生物， 其表达编码与 MtaABC 型甲基转移酶系 统一起催化 Wood-Ljungdahl 途径的羰基分支的酶的基因。 所述有机体能够将甲醇 ( 一种可 来源于合成气体的相对廉价的有机原料 ) 和包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体转化为乙酰 -CoA、 细胞物质和产物， 如异丙醇 (IPA)、 4- 羟基丁酸酯 (4-HB) 和 1， 4- 丁二醇 (BDO)。本发明也 部分地涉及非天然存在的微生物， 其表达编码催化 Wood-Ljungdahl 途径的羰基和甲基分 支的酶的基因。所述有机体能够将包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体转化为乙酰 -CoA、 细胞物 质和产物， 如 IPA、 4-HB 和 BDO。
在一个实施方案中， 本发明提供能够从甲醇和气态原料如合成气的混合物生产异 丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的非天然存在的微生物有机体。在其他实施方案中， 本 发明提供能够从合成气的混合物而无需甲醇生产异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的 非天然存在的微生物有机体。
在另一个实施方案中， 本发明提供通过培养这些非天然存在的微生物有机体生产 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的方法。
利用这些有机体的生物技术过程将会为异丙醇、 4- 羟基丁酸酯和 1， 4- 丁二醇制 造商提供操作灵活性， 以保证基于多元化原料的最低运营成本和任选地抵消目前原料 ( 如 石油和天然气 ) 的市场导向的商品价格波动。此外， 这些过程将提供可持续的生产实践， 利 用再生原料、 降低能源强度和降低温室气体的排放。
诸 如 杨 氏 梭 菌 (Moorella thermoacelica， C.liungdahlii) 和 嗜 羧 酸 梭 菌 (C.carboxidivorans) 等产乙酸菌可利用从己糖到一氧化碳的范围内的多种碳源生长。诸 如葡萄糖等已糖首先经由 Embden-Meyerhof-Parnas(EMP) 糖酵解代谢为丙酮酸酯， 然后经 由丙酮酸酯 ： 铁氧还蛋白氧化还原酶 (PFOR) 转化为乙酰 -CoA。乙酰 -CoA 可用于组建生物 质前体或可转化为乙酸酯， 其经由乙酸酯激酶和磷酸转乙酰酶产生能量。 葡萄糖至乙酸、 能 量和还原当量的总体转化由方程式 1 给出 ：
C6H12O6+4ADP+4Pi → 2CH3COOH+2CO2+4ATP+8[H] 方程式 1
产乙酸菌甚至从葡萄糖中提取更多的能量供应到乙酸酯转化， 同时也通过经由 Wood-Ljungdahl 途径将释放的 CO2 转化为乙酸酯来维持氧化还原平衡。
2CO2+8[H]+n ADP+n Pi → CH3COOH+n ATP 方程式 2
以上方程式中的系数 n 表示这种转化是产生能量的过程， 因为许多产乙酸菌可以 在 CO2 存在下经由 Wood-Ljungdahl 途径生长， 甚至在没有葡萄糖的情况下也可生长， 只要 存在氢以便供应必需的还原当量即可。
2CO2+4H2+n ADP+n Pi → CH3COOH+2H2O+n ATP 方程式 3
图 1 所说明的 Wood-Ljungdahl 途径与 Na+ 或 H+ 离子梯度的产生相联系， 所述离子 + + 梯度可分别经由 Na - 或 H 依赖性 ATP 合成酶产生 ATP(Muller， V.Appl Environ Microbiol 69 ： 6345-6353(2003))。基于这些已知的转化， 产乙酸菌也可具有利用 CO 作为唯一碳源和 能源的能力。具体来说， CO 可经氧化以产生还原当量和 CO2， 或可被直接同化成乙酰 -CoA， 其随后转化为生物质或乙酸酯。
4CO+2H2O → CH3COOH+2CO2 方程式 4
然而， 当存在足够的氢以满足还原当量的需求时， 甚至可获得更高的乙酸酯产率。2CO+2H2 → CH3COOH 方程式 5
根据图 1， 经由乙酰 -CoA 产生乙酸酯时会产生一个 ATP 分子， 而从乙酰 -CoA 产 生乙醇时则不会产生 ATP 分子且需要两个还原当量。因此可以预期， 从合成气产生乙醇 不会在无乙酸产生的情况下产生足够用于细胞生长的能量。然而， 在某些条件下， 杨氏 梭菌 (Clostridium ljungdahlii) 主要从合成气体产生乙醇 (Klasson 等人， Fuel 72 ： 1673-1678(1993))， 表明以下途径的一些组合实际上不产生足以支持细胞生长的能量。
2CO2+6H2 → CH3CH2OH+3H2O 方程式 6
6CO+3H2O → CH3CH2OH+4CO2 方程式 7
2CO+4H2 → -CH3CH2OH+H2O 方程式 8
诸如深红红螺菌 (R.rubrum) 等产氢细菌也可从 CO 和水转化为氢气的过程产生能 量 ( 参见图 1)(Simpma 等人， Critical Reviews in Biotechnology26 ： 41-65(2006))。一 个重要的机制是能量转换氢化酶 (ECH) 和 CO 脱氢酶的协同作用。CO 脱氢酶从 CO 供应电 子， 然后通过 ECH 用于将质子还原为 H2， ECH 的活性与产生能量的质子转移相联系。最终结 果是经由水煤气变换反应产生能量。
本发明的实施方案描述 (1) 用于将合成气连同和不连同甲醇转化为乙酰 -CoA 的 途径与 (2) 用于将乙酰 -CoA 转化为异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的途径的组合。 因此， 本发明提供生产有机体和转化途径， 其与经工程改造以从碳水化合物原料产生异丙 醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的有机体相比具有固有的产率优势。例如， 使用本文所述 的从乙酰 -CoA 开始进行的代谢途径， 从葡萄糖产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的 最大理论产率是每摩尔葡萄糖得到 1 摩尔产物。具体而言， 经由糖酵解每摩尔葡萄糖可产 生 2 摩尔乙酰 -CoA， 且每摩尔异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇需要 2 摩尔乙酰 -CoA。 通过以下化学计量方程式描述净转化 ：
异丙醇 ： C6H12O6+1.5O2 → C3H8O+3CO2+2H2O
4- 羟基丁酸酯 ： C6H12O6+1.5O2 → C4H8O3+2CO2+2H2O
1， 4- 丁二醇 ： C6H12O6 → C4H10O2+CH2O2+CO2
另一方面， 葡萄糖气化为其更简单的组分 CO 和 H2， 随后使用本文所述的途径转化 为异丙醇、 4- 羟基丁酸酯和 1， 4- 丁二醇， 这会产生以下最大理论产率 ：
异丙醇 ： 6CO+6H2 → 1.333C3H8O+2CO2+0.667H2O
4- 羟基丁酸酯 ： 6CO+6H2 → 1.333C4H8O3+0.667CO2+0.667H2O
1， 4- 丁二醇 ： 6CO+6H2 → 1.091C4H10O2+1.636CO2+0.545H2O
应注意葡萄糖的气化最多可提供 6 摩尔 CO 和 6 摩尔 H2。从合成气体产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯和 1， 4- 丁二醇的最大理论产率可通过如下文所述添加甲醇而得到进一步提 高：
异丙醇 ： CH4O+6CO+6H2 → 1.667C3H8O+2CO2+1.333H2O
4- 羟基丁酸酯 ： CH4O+6CO+6H2 → 1.667C4H8O3+0.333CO2+1.333H2O
1， 4- 丁二醇 ： CH4O+6CO+6H2 → 1.364C4H10O2+1.545CO2+1.182H2O
异丙醇 ： 2CH4O+6CO+6H2 → 2C3H8O+2CO2+2H2O
4- 羟基丁酸酯 ： 2CH4O+6CO+6H2 → 2C4HgO3+2H2O
1， 4- 丁二醇 ： 2CH4O+6CO+6H2 → 1.636C4H10O2+1.455CO2+1.818H2O因此， 本文所述的有机体和转化途径显然可提供将碳水化合物转化为异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的有效方法。
当关于本发明的微生物有机体或微生物使用时， 如本文所用的术语 “非天然存在” 意指微生物有机体具有在天然存在的所提及物种的菌株 ( 包括所提及物种的野生型菌株 ) 中通常未发现的至少一处基因变异。 基因变异包括例如引入可表达的编码代谢多肽的核酸 的修饰、 其他核酸添加、 核酸缺失和 / 或微生物遗传物质的其他功能性破坏。所述修饰包括 例如所提及物种的异源、 同源或异源与同源多肽的编码区和其功能片段。其他修饰包括例 如非编码调控区， 其中修饰会改变基因或操纵子的表达。 示例性代谢多肽包括异丙醇、 4- 羟 基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径内的酶或蛋白。
代谢修饰是指从天然存在的状态发生改变的生化反应。因此， 非天然存在的微生 物可具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的基因修饰。本文公开了示例性代谢修饰。
当关于微生物有机体使用时， 如本文所用的术语 “经分离的” 意指有机体基本上不 含在自然界中发现所提及的微生物有机体时所伴随的至少一种组分。 所述术语包括移除自 然环境中所伴随的部分或所有组分的微生物有机体。 所述术语还包括移除非天然存在的环 境中伴随微生物有机体的部分或所有组分的微生物有机体。因此， 经分离的微生物有机体 与在自然界中发现时或在非天然存在的环境中生长、 储存或生存时与其他物质部分或完全 分离。经分离的微生物有机体的具体例子包括部分纯的微生物、 基本上纯的微生物和在非 天然存在的培养基中培养的微生物。
如本文所用的术语 “微生物性” 、 “微生物有机体” 或 “微生物” 意指以古菌域、 细菌 域或真核域内所包括的显微细胞形式存在的任何有机体。因此， 所述术语意图涵盖具有显 微尺寸的原核或真核细胞或有机体， 且包括所有种类的细菌、 古细菌和真细菌， 以及真核微 生物， 例如酵母和真菌。所述术语还包括可经培养以用于产生生化物质的任何种类的细胞 培养物。
如本文所用的术语″ CoA” 或 “辅酶 A” 意指有机辅因子或辅基 ( 酶的非蛋白部 分 )， 其存在对于许多酶 ( 脱辅酶 ) 形成活性酶系统的活性是必需的。辅酶 A 在某些缩合酶 中、 在乙酰基或其他酰基转移中、 在脂肪酸合成和氧化、 在丙酮酸酯氧化中和在其他乙酰化 作用中发挥功能。
当关于培养或生长条件使用时， 如本文所用的术语 “基本上厌氧的” 意指液体培养 基中的含氧量小于溶解氧饱和含量的约 10％。所述术语还意图包括维持在小于约 1％氧气 的气氛下的液体或固体培养基的密封室。
如本文所用的 “外源” 意指所提及的分子或所提及的活性被引入到宿主微生物有 机体中。分子可例如通过将编码核酸引入到宿主遗传物质中而引入， 例如通过编码核酸整 合到宿主染色体中或编码核酸作为非染色体遗传物质 ( 例如质粒 )。因此， 在关于编码核 酸的表达使用时， 所述术语是指将编码核酸以可表达形式引入到微生物有机体中。当关于 生物合成活性使用时， 所述术语是指活性被引入到宿主参考有机体中。来源可为例如同源 或异源编码核酸， 其在引入到宿主微生物有机体中之后表达所提及的活性。因此， 术语 “内 源” 是指所提及的分子或活性是存在于宿主中。类似地， 当关于编码核酸的表达使用时， 所 述术语是指表达微生物有机体内所含的编码核酸。术语 “异源” 是指分子或活性是来源于 除所提及的物种以外的来源， 而 “同源” 是指分子或活性是来源于所述宿主微生物有机体。因此， 本发明的编码核酸的外源表达可利用异源编码核酸或同源编码核酸或这两者。
本发明的非天然存在的微生物有机体可含有稳定的基因变异， 这是指微生物在培 养超过 5 代后仍不会损失所述变异。 一般来说， 稳定的基因变异包括持续超过 10 代的修饰， 特别地， 稳定的修饰将持续超过约 25 代， 更特别地， 稳定的基因修饰将持续超过 50 代， 包括 无限持续下去。
本领域技术人员将了解， 对基因变异 ( 包括本文示例的代谢修饰 ) 的描述是关于 合适的宿主有机体 ( 例如大肠杆菌 ) 和其对应的代谢反应， 或产生期望遗传物质 ( 例如针 对期望代谢途径的基因 ) 的合适来源有机体。然而， 鉴于多种有机体的完整基因组测序和 基因组学领域中的高度技术水平， 本领域技术人员能够容易地将本文提供的教导和指导应 用于基本上所有其他有机体。例如， 通过并入来自除所提及物种以外的物种的相同或类似 的编码核酸， 本文示例的大肠杆菌代谢变化可容易地应用于其他物种。所述基因变异一般 包括例如种间同源物的基因变异， 特别是直系同源物、 旁系同源物或非直系同源基因置换。
直系同源物是通过垂直家系产生关联且在不同有机体中负责基本上相同或一致 的功能的基因。例如， 小鼠环氧化物水解酶和人类环氧化物水解酶可被视为环氧化物水解 的生物功能的直系同源物。 例如， 当基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的时， 所述 基因通过垂直家系产生关联， 或通过从共同祖先进化而产生关联。如果基因具有足量的三 维结构相似性但未必具有足量的序列相似性， 从而在无法鉴别到一级序列相似性的范围内 表明其是进化自共同祖先， 那么所述基因也可被视为直系同源物。直系同源的基因可编码 序列相似性为氨基酸序列同一性的约 25％到 100％的蛋白。如果编码共有氨基酸相似性小 于 25％的蛋白的基因的三维结构也显示相似性， 那么其也被视为是由垂直家系产生的。丝 氨酸蛋白酶家族的成员 ( 包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶 ) 被视为是通过垂直家系 从共同祖先产生的。
直系同源物包括经由例如进化而在结构或总体活性上趋异的基因或其编码的基 因产物。 例如， 在一种物种编码展现两种功能的基因产物的情况下， 以及在所述功能分离成 第二物种中的不同基因的情况下， 这三种基因和其对应产物被视为直系同源物。为了产生 生物化学产物， 本领域技术人员将了解， 可对具有欲引入或破坏的代谢活性的直系同源基 因进行选择， 以便构建非天然存在的微生物。展现可分离活性的直系同源物的例子是不同 活性已在两种或两种以上物种之间或在单一物种内被分离成不同基因产物。 具体例子是弹 性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解 ( 两种类型的丝氨酸蛋白酶活性 ) 被分离成作为 纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶的不同分子。另一例子是支原体 5′ -3′核酸外切酶和果蝇 DNA 聚合酶 III 活性的分离。第一物种的 DNA 聚合酶可被视为第二物种的核酸外切酶或聚 合酶中一者或两者的直系同源物， 且反之亦然。
相反， 旁系同源物是通过例如复制和随后的进化趋异而产生关联且具有相似或共 同、 但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可来源于或衍生于例如相同物种或不同物 种。例如， 微粒体环氧化物水解酶 ( 环氧化物水解酶 I) 和可溶性环氧化物水解酶 ( 环氧化 物水解酶 II) 可被视为旁系同源物， 因为其代表两种共同进化自共同祖先的不同酶， 催化 不同反应且在相同物种中具有不同功能。 旁系同源物是来自相同物种的彼此具有显著序列 相似性的蛋白， 表明其是同源的或通过共同进化自共同祖先而产生关联。旁系同源蛋白家 族的分组包括 HipA 同源物、 荧光素酶基因、 肽酶等。非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因， 可取代不同物种中的参 考基因功能。 取代包括例如能够在起源物种中执行与不同物种中的参考功能相比基本上相 同或类似的功能。虽然一般来说， 非直系同源基因置换可被鉴别为在结构上与编码参考功 能的已知基因相关， 但是结构相关性较小但功能类似的基因和其对应的基因产物在本文中 使用时仍然处于所述术语的含义内。 功能相似性需要例如非直系同源基因产物的活性位点 或结合区域与编码设法取代的功能的基因相比具有至少一些结构相似性。因此， 非直系同 源基因包括例如旁系同源物或无关基因。
因此， 在鉴别和构建具有异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成能力的本 发明的非天然存在的微生物有机体的过程中， 本领域技术人员将了解， 通过对特定物种应 用本文提供的教导和指导， 代谢修饰的鉴别可包括直系同源物的鉴别和纳入或失活。只要 参考微生物中存在旁系同源物和 / 或非直系同源基因置换以用于编码催化类似或基本上 类似的代谢反应的酶， 那么本领域技术人员也可利用这些进化上相关的基因。
直系同源物、 旁系同源物和非直系同源基因置换可通过本领域技术人员熟知的方 法来确定。例如， 检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将会揭示所比较序列之间的序列同一 性和相似性。 基于所述相似性， 如果相似性足够高， 那么本领域技术人员可确定蛋白是通过 进化自共同祖先而产生关联。 本领域技术人员熟知的算法 ( 例如 Align、 BLAST、 Clustal W) 比较和确定粗略序列相似性或同一性， 并且确定序列中可被指派权重或分数的空位的存在 或显著性。所述算法在本领域中也是已知的， 且类似地可用于确定核苷酸序列相似性或同 一性。足以确定关联性的相似性的参数是基于用于计算统计相似性的熟知方法， 或在随机 多肽中发现类似匹配的概率和所确定匹配的显著性来计算得出。 两种或两种以上序列的计 算机比较在必要时也可由本领域技术人员目测优化。 预期相关的基因产物或蛋白可具有高 相似性， 例如 25％到 100％序列同一性。如果扫描足够大小的数据库， 那么无关的蛋白可具 有与预期偶然发生的概率基本上相同的同一性 ( 约 5％ )。5％ -24％之间的序列可能代表 或可能不代表足以推断所比较序列是相关序列的同源性。 可执行鉴于数据集的大小确定所 述匹配的显著性的其他统计分析， 以便确定这些序列的相关性。
使用 BLAST 算法确定两种或两种以上序列的关联性的示例性参数例如可说明如 下。简言之， 氨基酸序列比对可使用 2.0.8 版 (1999 年 1 月 5 日 )BLASTP 和以下参数来进 行： 矩阵 ： 0 BLOSUM62 ； 空位开放 ： 11 ； 空位延伸 ： 1； x_ 扣分 ： 50 ； 期望值 ： 10.0 ； 字长 ： 3； 过 滤器 ： 开。 核酸序列比对可使用 2.0.6 版 (1998 年 9 月 16 日 )BLASTN 和以下参数来进行 ： 匹 11 ； 过滤器 ： 配： 1； 错配 ： -2 ； 空位开放 ： 5； 空位延伸 ： 2； x_ 扣分 ： 50 ； 期望值 ： 10.0 ； 字长 ： 关。 本领域技术人员知悉， 例如， 为了增加或降低比较严格度并确定两种或两种以上序列的 关联性， 可对上述参数作哪些修改。
大肠杆菌 (Escherichia coli) 是具有充分研究的一套基因工具的常用有机体。 将 合成气体转化为乙酰 -CoA( 重要代谢物， 可由其获得细胞物质组分和许多有价值的产物 ) 的能力可被工程改造入外部宿主， 例如大肠杆菌， 其随后表达编码 Wood-Ljungdahl 途径的 各种蛋白的外源基因。所述途径在例如热乙酸穆尔氏菌 (Moorella thermoacetica)( 以前 称作热乙酸梭菌 (Clostridium thermoaceticum)) 等产乙酸有机体中高度活跃， 热乙酸穆 尔氏菌早在 1942 年被分离出时就作为阐明 Wood-Ljungdahl 途径的模型有机体 (Fontaine 等人， J Bacteriol.43 ： 701-715(1942))。Wood-Ljungdahl 途径包含两个分支 ： 东部 ( 或甲基 ) 分支， 其允许 CO2 转化为甲基四氢叶酸 (Me-THF) ； 和西部 ( 或羰基 ) 分支， 其允许甲 基 -THF、 CO 和辅酶 A 转化为乙酰 -CoA( 参见图 2A)。在一些实施方案中， 本发明提供一种 非天然存在的微生物， 其表达与 MtaABC 型甲基转移酶系统一起催化 Wood-Ljungdahl 途径 的羰基分支的酶的编码基因。所述有机体能将甲醇 ( 一种可来源于合成气体的相对廉价的 有机原料 ) 和包含 CO、 CO2 和 / 或 H2 的气体转化为乙酰 -CoA、 细胞物质和产物。
在一些实施方案中， 本发明的有机体具有图 2B 所示的以下能力 ： 1) 功能甲基转移 酶系统， 能够从甲醇和 THF 生产 5- 甲基 - 四氢叶酸 (Me-THF)， 2) 将 CO、 辅酶 A 和 Me-THF 的甲基组合而形成乙酰 -CoA 的能力， 和 3) 从乙酰 -CoA 合成 IPA 的能力。在其他实施方案 中， 本发明的有机体具有功能甲基转移酶系统、 合成乙酰 -CoA 的能力以及从乙酰 -CoA 合成 4-HB 的能力， 如图 2C 所示。本发明的其他有机体具有功能甲基转移酶系统、 合成乙酰 -CoA 的能力以及从乙酰 -CoA 合成 BDO 的能力， 如图 2D 所示。
在一些实施方案中， 本发明的有机体能够 ‘固定’ 来自外源 CO 和 / 或 CO2 和甲醇的 碳， 以合成乙酰 -CoA、 细胞物质和产物。合成气体直接转化为乙酸酯是能量中性过程 ( 参 见图 1 和 2A)。具体而言， 在通过甲酰基 -THF 合成酶形成甲酰基 -THF 的过程中消耗 1 个 ATP 分子， 而在经由乙酸酯激酶产生乙酸的过程中则产生 1 个 ATP 分子。通过确保从甲醇 而不是 CO2 获得甲基分支产物甲基 -THF 上的甲基避免了 ATP 消耗需求。这因此确保了乙 酸酯形成具有正 ATP 产出， 从而帮助支持细胞生长和维持。经工程改造而具有这些能力且 天然也具有回补能力的宿主有机体 ( 例如， 大肠杆菌 ) 可在合适的外部电子受体 ( 例如硝 酸盐 ) 存在下， 利用甲醇和合成气所产生的乙酰 -CoA 生长。这种电子受体用于接受来自于 经由琥珀酸酯脱氢酶而形成的还原苯醌的电子。 添加外部电子受体的一个优点在于可从乙 酰 -CoA 的呼吸作用产生额外的能量用于细胞生长、 维持和产物形成。在其他实施方案中， 可以将丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶 (PFOR) 插到菌株中以允许在不存在外部电子受体 的情况下合成生物质前体。 本发明的有机体的另一特征是能够从分子氢提取还原当量的能 力。这允许高产率的还原产物， 例如乙醇、 丁醇、 异丁醇、 异丙醇、 1， 4- 丁二醇、 琥珀酸、 富马 酸、 苹果酸、 4- 羟基丁酸、 3- 羟基丙酸、 乳酸、 己二酸、 3- 羟基异丁酸、 2- 羟基异丁酸、 甲基丙 烯酸和丙烯酸。
本发明的有机体可从以下来源产生乙酰 -CoA、 细胞物质和目标化学品， 更具体而 言 IPA、 4-HB 或 BDO ： 1) 甲醇和 CO， 2) 甲醇、 CO2 和 H2， 3) 甲醇、 CO、 CO2 和 H2， 4) 甲醇和包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 甲醇和包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
成功地将这种途径工程改造到有机体中会涉及鉴别适当的酶集合， 将其对应基因 克隆到生产宿主中， 优化这些基因的稳定性和表达， 优化发酵条件， 和分析发酵后的产物形 成。 下文描述催化合成气体和甲醇转化为乙酰 -CoA 并进一步转化为异丙醇、 4- 羟基丁酸酯 或 1， 4- 丁二醇所必需的途径的每一步骤的多种酶。为了工程改造生产宿主以利用合成气 和甲醇， 在微生物中表达一种或多种编码酶的外源 DNA 序列。
在一些实施方案中， 本发明提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编 码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径， 所述外源核酸足量表达以产生异丙 醇。异丙醇途径酶包括乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 乙酰乙酰 -CoA: 乙酸酯 :CoA 转移酶、 乙酰乙 酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。本发明的额外异丙醇途径包括琥珀酰 -CoA:3- 酮酸 -CoA 转 移酶 (SCOT)、 乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。所述有机体还可包含例如以下的至少一种酶或多肽 ： 类咕啉蛋白、 甲基四氢叶酸 ： 类咕啉蛋白甲基转移酶、 类咕啉铁硫蛋白、 镍蛋白装配蛋白、 铁氧还蛋白、 乙酰 -CoA 合成 酶、 一氧化碳脱氢酶、 丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
在一些实施方案中， 具有异丙醇途径的有机体可包含甲醇甲基转移酶。在这种实 施方案中， 所述有机体利用例如以下的原料 ： 1) 甲醇和 CO， 2) 甲醇、 CO2 和 H2， 3) 甲醇、 CO、 CO2 和 H2， 4) 甲醇和包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 甲醇和包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
在其他实施方案中， 本发明的有机体具有甲酸酯脱氢酶、 甲酰四氢叶酸合成酶、 次 甲基四氢叶酸环化水解酶、 亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。所述有机体 利用选自以下的原料 ： 1)CO， 2)CO2 和 H2， 3)CO 和 CO2， 4) 包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 包 含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
本发明还提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编码 4- 羟基丁酸酯 途径酶的至少一种外源核酸的 4- 羟基丁酸酯途径， 所述外源核酸足量表达以产生 4- 羟基 丁酸酯。4- 羟基丁酸酯途径酶包括乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 3- 羟基丁酰 -CoA 脱氢酶、 巴豆 酸酶、 巴豆酰 -CoA 水合酶、 4- 羟基丁酰 -CoA 转移酶、 磷酸转 -4- 羟基丁酰酶和 4- 羟基丁酸 酯激酶。
所述有机体还可包含例如以下的至少一种酶或多肽 ： 类咕啉蛋白、 甲基四氢叶酸 ： 类咕啉蛋白甲基转移酶、 类咕啉铁硫蛋白、 镍蛋白装配蛋白、 铁氧还蛋白、 乙酰 -CoA 合成 酶、 一氧化碳脱氢酶、 丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
在一些实施方案中， 具有 4- 羟基丁酸酯途径的有机体可包含甲醇甲基转移酶。所 述有机体利用例如以下的原料 ： 1) 甲醇和 CO， 2) 甲醇、 CO2 和 H2， 3) 甲醇、 CO、 CO2 和 H2， 4) 甲 醇和包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 甲醇和包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
具有 4- 羟基丁酸酯途径的其他有机体可具有甲酸酯脱氢酶、 甲酰四氢叶酸合成 酶、 次甲基四氢叶酸环化水解酶、 亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。 所述有 机体利用例如以下的原料 ： 1)CO， 2)CO2 和 H2， 3)CO 和 CO2， 4) 包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
本发明还提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编码 1， 4- 丁二醇途 径酶的至少一种外源核酸的 1， 4- 丁二醇途径， 所述外源核酸足量表达以产生 1， 4- 丁二醇。 1， 4- 丁二醇途径酶包括例如乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 3- 羟基丁酰 -CoA 脱氢酶、 巴豆酸酶、 巴 豆酰 -CoA 水合酶、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原酶 ( 醇形成型 )、 4- 羟基丁酰 -CoA 还原酶 ( 醛形 成型 ) 和 1， 4- 丁二醇脱氢酶。
所述有机体还可包含例如以下的至少一种酶或多肽 ： 类咕啉蛋白、 甲基四氢叶酸 ： 类咕啉蛋白甲基转移酶、 类咕啉铁硫蛋白、 镍蛋白装配蛋白、 铁氧还蛋白、 乙酰 -CoA 合成 酶、 一氧化碳脱氢酶、 丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
在一些实施方案中， 具有 1， 4- 丁二醇途径的有机体可包含甲醇甲基转移酶。所述 有机体利用例如以下的原料 ： 1) 甲醇和 CO， 2) 甲醇、 CO2 和 H2， 3) 甲醇、 CO、 CO2 和 H2， 4) 甲 醇和包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 甲醇和包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
在其他实施方案中， 具有 1， 4- 丁二醇途径的有机体可包含甲酸酯脱氢酶、 甲酰四 氢叶酸合成酶、 次甲基四氢叶酸环化水解酶、 亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还 原酶。所述有机体利用选自以下的原料 ： 1)CO， 2)CO2 和 H2， 3)CO 和 CO2， 4) 包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
本发明还公开一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含编码乙酰 -CoA 途径 酶的至少一种外源核酸的乙酰 -CoA 途径， 所述外源核酸足量表达以产生乙酰 -CoA。乙 酰 -CoA 途径酶包括甲醇甲基转移酶和乙酰 -CoA 合成酶。
在另一个实施方案中， 本发明提供一种非天然存在的微生物有机体， 其具有包含 编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸的异丙醇途径， 所述外源核酸足量表达以产生异丙 醇， 所述异丙醇途径酶包括甲醇甲基转移酶、 类咕啉蛋白、 甲基四氢叶酸 ： 类咕啉蛋白甲基 转移酶、 类咕啉铁硫蛋白、 镍蛋白装配蛋白、 铁氧还蛋白、 乙酰 -CoA 合成酶、 一氧化碳脱氢 酶、 丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶和氢化酶。
在一些实施方案中， 所述有机体可包含例如以下的外源多肽或酶 ： 乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 乙酰乙酰 -CoA: 乙酸酯 :CoA 转移酶、 乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。在其他 实施方案中， 所述有机体可包含例如以下的外源多肽或酶 ： 琥珀酰 -CoA:3- 酮酸 -CoA 转移 酶 (SCOT)、 乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
经修饰的 Wood-Ljungdahl 途径在外来宿主中的表达 ( 参见图 2B) 需要一组甲 基转移酶以便利用由甲醇提供的碳和氢以及由 CO 和 / 或 CO2 提供的碳。3 种甲基转移 酶蛋白 ( 表示为 MtaA、 MtaB 和 MtaC) 的复合物发挥期望的甲醇甲基转移酶活性 (Naidu 和 Ragsdale， J Bacteriol.183 ： 3276-3281(2001) ； Ragsdale， S.W.， Crit Rev.Biochem. Mol.Biol 39 ： 165-195(2004) ； Sauer 等人， Eur.J BioChem.243 ： 670-677(1997) ； Tallant 和 Krzycki， JBacteriol.178 ： 1295-1301(1996) ； Tallant 和 Krzycki， J Bacteriol.179 ： 6902-6911(1997) ； Tallant 等人， J Biol Chem.276 ： 4485-4493(2001))。
MtaB 是一种锌蛋白， 催化甲基从甲醇转移到 MtaC( 类咕啉蛋白 )。可在产甲烷古 细菌， 例如巴氏甲烷八叠球菌 (Methanosarcina barkeri)(Maeder 等人， J Bacteriol.188 ： 7922-7931(2006)) 和 嗜 乙 酸 甲 烷 八 叠 球 菌 (Methanosarcina acetivorans)(Galagan 等 人， 基 因 组 Res 12 ： 532-542(2002))， 以 及 产 乙 酸 菌 热 乙 酸 穆 尔 氏 菌 (Moorella thermoacetica)(Das 等人， Proteins 67 ： 167-176(2007)) 中发现编码 MtaB 和 MtaC 的示例 性基因。一般来说， MtaB 和 MtaC 基因在染色体上彼此相邻， 因为其活性紧密地相互依赖。 巴氏甲烷八叠球菌、 嗜乙酸甲烷八叠球菌和热乙酸穆尔氏菌中的各种 MtaB 和 MtaC 编码基 因的蛋白序列可由以下 GenBank 登记号标识。
表 1.
蛋白 MtaB1 MtaC1 GenBank ID YP_304299 YP_304298 有机体 巴氏甲烷八叠球菌 巴氏甲烷八叠球菌MtaB2 MtaC2YP_307082 YP_307081巴氏甲烷八叠球菌 巴氏甲烷八叠球菌25102307986 A CN 102307993说MtaB3 MtaC3明书巴氏甲烷八叠球菌 巴氏甲烷八叠球菌13/52 页YP_304612 YP_304611MtaB1 MtaB1NP_615421 NP_615422嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌MtaB2 MtaC2NP_619254 NP_619253嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌MtaB3 MtaC3NP_616549 NP_616550嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌MtaB MtaC
YP_430066 YP_430065热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌将 来 自 巴 氏 甲 烷 八 叠 球 菌 的 MtaB1 和 MtaC1 基 因 YP_304299 和 YP_304298 克 隆 到 大 肠 杆 菌 并 测 序 (Sauer 等 人， Eur.J BioChem.243 ： 670-677(1997))。 也 可 获 得 这 种 甲 醇 - 钴 胺 素 甲 基 转 移 酶 复 合 物 的 晶 体 结 构 (Hagemeier 等 人， Proc Natl Acad Sci U.S.A.103 ： 18917-18922(2006))。巴氏甲烷八叠球菌中的 MtaB 基因 YP_307082 和 YP_304612 是通过与 YP_304299 的序列同源性鉴别。一般来说， 同源性搜索是鉴别甲醇甲 基转移酶的有效方法， 因为 MtaB 编码基因与作用于替代底物 ( 例如三甲胺、 二甲胺、 单甲 胺或二甲硫醚 ) 的甲基转移酶显示很小的相似性或不显示相似性。MtaC 基因 YP_307081 和 YP_304611 是基于其与 MtaB 基因的邻近性以及其与 YP_304298 的同源性来鉴别。来自 嗜乙酸甲烷八叠球菌的三组 MtaB 和 MtaC 基因已在遗传学、 生理学和生物化学上得到表征 (Pritchett 和 Metcalf， Mol.Microbiol 56 ： 1 183-1194(2005))。缺乏这三组基因中的两 组的突变菌株能够在甲醇上生长， 而缺乏所有三组 MtaB 和 MtaC 基因的菌株则无法在甲醇 上生长。这表明每一组基因都在甲醇利用方面起作用。热乙酸穆尔氏菌 MtaB 基因是基于 其与产甲烷菌 MtaB 基因的同源性以及其与甲醇引起的类咕啉蛋白 MtaC 的相邻染色体邻 近性来鉴别， MtaC 已被结晶 (Zhou 等人， Acta Crvstallogr.Sect.F Struct.Biol Cryst. Commun.61 ： 537-540(2005)) 且通过 Northern 杂交和 Western 印迹技术进一步表征 (Das 等 人， Proteins 67 ： 167-176(2007))。
MtaA 是一种锌蛋白， 催化甲基在产甲烷菌中从 MtaC 转移到辅酶 M 上或在产乙酸 菌中从 MtaC 转移到甲基四氢叶酸上。MtaA 还可利用甲基钴胺素作为甲基供体。可在产甲 烷古细菌， 例如巴氏甲烷八叠球菌 (Maeder 等人， J Bacteriol.188 ： 7922-7931(2006)) 和嗜乙酸甲烷八叠球菌 (Galagan 等人， 基因组 Res 12 ： 532-542(2002))， 以及产乙酸菌热乙 酸穆尔氏菌 (Das 等人， Proteins 67 ： 167-176(2007)) 中发现编码 MtaA 的示例性基因。一 般来说， 催化甲基从 CH3-MtaC 转移的 MtaA 蛋白难以在生物信息学上鉴别， 因为其与其他类 咕啉蛋白甲基转移酶具有相似性且在染色体上与 MtaB 和 MtaC 基因相邻定向。然而， 许多 MtaA 编码基因已经得到表征。 巴氏甲烷八叠球菌和嗜乙酸甲烷八叠球菌中的这些基因的蛋 白序列可由以下 GenBank 登记号标识。
表 2.
蛋白 MtaA MtaA1 MtaA2
GenBank ID YP_304602 NP_619241 NP_616548 有机体 巴氏甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌克隆来自巴氏甲烷八叠球菌的 MtaA 基因 YP_304602， 对其测序并在大肠杆菌中功 能性地过度表达 (Harms 和 Thauer， Eur.J BioChem.235 ： 653-659(1996))。在嗜乙酸甲烷 八叠球菌中， MtaA1 是在甲醇上生长所必需的， 而 MtaA2 则是不必要的， 即便在 MtaA2 突变 株中从甲醇产生甲烷被削弱了 (Bose 等人， J Bacteriol.190 ： 4017-4026(2008))。在巴氏 甲烷八叠球菌和嗜乙酸甲烷八叠球菌中还有多种尚未表征的其他 MtaA 同源物， 但其也会 催化类咕啉蛋白甲基转移酶活性。
热乙酸穆尔氏菌中的假定 MtaA 编码基因是通过其与已表征的产甲烷菌 MtaA 基 因的序列相似性来鉴别。具体而言， 三种热乙酸穆尔氏菌基因与来自巴氏甲烷八叠球菌的 YP_304602 显示高度同源性 ( ＞ 30％序列同一性 )。不同于天然催化甲基从 CH3-MtaC 转移 到辅酶 M 的产甲烷菌 MtaA 蛋白， 鉴于甲基四氢叶酸和辅酶 M 分别在产甲烷菌和产乙酸菌中 的类似角色， 热乙酸穆尔氏菌 MtaA 很可能将甲基转移到甲基四氢叶酸。来自热乙酸穆尔氏 菌的假定 MtaA 编码基因的蛋白序列可由以下 GenBank 登记号标识。
表 3.
蛋白 MtaA MtaA MtaA
GenBank ID YP_430937 YP_431175 YP_430935 有机体 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌ACS/CODH 是 Wood-Ljungdahl 途径的羰基分支的中心酶。其催化二氧化碳到一 氧化碳的可逆还原， 以及从一氧化碳、 辅酶 A 和来自甲基化类咕啉铁硫蛋白的甲基获得乙 酰 -CoA 的合成。类咕啉铁硫蛋白经由甲基转移酶由甲基四氢叶酸甲基化。ACS/CODH 在 外来宿主中的表达涉及引入以下蛋白和其对应活性中的一种或多种 ： 甲基四氢叶酸 ： 类咕啉蛋白甲基转移酶 (AcsE)、 类咕啉铁硫蛋白 (AcsD)、 镍蛋白装配蛋白 (AcsF)、 铁氧还蛋 白 (Orf7)、 乙酰 -CoA 合成酶 (AcsB 和 AcsC)、 一氧化碳脱氢酶 (AcsA) 或镍蛋白装配蛋白 (CooC)。
一氧化碳脱氢酶 / 乙酰 -CoA 合成酶活性所用的基因典型地驻留在可作为延伸操 纵子的天然基因组的有限区域中 (Morton 等人， J Biol Chem.266 ： 23824-23828(1991) ； Ragsdale， S.W.， Crit Rev.Biochem.Mol.Biol 39 ： 165-195(2004) ； Roberts 等 人， Proc Natl Acad Sci U.S.A.86 ： 32-36(1989))。 来 自 产 乙 酸 菌 热 乙 酸 穆 尔 氏 菌 的 此 操纵子中的每种基因已在大肠杆菌中克隆并积极地表达 (Lu 等人， J Biol Chem.268 ： 5605-5614(1993) ； Roberts 等人， Proc Natl Acad Sci U.S.A.86 ： 32-36(1989))。这些基 因的蛋白序列可由以下 GenBank 登记号标识。
表 4.
蛋白 AcsE AcsD AcsF Orf7 AcsC AcsB AcsA CooC
GenBank ID YP_430054 YP_430055 YP_430056 YP_430057 YP_430058 YP_430059 YP_430060 YP_430061 有机体 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌产氢细菌生氢氧化碳嗜热菌可通过乙酰 -CoA 合成酶利用一氧化碳作为生长底物 (Wu 等人， PLoS Genet.I ： e65(1995))。 在菌株 Z-2901 中， 乙酰 -CoA 合成酶复合物因为移码 突变而缺乏一氧化碳脱氢酶 (Wu 等人， PLoS Genet.I ： e65(1995))， 而在菌株 DSM 6008 中， 已经纯化了这种蛋白的功能性未移码全长形式 (Svetlitchnyi 等人， Proc Natl Acad Sci U.S.A.101 ： 446-451(2004))。来自菌株 Z-2901 的生氢氧化碳嗜热菌基因的蛋白序列可由 以下 GenBank 登记号标识。生氢氧化碳嗜热菌 DSM 6008 的序列目前无法从公众可利用的 数据库获得。
表 5.
蛋白 AcsE GenBank ID YP_360065 有机体 生氢氧化碳嗜热菌28102307986 A CN 102307993 AcsD AcsF Orf7 AcsC AcsB CooC
说明书生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌16/52 页YP_360064 YP_360063 YP_360062 YP_360061 YP_360060 YP_360059产甲烷古细菌嗜乙酸甲烷八叠球菌也可在一氧化氮上生长， 展现乙酰 -CoA 合成 酶 / 一氧化碳脱氢酶活性， 且同时产生乙酸酯和甲酸酯 (Lessner 等人， Proc Natl Acad Sci U.S.A.103 ： 17921-17926(2006))。 这种有机体含有两组编码 ACS/CODH 活性的基因 (Rother 和 Metcalf， Proc Natl Acad SciU.S.A.101 ： 16929-16934(2004))。这两组嗜乙酸甲烷八 叠球菌基因的蛋白序列可由以下 GenBank 登记号标识。
表 6.
蛋白 AcsC AcsD AcsF， CooC AcsB AcsEps AcsA GenBank ID NP_618736 NP_618735 NP_618734 NP_618733 NP_618732 NP_618731 有机体 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌AcsC AcsD AcsF， CooC AcsB AcsEps AcsANP_615961 NP_615962 NP_615963 NP_615964 NP_615965 NP_615966嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌 嗜乙酸甲烷八叠球菌AcsC、 AcsD、 AcsB、 AcsEps 和 AcsA 蛋白通常被称作产甲烷菌 CODH/ACS 的 γ、 δ、 β、 ε 和 α 亚单元。例如热乙酸穆尔氏菌等产乙酸菌或例如生氢氧化碳嗜热菌等产氢细 菌中并不存在 ε 编码基因的同源物。嗜乙酸甲烷八叠球菌中存在两种活性 CODH/ACS 操 纵子的假设包括 ： 催化性质 ( 即， Km， Vmax， kcat)， 其促进一氧化碳营养或解乙酸生长 ； 或差 异基因调控， 其启动各种刺激以诱发 CODH/ACS 表达 (Rother 等人， Arch.Microbiol 188 ： 463-472(2007))。
在热乙酸穆尔氏菌和生氢氧化碳嗜热菌中， 其他 CODH 编码基因位于 ACS/CODH 操 纵子外部。这些酶提供从一氧化碳到二氧化碳的转化作用中提取电子 ( 或还原当量 ) 的方 式。还原当量然后传递到受体， 例如氧化铁氧还蛋白、 NADP+、 水或过氧化氢， 以分别形成还 原铁氧还蛋白、 NADPH、 H2 或水。在一些情况下， 氢化酶编码基因与 CODH 邻近。在深红红螺 菌中， 经编码的 CODH/ 氢化酶蛋白形成膜结合酶复合物， 其被提议作为通过 CO 转化为 CO2 和 H2 而产生质子梯度形式的能量的位点 (Fox 等人， J Bacteriol.178 ： 6200-6208(1996))。 生氢氧化碳嗜热菌的 CODH-I 和其相邻基因已被提议基于其与深红红螺菌 CODH/ 氢化酶基 因簇的类似性来催化类似的功能角色 (Wu 等人， PLoS Genet.I ： e65(2005))。也已显示生 氢氧化碳嗜热菌 CODH-I 在连接于电极时会展现强烈的 CO 氧化和 CO2 还原活性 (Parkin 等人， J Am.Chem.Soc.129 ： 10328-10329(2007))。对编码生氢氧化碳嗜热菌 CODH-II 和 邻近蛋白 CooF 的基因进行克隆和测序 (Gonzalez 和 Robb， FEMS Microbiol Lett.191 ： 243-247(2000))。所得复合物是膜结合的， 但 CODH-II 的细胞质部分显示可催化 NADPH 的 形成， 这表明合成代谢作用 (Svetlitchnyi 等人， J Bacteriol.183 ： 5134-5144(2001))。 CODH-II 的晶体结构也可获得 (Dobbek 等人， Science 293 ： 1281-1285(2001))。 示例性 CODH 和氢化酶基因的蛋白序列可由以下 GenBank 登记号标识。
表 7.
蛋白 CODH( 假定 ) GenBank ID YP_430813 有机体 热乙酸穆尔氏菌CODH-I(CooS-I) CooF HypA CooH CooU CooX CoolYP_360644 YP_360645 YP_360646 YP_360647 YP_360648 YP_360649 YP_360650生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌30102307986 A CN 102307993 Cook CooM说明书生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌18/52 页YP_360651 YP_360652CooM Cook Cool CooX CooU CooH CooF CODH(CooS) CooC Coot CooJAAC45116 AAC45117 AAC45118 AAC45119 AAC45120 AAC45121 AAC45122 AAC45123 AAC45124 AAC45125 AAC45126深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌 深红红螺菌CODH-II(CooS-II) CooF
YP_358957 YP_358958生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌在不存在外部电子受体的情况下， 在合成气体和甲醇上的厌氧生长通过允许经由 丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶 (PPOR) 合成丙酮酸酯而赋予宿主有机体 MTR 和 ACS/CODH 活性。来自非洲脱硫弧菌的 PFOR 已在大肠杆菌中克隆并表达， 从而产生在氧存在下可稳定 数天的活性重组酶 (Pieulle 等人， J Bacteriol.179 ： 5684-5692(1997))。 氧稳定性在 PFOR 中相对罕见， 认为其是由非洲脱硫弧菌酶的多肽链中的 60 个残基的延伸引起的。热乙酸穆 尔氏菌 PFOR 也已得到充分表征 (Menon 和 Ragsdale， Biochemistry 36 ： 8484-8494(1997)) 且显示在自养生长期间在丙酮酸酯合成的方向上具有高活性 (Furdui 和 Ragsdale， J Biol Chem.275 ： 28494-28499(2000))。此外， 大肠杆菌具有未被表征的开放阅读框 ydbK， 其编码 与热乙酸穆尔氏菌 PFOR 具有 51％同一性的蛋白。丙酮酸酯氧化还原酶活性的证据已有描 述 (Blaschkowski 等人， Eur.J BioChem.123 ： 563-569(1982))。这些示例性 PFOR 酶的蛋 白序列可由以下 GenBank 登记号标识。若干种其他的 PFOR 酶已有描述 (Ragsdale， S.W.， Chem.Rev.103 ： 2333-2346(2003))。
表 8.31102307986 A CN 102307993
蛋白 Por Por YdbK
说明书有机体 非洲脱硫弧菌 热乙酸穆尔氏菌 大肠杆菌19/52 页GenBank ID CAA70873.1 YP_428946.1 NP_415896.1不同于 CO 和 MeOH 到乙酰 -CoA 或乙酸酯的氧化还原中性转化， 以最高的可能产率 产生还原程度更高的产物 ( 例如乙醇、 丁醇、 异丁醇、 异丙醇、 1， 4- 丁二醇、 丁二酸、 富马酸、 苹果酸、 4- 羟基丁酸、 3- 羟基丙酸、 乳酸、 己二酸、 3- 羟基异丁酸、 2- 羟基异丁酸、 甲基丙烯 酸和丙烯酸 ) 则需要从 CO 和 H2 提取额外的还原当量 ( 例如参见图 2A 中的乙醇形成 )。具 体而言， 还原当量 ( 例如图 2 中的 2[H]) 是通过 CO 和水经由一氧化碳脱氢酶转化为 CO2 来 获得， 或者直接来自利用氢的氢化酶将电子从 H2 转移到受体 ( 例如铁氧还蛋白、 黄素氧还 + + + 蛋白、 FAD 、 NAD 或 NADP ) 的活性。 大肠杆菌和其他肠细菌天然具有编码至多 4 种氢化酶的多种基因 (Sawers， G. ， Antonie Van Leeuwenhoek 66 ： 57-88(1994) ； Sawers 等 人， JBacteriol.164 ： 1324-1331(1985) ； Sawers 和 Boxer， Eur.J BioChem.156 ： 265-275(1986) ； Sawers 等人， J Bacteriol.168 ： 398-404(1986))。鉴于酶活性的多样性， 大肠杆菌或另一种宿主有机体有 可能提供足够的氢化酶活性以便分裂进入的分子氢并还原对应受体。 大肠杆菌的内源氢裂 解酶包括氢化酶 3、 使用铁氧还蛋白作为受体的膜结合酶复合物和也使用铁氧还蛋白受体 的氢化酶 4。 氢化酶 3 和 4 分别由 hyc 和 hyf 基因簇编码。 大肠杆菌中的氢化酶活性也取决于 hyp 基因的表达， 所述 hyp 基因对应的蛋白与氢化酶复合物的装配有关 (Jacobi 等人， Arch. Microbiol 158 ： 444-451(1992) ； Rangarajan 等人， J Bacteriol.190 ： 1447-1458(2008))。 热乙酸穆尔氏菌氢化酶适于缺乏足够的内源氢化酶活性的宿主。热乙酸穆尔氏菌可以 CO2 作为独有的碳源生长， 表明还原当量是从 H2 提取以允许经由 Wood-Ljungdahl 途径的 乙 酰 -CoA 合 成 (Drake， H.L.， J Bacteriol.150 ： 702-709(1982) ； Drake 和 Daniel， Res Microbiol 155 ： 869-883(2004) ； Kellum 和 Drake， J Bacteriol.160 ： 466-469(1984))( 参 见图 2A)。热乙酸穆尔氏菌具有来自大肠杆菌的若干 hyp、 hyc 和 hyf 基因的同源物。这些 基因所编码的这些蛋白序列可由以下 GenBank 登记号标识。此外， 热乙酸穆尔氏菌中存在 若干种编码氢化酶功能的基因簇， 且其对应的蛋白序列也在下表 9 中提供。
表 9.
蛋白 HypA HypB HypC GenBank ID NP_417206 NP_417207 NP_4172O8 有机体 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌32102307986 A CN 102307993 HypD Hype HypF
说明书大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌20/52 页NP_417209 NP_417210 NP_417192热乙酸穆尔氏菌中基因与大肠杆菌 hyp 基因同源的蛋白示于下表 10。 氢化酶 3 蛋 白列于表 11。氢化酶 4 蛋白示于表 12。
表 10.
蛋白 Moth_2175 Moth_2176 Moth_2177 Moth_2178 Moth_2179 Moth_2180 Moth_2181
蛋白 HycA HycB HycC HycD HycE HycF HycG GenBank ID NP_417205 NP_417204 NP_417203 NP_417202 NP_417201 NP_417200 NP_417199 有机体 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 GenBank ID YP_431007 YP_431008 YP_431009 YP_431010 YP_431011 YP_431012 YP_431013 有机体 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌表 11.33102307986 A CN 102307993 HycH HycI
蛋白 HyfA HytB HyfC HytD HyfE HyfF HyfG HyfH HyfI HyfJ HyfR
说明书大肠杆菌 大肠杆菌21/52 页NP_417198 NP_417197表 12.GenBank ID NP_416976 NP_416977 NP_416978 NP_416979 NP_416980 NP_416981 NP_416982 NP_416983 NP_416984 NP_416985 NP_416986 有机体 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌热乙酸穆尔氏菌中基因与大肠杆菌 hyc 和 / 或 hyf 基因同源的蛋白示于下表 13。 热乙酸穆尔氏菌中其他的氢化酶编码基因簇示于表 14。
表 13.
蛋白 Moth_2182 Moth_2183 Moth_2184 Moth_2185 GenBank ID YP_431014 YP_431015 YP_431016 YP_431017 有机体 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌34102307986 A CN 102307993 Moth_2186 Moth_2187 Moth_2188 Moth_2189 Moth_2190 Moth_2191 Moth_2192
蛋白 Moth_0439 Moth_0440 Moth_0441 Moth_0442说明书热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌22/52 页YP_431018 YP_431019 YP_431020 YP_431021 YP_431022 YP_431023 YP_431024表 14.GenBank ID YP_429313 YP_429314 YP_429315 YP_429316 有机体 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌Moth_0809 Moth_0810 Moth_0811 Moth_0812 Moth_0813 Moth_0814 Moth_0815 Moth_0816YP_429670 YP_429671 YP_429672 YP_429673热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌YP_429674 YP_429675 YP_429676热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌Moth_1193 Moth_1194YP_430050 YP_430051 35热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌102307986 A CN 102307993 Moth_1195 Moth_1196说明书热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌23/52 页YP_430052 YP_430053Moth_1717 Moth_1718 Moth_1719YP_430562 YP_430563 YP_430564热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌Moth_1883 Moth_1884 Moth_1885 Moth_1886 Moth_1887 Moth_1888YP_430726 YP_430727 YP_430728 YP_430729 YP_430730 YP_430731热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌Moth_1452 Moth_1453 Moth_1454
YP_43O305 YP_430306 YP_430307热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌异丙醇生产在表达来自丙酮丁醇梭菌的两种异源基因 (thl 和 adc 分别编码 乙酰乙酰 -CoA 硫解酶和乙酰乙酸酯脱羧酶 ) 和来自拜氏梭菌的一种基因 (adh 编码二 级醇脱氢酶 ) 后的重组大肠杆菌中实现， 同时编码乙酰乙酰 -CoA: 乙酸酯 :CoA 转移酶 活性的天然 atoA 和 atoD 基因的表达增加 (Hanai 等人， Appl Environ Microbiol 73 ： 7814-7818(2007))。
乙酰乙酰 -CoA 硫解酶将 2 分子的乙酰 -CoA 转化为 1 分子的乙酰乙酰 -CoA 和 1 分子的 CoA。示例性乙酰乙酰 -CoA 硫解酶包括以下基因的基因产物 ： 来自大肠杆菌的 atoB(Martin 等人， Nat.Biotechnol 21 ： 796-802(2003))、 来自丙酮丁醇梭菌的 thlA 和 thlB(Hanai 等 人， Appl EnvironMicrobiol 73 ： 7814-7818(2007) ； Winzer 等 人， J.Mol. Microbiol Biotechnol2 ： 531-541(2000)) 和来自酿酒酵母的 ERG10(Hiser 等人， J.Biol. Chem.269 ： 31383-31389(1994))。
表 15.
36102307986 A CN 102307993 蛋白 AtoB ThIA ThIB ERG10
说明书有机体 大肠杆菌 丙酮丁醇梭菌 丙酮丁醇梭菌 酿酒酵母24/52 页GenBank ID NP_416728 NP_349476.1 NP_149242.1 NP_015297乙 酰 乙 酰 -CoA: 乙 酸 酯 :CoA 转 移 酶 将 乙 酰 乙 酰 -CoA 和 乙 酸 酯 转 化 成 乙 酰 乙 酸 酯 和 乙 酰 -CoA。 示 例 性 酶 包 括 来 自 大 肠 杆 菌 的 atoAD 的 基 因 产 物 (Hanai 等 人， Appl Environ Microbiol 73 ： 7814-7818(2007)、 来自丙酮丁醇梭菌的 ctfAB 的基因产物 (Jojima 等 人， Appl Microbiol Biotechnol 77 ： 1219-1224(2008) 和 来 自 Clostridium saccharoperbutylacetonicum 的 ctfAB 的 基 因 产 物 (Kosaka 等 人， Biosci.Biotechnol BioChem.71 ： 58-68(2007))， 示于下表 16。琥珀酰 -CoA:3- 酮酸 CoA 转移酶 (SCOT) 也可以 催化 3- 酮代酰基 -CoA、 乙酰乙酰 -CoA 转化成 3- 酮酸、 乙酰乙酸酯。 与乙酰乙酰 -CoA: 乙酸 酯 :CoA 转移酶相反， SCOT 利用琥珀酸酯代替乙酸酯作为 CoA 受体。示例性琥珀酰 -CoA:3: 酮酸 -CoA 转移酶存在于幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)(Corthesy-Theulaz 等人， J Biol Chem 272 ： 25659-25667(1997))、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)(Stols， L. 等 人， Protein ExprPurif 53 ： 396-403(2007)) 和 智 人 (Homo sapiens)(Fukao， T. 等 人， Genomics68 ： 144-151(2000) ； Tanaka， H. 等人， MoI Hum Reprod 8 ： 16-23(2002)) 中。能 够进行这种转化的另一种转移酶是丁酰 -CoA: 乙酰乙酸酯 CoA- 转移酶。示例性酶可以 在 具 核 梭 杆 菌 (Fusobacterium nucleatum)(Barker H.A. 等 人， J Bacteriol 152(1) ： 201-7(1982))、 梭菌 SB4(Barker H.A. 等人， JBiol Chem 253(4) ： 1219-25(1978)) 和丙酮 丁醇梭菌 (Wiesenborn D.P. 等人， Appl Environ Mic robiol 55(2) ： 323-9(1989)) 中找 到。应注意， 许多转移酶具有广泛的特异性， 从而可以利用多种 CoA 受体， 如乙酸酯、 琥珀酸 酯、 丙酸酯、 丁酸酯、 2- 甲基乙酰乙酸酯、 3- 酮代己酸酯、 3- 酮代戊酸酯、 戊酸酯、 巴豆酸酯、 3- 巯基丙酸酯、 丙酸酯、 乙酸乙烯酯、 丁酸酯等等。或者， 乙酰乙酰 -CoA 水解酶可以用来将 乙酰乙酰 -CoA 转化成乙酰乙酸酯。这种酶在各种哺乳动物中是共有的 (Patel， T.B. 等人， Biochem J， 176 951-958(1978) ； Rous， S.， Biochem Biophys Res Commun 69 74-78(1976) ； Baird， G.D. 等人， Biochem J 117 703-709(1970))。
表 16.
蛋白 AtoA AtoD GenBank ID NP_416726.1 NP_416725.1 有机体 大肠杆菌 大肠杆菌37102307986 A CN 102307993 CtfA CtfB CtfA CtfB HPAGI_0676 HPAGI_0677 ScoA ScoB OXCT1 OXCT2
说NP_149326.1 NP_149327.1 AAP42564.1 AAP42565.1 YP_627417 YP_627418 NP_391778 NP_391777 NP_000427 NP_071403明书丙酮丁醇梭菌 丙酮丁醇梭菌25/52 页Clostridium saccharoperbutylacetonicum Clostridium saccharoperbutylacetonicum 幽门螺杆菌 幽门螺杆菌 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 智人 智人乙酰乙酸酯脱羧酶将乙酰乙酸酯转化成二氧化碳和丙酮。 示例性乙酰乙酸酯脱羧 酶由丙酮丁醇梭菌的 adc 基因产物编码 (Petersen 和 Bennett， Appl Environ.Microbiol 56 ： 3491-3498(1990)) 和 Clostridium saccharoperbutylacetonicum 的 adc 基因产物编 码 (Kosaka 等人， Biosci.Biotechnol BioChem.71 ： 58-68(2007))。 来自拜氏梭菌的酶可以 从序列相似性推断。这些蛋白在下表 17 中标识。
表 17.
蛋白 Adc Adc Adc
GenBank ID NP_149328.1 AAP42566.1 YP_001310906.1 有机体 丙酮丁醇梭菌 Clostridium saccharoperbutylacetonicum 拜氏梭菌异丙醇合成途径的最后步骤涉及丙酮还原成异丙醇。能够进行这种转化的 示 例 性 醇 脱 氢 酶 包 括 来 自 拜 氏 梭 菌 的 adh(Hanai 等 人， Appl EnvironMicrobiol 73 ： 7814-7818(2007) ； Jojima 等 人， Appl Microbiol Biotechnol77 ： 1219-1224(2008)) 和 来自嗜热厌氧乙醇菌的 adh(Hanai 等人， ApplEnviron Microbiol 73 ： 7814-7818(2007) ； Peretz 等人， Anaerobe 3 ： 259-270(1997))。其他特征酶包括来自 Ralstonia eutropha 的 醇脱氢酶 ( 以前的真氧产碱杆菌 )(Steinbuchel 和 Schlegel 等人， Eur.J.BioChem.141 ： 555-564(1984)) 和 Phytomonas 物 种 (Uttaro 和 Opperdoes 等 人， Mol.Biochem. Parasitol.85 ： 213-219(1997))。
表 18.38102307986 A CN 102307993
蛋白 Adh Adh Adh iPDH
说明书有机体 嗜热厌氧乙醇菌 拜氏梭菌 氧产碱杆菌 植生滴虫菌26/52 页GenBank ID P14941.1 AAA23199.2 YP_29939.1 AAP39869.1将乙酰乙酰 -CoA 转化为 3- 羟基丁酰 -CoA 的示例性 3- 羟基酰基脱氢酶包括来自 丙酮丁醇梭菌的 hbd(Boynton 等人， Journal of Bacteriology 178 ： 3015-3024(1996))、 来 自拜氏梭菌 (C.beijerinckii) 的 hbd(Colby 和 Chen 等人， Appl Environ.Microbiol 58 ： 3297-3302(1992)) 和来自勤奋金属球菌 (Metallosphaera sedula) 的许多类似酶 (Berg 等 人， 2007 Science 318 ： 1782-1786(2007))。
表 19.
蛋白 hbd hbd Msed_1423 Msed_0399 Msed_0389 Msed_1993
GenBank ID NP_349314.1 AAM14586.1 YP_001191505 YP_001190500 YP_001190490 YP_001192057 有机体 丙酮丁醇梭菌 拜氏梭菌 勤奋金属球菌 勤奋金属球菌 勤奋金属球菌 勤奋金属球菌来 自 丙 酮 丁 醇 梭 菌 的 crt 的 基 因 产 物 催 化 3- 羟 基 丁 酰 -CoA 脱 水 生 成 巴 豆 酰 -CoA(Atsumi 等 人， Metab Eng(2007) ； Boynton 等 人， Journal ofBacteriology 178 ： 3015-3024(1996))。此外， 烯脂酰 -CoA 水合酶是可逆的酶且因此是催化 3- 羟基丁酰 -CoA 脱水生成巴豆酰 -CoA 的合适候选物。 恶臭假单胞菌的烯脂酰 -CoA 水合酶 phaA 和 phaB 被认 为在苯基乙酸酯分解代谢期间对双键执行羟基化作用 (Olivera 等人， Proc Nat Acad Sci U.S.A.95 ： 6419-6424(1998))。荧光假单胞菌的 paaA 和 paaB 催化类似的转化 (Olivera 等人， Proc Nat Acad Sci U.S.A.95 ： 6419-6424(1998))。最后， 许多大肠杆菌基因已经 显示可展现烯脂酰 -CoA 水合酶功能性， 包括 maoC、 paaF 和 paaG(Ismail 等人， European Journal of Biochemistry 270 ： 3047-3054(2003) ； Park 和 Lee， J Bacteriol.185 ： 5391-5397(2003) ； Park 和 Lee， Appl Biochem.Biotechnol 113-116 ： 335-346(2004) ； Park 681-686(2004))。 和 Yup， Biotechnol Bioeng 86 ：
表 20.GenBank ID NP_349318.1 NP_745427.1 NP_745426.1 ABF82233.1 ABF82234.1 NP_415905.1 NP_415911.1 NP_415912.1 有机体 丙酮丁醇梭菌 恶臭假单胞菌 恶臭假单胞菌 荧光假单胞菌 荧光假单胞菌 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌已经在许多物种中鉴别出了活体内天然催化逆反应 ( 即， 4- 羟基丁酰 -CoA 脱水生 成巴豆酰 -CoA) 的若干种酶。 所述转化用于氨基丁酸梭菌 (Clostridium aminobutyricum) 的 4- 氨基丁酸酯发酵 (Scherf 和 Buckel， Eur.JBioChem.215 ： 421-429(1993)) 和克氏梭 菌 (Clostridium kluyveri) 的琥珀酸酯 - 乙醇发酵 (Scherf 等人， Arch.Microbiol 161 ： 239-245(1994))。所述转化也是例如勤奋金属球菌等古细菌中的一个步骤， 作为 3- 羟 基丙酸酯 /4- 羟基丁酸酯自养二氧化碳同化途径的一部分 (Berg 等人， Science 318 ： 1782-1786(2007))。此途径利用巴豆酰 -CoA 的水合以形成 4- 羟基丁酰 -CoA。4- 羟基丁 酰 -CoA 脱水酶的可逆性已有详细记录 (Friedrich 等人， Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47 ： 3254-3257(2008) ； Muh 等人， Eur.J.BioChem.248 ： 380-384(1997) ； Muh 等人， Biochemistry 35 ： 11710-11718(1996))， 且平衡常数已被报导为约 4， 位于巴豆酰 -CoA 一侧 (Scherf 和 Buckel， Eur.J BioChem.215 ： 421-429(1993))。这表明下游 4- 羟基丁酰 -CoA 脱氢酶保持 4- 羟基丁酰 -CoA 浓度很低， 以致不能在巴豆酰 -CoA 处产生热力学瓶颈。
表 21.
蛋白 AbfD AbfD Msed_1321 Msed_1220 GenBank ID CAB60035 YP_001396399 YP_001191403 YP_001191305 有机体 氨基丁酸梭菌 克氏梭菌 勤奋金属球菌 勤奋金属球菌4- 羟基丁酰 -CoA 转移酶将 CoA 部分从 4- 羟基丁酰 -CoA 转移到乙酸酯， 于是形 成 4- 羟基丁酸酯和乙酰 -CoA。一种示例性 4- 羟基丁酰 -CoA 转移酶是由克氏梭菌的 cat2 基 因 编 码 (Seedorf 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105 ： 2128-2133(2008) ； Sohling 和 Gottschalk J Bacteriol.178 ： 871-880(1996))。也显示牙龈卟啉菌 (Porphyromonas gingivalis) 的 abfT-2 基因当作为产生 4- 羟基丁酸酯和 1， 4- 丁二醇的途径的一部分实 施时可展现 4- 羟基丁酰 -CoA 转移酶活性 (Burk 等人， WO/2008/115840(2008))。可通过 序列同源性推断由牙龈卟啉菌的 abfT-1 编码的另一种候选酶。另一种 4- 羟基丁酰 -CoA 转移酶是由氨基丁酸梭菌的 abfT 的基因产物编码 (Gerhardt 等人， Arch.Microbiol 174 ： 189-199(2000))。
表 22.
蛋白 cat2 abfT-2 abfT-1 abfT
GenBank ID YP_001396397 NP_906037 NP_904965.1 CAB60036 有机体 克氏梭菌 牙龈卟啉菌 牙龈卟啉菌 氨基丁酸梭菌示例性磷酸转移性酰基转移酶包括由 pta 编码的磷酸转乙酰酶和由 ptb 编码的 磷酸转丁酰酶。来自大肠杆菌的 pta 基因编码可将乙酰 -CoA 转化为乙酰磷酸酯且反之 亦然的酶 (Suzuki， T.1969 Biochim.Biophys.Acta 191 ： 559-569(1969))。所述酶也可利 用丙酰 -CoA 代替乙酰 -CoA， 从而在过程中形成丙酸酯 (Hesslinger 等人， Mol.Microbiol 27 ： 477-492(1998))。类似地， 来自丙酮丁醇梭菌的 ptb 基因编码可将丁酰 -CoA 转化为丁 酰磷酸酯的酶 (Huang 等人， J.Mol.Microbiol Biotechnol 2 ： 33-38(2000) ； (Walter 等 人， Gene 134 ： 107-1 11(1993))。这种酶显示在作为产生 1， 4- 丁二醇的途径的一部分实 施时可对 4- 羟基丁酰 -CoA 具有活性 (WO/2008/115840(2008))。其他 ptb 基因可在产丁 酸菌 L2-50(Ljungdahl 和 Andreesen， Methods Enzymol.53 ： 360-372(1978)) 和解磷细菌 (Bacihs megaterium)(Vazquez 等人， Curr.Microbiol 42 ： 345-349(2001)) 中发现。
表 23.
蛋白 pta ptb ptb ptb GenBank ID NP_416800.1 NP_349676 AAR19757.1 CACO7932.1 41 有机体 大肠杆菌 丙酮丁醇梭菌 产丁酸菌 L2-50 解磷细菌102307986 A CN 102307993
说明书29/52 页示例性激酶包括大肠杆菌乙酸激酶， 由 ackA 编码 (Skarstedt 和 Silverstein， J.Biol.Chem.251 ： 6775-6783(1976)) ； 丙 酮 丁 醇 梭 菌 丁 酸 酯 激 酶， 由 bukl 和 buk2 编 码 (Huang 等 人， 2000J.Mol.Microbiol Biotechnol 2 ： 33-38(2000) ； Walter 等 人， Gene 134 ： 107-111(1993)) ； 和 大 肠 杆 菌 γ- 谷 氨 酸 激 酶， 由 proB 编 码 (Smith 等 人， J.Bacteriol.157 ： 545-551(1984))。 这 些 酶 分 别 磷 酸 化 乙 酸 酯、 丁 酸 酯 和 谷 氨 酸 酯。 大 肠 杆 菌 的 ackA 基 因 产 物 也 磷 酸 化 丙 酸 酯 (Hesslinger 等 人， Mol.Microbiol 27 ： 477-492(1998))。Burk 等人， WO/2008/115840(2008) 显示丙酮丁醇梭菌的 buk1 基因产物 当作为产生 1， 4- 丁二醇的途径的一部分实施时对 4- 羟基丁酰 -CoA 具有活性。
表 24.
蛋白 GenB amkID 有机体ackA buk1 buk2 proB
NP_416799.1 NP_349675 Q97II1 NP_414777.1大肠杆菌 丙酮丁醇梭菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌醇 形 成 型 4- 羟 基 丁 酰 -CoA 还 原 酶 催 化 从 4- 羟 基 丁 酰 -CoA 形 成 1， 4- 丁 二 醇所必需的 2 个还原步骤。将酰基 -CoA 转化为醇的示例性 2 步氧化还原酶包括那些 将 例 如 乙 酰 -CoA 等 底 物 转 化 为 乙 醇 ( 例 如， 大 肠 杆 菌 的 adhE)(Kessler 等 人， FEBS. Lett.281 ： 59-63(1991)) 和 将 丁 酰 -CoA 转 化 为 丁 醇 ( 例 如， 丙 酮 丁 醇 梭 菌 的 adhE2) (Fontaine 等人， J.Bacteriol.184 ： 821-830(2002)) 的氧化还原酶。参考文献 Burk 等人， WO/2008/115840(2008) 具体地显示了丙酮丁醇梭菌的 adhE2 酶可用于从 4- 羟基丁酰 -CoA 产生 BDO。 除了将乙酰 -CoA 还原为乙醇外， 肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides) 的 adhE 所编码的酶已显示可将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰 -CoA(Kazahaya 等人， J.Geh. Appl.Microbiol.18 ： 43-55(1972) ； Koo 等人， Biotechnol Lett.27 ： 505-510(2005))。
蛋白 adhE adhE2 adhE
GenBank ID NP_415757.1 AAK09379.1 AAV66076.1 有机体 大肠杆菌 丙酮丁醇梭菌 Leuconostoc mesenteroides表 25.另一种示例性酶可将丙二酰 -CoA 转化为 3-HP。具有此活性的 NADPH 依赖性 酶已在橙色绿屈挠菌 (Chloroflexus aurantiacus) 中得到表征， 其中所述酶参与 3- 羟基 丙 酸 酯 循 环 (Hugler 等 人， J.Bacteriol.184 ： 2404-2410(2000) ； Strauss 和 Fuchs， Eur.J.BioChem.215 ： 633-643(1993))。所述酶的质量为 300kDa， 其具有高度的底物特异 性且与其他已知的氧化还原酶显示很小的序列相似性 (Hugler 等人， J.Bacteriol.184 ： 2404-2410(2002))。没有显示其他有机体中的酶可催化所述特异性反应 ； 然而， 存在生物 信息学证据证明其他有机体可能具有类似的途径 (Klatt 等人， Environ.Microbiol.9 ： 2067-2078(2007))。 可 通 过 序 列 相 似 性 推 断 包 括 卡 氏 玫 瑰 弯 菌 (Roseiflexus castenholzii)、 赤细菌属 (Erythrobacter sp.)NAP1 和海洋 γ 变形杆菌 (marine gamma proteobacterium)HTCC2080 的其他有机体中的候选酶。
表 26.
蛋白 mcr Rcas_2929 NAPI_02720 MGP2080_00535
GenBank ID AAS20429.1 YP_001433009.1 ZP_01039179.1 ZP_01626393.1 有机体 橙色绿屈挠菌 卡氏玫瑰弯菌 赤细菌属 NAP1 海洋 γ 变形杆菌 HTCC2080从 4- 羟基丁酰 -CoA 产生 BDO 的替代途径涉及首先将所述化合物还原为 4- 羟基丁 醛。 若干种酰基 -CoA 脱氢酶能够将酰基 -CoA 还原为其对应的醛。 编码所述酶的示例性基因 包括 ： 醋酸钙不动杆菌 (Acinetobacter caicoaceticus)actl， 其编码脂肪酰 -CoA 还原酶 (Reiser 和 Somerville， Journal of Bacteriology 179 ： 2969-2975(1997)) ； 不动杆菌属 (Acinetobacter sp.)M-1 脂肪酰 -CoA 还原酶 (Ishige 等人， Appl.Environ.Microbiol.68 ： 1192-1195(2002)) ； 和克氏梭菌 sucD 基因， 其编码 CoA- 和 NADP- 依赖性琥珀酸酯半醛脱氢 酶 (Sohling 和 Gottschalk， J Bacteriol.178 ： 871-880(1996))。牙龈卟啉菌的 SucD 是另 一种琥珀酸半醛脱氢酶 (Takahashi 等人， J.Bacteriol.182 ： 4704-4710(2000))。参考文 献 Burk 等人， WO/2008/115840(2008) 具体地显示了这些琥珀酸酯半醛脱氢酶可作为产生 1， 4- 丁二醇的途径的一部分而将 4- 羟基丁酰 -CoA 转化为 4- 羟基丁醛。假单胞菌属中由 bphG 编码的使乙醛脱氢酶酰化的酶是另一种有用的酶， 因为其已被证实可氧化乙醛、 丙醛、 丁醛、 异丁醛和甲醛并使其酰化 (Powlowski 等人， J Bacteriol.175 ： 377-385(1993。
表 27.
将酰基 -CoA 转化为其对应醛的另一种类型的酶是丙二酰 -CoA 还原酶， 其将丙二 酰 -CoA 转化为丙二酸半醛。丙二酰 -CoA 还原酶是嗜热嗜酸古菌中经由 3- 羟基丙酸酯循 环的自养碳固定中的关键酶 (Berg 等人， Science 318 ： 1782-1786(2007) ； Thauer， R.K， Science 318 ： 1732-1733(2007))。所述酶利用 NADPH 作为辅因子且已在金属球菌和硫化 叶 菌 (Sulfolobus spp) 中得到 表征 (Alber 等人， J.Bacteriol.188 ： 8551-8559(2006) ； Hugler 等 人， J.Bacteriol.184 ： 2404-2410(2002))。 所 述 酶 在 勤 奋 金 属 球 菌 中 是 由 Msed 0709 编 码 (Alber 等 人， J.Bacteriol.188 ： 8551-8559(2006) ； Berg 等 人， Science 318 ： 1782-1786(2007))。 将 来 自 托 氏 硫 化 叶 菌 (Sulfolobus tokodaii) 的 编 码 丙 二 酰 -CoA 还 原酶 的基因 在大 肠杆菌中克 隆并异源表达 (Alber 等人， J.Bacteriol.188 ： 8551-8559(2006))。虽然这些酶的醛脱氢酶功能类似于来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢 酶， 但是其序列相似性却很小。这两种丙二酰 -CoA 还原酶候选物与天门冬氨酸半醛脱氢酶 具有高度的序列相似性， 天门冬氨酸半醛脱氢酶是一种催化天冬氨酰 -4- 磷酸还原且同时 脱磷酸成天门冬氨酸半醛的酶。可在包括硫磺矿硫化叶菌 (Sulfolobus solfataricus) 和 嗜酸热硫化叶菌 (Sulfolobus acidocaldarius) 的其他有机体中通过与蛋白的序列同源性 来发现其他候选基因。
表 28.
蛋白 Msed_0709 mcr asd-2 Saci_2370
GenBank ID YP_001190808.1 NP_378167.1 NP_343563.1 YP_256941.1 有机体 勤奋金属球菌 托氏硫化叶菌 硫磺矿硫化叶菌 嗜酸热硫化叶菌展现 1， 4- 丁二醇脱氢酶活性的酶能够从 4- 羟基丁醛形成 1， 4- 丁二醇。 催化醛转 化为醇的酶 ( 即， 醇脱氢酶， 或等同地称作醛还原酶 ) 的示例性编码基因包括 ： 编码 C2-C14 的 中 链 醇 脱 氢 酶 的 alrA(Tani 等 人， Appl.Environ.Microbiol.66 ： 5231-5235(2000)) ； 来自酿酒酵母的 ADH2(Atsumi 等人， Nature 451 ： 86-89(2008)) ； 来自大肠杆菌的 yqhD， 其 偏 好 长 于 C(3) 的 分 子 (Sulzenbacher 等 人， Journal of Molecular Biology 342 ： 489-502(2004)) ； 和来自丙酮丁醇梭菌的 bdh I 和 bdh II， 其将丁醛转化为丁醇 (Walter 等人， Journal of Bacteriology 174 ： 7149-7158(1992))。
表 29.
蛋白 alrA ADH2 yqhD bdhI bdhII
GenBank ID BAB12273.1 NP_014032.1 NP_417484.1 NP_349892.1 NP_349891.1 有机体 不动杆菌菌株 M-1 酿酒酵母 大肠杆菌 丙酮丁醇梭菌 丙酮丁醇梭菌展现 4- 羟基丁酸酯脱氢酶活性的酶 (EC 1.1.1.61) 也属于此范畴。 所述酶已在真 氧产碱杆菌 (Ralstonia eutropha)((Bravo 等人， J.Forensic Sci.49 ： 379-387(2004))、 克 氏梭菌 (Wolff 和 Kenealy， Protein Expr.Purif.6 ： 206-212(1995)) 和拟南芥 (Breitkreuz 等人， J.Biol.Chem.278 ： 41552-41556(2003)) 中得到表征。
蛋白 4hbd 4hbd 4hbd
GenBank ID YP_726053.1 L21902.1 Q94B07 有机体 真氧产碱杆菌 H16 克氏梭菌 DSM 555 拟南芥表 30.克隆和表达中的第一步是在大肠杆菌中表达用于从甲醇产生 Me-THF 所需的最 小基因集合 ( 例如 MtaA、 MtaB 和 MtaC)。这些甲基转移酶活性使用辅酶 B12( 钴胺素 ) 作 为辅因子。在热乙酸穆尔氏菌中， 甲基转移酶蛋白的级联介导甲醇衍生的甲基组合入乙 酰 -CoA 合成酶途径。近来的工作 (Das 等人， Proteins 67 ： 167-176(2007)) 表明 MtaABC 由 Moth_1208-09 和 Moth_2346 编码。经由校对 PCR(proof-reading PCR) 克隆这些基因， 并将其连接到一起以供在阻抑型 PA1-lacO1 启动子的控制下， 在高拷贝数的载体 ( 例如 pZE22-S) 中表达 (Lutz 和 Bujard， Nucleic Acids Res.25 ： 1203-1210(1997))。通过 PCR 和 / 或限制性酶图谱验证克隆的基因以证实 3- 基因集合的构建和其被插入表达载体中。 对假定克隆进行 DNA 测序以证实每种基因的预期序列。一旦得到确认， 就通过添加最终浓 度介于 0.05mM 与 1mM 之间的 IPTG 诱导子而在大肠杆菌 K-12(MG1655) 细胞中表达最终构 建体。使用全细胞提取物的 SDS-PAGE 来监测经克隆的基因的表达。为优化可溶 vs. 小球 ( 潜在包合体来源 ) 蛋白的水平， 可以检测在这些水平时启动子的滴定影响。 如果未获得可 接受的表达， 则测试启动子强度中的更高或更低的拷贝数载体或变体。
为了确定 MtaABC 蛋白的表达是否赋予大肠杆菌将甲基从甲醇转移到四氢叶酸 (THF) 的能力， 向重组菌株馈送不同浓度的甲醇。如针对热乙酸穆尔氏菌中作为甲基 源 的 香 草 酸 (Naidu 和 Ragsdale， J Bacteriol.183 ： 3276-3281(2001)) 或 巴 氏 甲 烷 八 叠 球 菌 甲 醇 甲 基 转 移 酶 (Sauer 等 人， Eur.JBioChem.243 ： 670-677(1997) ； Tallant 和 Krzycki， J Bacterid.178 ： 1295-1301(1996) ； Tallant 和 Krzycki， J Bacteriol.179 ： 6902-6911(1997) ； Tallant 等人， J Biol Chem.276 ： 4485-4493(2001)) 所述， 在厌氧条件 下分析甲基转移酶系统的活性。 对于阳性对照， 平行培养热乙酸穆尔氏菌细胞， 并在厌氧条 件下分析内源甲基转移酶活性。证实了活性取决于所添加的外源辅酶 B 12， 这确认了甲醇 ： 类咕啉甲基转移酶活性在大肠杆菌中的表达。
一旦实现了甲基转移酶的表达， 进一步工作是对表达进行优化。滴定表达载体 中的启动子使得测试表达水平的范围。然后， 用作指导单拷贝中所需的表达， 或允许测 定这些基因的单拷贝是否可以充分表达。如果是这样， 则甲基转移酶基因整合到染色 体作为单一的、 合成操纵子。这需要使用使用基于 RecET 的 “重组工程”的针对性整合 (Angrand 等人， NucleicAcids Res 27 ： e16(1999) ； Muyrers 等人， Nucleic Acids Res 27 ： 1555-1557(1999) ； Zhang 等人， 1998 Nat.Genet.20 ： 123-128(1998))。盒子的基于 RecET 的整合以及通过 FLP 或 Cre 除去 FRT 或 loxP- 结合的选择性标记的潜在问题是在每个整合 位点产生重组疤痕。虽然由此引起的问题可以通过多种方法最小化， 但是可以使用不留基 因组疤痕的其他方法。标准选择是引入所需的基因， 使用如由芽孢杆菌 sacB 基因引起耦合 到反选择的一体化 “自杀” 质粒 (Link 等人， J Bacteriol.179 ： 6228-6237(1997)) ； 按此方 式， 可以在大肠杆菌染色体中的任何位置产生无标记和少疤痕的插入。最终目标是在可诱 导启动子下和单拷贝中表达甲醇 ： 类咕啉甲基转移酶活性的大肠杆菌 K-12 的菌株 ( 染色体 集成的 )。
使用标准 PCR 方法， 将完全 ACS/CODH 操纵子装配到低或中等拷贝数的载体中， 例如 pZA33-S( 基于 P15A) 或 pZS13-S( 基于 pSC101)。如针对甲基转移酶所描述， 确认经 克隆的基因的结构和序列。经由对在具有必需金属 (Ni、 Zn、 Fe) 和辅酶 B12 的严格厌氧条 件下生长的全细胞溶解物进行蛋白疑胶电泳来监测表达。必要时， 通过鉴别任何明显的 终止子并将其移除， 并引入从已知在大肠杆菌中有效的位点中选择的一致性核糖体结合 位点， 借此对基因簇进行修饰以供大肠杆菌表达 (Barrick 等人， NucleicAcids Res.22 ： 1287-1295(1994) ； Ringquist 等人， Mol.Microbiol 6 ： 1219-1229(1992))。 然而， 每种基因 簇是以与其天然结构和表达平行的方式克隆和表达。 这有助于确保大部分彼此相互作用的 各种基因产物之间的期望化学计量。一旦在厌氧条件下获得了令人满意的 CODH/ACS 基因 簇表达， 则分析表达这些基因的细胞将 CO 和 / 或 CO2 固定到细胞碳中的能力。初始条件利 用以外源葡萄糖作为碳源和能源， 经由底物水平的磷酸化或以硝酸盐作为电子受体的厌氧 呼吸， 在严格厌氧条件下生长的细胞。此外， 将外源提供的 CH3-THF 添加到培养基中。
将 ACS/CODH 基因克隆， 并在也表达甲醇 - 甲基转移酶系统的细胞中表达。这是通 过将表达 ACS/CODH 的相容质粒引入到 MTR 表达细胞中来实现。为了获得附加的长期稳定 性， ACS/CODH 和 MTR 基因也可整合到染色体中。在获得能够利用甲醇产生 Me-THF 并表达 活性 CODH/ACS 基因的大肠杆菌菌株之后， 分析其利用甲醇和合成气以便并入到乙酰 -CoA、 乙酸酯和细胞物质中的能力。初始条件是利用在严格厌氧条件下生长的细胞， 其以外源葡 萄糖作为碳源和能源。 或者， 或除葡萄糖以外， 硝酸盐可添加到发酵液中以用作电子受体和生长引发剂。已经证实大肠杆菌在硝酸盐存在下可利用脂肪酸进行厌氧生长， 所述脂肪酸 最终代谢为乙酰 -CoA(Campbell 等人， Molecular Microbiology 47 ： 793-805(2003))。也 可提供氧， 只要其细胞内含量被维持在经工程改造的酶的任何限制阈值以下即可。与甲醇 一起使用具有适合于这些实验的组成的 “合成气” 。 向细胞提供 13C 标记的甲醇或 13C 标记的 CO， 并使用分析质谱法测量经标记的碳在乙酸酯和细胞物质 ( 例如， 蛋白氨基酸 ) 中的并入 量。
克隆来自热乙酸穆尔氏菌、 非洲脱硫弧菌和大肠杆菌的丙酮酸酯铁氧还蛋白氧 化还原酶基因， 并在展现 MTR 和 ACS/CODH 活性的菌株中表达。条件、 启动子等在上文已 有描述。鉴于 PFOR 基因的大尺寸和对应酶的氧敏感性， 使用低拷贝或单拷贝质粒载体或 单拷贝染色体整合法进行测试。应用参考文献 (Furdui 和 Ragsdale， J Biol Chem.275 ： 28494-28499(2000)) 中所述的活性分析来证实活性。此外， 证实了菌株在不存在外部电子 受体的情况下可在气态碳源和甲醇上生长， 这提供了活体内 PFOR 活性的另一证据。
通过在存在和不存在氢的情况下如上所述培养细胞来测试宿主有机体利用氢的 内源氢化酶活性。如果在发酵期间观察到朝向形成更多还原产物 ( 例如相比于乙酸酯， 乙 醇增多 ) 的急剧迁移， 那么这表明内源氢化酶的活性足够高。在这种情况下， 没有异源氢化 酶被克隆和表达。如果天然酶不具有足够活性或减少必需的受体， 那么克隆编码个别氢化 酶复合物的基因并在展现 MTR、 ACS/CODH 和 PFOR 活性的菌株中表达。条件、 启动子等在上 文已有描述。
如先前所述， 在表达质粒上克隆异丙醇合成所必需的非天然基因。宿主菌株也表 达甲醇甲基转移酶活性、 CODH/ACS 活性和可能的 PFOR 和氢化酶活性。此处， 将这些 (CODH/ ACS 等 ) 基因整合到基因组中， 并从可组成性使用或与诱导子 ( 即， PA1-lacO1 可在含 lacI 的细胞中诱导， 或者在其他方面是组成性的 ) 一起使用的启动子开始表达。一旦异丙醇 的表达和产率得到优化， 即可通过在中性位点整合单拷贝的这些基因来进一步修饰基础菌 株。鉴于基因的数量相对有限 ( 最少 3 种且最多 6 种 )， 申请人可构建编码所需基因的人工 操纵子。使用整合质粒引入所述操纵子， 并将其与例如杆菌 sacB 基因所允许的反选择方法 结合 (Link 等人， J Bacteriol.179 ： 6228-6237(1997))。按此方式， 可在大肠杆菌染色体 的任何位置产生无标记且无痕的插入。 优化涉及改变基因次序以及核糖体结合位点和启动 子。
为了过度表达任何天然基因， 例如， 可以用作异丙醇产生所需的丙酮丁醇梭菌乙 酰基 - 辅酶 A[CoA] 乙酰基转移酶替代的大肠杆菌的天然 atoB(b2224) 基因， 基于 RecET 的 方法应用于整合更强的上游启动子。在 atoB 的情况下， 这种基因是操纵子中的最后一个， 并且接着的基因下游 (yfaP) 是非必要的并且在相反方向上。因此， 极性不应该是问题。包 含选择性标记的盒子， 例如 FRT 或 loxP 侧面的奇霉素耐药或氯霉素耐药， 用于选择引入强 的组成型启动子 ( 例如， PL)。一旦获得正确的克隆并使用 qRT-PCR 验证， 则 FLP 或 Cre 表 达用于选择除去 FRT- 或 loxP- 结合的标记。
如先前所述， 在表达质粒上克隆 4- 羟基丁酸酯合成所必需的非天然基因。宿主 菌株也表达甲醇甲基转移酶活性、 CODH/ACS 活性和可能的 PFOR 和氢化酶活性。此处， 将这 些 (CODH/ACS 等 ) 基因整合到基因组中， 并从可组成性使用或与诱导子 ( 即， PA1-lacO1 可 在含 lacI 的细胞中诱导， 或者在其他方面是组成性的 ) 一起使用的启动子开始表达。一旦4- 羟基丁酸酯的表达和产率得到优化， 即可通过在中性位点整合单拷贝的这些基因来进一 步修饰基础菌株。鉴于基因的数量相对有限 ( 最少 5 种且最多 6 种 )， 可构建编码所需基因 的人工操纵子。使用整合质粒引入所述操纵子， 并将其与例如杆菌 sacB 基因所允许的反选 择方法结合 (Link 等人， JBacteriol.179 ： 6228-6237(1997))。按此方式， 可在大肠杆菌染 色体的任何位置产生无标记且无痕的插入。 优化涉及改变基因次序以及核糖体结合位点和 启动子。
如先前所述， 在表达质粒上克隆 1， 4- 丁二醇合成所必需的非天然基因。宿主菌 株也表达甲醇甲基转移酶活性、 CODH/ACS 活性和可能的 PFOR 和氢化酶活性。此处， 将这些 (CODH/ACS 等 ) 基因整合到基因组中， 并从可组成性使用或与诱导子 ( 即， PA1-lacO1 可在 含 lacI 的细胞中诱导， 或者在其他方面是组成性的 ) 一起使用的启动子开始表达。 一旦 1， 4- 丁二醇的表达和产率得到优化， 即可通过在中性位点整合单拷贝的这些基因来进一步修 饰基础菌株。鉴于基因的数量相对有限 ( 最少 5 种且最多 6 种 )， 可构建编码所需基因的人 工操纵子。使用整合质粒引入所述操纵子， 并将其与例如杆菌 sacg 基因所允许的反选择方 法结合 (Link 等人， JBacteriol.179 ： 6228-6237(1997))。按此方式， 可在大肠杆菌染色体 的任何位置产生无标记且无痕的插入。 优化涉及改变基因次序以及核糖体结合位点和启动 子。
将合成气体转化为乙酰 -CoA( 重要代谢物， 可由其获得所有细胞物质组分和 许多有价值的产物 ) 的能力可被工程改造入外部宿主， 例如大肠杆菌， 其随后表达编码 Wood-Ljungdahl 途径的各种蛋白的外源基因。所述途径在例如热乙酸穆尔氏菌 (Moorella thermoacetica)( 以前称作热乙酸梭菌 (Clostridium thermoaceticum)) 等产乙酸有机体 中高度活跃， 热乙酸穆尔氏菌早在 1942 年被分离出时就作为阐明 Wood-Ljungdahl 途径的 模型有机体 (Fontaine 等人， J Bacteriol.43 ： 701-715(1942))。Wood-Ljungdahl 途径包 含两个分支 ： 东部 ( 或甲基 ) 分支， 其允许 CO2 转化为甲基四氢叶酸 (Me-THF) ； 和西部 ( 或 羰基 ) 分支， 其允许甲基 -THF、 CO 和辅酶 A 转化为乙酰 -CoA( 图 3)。在一些实施方案中， 本发明提供一种非天然存在的微生物， 其表达催化 Wood-Ljungdahl 途径的甲基和羰基分 支的酶的编码基因。所述有机体能将 CO、 CO2 和 / 或 H2 转化为乙酰 -CoA、 细胞物质和产物。
本发明的另一种有机体包含图 3A 中所示的三种能力 ： 1)Wood-Ljungdahl 途径的 功能性甲基分支， 能够使 THF 和 CO2 转化成 5- 甲基 - 四氢叶酸， 2) 组合 CO、 辅酶 A 和 Me-THF 的甲基形成乙酰 -CoA 的能力， 和 3) 从乙酰 -CoA 合成异丙醇的能力。图 3B 所示的本发明 中所述的第五种有机体包含 Wood-Ljungdahl 途径的功能性甲基分支、 合成乙酰 -CoA 的能 力和从乙酰 -CoA 合成 4- 羟基丁酸酯的能力。图 3C 所示的本发明中所述的第六种有机体 包含 Wood-Ljungdahl 途径的功能性甲基分支、 合成乙酰 -CoA 的能力和从乙酰 -CoA 合成 1， 4- 丁二醇的能力。
这三种有机体能够 ‘固定’ 来自外源 CO 和 / 或 CO2 的碳， 以合成乙酰 -CoA、 细胞物 质和产物。经工程改造而具有这些能力且天然也具有回补能力的宿主有机体 ( 例如， 大肠 杆菌 ) 可在合适的外部电子受体 ( 例如硝酸盐 ) 存在下， 在合成气所产生的乙酰 -CoA 上生 长。这种电子受体被要求接受来自于经由琥珀酸酯脱氢酶而形成的还原苯醌的电子。添 加外部电子受体的另一个优点在于可从乙酰 -CoA 的呼吸作用产生额外的能量用于细胞生 长、 维持和产物形成。可选策略涉及将丙酮酸酯铁氧还蛋白氧化还原酶 (PFOR) 工程改造到菌株中以允许在不存在外部电子受体的情况下合成生物质前体。 经工程改造的有机体的另 一特征是能够从分子氢提取还原当量的能力。这允许高产率的还原产物， 例如乙醇、 丁醇、 异丁醇、 异丙醇、 1， 4- 丁二醇、 琥珀酸、 富马酸、 苹果酸、 4- 羟基丁酸、 3- 羟基丙酸、 乳酸、 己 二酸、 3- 羟基异丁酸、 2- 羟基异丁酸、 甲基丙烯酸和丙烯酸。
本发明提供的有机体可从以下来源产生乙酰 -CoA、 细胞物质和目标化学品， 更具 体而言异丙醇、 4- 羟基丁酸酯和 1， 4- 丁二醇 ： 1)CO， 2)CO2 和 H2， 3)CO、 CO2 和 H2， 4) 包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
成功地将这些途径中的任一种工程改造到有机体中会涉及鉴别适当的酶集合， 将 其对应基因克隆到生产宿主中， 优化这些基因的稳定性和表达， 优化发酵条件， 和分析发酵 后的产物形成。下文描述催化图 3A ～ 3C 中所示途径中的步骤 1 ～ 5 的多种酶。这些酶被 要求能够使合成气体转化为乙酰 -CoA。上面描述了图 3A 的步骤 6 ～ 17 中和图 3B 和 3C 中 的步骤 6 ～ 20 的多种酶。为了工程改造生产宿主以利用合成气和甲醇， 在微生物中表达一 种或多种编码必须酶的外源 DNA 序列。
甲酸酯脱氢酶是一种有两个亚单元的含硒代半胱氨酸的蛋白， 其催化热乙酸 穆 尔 氏 菌 中 CO2 并 入 甲 酸 酯 中 的 过 程 (Andreesen 和 Ljungdahl， J.Bacteriol.116 ： 867-873(1973) ； Li 等 人， J.Bacteriol.92 ： 405-412(1966) ； Yamamoto 等 人， J.Biol. Chem.258 ： 1826-1832(1983))。 基 因 座 Moth_2312 和 Moth_2313 实 际 上 是 负 责 编 码 甲 酸酯脱氢酶的 α 亚单元的一个基因， 而 β 亚单元则由 Moth_2314 编码 (Pierce 等人， Environ.Microbiol.(2008))。编码容易发生 CO2 还原的甲酸酯脱氢酶活性的另一组基因 是由弗氏互营杆菌中的 Sfum_2703 到 Sfum_2706 编码 (de Bok 等人， Eur.J.BioChem.270 ： 2476-2485(2003)) ； Reda 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105 ： 10654-10658(2008))。 与 其热乙酸穆尔氏菌对应物类似， Sfum_2705 和 Sfum_2706 实际上也是一个基因。被假定执 行相同功能的类似基因集合是在生氢氧化碳嗜热菌中由 CHY_0731、 CHY_0732 和 CHY_0733 编码 (Wu 等人， PLoS Genet.1 ： e65(2005))。
表 31.
蛋白 Moth_2312 Moth_2313 Moth_2314 Sfum_2703 Sfum_2704 Sfum_2705 Sfum_2706 GenBank ID YP_431142 YP_431143 YP_431144 YP_846816.1 YP_846817.1 YP_846818.1 YP_846819.1 有机体 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 热乙酸穆尔氏菌 弗氏互营杆菌 弗氏互营杆菌 弗氏互营杆菌 弗氏互营杆菌49102307986 A CN 102307993 CHY_0731 CHY_0732 CHY_0733
说明书生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌 生氢氧化碳嗜热菌37/52 页YP_359585.1 YP_359586.1 YP_359587.1甲酰四氢叶酸合成酶消耗 1 个 ATP 将甲酸酯连接到四氢叶酸上。这个反应在 热 乙 酸 穆 尔 氏 菌 中 是 由 Moth_0109 的 基 因 产 物 (Lovell 等 人， Arch.Microbiol 149 ： 280-285(1988) ； Lovell 等 人， Biochemistry 29 ： 5687-5694(1990) ； O ′ brien 等 人， Experientia.Suppl.26 ： 249-262(1976))、在 尿 酸 梭 菌 中 是 由 FHS 的 基 因 产 物 (Whitehead 和 Rabinowitz， J.Bacteriol.167 ： 205-209(1986) ； Whitehead 和 Rabinowitz， J.Bacteriol.170 ： 3255-3261(1988)) 且在生氢氧化碳嗜热菌中是由 CHY_2385 的基因产物 (Wu 等人， PLoS Genet.1 ： e65(2005)) 催化。
表 32.
蛋白 Moth_0109 CHY_2385 FHS
GenBank ID YP_428991.1 YP_361182.1 P13419.1 有机体 热乙酸穆尔氏菌 生氢氧化碳嗜热菌 尿酸梭菌在热乙酸穆尔氏菌、 大肠杆菌和生氢氧化碳嗜热菌中， 次甲基四氢叶酸环化水解 酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶是由 Moth_1516、 f01D 和 CHY_1878 的双功能基因产物分别产 生 (D′ Ari 和 Rabinowitz， J.Biol.Chem.266 ： 23953-23958(1991) ； Pierce 等人， Environ. Microbiol(2008) ； Wu 等人， PLoS Genet.1 ： e65(2005)).
表 33.
蛋白 Moth_1516 folD CHY_1878
GenBank ID YP_430368.1 NP_415062.1 YP_360698.1 有机体 热乙酸穆尔氏菌 大肠杆菌 生氢氧化碳嗜热菌Wood-Ljungdahl 途 径 的 甲 基 分 支 的 最 后 步 骤 是 由 亚 甲 基 四 氢 叶 酸 还 原 酶 催 化。在热乙酸穆尔氏菌中， 所述酶对氧敏感且含有铁硫簇 (Clark 和 Ljungdahl， J Biol Chem.259 ： 10845-10849(1984))。所述酶在大肠杆菌中是由 metF 编码 (Sheppard 等人， J.Bacteriol.181 ： 718-725(1999))， 且在生氢氧化碳嗜热菌中是由 CHY_1233 编码 (Wu 等 人， PLoS Genet.1 ： e65(2005))。热乙酸穆尔氏菌基因和其生氢氧化碳嗜热菌对应物位于 CODH/ACS 基因簇附近， 所述基因簇是由假定氢化酶和杂二硫键还原酶基因分隔。表 34.GenBank ID NP_418376.1 YP_360071.1 有机体 大肠杆菌 生氢氧化碳嗜热菌虽然大肠杆菌天然具有一部分所需转换的能力 ( 即， 次甲基四氢叶酸环化水解 酶、 亚甲基四氢叶酸脱氢酶、 亚甲基四氢叶酸还原酶 )， 但据认为， 来自产乙酸菌的甲基分 支酶与来自非产乙酸菌的那些相比可能具有显著更高 (50-100X) 的比活性 (Morton 等 人， Genetics and molecular biology of anaerobic bacteria， p.389-406， Springer Verlag， New York(1992))。 甲 酸 酯 脱 氢 酶 也 似 乎 是 专 用 于 厌 氧 条 件 (Ljungdahl 和 Andreesen， FEBS Lett.54 ： 279-282(1975))。因此， 这些酶的各种非天然形式在能够利用 甲醇和合成气的大肠杆菌的菌株中表达。具体而言， 这些基因被克隆并组合到被设计成 作为组表达的表达载体中。最初， 高或中等拷贝数载体被选择 ( 使用 ColE1 或 P15A 复制 子 )。 可以使用的一种启动子是强组成型启动子， 如 λPL 或其 IPTG 诱导形式 pL-lacO(Lutz 和 Bujard， Nucleic Acids Res 25 ： 1203-1210(1997))。为了制造人工操纵子， 一个 5 ′ 端启动子放在一组基因的上游， 并且每个基因接收共识 rbs 元件。基因的顺序尽可能 基于自然顺序。最终， 该基因整合到大肠杆菌染色体中。根据文献中的记载进行酶分 析 (Clark 和 Ljungdahl， J Biol Chem.259 ： 10845-10849(1984) ； Clark 和 Ljungdahl， Methods Enzymol.122 ： 392-399(1986) ； D ′ Ari 和 Rabinowitz， J.Biol.Chem.266 ： de Mata 和 Rabinowitz ， J.Biol.Chem.255 ： 2569-2577(1980) ； 23953-23958(1991) ； Ljungdahl 和 Andreesen， MethodsEnzymol.53 ： 360-372(1978) ； Lovell 等 人， 1988 Arch. Microbiol 149 ： 280-285(1988) ； Yamamoto 等人， J.Biol.Chem.258 ： 1826-1832(1983))。
在构建同时表达 Wood-Ljungdahl 途径的羰基和甲基分支的大肠杆菌菌株之后， 分析它们利用由 CO、 CO2 和 H2 构成的合成气进入乙酰 -CoA、 细胞物质和异丙醇或 1， 4- 丁二 醇的能力。初始条件是利用在严格厌氧条件下生长的细胞， 其以外源葡萄糖作为碳源和能 源。或者， 或除葡萄糖以外， 硝酸盐可添加到发酵液中以用作电子受体和生长引发剂。已 经证实大肠杆菌在硝酸盐存在下可利用脂肪酸进行厌氧生长， 所述脂肪酸最终代谢为乙 酰 -CoA(Campbell 等人， Molecular Microbiology 47 ： 793-805(2003))。 也可提供氧， 只要 其细胞内含量被维持在经工程改造的酶的任何限制阈值以下即可。 使用具有适合于这些实 13 验的组成的 “合成气” 。向细胞提供 C 标记的 CO 和 / 或 CO2， 并使用分析质谱法测量经标记 的碳在乙酸酯、 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯、 1， 4- 丁二醇和细胞物质 ( 例如， 蛋白氨基酸 ) 中的 并入量。
本文对本发明的描述一般是通过代谢反应、 反应物或其产物， 或具体通过一种或 多种核酸或基因描述， 所述核酸或基因编码与所提及的代谢反应、 反应物或产物相关的酶 或催化所提及的代谢反应、 反应物或产物的酶， 或与所提及的代谢反应、 反应物或产物相关 的蛋白。除非本文明确说明， 否则本领域技术人员将了解提及反应时同样表示提及反应的 反应物和产物。类似地， 除非本文明确说明， 否则指代反应物或产物时同样表示提及反应，且提及任何这些代谢组分时同样表示提及一种或多种编码催化所提及的反应、 反应物或产 物的酶或与所提及的反应、 反应物或产物相关的蛋白的基因。同样， 鉴于代谢生物化学、 酶 学和基因组学是熟知领域， 本文提及基因或编码核酸也等同于提及对应的所编码酶和其催 化的反应， 或反应的相关蛋白， 以及反应的反应物和产物。
本发明的非天然存在的微生物有机体可通过引入编码一种或多种异丙醇、 4- 羟 基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径中所涉及的一种或多种酶或蛋白的可表达核酸来产 生。 取决于为生物合成所选的宿主微生物有机体， 可表达部分或所有的特定异丙醇、 4- 羟基 丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径的核酸。例如， 如果所选宿主缺乏期望生物合成途径的 一种或多种酶或蛋白， 那么将用于所缺乏酶或蛋白的可表达核酸引入到宿主中以供随后的 外源表达。或者， 如果所选宿主展现一些途径基因的内源表达， 但缺乏其他基因， 那么需要 编码所缺乏酶或蛋白的核酸以便实现异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成。因 此， 本发明的非天然存在的微生物有机体可通过引入外源酶或蛋白活性以获得期望生物合 成途径来产生， 或者期望生物合成途径可通过引入一种或多种外源酶或蛋白活性来获得， 所述一种或多种外源酶或蛋白活性与一种或多种内源酶或蛋白一起产生例如异丙醇、 4- 羟 基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇等期望产物。
取决于所选宿主微生物有机体的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成 途径组分， 本发明的非天然存在的微生物有机体将包含至少一种外源表达的编码异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径的核酸， 最多为一种或多种异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径所有的编码核酸。例如， 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物 合成可在缺乏途径酶或蛋白的宿主中经由对应编码核酸的外源表达来实现。在缺乏异丙 醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径的所有酶或蛋白的宿主中， 可包含所有途径酶或蛋白 的外源表达， 但应了解即使宿主含有途径酶或蛋白中的至少一种， 也可表达所有的途径酶 或蛋白。例如， 可包含用于产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的所有途径酶或蛋白 的外源表达。
根据本文所提供的教导和指导， 本领域技术人员将了解以可表达形式引入的编码 核酸的数目至少与选定宿主微生物有机体的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径缺 乏的相当。 因此， 本发明的非天然存在的微生物有机体可具有一种、 两种、 三种、 四种、 五种、 六种、 七种、 八种、 九种、 十种、 十一种、 十二种、 十三种、 十四种、 十五种、 十六种或至多所有 的编码组成本文所公开的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径的酶或蛋白 的核酸。 在一些实施方案中， 非天然存在的微生物有机体也可包含其他基因修饰， 其促进或 优化异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成或赋予宿主微生物有机体其他有用的 功能。 一种所述其他功能可包括例如增加一种或多种异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇 途径前体 ( 例如乙酰 -CoA) 的合成。
一般来说， 对宿主微生物有机体进行选择， 以便其能产生作为天然产生的分子或 工程产物的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径的前体， 所述工程产物提供期望前体 的从头产生， 或导致由宿主微生物有机体天然产生的前体的产生增多。例如， 乙酰 -CoA 在 宿主有机体如大肠杆菌中天然产生。宿主有机体可经工程改造以便增加前体的产量， 如本 文所公开。 此外， 已经工程改造以产生期望前体的微生物有机体可用作宿主有机体， 且进一 步经工程改造以表达异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径的酶或蛋白。在一些实施方案中， 本发明的非天然存在的微生物有机体是从含有合成异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的酶促能力的宿主产生。在此特定实施方案中， 可以增加异 丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径产物的合成或积累以便例如驱动异丙醇、 4- 羟基丁 酸酯或 1， 4- 丁二醇途径反应朝产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的方向进行。增 加的合成或积累可通过例如编码一种或多种上述异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途 径酶或蛋白的核酸的过度表达来实现。异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径的一种 或多种酶和 / 或蛋白的过度表达可例如经由一种或多种内源基因的外源表达或经由一种 或多种异源基因的外源表达来进行。因此， 天然存在的有机体可容易地变为本发明的非大 然存在的微生物有机体， 从而例如经由过度表达一种、 两种、 三种、 四种、 五种、 六种、 七种、 八种、 九种、 十种、 十一种、 十二种、 十三种、 十四种、 十五种、 十六种、 即至多所有的编码异丙 醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径酶或蛋白的核酸来产生异丙醇、 4- 羟基丁酸 酯或 1， 4- 丁二醇。此外， 非天然存在的有机体可通过诱发内源基因的突变， 从而导致异丙 醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径中的酶活性增加来产生。
在尤其有用的实施方案中， 利用编码核酸的外源表达。外源表达赋予宿主定制表 达和 / 或调控元件的能力， 以及实现由使用者控制的期望表达水平的应用。然而， 在其他实 施方案中也可利用内源表达， 例如通过移除负调控效应子或当连接于可诱导的启动子或其 他调控元件时诱导基因的启动子。因此， 具有天然存在的可诱导启动子的内源基因可通过 提供适当的诱导剂而得到上调， 或内源基因的调控区可经工程改造以并入可诱导的调控元 件， 从而允许在期望时间对内源基因增加的表达进行调控。 类似地， 可包含可诱导的启动子 作为引入非天然存在的微生物有机体中的外源基因的调控元件。
应了解， 在本发明的方法中， 所述一种或多种外源核酸中的任一种皆可引入到微 生物有机体中以产生本发明的非天然存在的微生物有机体。 可引入核酸以便例如赋予在微 生物有机体上异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径。或者， 可引入编码核酸 以便产生中间微生物有机体， 其具有催化一些赋予异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生 物合成能力所必需的反应的生物合成能力。例如， 具有异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二 醇生物合成途径的非天然存在的微生物有机体可包含至少两种编码期望酶或蛋白的外源 核酸。因此， 应了解本发明的非天然存在的微生物有机体可包含生物合成途径的两种或两 种以上酶或蛋白的任何组合。类似地， 应了解本发明的非天然存在的微生物有机体可视需 要包含生物合成途径的三种或三种以上酶或蛋白的任何组合， 只要期望生物合成途径的酶 和 / 或蛋白的组合导致产生对应的期望产物即可。类似地， 本发明的非天然存在的微生物 有机体可视需要包含如本文所公开的生物合成途径的四种以上酶或蛋白的任何组合， 只要 期望生物合成途径的酶和 / 或蛋白的组合导致产生对应的期望产物即可。
除了本文所述的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的生物合成外， 本发明的非 天然存在的微生物有机体和方法也可以彼此的各种组合以及与本领域中熟知的其他微生 物有机体和方法的各种组合来利用， 以便通过其他途径实现产物的生物合成。 例如， 除了使 用异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇微生物产生者外， 一种产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯 或 1， 4- 丁二醇的替代方案是添加另一种能够将异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径 中间物转化为异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的微生物有机体。一种所述程序包括 例如发酵可产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径中间物的微生物有机体。异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径中间物可接着用作底物以供第二微生物有机体将异 丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径中间物转化为异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二 醇。 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径中间物可直接添加到第二有机体的另一培养 物中， 或者可例如通过细胞分离从异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径中间物产生者 的原始培养物移除这些微生物有机体， 随后可向发酵液中添加第二有机体以便无需中间纯 化步骤即可产生最终产物。
在其他实施方案中， 本发明的非天然存在的微生物有机体和方法可以众多亚途径 装配以便实现例如异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的生物合成。在这些实施方案中， 本发明的期望产物的生物合成途径可分到不同的微生物有机体中， 且不同的微生物有机体 可共培养以便产生最终产物。在所述生物合成方案中， 一种微生物有机体的产物是另一种 微生物有机体的底物， 直到合成最终产物为止。 例如， 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇 的生物合成可通过构建含有用于将一种途径中间物转化为另一种途径中间物或产物的生 物合成途径的微生物有机体来实现。或者， 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇也可经由 使用两种有机体在同一容器中共培养或共发酵而以生物合成方法从微生物有机体产生， 其 中第一微生物有机体产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇中间物， 而第二微生物有机 体将中间物转化为异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇。
根据本文所提供的教导和指导， 本领域技术人员将了解， 本发明的非天然存在的 微生物有机体和方法， 连同其他微生物有机体、 具有亚途径的其他非天然存在的微生物有 机体的共同培养物、 和本领域中熟知的用于产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的其 他化学和 / 或生物化学程序的组合存在众多组合和置换。
异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径酶或蛋白的编码核酸的来源可包括例 如其中经编码基因产物能够催化所提及的反应的任何物种。 所述物种包括原核和真核有机 体， 包括但不限于细菌 ( 包括古细菌和真细菌 ) 和真核生物 ( 包括酵母、 植物、 昆虫、 动物和 哺乳动物， 包括人类 )。 所述来源的示例性物种包括例如大肠杆菌以及本文公开的或可作为 对应基因的来源有机体获得的其他示例性物种。然而， 因为现在可从超过 550 种物种获得 完整基因组序列 ( 其中超过一半可从例如 NCBI 等公开数据库获得 )， 包括 395 种微生物基 因组和多种酵母、 真菌、 植物和哺乳动物基因组， 所以对于相关或远亲物种中的一种或多种 基因鉴别编码必需异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成活性的基因是常规的且 在本领域中为人所熟知， 包括例如已知基因的同源物、 直系同源物、 旁系同源物和非直系同 源基因置换， 和有机体之间基因变异的互换。因此， 本文参考特定有机体 ( 例如大肠杆菌 ) 描述的能实现异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的生物合成的代谢变化可容易地应用 于其他微生物， 同样包括原核和真核有机体。 根据本文所提供的教导和指导， 本领域技术人 员将知悉在一种有机体中示例的代谢变化可同样地应用于其他有机体。
在一些情况下， 例如当无关物种中存在替代异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇 生物合成途径时， 宿主物种可被赋予异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成， 例如 通过从无关物种外源表达一种或多种旁系同源物， 这会催化类似但不相同的代谢反应以置 换所提及的反应。因为不同有机体的代谢网络之间存在某些差别， 所以本领域技术人员将 了解不同有机体之间的实际基因使用可有所不同。 然而， 根据本文所提供的教导和指导， 本 领域技术人员还将了解， 本发明的教导和方法可应用于所有的微生物有机体， 其中使用本文中示例的用于在合成异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的目的物种中构建微生物有 机体的代谢变化的同源代谢变化。
宿主微生物有机体可选自以下物种且非天然存在的微生物有机体可在以 下物种中产生 ： 例 如 细 菌、 酵 母、 真菌或各种适用于发酵过程的其他微生物中的任 一 种。 示 例 性 细 菌 包 括 选 自 以 下 的 物 种 ： 大 肠 杆 菌、 产 酸 克 雷 伯 氏 菌 (Klebsiella oxytoca)、 产 琥 珀 酸 厌 氧 螺 菌 (Anaerobiospirilium succiniciproducens)、 产琥珀 酸 放 线 杆 菌 (Actinobacillus succinogenes)、 产 琥 珀 酸 曼 海 姆 氏 菌 (Mannheimia succiniciproducens)、 菜豆根瘤菌 (Rhizobium etli)、 枯草杆菌 (Bacillus subtilis)、 谷 氨 酸 棒 杆 菌 (Corynebacteriumglutamiciim)、 Gluconobacter oxydans、 氧化葡萄 糖 酸 杆 菌 (Zymomonas mobilis)、 乳 酸 乳 球 菌 (Lactococcus lactis)、 植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)、 天 蓝 色 链 霉 菌 (Streptomyces coelicolor)、 丙酮丁醇梭 菌 (Clostridium acetobutylicum)、 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens) 和恶臭 假单胞菌 (Pseudomonas putida)。示例性酵母或真菌包括选自以下的物种 ： 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、 乳酸克鲁维 酵母 (Kluyveromyces lactis)、 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus)、 土曲霉 (Aspergillus terreus)、 黑曲霉 (Aspergillus niger) 和毕赤酵母 (Pichia pastoris)。 大肠杆菌是尤其有用的宿主有机体， 因为其是得到充分表征的适用于基因工程的微生物有 机体。其他尤其有用的宿主有机体包括酵母， 例如酿酒酵母。
用于构建非天然存在的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇生产宿主和测试其 表达水平的方法可例如通过本领域中熟知的重组和检测方法来执行。例如 Sambrook 等人， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 3 版， Cold Spring Harbor Laboratory， New York(2001) ； 和 Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley 和 Sons， Baltimore， MD(1999) 描述所述方法。
用于产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的途径中所涉及的外源核酸序列 可使用本领域中熟知的技术稳定地或暂时地引入宿主细胞中， 所述技术包括但不限于接 合、 电穿孔、 化学转化、 转导、 转染和超声波转化。对于在大肠杆菌或其他原核细胞中的外 源表达， 真核核酸的基因或 cDNA 中的一些核酸序列可编码导向信号， 例如 N 端线粒体导向 信号或其他导向信号， 必要时其可在转化到原核宿主细胞中之前被移除。例如， 移除线粒 体前导序列会导致在大肠杆菌中的表达有所增加 (Hoffmeister 等人， J.Biol.Chem.280 ： 4329-4338(2005))。对于在酵母或其他真核细胞中的外源表达， 基因可在细胞溶质中表达 而无需添加前导序列， 或可通过添加合适的导向序列 ( 例如适用于宿主细胞的线粒体导向 或分泌序列 ) 而导向到线粒体或其他细胞器或经导向用于分泌。因此， 应了解为了移除或 包含导向序列而对核酸序列所作的适当修饰可并入外源核酸序列中以便赋予所需性质。 此 外， 可使用本领域中熟知的技术对基因进行密码子优化以获得蛋白的优化表达。
可构建一种或多种表达载体以包括如本文示例的一种或多种异丙醇、 4- 羟基丁酸 酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径编码核酸， 所述编码核酸可操作性连接到在宿主有机体中 具有功能的控制序列上。适用于本发明的微生物宿主有机体的表达载体包括例如质粒、 噬 菌体载体、 病毒载体、 附加体 (episome) 和人工染色体， 其包括可用于稳定整合到宿主染色 体中的载体和选择序列或标记。另外， 表达载体可包括一种或多种选择标记基因和适当的表达控制序列。 也可包括选择标记基因， 其例如提供抗生素或毒素抗性、 补充营养缺乏或供 应培养基中没有的关键营养物。 表达控制序列可包括本领域中熟知的组成型和诱导型启动 子、 转录增强子、 转录终止子等。当打算共表达两种或两种以上外源编码核酸时， 这两种核 酸皆可插入例如单一表达载体中或单独的表达载体中。对于单一载体表达， 编码核酸可操 作性地连接于一种常用表达控制序列或连接于不同的表达控制序列， 例如一种诱导型启动 子和一种组成型启动子。 代谢或合成途径中所涉及的外源核酸序列的转化可使用本领域中 熟知的方法进行证实。所述方法包括例如核酸分析， 例如 mRNA 的 Northern 印迹技术或聚 合酶链反应 (PCR) 增大， 或基因产物表达的免疫印迹技术， 或其他用于测试所引入核酸序 列或其对应基因产物的表达的合适分析方法。 本领域技术人员应了解外源核酸是足量表达 以产生期望产物， 且应进一步了解可使用本领域中熟知且如本文所公开的方法优化表达水 平以获得充分表达。
本发明提供一种产生异丙醇的方法， 其包括培养具有异丙醇途径的非天然存在的 微生物有机体。所述途径包含编码异丙醇途径酶的至少一种外源核酸， 所述外源核酸在用 于产生异丙醇的条件和足够时间下足量表达以产生异丙醇。 异丙醇途径包括乙酰乙酰 -CoA 硫解酶、 乙酰乙酰 -CoA: 乙酸酯 :CoA 转移酶、 乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。可选的 异丙醇途径包括琥珀酰 -CoA:3- 酮酸 CoA 转移酶、 乙酰乙酸酯脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
在有机体具有甲醇甲基转移酶的实施方案中， 培养可利用例如以下的原料进行 ： 1) 甲醇和 CO， 2) 甲醇、 CO2 和 H2， 3) 甲醇、 CO、 CO2 和 H2， 4) 甲醇和包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 甲醇和包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
在有机体具有甲酸酯脱氢酶、 甲酰四氢叶酸合成酶、 次甲基四氢叶酸环化水解酶、 亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶的实施方案中， 所述有机体可利用例如以 下的原料 ： 1)CO， 2)CO2 和 H2， 3)CO 和 CO2， 4) 包含 CO 和 H2 的合成气体， 和 5) 包含 CO、 CO2 和 H2 的合成气体。
类似地， 可以通过培养本文上述的适宜有机体来生产 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二 醇。
可使用熟知方法执行用于测试异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇产生的合适 纯化和 / 或分析。对于打算测试的每种经工程改造的菌株， 可培养合适的复制菌株， 例如一 式三份培养物。例如， 可监测经工程改造的生产宿主中的产物和副产物形成。可通过例如 HPLC( 高效液相色谱 )、 GC-MS( 气相色谱 - 质谱法 ) 和 LC-MS( 液相色谱 - 质谱法 ) 或其他 合适的分析方法等方法， 使用本领域中熟知的常规程序来分析终产物和中间物和其他有机 化合物。也可用培养物上清液来测试发酵液中的产物释放情况。副产物和残余葡萄糖可通 过 HPLC， 使用例如针对葡萄糖和醇类的折射率检测器和针对有机酸的 UV 检测器 (Lin 等人， Biotechnol.Bioeng.90 ： 775-779(2005))， 或其他在本领域中熟知的合适分析和检测方法 来定量。来自外源 DNA 序列的单独酶或蛋白活性也可使用本领域中熟知的方法来分析 ( 参 见例如， WO/2008/115840 和 Hanai 等人， Appl Environ Microbiol 73 ： 7814-7818(2007))。
异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇可使用本领域中熟知的各种方法与培养物 中的其他组分分离。所述分离方法包括例如萃取程序， 以及包括连续液液萃取、 渗透蒸发、 膜过滤、 膜分离、 反渗透、 电渗析、 蒸馏、 结晶、 离心、 萃取过滤、 离子交换色谱、 尺寸排阻色 谱、 吸附色谱和超滤的方法。所有上述方法皆为本领域中所熟知。可培养本文所述的任何非天然存在的微生物有机体以产生和 / 或分泌本发明的 生物合成产物。例如， 可培养异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇产生者以便以生物合成 产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇。
为了产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇， 在具有碳源和其他必需营养物的 培养基中培养重组菌株。非常需要在发酵罐中维持厌氧条件以降低全过程的成本。所述条 件可例如通过首先用氮气喷射培养基， 然后用隔膜和螺旋盖密封烧瓶来获得。对于在厌氧 条件下未观察到生长的菌株， 可通过在隔膜上打出用于有限通气的小孔来应用微氧条件。 示例性厌氧条件先前已有描述且为本领域中所熟知。例如 2007 年 8 月 10 日提交的美国专 利申请序列号 No.11/891,602 描述示例性需氧和厌氧条件。发酵可如本文所公开以分批、 补料分批或连续方式进行。
必要时， 可通过根据需要添加碱 ( 例如 NaOH 或其他碱 ) 或酸使培养基维持在所需 pH 下而使培养基的 pH 维持在期望 pH， 尤其中性 pH， 例如约 7 的 pH。生长速率可通过使用 分光光度计 (600nm) 测量光学密度来测定， 且葡萄糖摄取速率可通过监测碳源随时间的消 耗来测定。
除了例如上述示例的再生原料之外， 本发明的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二 醇微生物有机体可被改造为在作为碳源的合成气上生长。在具体实施方案中， 一种或多种 蛋白或酶在产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的有机体中表达， 以提供利用合成气 或其他气态碳源的代谢途径。
虽然本发明的有机体被设计成利用合成气和 / 或甲醇作为生长源， 但是它们可以 利用例如任何可向非天然存在的微生物供应碳源的碳水化合物源。 所述碳水化合物源包括 例如糖类， 例如葡萄糖、 木糖、 阿拉伯糖、 半乳糖、 甘露糖、 果糖和淀粉。 其他碳水化合物源包 括例如再生原料和生物质。 可在本发明方法中用作原料的生物质的示例性类型包括纤维素 类生物质、 半纤维素类生物质和木质素原料或所述原料的部分。所述生物质原料含有例如 可用作碳源的碳水化合物底物， 例如葡萄糖、 木糖、 阿拉伯糖、 半乳糖、 甘露糖、 果糖和淀粉。 根据本文提供的教导和指导， 本领域技术人员将了解除上文示例者之外的再生原料和生物 质也可用于培养本发明的微生物有机体以供产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇。
因此， 根据本文所提供的教导和指导， 本领域技术人员将了解可产生非天然存在 的微生物有机体， 其在例如 CO 和 / 或 CO2 等碳源生长时， 可分泌经生物合成的本发明化合 物。所述化合物包括例如异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇和异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径中的任何中间代谢物。为了实现期望化合物或中间物的生物合成， 需要对 一种或多种所需酶或蛋白活性进行工程改造， 包括例如并入部分或所有异丙醇、 4- 羟基丁 酸酯或 1， 4- 丁二醇生物合成途径。因此， 本发明提供一种非天然存在的微生物有机体， 其 在碳水化合物或其他碳源上生长时产生和 / 或分泌异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇， 且在碳水化合物或其他碳源上生长时产生和 / 或分泌异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇 途径中所示的任何中间代谢物。 本发明的产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的微生 物有机体可引发从例如乙酰 -CoA 等中间物的合成。
可使用如本文示例的本领域中熟知的方法构建本发明的非天然存在的微生物有 机体， 以便以足够量外源表达至少一种编码异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇途径酶或 蛋白的核酸以产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇。 应了解本发明的微生物有机体是在足以产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的条件下培养。 根据本文提供的教导和指 导， 本发明的非天然存在的微生物有机体可实现异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的生 物合成， 从而产生约 0.001-200mM 以上的细胞内浓度。一般来说， 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的细胞内浓度为约 3-1800mM， 尤其是约 5-1700mM， 更尤其是约 8-1600mM， 包括 约 100mM、 200mM、 500mM、 800mM 以上。还可从本发明的非天然存在的微生物有机体获得介于 这些示例性范围之间和在这些示例性范围以上的细胞内浓度。
在一些实施方案中， 培养条件包括厌氧或基本上厌氧的生长或维持条件。示例性 厌氧条件先前已有描述且为本领域中所熟知。本文描述了用于发酵过程的示例性厌氧条 件， 且其也例如描述于 2007 年 8 月 10 日提交的美国专利申请序列号 No.11/891,602 中。 这 些条件中的任一种以及本领域中熟知的其他厌氧条件皆可用于非天然存在的微生物有机 体。 在所述厌氧条件下， 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇产生者可以 5-10mM 以上的细 胞内浓度以及本文示例的所有其他浓度合成异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇。应了 解， 即使以上描述是指细胞内浓度， 产生的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇微生物有 机体可细胞内产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇和 / 或将产物分泌进培养基中。
培养条件可包括例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如本文所 述， 本发明的生物合成产物的尤其有用的产率可在厌氧或基本上厌氧的培养条件下获得。
如本文所述， 一种用于实现异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的生物合成的示 例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方案中， 本发明的非天然存在的微生 物有机体可在厌氧或基本上厌氧条件下维持、 培养或发酵。 简言之， 厌氧条件是指没有氧的 环境。 基本上厌氧条件包括在例如培养基中的溶解氧浓度保持在 0 ～ 10％饱和度的条件下 培养、 分批发酵或连续发酵。基本上厌氧条件还包括在维持于小于 1％氧的气氛的密封室 内， 在液体培养基中或固体琼脂上生长或放置细胞。氧的百分比可通过例如用 N2/CO2 混合 物或其他合适的一种或多种非氧气体喷射培养物来维持。
本文所述的培养条件可以按比例扩大和连续扩大以供产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯 或 1， 4- 丁二醇。 示例性生长程序包括例如补料分批发酵和分批分离 ； 补料分批发酵和连续 分离 ； 或连续发酵和连续分离。所有这些过程皆为本领域中所熟知。发酵程序尤其适用于 以生物合成方法产生商业量的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇。通常情况下且如同 不连续培养程序中的情况一样， 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的连续和 / 或接近连 续产生将包括在充足的营养物和培养基中培养本发明的非天然存在的产生异丙醇、 4- 羟基 丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的有机体以保持和 / 或接近保持指数生长期的生长。在所述条件下 的连续培养可包括例如 1 天、 2 天、 3 天、 4 天、 5 天、 6 天或 7 天以上。此外， 连续培养可包括 1 周、 2 周、 3 周、 4 周或 5 周以上和至多数月。或者， 本发明的有机体可根据特定应用的需要 培养数小时。应了解连续和 / 或接近连续培养条件还可包括这些示例性时段之间的所有时 间间隔。应进一步了解， 本发明的微生物有机体的培养时间是足以产生足量产物用于期望 目的的时段。
发酵程序为本领域中所熟知。 简言之， 用于以生物合成方法产生异丙醇、 4- 羟基丁 酸酯或 1， 4- 丁二醇的发酵可例如以下列方式利用 ： 补料分批发酵和分批分离 ； 补料分批发 酵和连续分离 ； 或连续发酵和连续分离。分批和连续发酵程序的例子为本领域中所熟知。
除了使用本发明的异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇产生者连续产生大量异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的上述发酵程序外， 异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二 醇产生者也可例如根据需要同时经历化学合成程序以将产物转化为其他化合物， 或产物可 从发酵培养物分离， 和后续经历化学转化以将产物转化为其他化合物。
合成气发酵中重要的过程考虑因素有高生物质浓度和良好的气 - 液传质 (Bredwell 等人， Biotechnol Prog.15 ： 834-844(1999)。CO 在水中的溶解度稍微小于氧在 水中的溶解度。在受控发酵罐中执行连续充气发酵， 其中通过质谱测定法和周期液体取样 进行恒定废气分析并通过 GC 和 HPLC 进行分析。液相可以分批模式运行。例如醇、 有机酸 和残余葡萄糖以及残余甲醇等发酵产物可通过 HPLC(Shimadzu， Columbia MD) 定量， 其中例 如使用 HPLC 柱的 系列 ( 例如 HPX-87 系列 )(BioRad， Hercules CA)， 对于葡萄糖 和醇使用折射率检测器， 且对于有机酸使用 UV 检测器。通过使用分光光度计 (600nm) 测量 光学密度来确定生长速率。 这些系统中的所有管道都是玻璃或金属的， 以便维持厌氧条件。 用玻璃料执行气体鼓泡以降低气泡尺寸并改善质量传递。测试在约 0.1 ～ 1vvm( 每分钟的 蒸气体积 ) 范围内的各种鼓泡速率。为了获得气体吸收率的精确测量， 执行暂时停止气流 的周期性挑战， 并将气相组成作为时间的函数来监测。
为了实现总体目标生产率， 使用细胞滞留或再循环方法。一种增加微生物浓度 的方法是经由切向流膜 (tangential flow membrane) 从测流再循环细胞。也可使用 重复分批培养， 如先前针对穆尔氏菌的乙酸酯生产所述 (Sakai 等人， J Biosci.Bioeng 99 ： 252-258(2005))。 也 可 使 用 各 种 其 他 方 法 (Bredwell 等 人， Biotechnol Prog.15 ： 834-844(1999) ； Datar 等 人， Biotechnol Bioeng 86 ： 587-594(2004))。 可 测 试 其 他 优 化 ( 例 如 1.5atm 的 超 压 ) 以 改 善 质 量 传 递 (Najafpour 和 Younesi， Enzyme and MicrobialTechnology 38[1-2]， 223-228(2006))。
一旦使用纯 H2/CO 作为进料获得了令人满意的表现， 则产生含有可能存在于商业 合成气中的抑制剂的合成气混合物。例如， 典型杂质概况为 4.5％ CH4、 0.1％ C2H2、 0.35％ C2H6、 1.4％ C2H4 和 150ppm 一氧化氮 (Datar 等人， Biotechnol Bioeng 86 ： 587-594(2004))。 由例如苯、 甲苯、 乙苯、 对二甲苯、 邻二甲苯和萘等化合物代表的焦油以 ppm 水平添加以测 试对生产的任何影响。例如， 已经显示 40ppm 的 NO 对嗜羧酸梭菌具有抑制性 (Ahmed 和 Lewis， Biotechnol Bioeng 97 ： 1080-1086(2007))。培养物在转移到发酵罐之前以摇瓶培 养法测试。还测试这些潜在抑制化合物的不同含量以便定量其对细胞生长的影响。所述知 识用于开发合成气纯度的规格， 其用于按比例增大的研究和生产中。如果发现有任何特定 组分难以从用于规模化的合成气中减少或移除， 那么可利用适应进化程序使细胞耐受一种 或多种杂质。
为 了 产 生 更 好 的 产 生 者， 可 利 用 代 谢 建 模 来 优 化 生 长 条 件。 也 可 用 建 模 来 设计基因剔除， 其另外优化途径的利用 ( 参见例如美国专利公开 US2002/0012939、 US 2003/0224363、 US 2004/0029149、 US 2004/0072723、 US 2003/0059792、 US 2002/0168654 和 US 2004/0009466， 和美国专利 No.7,127,379)。建模分析允许可靠地预测使代谢朝着更 有效产生异丙醇、 4- 羟基丁酸酯或 1， 4- 丁二醇的方向移动对细胞生长的影响。
一种鉴别和设计有利于期望产物的生物合成的代谢改变的计算方法是 OptKnock 计算框架 (Burgard 等人， Biotechnol.Bioeng.84 ： 647-657(2003))。OptKnock 是一种代 谢建模和模拟程序， 其表明可形成过量产生目标产物的遗传稳定的微生物的基因缺失策略。具体来说， 所述框架检查微生物的完整代谢和 / 或生物化学网络， 以便表明促使期望 生物化学产物变成细胞生长的专性副产物的基因操作。通过用具有战略意义的基因缺失 或其他功能基因破坏使生物化学生产与细胞生长联系， 在生物反应器中历经长时间后施加 于经工程改造的菌株的生长选择压力可导致性能提高， 因为生长与生物化学生产被强制联 系。最后， 当构建基因缺失时， 经设计的菌株还原成其野生型状态的可能性可以忽略， 因为 OptKnock 所选择的基因会从基因组完全移除。因此， 所述计算方法可用于鉴别可实现期望 产物的生物合成的替代途径， 或与非天然存在的微生物有机体结合使用以便进一步优化期 望产物的生物合成。
简言之， OptKnock 是本文中用于指代建模细胞代谢的计算方法和系统的术语。 OptKnock 程序涉及将特定约束纳入通量平衡分析 (FBA) 模型中的模型和方法的框架。 这些 约束包括例如定性动态信息、 定性调控信息和 / 或 DNA 微阵列实验数据。OptKnock 还例如 通过缩窄经由通量平衡模型产生的通量边界， 随后探测在基因添加或缺失存在下代谢网络 的性能极限来计算各种代谢问题的解决方案。OptKnock 计算框架允许构建能够有效地询 问代谢网络的性能极限的模型公式， 并提供对所得混合整数线性规划问题求解的方法。本 文中称为 OptKnock 的代谢建模和模拟方法描述于例如 2002 年 1 月 10 日提交的美国公开 2002/0168654、 2002 年 1 月 10 日提交的国际专利申请 No.PCT/US02/00660 和 2007 年 8 月 10 日提交的美国专利申请 No.11/891,602 中。
另一种鉴别和设计有利于产物的生物合成产生的代谢变化的计算方法是被称作 的代谢建模和模拟系统。 这种计算方法和系统描述于例如 2002 年 6 月 14 日提 交的美国公开 2003/0233218 和 2003 年 6 月 13 日提交的国际专利申请 No.PCT/US03/18838 号中。 是一种计算系统， 可用于产生硅中 (insilico) 网络模型并模拟质量、 能 量或电荷通过生物系统的化学反应的通量， 以便界定含有化学反应在系统中任何和所有可 能的功能性的解空间， 从而确定生物系统的允许活性的范围。这种方法被称作基于约束的 建模， 因为解空间是由例如所包括反应的已知化学计量以及反应热力学和与通过反应的最 大通量能力约束等约束界定。 可询问这些约束所界定的空间以确定生物系统或其生物化学 组分的表型能力和行为。
这些计算方法与生物现实一致， 因为生物系统适用性强且可以许多不同方式获得 相同结果。经由进化机制设计生物系统， 所述进化机制已经受所有活系统必须面对的基本 约束限制。因此， 基于约束的建模策略涵盖这些一般现实。此外， 经由缩窄约束而对网络模 型连续施加进一步约束的能力导致解空间的尺寸变小， 从而提高生理性能或表型的预测精 确性。
根据本文所提供的教导和指导， 本领域技术人员将能够应用代谢建模和模拟的各 种计算框架， 以便设计和实施期望化合物在宿主微生物有机体中的生物合成。所述代谢建 模和模拟方法包括例如上文以 和 OptKnock 示例的计算系统。为了说明本发 明， 本文关于建模和模拟的 OptKnock 计算框架描述了一些方法。本领域技术人员将知悉如 何使用 OptKnock 对本领域中熟知的任何其他代谢建模和模拟计算框架和方法应用代谢变 化的鉴别、 设计和实施。
上文所述的方法将提供一组用于破坏的代谢反应。 所述组内每个反应的消除或代 谢修饰可导致期望产物在有机体的生长期中作为专性产物产生。因为这些反应是已知的，所以二层 OptKnock 问题的解决方案也将提供催化这一组反应内每个反应的一种或多种酶 的相关编码基因。对于一组反应和其参与每个反应的酶的对应编码基因的鉴别一般是自 动化方法， 这可经由将所述反应与在酶和编码基因之间具有关系的反应数据库相关联来实 现。
一旦得到鉴别， 就通过至少一种编码这一组反应内每个代谢反应的基因的功能破 坏在目标细胞或有机体中实施打算破坏以产生期望产物的这一组反应。 一种尤其有用的实 现反应组的功能破坏的方法是缺失每种编码基因。 然而， 在一些情况下， 通过其他基因畸变 破坏反应可能是有利的， 包括例如突变、 调控区 ( 例如启动子或调控因子的顺式结合位点 ) 缺失或在许多位置中的任一个位置截断编码序列。例如， 当希望快速评定产物偶联时， 或 当遗传逆转不太可能发生时， 产生少于基因集合的总体缺失的缺失的这些畸变可能是有利 的。
为了针对上述二层 OptKnock 问题确定其他生产解决方案， 从而产生用于破坏的 其他各组反应或可实现生物合成 ( 包括期望产物的生长偶联型生物合成 ) 的代谢修饰， 可 实施被称作整数分割的优化方法。所述方法是通过对上文示例的 OptKnock 问题迭代求解 来进行， 其中在每次迭代时纳入被称作整数分割的另一种约束。整数分割约束有效地防止 求解过程选择在任何先前迭代中鉴别的完全相同的一组反应， 所述迭代强制产物生物合成 与生长联系。例如， 如果先前鉴别的生长偶联型代谢修饰规定反应 1、 2 和 3 用于破坏， 那么 以下约束防止在随后求解中同时考虑相同的反应。 整数分割方法在本领域中是熟知的且可 描述于例如 Burgard 等人， Biotechnol.Prog.17 ： 791-797(2001) 中。与本文关于与代谢建 模和模拟的 OptKnock 计算框架组合使用而描述的所有方法一样， 减少迭代计算分析中的 冗余度的整数分割方法也可与本领域中熟知的其他计算框架 ( 包括例如 起应用。 本文中示例的方法允许构建以生物合成方式产生期望产物的细胞和有机体， 包括 强制目标生物化学产物的产生与经工程改造以具有所鉴别基因变异的细胞或有机体的生
)一长偶联。因此， 本文所述的计算方法允许鉴别和实施通过选自 OptKnock 或的硅中方法鉴别的代谢修饰。 这组代谢修饰可包括例如一种或多种生物合成途径酶的添加和 / 或一种或多种代谢反应的功能破坏， 包括例如通过基因缺失来破坏。
如上文所讨论的， OptKnock 方法的开发是基于突变型微生物网络当经历长期生长 选择时可朝向其以计算机预测的最大生长表型进化这一前提。换句话说， 所述方法调节有 机体在选择性压力下自我优化的能力。 OptKnock 框架允许对基于网络化学计量迫使生物化 学生产与细胞生长偶联的基因缺失组合进行穷举。对于最佳基因 / 反应剔除的鉴别需要对 二层优化问题求解， 所述问题选择活性反应组， 使得所得网络的最佳生长答案过量产生目 的生物化学品 (Burgard 等人， Biotechnol.Bioeng.84 ： 647-657(2003))。
大肠杆菌代谢的硅中化学计量模型可用于鉴别先前示例的代谢途径的必需基因， 且描述于例如美国专利公开 US 2002/0012939、 US2003/0224363、 US 2004/0029149、 US 2004/0072723、 US 2003/0059792、 US 2002/0168654 和 US 2004/0009466， 以及美国专利 No.7,127,379 中。如本文所公开的， OptKnock 数学框架可用于定位导致期望产物的生长偶 联型生产的基因缺失。此外， 二层 OptKnock 问题的解决方案仅提供一组缺失。为了列举所 有有意义的解决方案、 即导致生长偶联型生产形成的所有剔除集合， 可实施被称作整数分割的优化技术。这要求对 OptKnock 问题迭代求解， 其中在每次迭代时纳入被称作整数分割 的另一种约束， 如上文所讨论的。
应了解不会对本发明的各种实施方案的活性造成实质影响的修改也可涵盖在本 文提供的本发明的定义中。因此， 以下实施例打算说明但不限制本发明。
实施例 I
大肠杆菌中的 ACS/CODH 基因插入
本实施例描述大肠杆菌质粒的产生， 其表达产乙酸菌 ACS/CODH 操纵子基因， 包括 CODH、 ACS、 甲基转移酶和类咕啉铁硫蛋白所需的那些。本实施例还描述了它们在大肠杆菌 中的表达， 导致可观察的 CO 氧化活性、 甲基转移酶活性和类咕啉铁硫蛋白活性。最后， 本实 施例证实， 大肠杆菌容忍高 CO 浓度， 甚至当表达来自热乙酸穆尔氏菌的利用 CO 基因产物时 可以消耗 CO。
表 达 载 体 选 自 Lutz 和 Bujard 所 述 的 组 (Lutz 和 Bujard， Nucleic AcidsRes 25 ： 1203-1210(1997)) ； 这 些 与 覆 盖 一 定 范 围 拷 贝 数 的 复 制 子 兼 容。 此 外， 每个包含 prA1-lacol ； T7 早期基因启动子经 IPTG 诱导， 并且在 IPTG 存在下可以导致非常高水平的 转录， 在其他条件下抑制。从 Moth_J204(cooC) 到 Moth_1197 克隆 ACS/CODH- 编码操纵 子； 也构建仅含有 Moth_1203 ～ Moth_1197 的第二形式。通过 DNA 序列分析确认这些片段 (10-11kbp)。在 pI 5A 和 ColE1- 基载体中构建它们以得到中到高拷贝数。
为了估算重组蛋白的最终浓度， 对用于 CO 氧化、 ACS、 甲基转移酶和类咕啉 Fe-S 分 析中的相同细胞提取物相继执行 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析。所用抗血清是纯化的热 乙酸穆尔氏菌 ACS/CODH 和 Mtr 蛋白的多克隆， 并使用碱性磷酸酶连接的山羊抗兔二抗显现 出来。Western 印迹示于图 4A 和 4B 中。通过与对照泳道对比， 估算 ACS90 和 ACS91 中的 CODH 量为 50ng。
一氧化碳氧化分析 (Seravalli 等人， Biochemistry 43 ： 3944-3955(2004)) 用于 测试是否实现了来自热乙酸穆尔氏菌的 CODH- 编码基因的功能表达。含有空白载体或表 达″ Acs90″或″ Acs91″的载体的大肠杆菌 MG1655 培养物在厌氧条件下在极品肉汤培养 基 ( 补充氰基钴胺素、 亚铁和还原剂 ) 中生长， 直到到达中高密度， 此时， 加入 IPTG 到最终 浓度为 0.2mM， 以诱导启动子。在 37℃下生长 3.5 小时后， 在用溶菌酶和温和洗涤剂溶解之 前收集细胞并放置。热乙酸穆尔氏菌 CODH 比活度的基准图， 在 55℃下是 500U 或在 25℃下 是约 60U。所述分析利用在 CO 存在下甲基紫精的还原作用。这是在 578nm 下在塞紧的无 氧玻璃试管中进行测量。对于 CODH 的 CO 氧化阳性的反应变成深紫色 ( 参见图 5)。基于 Western 印迹技术的估算， 0.5％的细胞蛋白是 CODH， 因此表 35 中数据是热乙酸穆尔氏菌 CODH 活性 500U/mg 的约 1/50。然而， 在阴性对照中的活性非常小的情况下， 所述实验明确 证实了重组大肠杆菌中的 CO 氧化活性。在阴性对照中观察到的少量 CO 氧化 (CH3 紫精还 原 ) 表明大肠杆菌可能具有还原 CH3 紫精的有限能力。
表 35.
所述分析是使用 ACS/CODH、 甲基转移酶和 CFeSP 从甲基 - 四氢叶酸、 CO 和 CoA 合 成乙酰 -CoA 的活体外反应 (Raybuck 等人， Biochemistry27 ： 7698-7702(1988))。通过添加 或省略所涉及的每种酶， 所述分析可用于多种实验中， 包括测试一种或多种纯酶或细胞提 取物的活性， 和在各种条件下或用限制量的底物或酶测定反应动力学。各个时间点获取的 反应样品用从乙酰 -CoA 终产物释放乙酸酯的 1M HCl 终止反应。在用 Dewex 柱纯化之后， 可通过色谱法、 质谱法或通过测量放射性来分析乙酸酯。确切方法将由反应中所用的特异 性底物来决定。
进行分析以确定是否在大肠杆菌中表达的 ACS/CODH 操纵子表达 Fe-S 类咕啉蛋白 活性。因此， 14C- 标记的甲基 -THF 用作标记的底物， 以通过加到分离的乙酸酯样品中的放 射性测量乙酸酯合成。测试以下 6 种不同条件 ：
纯化的 ACS/CODH、 MeTr 和 CFeSP， 作为阳性对照
纯化的 ACS/CODH 与 ACS90 细胞提取物
纯化的 ACS/CODH 与 ACS91 细胞提取物
纯化的 ACS/CODH、 MeTr 与 ACS90 细胞提取物
纯化的 ACS/CODH、 MeTr 与 ACS91 细胞提取物
纯化的 ACS/CODH、 MeTr 与尽可能多的 ACS91 细胞提取物 ( 排除 MES 缓冲液 )
反应是在厌氧培养室中于充满 CO 的分析瓶中装配。总反应体积小于小瓶容积， 试剂在用 CO 填充之前添加， 使用气密性 Hamilton 注射器并维持试剂厌氧性的。反应 ( 总 计约 60μl) 由细胞提取物 ( 除了 #11)、 CoA、 柠檬酸钛 (III)、 MES( 除了 #6)、 纯化的 ACS/ CODH、 14C- 甲基 - 四氢叶酸、 甲基 - 紫精和铁氧还蛋白组成。此外， 将纯化的 MeTr 添加到 #1、 #4-6 中， 并将纯化的 CFeSP 添加到 #1 中。
反应在厌氧培养室中在 55℃的砂浴中进行。最后添加的试剂是 14C- 甲基 - 四氢 叶酸， 其启动反应 (t ＝ 0s)。立即获取初始样品， 随后在 30 分钟、 1 小时和 2 小时时获取样 品。这些时间点并不精确， 因为 6 种条件是同时运行 ( 因为该实验主要是定性实验 )。将
15μl 样品添加到闪烁瓶中的 15μl 1M HCl 中。在对反应混合物计数之后， 确定了 ACS90 提取物中的类咕啉 Fe-S 蛋白具有活性， 总活性接近阳性对照的约 1/5。
催化 CH3 从甲基 - 四氢叶酸转移到 ACS 复合物而作为乙酰 -CoA 合成的一部分的 必需甲基转移酶活性在 ACS/CODH 操纵子内编码 ( 即， 这是甲基和羰基途径结合到一起的步 骤 )。在热乙酸穆尔氏菌的操纵子内， Mtr 编码基因是 Moth_1197 且跟在主要 CODH 和 ACS 亚单元后面。因此， Mtr 活性将构成更邻近基因可被表达的间接证据。
通过光谱法分析 Mtr 活性。 具体而言， 含有 Co(III) 的甲基化 CFeSP 在约 450nm 下 具有小吸收峰， 而含有 Co(I) 的未甲基化 CFeSP 在约 390nm 下具有大峰。该光谱的形成是 因为钴和铁硫簇发色团的原因。 此外， 应注意， CFeSP 可自发地氧化为 Co(II)， 其在约 470nm 下产生宽吸收峰 (Seravalli 等人， Biochemistry 38 ： 5728-5735(1999))。对于含有 ACS90 的大肠杆菌细胞结果参见图 6。
为了测试大肠杆菌是否可在饱和量的 CO 存在下厌氧生长， 在厌氧条件下准备具 有 50ml 极品肉汤培养基 ( 加上 NiCl2、 Fe(II)NH4SO4 和氰基钴胺素 ) 的 120ml 血清瓶。这些 瓶子的一半用氮气平衡 30 分钟， 另一半则用 CO 气体平衡 30 分钟。使用空白载体 (pZA33) 作为对照， 并用 N2 和 CO 测试含有 pZA33 空白载体以及 ACS90 和 ACS91 的培养物。所有培养 物在 37℃下振荡 (250rpm) 下培养 36 小时。在 36 小时结束时， 检查烧瓶， 发现总共有大量 的生长 ( 图 7)。观察到的生长整体在过夜后会发生一些密度的长延迟 ( 低但可以看到 )。 来自大肠杆菌种的接种体大小为约 0.5ml。
通过分析肌红蛋白在暴露于 CO 后的光谱移位来测量最终 CO 浓度。经连二亚硫酸 钠还原的肌红蛋白在 435nm 下具有吸收峰 ； 这个峰在使用 CO 的情况下则移动到 423nm。因 为波长很低 ( 并且需要记录从 300nm 向上的全波谱 )， 所以必须使用石英试管。 针对标准曲 线测量 CO 浓度， 且其取决于在 20℃和 latm 下的最大水溶性＝ 970 微摩尔浓度的 CO 的亨利 定律 (Henry′ s Law) 常数。
表 36 所示结果是极为令人鼓舞的。无论菌株是否在 CO 存在下培养， 生长到达相 似水平 ( 通过目视观察 )。此外， 阴性对照的最终 CO 浓度为 930 微摩尔， 而 ACS/CODH 操纵 子表达菌株为 688 和 728 微摩尔。显然， 由于大的标准偏差， 这些测量的误差很大。然而， 该测试的确允许获得两个试验结论 ： 1) 大肠杆菌可耐受厌氧条件下对 CO 的暴露， 和 2) 表 达 ACS/CODH 操纵子的大肠杆菌细胞可代谢部分 CO。第二个结论与第一个结论相比确定性 明显更低。
表 36.
本申请通篇引用了各种公开文献。 这些公开文献的公开内容是以引用的方式全部 并入到本申请中， 以便更充分地描述本发明所属领域的发展水平。
虽然已经参考所公开的实施方案描述了本发明， 但是本领域技术人员应了解上述 的具体例子和研究仅用于说明本发明。 应了解在不脱离本发明精神的情况下可进行各种修 改。因此， 本发明仅受所附权利要求书的限制。