一种用于肺癌化疗药物敏感性检测的细胞系及其建立 【技术领域】
本方法涉及一种稳定表达细胞系及其建立，该细胞系能够对现有肺癌化疗药物进行药物敏感性检测并预测患者的化疗疗效。
背景技术
肺癌是我国和全世界范围危害人类生命健康的常见肿瘤。在全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首。5年生存率仅约10％，使得肺癌防治成为癌症防治的重中之重、难中之难。我国肺癌的发病率和死亡率一直呈明显上升趋势。20世纪90年代与70年代相比，我国肺癌的死亡率上升了111.85％。目前我国肺癌发病率已超过万分之三，达到十万分之三十五，成为发病率最高的恶性肿瘤。同时肺癌的死亡率已由20世纪70年代位居癌症死因的第4位攀升为第1位。由于已暴露的人群数目甚大，上升趋势至少要延续20～30年。
肺癌早期少有症状，因症状就诊者多属中晚期，化疗方案虽繁多，但疗效不佳，且毒副反应严重。因而选择合适的治疗方案以提高化疗疗效是提高肺癌治愈率、降低死亡率的关键。但是，目前全世界尚没有成熟的肺癌化疗敏感性预测方法。
eIF3a是一种新确定的肿瘤相关蛋白，它在肿瘤发生机制，维持恶性生物性状中具有重要作用，eIF3a的高度表达与细胞的分化增殖密切相关。现有研究表明eIF3a的表达情况与肺癌的化疗敏感性相关。因此，体外检测并确定化疗药物疗效与eIF3a表达情况的相关性对于制定肿瘤化学治疗方案具有重要指导意义。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提出一种能够用于对现有肺癌化疗药物进行药物敏感性检测并预测患者化疗疗效的稳定表达eIF3a的细胞系及其建立的方法。该细胞系的建立方法操作简便、条件稳定、成本低，建立的细胞系稳定表达，预测效果好。
本发明是通过以下方式实现的。
NIH3T3为小鼠的成纤维细胞系，细胞贴壁生长，呈梭形，生长速度快，2-3天传代一次，该细胞系无eIF3a的内源性表达，故选择该细胞建系。本发明NIH3T3-eIF3a细胞系的具体建立方法为：将NIH3T3细胞使用10％的小牛血清加上DMEM(GIBCO，invitrogen公司产品)培养，置于37℃，5％CO2培养箱中培养3天，种12孔板，并换上无抗生素培养基继续培养24小时。使用Lipofectamine 2000TM按照1∶2.5的比例转染2μg的eIF3a真核表达载体pCβA-eIF3a(其具体序列见后序列表)至细胞中。转染后48小时按照1∶10体积比例稀释传代至100mm的细胞培养皿中，其接种量为1ml。加入600μg/ml的G418筛选2个星期，挑选单克隆并扩大培养。使用Real-time PCR和Western Blot验证后，稳定传代至建立细胞系。所建立的细胞系使用350μg/ml的G418维持培养。
本发明研究了一种能够用于对现有肺癌化疗药物进行药物敏感性检测并预测患者化疗疗效的稳定表达eIF3a的细胞系及其建立的方法。该细胞系的建立方法操作简便、条件稳定、成本低，建立的细胞系稳定表达，预测效果好。
【附图说明】
图1为NIH3T3-eIF3a细胞系的eIF3a表达Real-time PCR检测结果；
图2为NIH3T3-eIF3a细胞系的eIF3a表达Western Blot检测结果；
S1，S2：两株eIF3a过表达的NIH3T3-eIF3a细胞系，
Vector：空白载体转染细胞，
Empty：未转染细胞。
【具体实施方式】
以下实施例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1：本发明细胞系的建立
将NIH3T3细胞使用10％的小牛血清加上DMEM(GIBCO，invitrogen公司产品)培养，置于37℃，5％CO2培养箱中培养3天，种12孔板，并换上无抗生素培养基继续培养24小时。使用Lipofectamine 2000TM按照1∶2.5的比例转染2μg的eIF3a真核表达载体pCβA-eIF3a，其具体构建方法为扩增eIF3a的cDNA，并且两端带上Not I和Kpn I的酶切位点，然后连接到pCβA空载体上。其具体序列见后序列表)至细胞中。转染后48小时按照1∶10体积比例稀释传代至100mm的细胞培养皿中，其接种量为1ml。加入600μg/ml的G418筛选2个星期，挑选单克隆并扩大培养。使用Real-time PCR和Western Blot验证后，稳定传代至建立细胞系。所建立的细胞系使用350μg/ml的G418维持培养。
实施例2：具体检测方法
(1)取对数生长期NIH3T3细胞，调整细胞悬液浓度，种于96孔板，每孔100ul，5000个/孔；
(2)37℃，5％CO2培养24小时；
(3)分别加入不同浓度的待测药物(各不同种类的肺癌化疗药物)，继续培养3天。所使用的浓度为0，0.01，0.1，1，10，100uM；
(4)分别选取第1、2、3天的细胞，加入20ul MTT/孔，继续培养4-6小时；
(5)使用酶标仪于490nm处检测吸光值；
(6)根据不同浓度药物的吸光值绘制剂量效应曲线，并计算不同组别的IC50，使用方差分析比较有eIF3a表达和无eIF3a表达细胞组别的IC50，以确定是否有差别。若有差别则表示eIF3a表达不同的患者对于该药物反应不同，需调整用药。
使用本方法筛查了8种化疗药物的结果如下表所示：
稳定转染eIF3a的NIH3T3细胞对化疗药物地敏感性检测
*p＜0.05与对照组比较
从上表可以看出，该细胞系可以灵敏的在体外检测出受eIF3a表达影响的化疗药物的敏感性。
【序列表】
<110>中南大学
<120>一种用于肺癌化疗药物敏感性检测的细胞系及其建立
<130>无
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>4780
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>人工序列
<400>1
gaattccggc gcgggcgact gctggcgagg cgcgtgggac cttacgctgg ttccccttcg 60
tctcctctcc cggcccgggc cactagagag ttcgctgacg ccgggtgagc tgagcctgcc 120
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gagaaagaga ccgagaccga gaaagagaag gtgaaaaaga gaaggcctca tggagagctg 4200
agaaagatag ggaatctctc cgtcgtacta aaaatgagac tgatgaagat ggatggacca 4260
cagtacgacg ttaagtctca agataatgga tttaaactgg tgtcttaaat aggtttgatc 4320
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cttcaggtat tgagtaacac ctttatcttg gtatagaact gatacctttt tttgattttg 4620
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