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鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法
    【技术领域】

    本发明属于转基因植物检测领域，特别是涉及鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法

    背景技术

    我国是转基因作物的主要种植国家之一，2009年种植面积位于全球第六位。我国商业化种植的转基因作物主要为转基因抗虫棉花何抗木瓜环斑病毒的转基因番木瓜等。其中，转Bt基因抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，2009年种植面积达370万公顷，占我国棉花种植总面积的近70％(James，Clive.2009.Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops：2009.ISAAA BriefNo.41.ISAAA：Ithaca，NY.)。我国种植的转基因棉花主要为抗虫转基因棉花。此外我国还允许国外抗除草剂棉花LLCOTTON25、抗虫转基因棉花531等5个转基因棉花进口用作加工原料(http://www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/t20091022_819214.htm)。

    抗除草剂棉花LLCOTTON25是由拜耳作物科学公司研发的通过农杆菌介导的转bar基因的抗除草剂棉花品种，2003年在美国被批准商业化应用，随后陆续在澳大利亚、巴西、加拿大等国被批准应用(http://www.agbios.com/dbase.php？action＝Submit&evidcode＝LLCotton25)。我国于2006年批准抗除草剂棉花LLCOTTON25进口用于加工原料(农基安证字(2006)第360号)。因此建立抗除草剂棉花LLCOTTON25的快速、特异性的检测方法对其监管和安全性评价显得十分必要。

    目前，PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类：一、筛选检测，以转基因通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特异性检测，以转化体特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接区域)为靶标区域。这四类检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。

    经检索公开文献和专利发现，目前尚没有抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性片段序列的报道。

    【发明内容】

    针对上述领域中的空白，本发明提供了抗除草剂棉花LLCOTTON25的5‘端和3’端转化体特异性序列以及鉴别抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出抗除草剂棉花LLCOTTON25，以及以抗除草剂棉花LLCOTTON25为亲本的棉花品系。

    鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法，其特征在于PCR体系中的正向引物是根据Seq ID No.1所示核苷酸序列1-1723bp位置设计，反向引物是根据Seq IDNo.1所示核苷酸序列1724-2006bp位置设计。

    所述正向引物为LL25-5F：5‘-ACCATCTAGCTCACTCTTGG-3’，

    所述反向引物为LL25-5R：5‘-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3’，扩增的片段为长度为411bp。

    鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法，其特征在于PCR体系中的正向引物是根据Seq ID No.2所示核苷酸序列1-476bp位置设计，反向引物是根据SeqID No.2所示核苷酸序列477-1010bp位置设计。

    所述正向引物为LL25-3F：5‘-AATCCTGTTGCCGGTCTTGC-3’，

    所述反向引物为LL25-3R：5‘-CAATCACTTGGAGTGATGAAG-3’，扩增片段长度为430bp。

    本发明通过Genome walking方法获得转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性序列，一条为外源重组载体5’端插入区域的特异性旁侧序列，另一条外源重组载体的3’端插入区域的特异性旁侧序列，根据这两条旁侧序列任意一条设计引物对，能够专门用检测LLCOTTON25及以其为亲本的棉花品种。

    本发明还进一步设计了两对特异性引物，可以用于LLCOTTON25及以其为亲本的棉花品种鉴别的最优化方案。

    本发明提供的的转化体特异性序列以及依赖其建立的转化体特异性PCR方法可作为一种鉴定转抗除草剂棉花LLCOTTON25，以及以这个品种为亲本的转基因棉品系的有效手段，由于转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25是我国允许进口用作加工原料的转基因棉花品系之一，因此本发明为特异性鉴定转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。

    【附图说明】

    图1转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体特异性序列的Genome Walking扩增

    M：DNA Marker DL2000；1-4：5‘端DL1-DL4的Walking产物；5-8：3‘端DL1-DL4的Walking产物

    图2转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的5‘端转化体特异性PCR检测结果

    M：DNA Marker DL2000；1：转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25，2-9：8个市场棉花样品；10：空白对照

    图3转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的3‘端转化体特异性PCR检测结果

    M：DNA Marker DL2000；1：转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25，2-9：8个市场棉花样品；10：空白对照

    【具体实施方式】

    下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。

    实施例1转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体特异性序列的克隆

    1实验材料

    1.1植物材料

    转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25(拜耳作物科学公司)，本实验室有保存，可向公众发放用于实验研究。

    1.2酶与试剂

    分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker等购自大连宝生物工程有限公司。

    其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

    1.3实验仪器

    PCR扩增仪：Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

    核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

    DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)

    DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

    其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。

    2实验方法和过程

    2.1棉花基因组DNA提取与检测

    2.1.1棉花基因组DNA提取

    取子叶期的幼嫩棉花叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公司)的操作手册，进行棉花材料总DNA的提取。

    2.1.2DNA检测

    取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取地DNA的浓度和纯度。

    2.2Genome walking分离转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性序列

    Genome walking也是一种扩增已知序列旁侧未知区域序列的方法，主要步骤为基因组DNA酶切、与接头连接、两次巢式PCR扩增等。本实施例采用Genome walking的方法获得了转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性序列。具体步骤参照Genome WalkerTMUniversal Kit(Takara大连公司)试剂盒说明，本实施例进行了部分改进，主要操作步骤如下。

    2.2.1基因组DNA酶切

    分别用Dra I、Stu I、Pvu II、EcoR V酶切转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25基因组DNA，标记为DL1～DL4。酶切体系为：基因组DNA(0.1μg/μL)，25μL；10×酶切Buffer，10μL；内切酶(10U/μL)，8μL；ddH2O，57μL；总体积100μL。37℃温浴2h，取出离心管，低速离心5～10s，继续温浴16～18h。各取5μL进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全。

    2.2.2纯化酶切产物

    按回收试剂盒说明书纯化酶切产物。

    2.2.3连接反应

    连接反应体系：纯化的酶切产物，4μL；接头(25μM)，1.9μL；10×连接Buffer，1.6μL；T4DNA连接酶(6U/μL)，0.5μL；ddH2O，8μL；总体积16μL。

    混合反应液，16℃温浴过夜，然后70℃变性5min。每管加入72μL ddH2O，混匀，-20℃保存备用。

    2.2.4PCR反应

    Genome Walking共需要两轮PCR反应，其PCR的反应体系见表1。

    表1反应体系(μL)

      第一轮  第二轮  ddH2O  17.375  36.25  10×Buffer(Mg2+Plus)  2.5  5  dNTP(2.5mM each)  2  4  AP1(10μM)  1  2 GSP Primer 1(10μM)  1  2  Ex Taq(5U/μL)  0.125  0.25  Template(20ng/μL)  1  0.5(第一轮反应产物)  Total volume  25  50

    两轮PCR扩增的程序见表2。

    表2Genome Walking扩增程序

    Extraction kit回收扩增片段，连接到pGEM-T easy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABI PRISM1300Genetic Analyzer进行序列测定。采用软件vectorNTI10.0(Invitrogen)对测定的序列进行拼接和分析。在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的基因组序列。

    3实验结果

    3.1转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体特异性序列测定

    分别经过1次Genome Walking获得转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的5‘端和3‘端转化体特异性序列。5‘端Genome Walking以引物5W1-P1和5W1-P2(表3)分别进行第一轮和第二轮PCR扩增，结果获得2006bp的扩增产物(图1，泳道4)。3‘端Genome Walking以引物3W1-P1和3W1-P2(表3)，分别进行第一轮和第二轮PCR扩增，结果获得1010bp的扩增产物(图1，泳道6)。

    表3Genome Walking引物

      引物  序列  5W1-P1  5’-CTCTTGGGCTTGAGTTGAGC-3’  5W1-P2  5’-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3’  3W1-P1  5’-TGGCATGACGTGGGTTTCTG-3’  3W1-P2  5’-GACTTCAGCCTGCCGGTAC-3’

    3.2转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体特异性序列分析

    将获得的序列提交NCBI数据库比对分析，5‘端转化体特异性序列的1-1723bp为棉花基因组序列，1724-2006bp为转化载体序列，序列见SEQ ID NO1。3‘端转化体特异性序列的1-476bp为转化载体序列，477-1010bp为棉花基因组序列，序列见SEQ ID NO2。

    实施例2

    本发明的转化体特异性PCR方法应用于鉴别转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25

    1实验材料

    1.1植物材料

    转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25(拜耳作物科学公司)，本实验室有保存，可向公众发放用于实验研究。

    8个棉花材料，购自市场。

    1.2酶与试剂

    分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、Marker等购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

    1.3实验仪器

    PCR扩增仪：Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

    核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

    DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

    其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。

    2实验方法和过程

    2.1棉花基因组DNA提取与检测

    见实施例1中2.1棉花基因组DNA提取与检测。

    2.2鉴别转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性PCR方法

    依据5‘端转化体特异性序列，设计引物LL25-5F/LL25-5R组合(序列见表4)，预期扩增片段为411bp；依据3‘端转化体特异性序列，设计引物LL25-3F/LL25-3R组合(序列见表4)，预期扩增片段为430bp。检测购自市场的8个棉花样品，见图2和图3。

    实验结果表明，转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25这两对引物均能获得预期大小的扩增片段，而检测的8个市场样品均未获得预期大小的扩增片段。

    分别克隆这两个扩增片段，按实施例1中“2.2.5序列测定和分析”进行序列分析。序列分析结果表明，5‘端扩增片段序列与SEQ ID NO1的1596-2006位完全一致，3‘端扩增片段序列与SEQ ID NO2的120-549位完全一致。

    检测结果表明本发明提供的PCR方法能很好地鉴别出棉花样品中是否含有转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25。

    PCR反应体系为：0.25μL rTaq(5U/μL)，5μL 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)，4μL dNTP(各2.5mM)，引物各2μL(10μM)，模板各2μL(20ng/μL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50μL。

    扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃10min。

    表4鉴别转基因抗除草剂棉花LLCOTTON25的转化体特异性PCR引物

      引物  序列  LL25-5F  ACCATCTAGCTCACTCTTGG  LL25-5R  CAACCTGTCTGTTTGCTGAC  LL25-3F  AATCCTGTTGCCGGTCTTGC  LL25-3R  CAATCACTTGGAGTGATGAAG

    SEQUENCE LISTING

    <110>中国农业科学院植物保护研究所

    <120>鉴别转抗除草剂棉花LLCOTTON25转化体的PCR方法

    <130>P10195/ZWB

    <160>10

    <170>PatentIn version 3.3

    <210>1

    <211>2006

    <212>DNA

    <213>抗除草剂转基因棉花LLcotton25的5’端转化体特异性序列

    <400>1

    ctcttcaagt gttcaatcaa cagtgttttg ataggcttta aactcttatt taaaagttga  60

    aattattcca ttaattatct taagtattta tcacataaaa gtcttcataa attagtcttc  120

    caactgcccc aaaaatctct tgaataaata tgatatttta tctcttaaaa ataatattaa  180

    taataagatt ataatgctta tccaataacc tcaagcaatc cattgggagt cttagcacct  240

    tagtcagtcc atgcttctag ttttgtcaaa tatgctagat tcaagtagac cgagctcagc  300

    acaaacgaaa tgtattcaag gaataagtcg atggctcaag tagataaaca gtttcgttat  360

    agcaagacat ggaagtagca gttgcagctt tctcaacaat ctcccccttg acatttttta  420

    caaaaccctg caaccaatgg ttagcccaca atccaaacaa gccacaaaaa agatcctcta  480

    attccaatta agaatttatt gggtccttta ggaatagccc caaaaattgc aaatttttat  540

    tcattatttt accttttaat aactcataat caaacttaat agcaaaaaat ttgtaacttg  600

    acaatttaaa acaagctttt caagtactta actattattt aatagctgaa aatgagagaa  660

    tttataattt tgatccatgt cataacatat ttttgaataa caagagattt agaatatgtc  720

    tgcccctaag cggtagaacc atgcttgatc acaccccaaa tcaatatgct tgttcatcac  780

    ataacaatta agcatgcacc aaggtcataa atatgcagta aaaactatca ccatatctct  840

    ttttaatgaa gcaaaatgta gcaatcataa ccaagaacaa aacttttcat ttggtactac  900

    cacattctcc cccctttttg ataaagatgc gaaaagtgca accataaaaa aaccataagt  960

    agaatcaaag tagatggaat taccaaatca acaaaattac tcacccttac tctattcatc  1020

    ccttatgggc ttccatcata ttgtttaaag gggatgagat tgaatgttac cttatcaaca  1080

    aaaggagttg tagctcatgg aacaacaata gtcttttcca cgaaacctag atgatgtttc  1140

    tccaatgctt gataaatctt taacattgtc atcataagtt gcaacctcat gtttcacaca  1200

    agcatcaatc aaatgttgat cttcattact aaaatgtgct tgatccttcc ttacacaaat  1260

    ctacctatgt tgtggtattt tgttctattc atcattctaa caagttttgc aattgagttg  1320

    aacttcttcc aatctcgtat cagcctataa tagtggggtc taatatgtcc atttttccca  1380

    caataatgac atataatctt tctaaagctt tcattctctg ccttatgatg aaaagaaccc  1440

    aaatctttaa ctttaacaaa aataagatga gcgataggtt ctttaccttt attgatgtaa  1500

    ccaagtcctc tatggcatgg ttcaattctc attgaagcca aaatttcatg aaacttctca  1560

    cattggcctc taaacttctt caagatagcc tttgcaccat ctagctcact cttggttgtt  1620

    ttcaaaacat catccgtttc ttggaccaca attttgagct tttcattttc tattttgagg  1680

    ataatagttt attccctcaa ggaactattc aactgagctt aacagtactc ggccgtcgac  1740

    cgcggtaccc cggaattcca atcccacaaa aatctgggct taacagcaca gttgctcctc  1800

    tcagagcaga atcgggtatt caacaccctc atatcaacta ctacgttgtg tataacggtc  1860

    cacatgccgg tatatacgat gactggggtt gtacaaaggc ggcaacaaac ggcgttcccg  1920

    gagttgcaca caagaaattt gccactatta cagaggcaag agcagcagct gacgcgtaca  1980

    caacaagtca gcaaacagac aggttg                                       2006

    <210>2

    <211>1010

    <212>DNA

    <213>抗除草剂转基因棉花LLcotton25的3’端转化体特异性序列

    <400>2

    gacttcagcc tgccggtacc gccccgtccg gtcctgcccg tcaccgagat ctgagatcac  60

    gcgttctagg atccgaagca gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga  120

    atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg  180

    taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc  240

    cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat  300

    tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgcagatc ctctagagtc gacctgcagg  360

    catgcaagct tagatccatg gagccattta caattgaata tatcctccaa atatttaaaa  420

    agaatatcac cattatccga atcttcttta aaatctgtta gaacacggtt tggaatagtg  480

    gtagtaaaag taacatagtt gctcgcatct tgatctacat taaactttct tcatcactcc  540

    aagtgattgt aaatgacttc tattccttct tagtattagc acattctaat tttaagtgaa  600

    acaatccctt acattcataa cattgaatat ccttctacct tgtctcacta tatctacttt  660

    agttcccttc ttagggaacc ttttcatgtc ctttgtgaac aaggctaatt gctttttgat  720

    ctcatcaatg tcttctacta tctatttctc tattggatta gcattttaag aattgaatgc  780

    tactttcttg ggcaaatgat tatgcctcga catatgtgta ccaagactat gaattaacac  840

    aaatacaaat ataaatatag tggtgtacta caagtgtgac aagtcagttg taatatttat  900

    aagtgttaca atggaacagt tcgagtgttc caagtatcaa acctaaagga ttgtcaaatt  960

    tataaatatg tttatcaagt taattagaag ttaaataatt gttaatctaa             1010

    <210>3

    <211>20

    <212>DNA

    <213>正向引物LL25-5F

    <400>3

    accatctagc tcactcttgg                                              20

    <210>4

    <211>20

    <212>DNA

    <213>反向引物LL25-5R

    <400>4

    caacctgtct gtttgctgac                                              20

    <210>5

    <211>20

    <212>DNA

    <213>正向引物LL25-3F

    <400>5

    aatcctgttg ccggtcttgc                                              20

    <210>6

    <211>21

    <212>DNA

    <213>反向引物LL25-3R

    <400>6

    caatcacttg gagtgatgaa g                                            21

    <210>7

    <211>20

    <212>DNA

    <213>Genome Walking引物5W1-P1

    <400>7

    ctcttgggct tgagttgagc                                            20

    <210>8

    <211>20

    <212>DNA

    <213>Genome Walking引物5W1-P2

    <400>8

    caacctgtct gtttgctgac                                            20

    <210>9

    <211>20

    <212>DNA

    <213>Genome Walking引物3W1-P1

    <400>9

    tggcatgacg tgggtttctg                                            20

    <210>10

    <211>19

    <212>DNA

    <213>Genome Walking引物3W1-P2

    <400>10

    gacttcagcc tgccggtac                                            19