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一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24
    【技术领域】

    本发明涉及一种吲哚和粪臭素降解微生物。

    背景技术

    吲哚和粪臭素是畜禽养殖场废水中主要的有恶臭气味的杂环芳香烃类化合物，它们由色氨酸在动物体内分解而产生的。这两种化合物同样出现在医疗用品、杀虫剂、消毒剂、农用化工用品的生产废水中。这些化学物质的大规模的生产和广泛的应用导致了土壤、地表水和地下水的污染，对人体和动物健康造成了严重的威胁。吲哚和粪臭素可以被人体和动物吸收进入血液，经生物活化后产生有毒的中间产物而影响血液中复合胺的产生，甚至产生溶血现象。有研究表明，动物体内雌激素酮浓度的升高与粪臭素含量直接相关。另外，粪臭素还是一种肺炎球菌毒素。暴露在吲哚环境下的植物组织由于蒽醌合成的影响而表现出低色素沉着。吲哚和粪臭素同样对许多微生物存在毒性效应。它们对细菌均有相当广泛的生物抑制作用，同时对瘤胃纤毛微生物也有毒性作用。

    由于吲哚和粪臭素的难降解性及其生物毒性，降解这类化合物的细菌很难分离。虽然前人做过一些关于混合微生物降解的研究工作，但关于纯细菌对吲哚或粪臭素的降解还很少见到报道。

    【发明内容】

    本发明的目的在于提供一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24，它具有良好的去除畜禽养殖废水中吲哚和粪臭素的能力。

    本发明所提供一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24，为恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24 CCTCC NO：M 209099，已于2009年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M 209099。

    一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的菌落形态为：菌落呈米白色(老龄菌呈米黄色)、规则圆形、缘齐、不透明、表面光滑、球状凸起、粘稠状，菌株生理特征：呈直或微弯的杆状，0.7～1.1μm×2.0～4.0μm，单个或成对排列，革兰氏阴性；主要生化特征：兼性厌氧，化能异养菌，能利用硝酸盐，氧化酶阳性，产生精氨酸双水解酶和脲酶，运动，不生孢子，最适生长温度25～37℃。

    所述的畜禽主要有猪、牛、羊、驴、兔、鸡、鸭、鹅等。

    本发明的有益效果是：从畜禽养殖废水的厌氧反应器的活性污泥中筛选到一株在含粪臭素和吲哚条件下具有一定生长能力的新菌株。一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24有良好的去除畜禽养殖废水中吲哚和粪臭素的能力，该菌株能使吲哚和粪臭素的去除效率提高20-30％。

    【附图说明】

    图1是一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的PCR产物琼脂糖电泳图(1：核DNA，2：扩增产物，M：Marker)。

    图2是一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24的电镜图片。

    图3是一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24在含有0.5mM吲哚和粪臭素的人工废水中的降解效率图。

    【具体实施方式】

    一、一株吲哚和粪臭素降解菌的筛选方法：

    (一)、材料准备：

    1、实验废水(畜禽养殖废水)取自湖北省鄂州市湖北省原种猪场排污口，活性污泥取

    四、菌株LPC24为新的菌株：

    采用BLAST分析法对菌株LPC24的16S rRNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现，菌株LPC24与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的同源性高达99.0％。

    综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株LPC24命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)LPC24。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)LPC24为新的菌株，已于2009年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M 209099。

    本发明从畜禽养殖废水厌氧反应器的活性污泥中分离出这一株细菌，并发现其较强的降解吲哚和粪臭素的功能。这拓宽了人们对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含吲哚和粪臭素类废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。

    五、菌株LPC24的应用：

    (一)、挑取恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24单菌落，于液体MSM培养基中培养过夜，按培养后的恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24∶含吲哚和粪臭素废水(如畜禽养殖废水)的体积比为0.5-2∶100取恶臭假单胞菌(Psedomonas.putida)LPC24接种于含吲哚和粪臭素废水(如畜禽养殖废水)中，30-35℃恒温培养，pH值为6.0-8.0，反应3-5天。

    所述的液体MSM培养基为：(NH₄)₂SO₄，0.33g；NaNO₃，0.85g；K₂HPO₄，0.79g；KH₂PO₄，0.20g；CaCl₂，0.05g；MgCl₂，0.50g；FeCl₂，0.01g；H₂O 1000mL；pH为7.2；高压灭菌后采用过滤除菌后的粪臭素和吲哚，使液体MSM培养基中粪臭素和吲哚的浓度为1.0mM(即mmol/L)。

    (二)、菌株LPC24对吲哚、粪臭素的降解能力：

    为了考察菌株对吲哚、粪臭素的降解能力，研究了在人工废水MSM中，细菌降解吲哚、粪臭素的能力。取人工废水MSM{人工废水MSM(g/L)：(NH₄)₂SO₄，0.33；NaNO₃，0.85；K₂HPO₄，0.79；KH₂PO₄，0.20；CaCl₂，0.05；MgCl₂，0.50；FeCl₂，0.01，pH为7.2；加入粪臭素和吲哚使其终浓度为1.0mM}100mL加入250mL的锥形瓶中，加入菌株LPC24的菌悬液(菌悬液配制：用接种环挑取LPC24菌落于10mL的LB液体培养基中，30℃震摇培养12小时)1mL，30℃、静止培养18d，定期检测剩余吲哚、粪臭素的量(见图3)。结果表明。该菌株能在10天内将0.5mM的吲哚降解99％以上，将0.5mM的粪臭素在19天内降解99％以上。

    为了考察该菌株在实际处理畜禽养殖废水的中吲哚和粪臭素的能力，研究了该菌株投加到畜禽养殖废水厌氧反应器中，吲哚和粪臭素的降解效率。在长期(稳定运行三个月以上)稳定运行的反应器中加入菌株LPC24的菌悬液10mL(菌悬液配制：用接种环挑取LPC24菌落于10mL的LB液体培养基中，30℃震摇培养12小时)，反应器中含吲哚和粪臭素废水{实验废水(畜禽养殖废水)取自湖北省鄂州市湖北省原种猪场排污口}为1000mL(粪臭素的浓度约为1.0mg/L，吲哚的浓度约为1.5mg/L)，30℃、静止一周，再稳定运行30天，在反应器稳定运行期间定期检测吲哚、粪臭素的去除效率，与未投加该菌株的对照反应器对比，结果表明，去除畜禽养殖废水中的粪臭素约为1.0mg/L，吲哚约为1.5mg/L；该菌株能使该反应器处理吲哚和粪臭素的去除效率提高20-30％(反应器原始去除率为70-75％，加入菌株LPC24后处理效率为96-99％)。

    菌株LPC24的序列表

    <110>中国地质大学(武汉)

    <120>一株吲哚和粪臭素降解菌株LPC24

    <160>1431

    <210>1

    <211>1431bp

    <212>DNA

    <213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

    <400>1

    CCGTGGTAAC CGTCCTCCCG AAGGTTAGAC TAGCTACTTC TGGTGCAACC CACTCCCATG    60

    GTGTGACGGG CGGTGTGTAC AAGGCCCGGG AACGTATTCA CCGCGACATT CTGATTCGCG    120

    ATTACTAGCG ATTCCGACTT CACGCAATCG AGTTGCAGAC TGCGATCCGG ACTACGATCG    180

    GTTTTGTGAG ATTAGCTCCA CCTCGCGGCT TGGCAACCCT CTGTACCGAC CATTGTAACA    240

    CGTGTGTAGC CCAGGCCGTA AGGGCCATGA TGACTTGACG TCATCCCCAC CTTCCTCCGG    300

    TTTGTCACCG GCAGTCTCCT TAAAGTGCCC ACCATTACGT GCTGGTAACT AAGGACAAGG    360

    GTTGCGCTCG TTACGGGACT TAACCCAACA TCTCACGACA CGAGCTGACG ACAGCCATGC    420

    AGCACCTGTG TCAGAATTCC CGAAGGCACC AATCCATCTC TGGAAAGTTC TCTGCATGTC    480

    AAGGCCTGGT AAGGTTCTTC GCGTTGCTTC CAATTAAACC ACATGCTCCA CCGCTTGTGC    540

    GGGCCCCCGT CAATTCATTT GAGTTTTAAC CTTGCGGCCG TACTCCCCAG GCGGTCAACT    600

    TAATGCGTTA GCTGCGCCAC TAAAATCTCA AGGATTCCAA CGGCTAGTTG ACATCGTTTA    660

    CGGCGTGGAC TACCAGGGTA TCTAATCCTG TTTGCTCCCC CACGCTTTCG CACCTCAGTG    720

    TCAGTATCAG TCCAGGTGGT CGCCTTCGCC ACTGGTGTTC CTTCCTATAT CTACGCATTT    780

    CACCGCTACA CAGGAAATTC CACCACCCTC TACCGTACTC TAGCTTGCCA GTTTTGGATG    840

    CAGTTCCCAG GTTGAGCCCG GGGCTTTCAC ATCCAACTTA ACAAACCACC TACGCGCGCT    900

    TTACGCCCAG TAATTCCGAT TAACGCTTGC ACCCTCTGTA TTACCGCGGC TGCTGGCACA    960

    GAGTTAGCCG GTGCTTATTC TGTCGGTAAC GTCAAAACAG CAAGGTATTA ACTTACTGCC    1020

    CTTCCTCCCA ACTTAAAGTG CTTTACAATC CGAAGACCTT CTTCACACAC GCGGCATGGC    1080

    TGGATCAGGC TTTCGCCCAT TGTCCAATAT TCCCCACTGC TGCCTCCCGT AGGAGTCTGG    1140

    ACCGTGTCTC AGTTCCAGTG TGACTGATCA TCCTCTCAGA CCAGTTACGG ATCGTCGCCT    1200

    TGGTGAGCCA TTACCCCACC AACTAGCTAA TCCGACCTAG GCTCATCTGA TAGCGCAAGG    1260

    CCCGAAGGTC CCCTGCTTTC TCCCGTAGGA CGTATGCGGT ATTAGCGTTC CTTTCGAAAC    1320

    GTTGTCCCCC ACTACCAGGC AGATTCCTAG GCATTACTCA CCCGTCCGCC GCTGAATCAA    1380

    GGAGCAAGCT CCCGTCATCC GCTCGACTTG CATGTGTTAG GCCTGCCGCC A             1431