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一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用。
背景技术
hpRNA在植物体内会被处理成为siRNA从而诱导RNA干扰，构建hpRNA被广泛应用于RNA干扰和基因沉默。hpRNA的编码区包含两段反向互补的目的基因片段，两片段之间夹有一段环片段(loop region)。该编码区构建到质粒上，经转录后产生自身互补的单链hpRNA。
目前构建hpRNA的方法虽然已有较大的进展，但仍存在费用高、耗时大、操作繁琐、技术不易掌握等缺陷。hpRNA载体pHANNNIBAL和pKANNIBAL是通过传统的限制性内切酶和连接系统进行构建的(Wesley，S.，Helliwell，C.，Smith，N.，Wang，M.，Rouse，D.，Liu，Q.，Gooding，P.，Singh，S.，Abbott，D.，Stoutjesdijk，P.et al.(2001)Construct design for efficient，effective andhigh-throughput gene silencing in plants.Plant J，27，581-590.)；通过一步或两步PCR得到目标片段，利用限制性内切酶依次连入载体中；除了酶切位点的局限性，该方法的主要问题是其耗时过大，故只能在小规模构建中使用。Gateway系统较传统方法有了较大改进。其主要利用lambda噬菌体生活周期中会与寄主基因组发生位点特异的同源重组的特性，利用LR反应进行构建(Landy，A.(1989)Dynamic，structural，and regulatory aspects of lambda site-specificrecombination.Annu Rev Biochem，58，913-949.)；质粒立pHELLSGATE4，pHELLSGATE8和pHELLSGATE12均为通过该系统进行hpRNA构建(Helliwell，C.andWaterhouse，P.(2003)Constructs and methods for high-throughput genesilencing in plants.Methods，30，289-295.)；然而通过前两个质粒进行的构建会出现非预期的位点重组，产生反向无功能的内含子；而通过pHELLSGATE12质粒进行的构建虽然保证了内含子的有效性，但其PTGS的效率不稳定(Wesley，S.，Helliwell，C.，Smith，N.，Wang，M.，Rouse，D.，Liu，Q.，Gooding，P.，Singh，S.，Abbott，D.，Stoutjesdijk，P.et al.(2001)Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants.Plant J，27，581-590.)；更重要的是该方法中用到的酶成本过高。DA-ihpRNA(Xiao，Y.，Yin，M.，Hou，L.and Pei，Y.(2006)Direct ampiification of intron-containinghairpin RNA construct from genomic DNA.Biotechniques，41，548，550，552.)方法是基于基因组DNA序列的，其利用特定基因的自身的内含子产生hpRNA；该方法虽然简单快捷，但目标片段的位置受到极大的限制。最近出现了一种一步构建hpRNA的方法，该方法利用ZeBaTA载体(Chen，S.，Songkumarn，P.，Liu，J.andWang，G.(2009)A Versatile Zero Background T-vector System for Gene Cloningand Functional Genomics.Plant Physiol.)；该方法中hpRNA茎环结构是由两段反向的目标序列和任意的中间片段进行搭接PCR得到的；然而，实际操作中，由于PCR抑制效应，通过搭接PCR一步产生hpRNA片段是很难做到的；此外，每个构建都需要通过搭接PCR逐个引入环片段，使得该方法难以作为大规模筛选。MOOE-PCR方法中，同样作为环片段的内含子每次都需要单独引入；且其搭接PCR的条件需要根据不同基因的特性逐个进行优化(Yan，P.，Shen，W.，Gao，X.，Duan，J.andZhou，P.(2009)Rapid one-step construction of hairpin RNA.Biochem BiophysRes Commun，383，464-468.)。
随着基因组信息的大量涌现，发展一种简单有效，可以高通量构建hpRNA的方法是极为必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用。
本发明提供了一种表达盒，为双链互补的DNA片段，从启动子到终止子转录方向定义为5′→3′方向，依次包括：启动子、DNA片段A、20个以上脱氧核糖核苷酸组成的loop核苷酸序列、DNA片段B、DNA片段C和终止子；所述DNA片段A的5′→3′的链，自上游至下游依次由LIC处理单核苷酸终止位点，LIC1片段、限制性内切酶A识别位点、与LIC3片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段和LIC处理单核苷酸终止位点互补位点组成；所述DNA片段B的5′→3′的链，自上游至下游依次由LIC处理单核苷酸终止位点、LIC2片段和限制性内切酶B识别位点组成；所述DNA片段C的5′→3′的链，自上游至下游依次由限制性内切酶C识别位点、与LIC4片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段和LIC处理单核苷酸终止位点互补位点组成；
所述LIC1片段、LIC2片段、LIC3片段和LIC4片段均由12至50个脱氧核糖核苷酸组成(同一个表达盒中，LIC1片段、LIC2片段、LIC3片段和LIC4片段的核苷酸数目可不一致)；所述LIC处理单核苷酸终止位点为A、T、C和G这四种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补的一个脱氧核糖核苷酸；
所述DNA片段A满足如下(I)或(II)或(III)的条件：
(I)所述DNA片段A被所述限制性内切酶A酶切后，在切割位点处产生平末端；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；
(II)所述DNA片段A被所述限制性内切酶A酶切后，在切割位点处产生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述3’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；
(III)所述DNA片段A被所述限制性内切酶A酶切后，在切割位点处产生5’粘性末端；所述DNA片段A的3′→5′的链，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述DNA片段A的5′→3′的链，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸外，由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述5’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；
所述DNA片段B满足如下(IV)或(V)或(VI)的条件：
(IV)所述DNA片段B被所述限制性内切酶B酶切后，在切割位点处产生平末端；所述DNA片段B的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；
(V)所述DNA片段B被所述限制性内切酶B酶切后，在切割位点处产生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段B的5′→3′的链，除了所述3’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；
(VI)所述DNA片段B被所述限制性内切酶B酶切后，在切割位点处产生5’粘性末端；所述DNA片段B的3′→5′的链，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸外，由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段B的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；
所述DNA片段C满足如下(VII)或(VIII)或(IX)的条件：
(VII)所述DNA片段C被所述限制性内切酶C酶切后，在切割位点处产生平末端；所述DNA片段C的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；
(VIII)所述DNA片段C被所述限制性内切酶C酶切后，在切割位点处产生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段C的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；
(IX)所述DNA片段C被所述限制性内切酶C酶切后，在切割位点处产生5’粘性末端；所述DNA片段C的5′→3′的链，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸外，由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段C的5′→3′的链，除了所述5’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成。
所述表达盒可依次包括：所述启动子、所述DNA片段A、所述20个以上脱氧核糖核苷酸组成的loop核苷酸序列、所述DNA片段B、负筛选基因、所述DNA片段C和所述终止子。所述启动子可为在植物中具有启动转录功能的任意启动子，包括组织特异性启动子(只在植物某些组织中启动表达)，诱导性启动子(包括各类诱导因子添加所引起的表达)，组成型表达启动子等，也可以使用若干串联的启动子(如串联的35S启动子)。所述loop核苷酸序列可为常用的Pdk Intron(正向、反向均可)等，也可为与靶基因相对应的内含子(正向、反向均可)，其它任意核酸序列也可以代替Intron作为spacer隔断两边反向互补靶基因序列。所述负筛选基因用于提高筛选效率，可为具有类似实施例中ccdB负筛选功能的基因。所述终止子可为任何在植物中具有终止转录功能的终止子，如Nos终止子。
所述LIC处理单核苷酸终止位点具体可为核苷酸T，所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点具体可为核苷酸A。所述LIC1片段具体可如序列表的序列1所示；所述LIC2片段具体可如序列表的序列2所示；所述LIC3片段具体可如序列表的序列3所示；所述LIC4片段具体可如序列表的序列4所示。
所述35S启动子具体可如序列表的序列5所示。所述反向互补的Pdk内含子具体可如序列表的序列6所示。所述ccdB基因具体可如序列表的序列7所示；所述Nos终止子具体可如序列表的序列8所示。
所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B和所述限制性内切酶C可为相同的限制性内切酶。所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B和所述限制性内切酶C均可为SmaI。
所述表达盒具体可为序列表的序列9所示的DNA。
所述表达盒可以亚克隆到不同的骨架载体，从而采用不同的选择标记，如利用壮观霉素作为细菌中的选择标记，利用庆大霉素作为植物中的筛选基因等。
含有以上任一所述表达盒的重组载体也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为序列表的序列10所示的DNA。
本发明还保护一种构建hpRNA载体的方法，包括如下步骤：
用限制性内切酶A、限制性内切酶B和限制性内切酶C酶切所述重组载体，用与所述LIC处理单核苷酸终止位点相同的脱氧核糖核苷酸和T4 DNA聚合酶处理酶切产物，得到产物甲；用与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点相同的脱氧核糖核苷酸和T4 DNA聚合酶处理DNA片段I和DNA片段II，得到产物乙；将产物甲和产物乙混合，得到hpRNA载体；
所述DNA片段I由目标基因片段及其上游序列和下游序列组成；所述目标基因片段上游序列为与如下核苷酸序列互补的核苷酸序列：将所述重组载体用限制性内切酶A酶切，再经过T4 DNA聚合酶和与LIC处理单核苷酸终止位点相同的脱氧核糖核苷酸处理得到的LIC1端的粘性末端；所述目标基因片段下游序列为与如下核苷酸序列互补的核苷酸序列：将所述重组载体用限制性内切酶B酶切，再经过T4 DNA聚合酶和与LIC处理单核苷酸终止位点相同的脱氧核糖核苷酸处理得到的LIC2端的粘性末端；
所述DNA片段II由目标基因片段及其上游序列和下游序列组成；所述目标基因片段上游序列为与如下核苷酸序列互补的核苷酸序列：将所述重组载体用限制性内切酶C酶切，再经过T4 DNA聚合酶和与LIC处理单核苷酸终止位点相同的脱氧核糖核苷酸处理得到的LIC4端的粘性末端；所述目标基因片段下游序列为与如下核苷酸序列互补的核苷酸序列：将所述重组载体用限制性内切酶A酶切，再经过T4 DNA聚合酶和与LIC处理单核苷酸终止位点相同的脱氧核糖核苷酸处理得到的LIC3端的粘性末端。
所述重组载体具体可为序列表的序列10所示的DNA。
应用所述方法构建得到的hpRNA载体也属于本发明的保护范围。
以上任一所述表达盒、任一所述重组载体或hpRNA载体均可应用于抑制目的基因表达(或沉默目的基因)。
应用所述hpRNA构建载体进行目的基因沉默的方法如下：
(一)设计引物
根据DNA片段I中的目标基因片段及其上游序列设计上游引物；根据DNA片段I中的目标基因片段及其下游序列设计下游引物。根据DNA片段II中的目标基因片段及其上游序列设计上游引物；根据DNA片段II中的目标基因片段及其下游序列设计下游引物。
当所处重组载体用所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B和所述限制性内切酶C酶切后均产生平末端时，可基于如下原则设计引物对：
用于制备DNA片段I的引物对(引物对甲)：
上游引物序列由LIC1、限制性内切酶A的识别位点中切割位点上游的核苷酸、LIC处理单核苷酸终止位点和靶基因5’特异性序列组成；下游引物序列由LIC2、限制性内切酶A的识别位点中切割位点上游的核苷酸、LIC处理单核苷酸终止位点和靶基因3’特异性互补序列组成。
用于制备DNA片段II的引物可为(引物对乙)：
上游引物序列由LIC4、限制性内切酶A的识别位点中切割位点上游的核苷酸、LIC处理单核苷酸终止位点和靶基因5’互补序列组成；下游引物序列由LIC3、限制性内切酶A的识别位点中切割位点上游的核苷酸、LIC处理单核苷酸终止位点和靶基因3’特异性序列组成。引物对乙用于直接对待测基因模板进行扩增。
用于制备DNA片段II的引物还可为(引物对丙)：
上游引物序列由LIC4、限制性内切酶A的识别位点中切割位点上游的核苷酸、LIC处理单核苷酸终止位点、LIC处理单核苷酸终止位点、LIC1、限制性内切酶A的识别位点中切割位点上游的核苷酸和LIC处理单核苷酸终止位点组成。下游引物序列由LIC3、限制性内切酶A的识别位点中切割位点上游的核苷酸、LIC处理单核苷酸终止位点、LIC处理单核苷酸终止位点、LIC2、限制性内切酶A的识别位点中切割位点上游的核苷酸和LIC处理单核苷酸终止位点组成。引物对丙用于对引物对甲的扩增产物进行扩增。
(二)制备正向基因片段和反向基因片段
以目的基因片段的DNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增，得到DNA片段I。
以目的基因片段的DNA为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到DNA片段II。或者，以DNA片段I为模板，用引物对丙进行PCR扩增，得到DNA片段II。
(三)OZ-LIC方法
将所述重组载体(如实施实例中pRNAi-LIC)，首先通过所选择的限制性内切酶进行线性化处理，继而在同时具有3’-5’DNA外切酶活性和5’-3’DNA聚合酶活性(如实施实例中的T4DNA聚合酶，或者Pfu等DNA聚合酶)的LIC酶反应系统中，加入同单核苷酸终止位点相同碱基的脱氧核糖核苷酸进行孵育。所使用LIC酶发挥3’-5’DNA外切酶活性活性直到单核苷酸终止位点处，由于与该位点相同外源脱氧核糖核苷酸的存在使得LIC酶能够发挥5’-3’DNA聚合酶活性，在该位点处达到平衡，最终产生具有3’突出的LIC粘性末端。正向以及反向靶基因片段在同时具有3’-5’DNA外切酶活性和5’-3’DNA聚合酶活性(如实施实例中的T4
DNA聚合酶，或者Pfu等DNA聚合酶)的LIC酶反应系统中，加入同LIC处理单核苷酸终止位点互补碱基的脱氧核糖核苷酸进行孵育。所使用LIC酶发挥3’-5’DNA外切酶活性活性直到LIC处理单核苷酸终止位点处，由于与该位点互补的外源核糖核苷酸的存在使得LIC酶能够发挥5’-3’DNA聚合酶活性，在该位点处达到平衡，最终产生具有5’突出的LIC粘性末端。将处理好的载体以及两个靶基因片段混合后孵育能够使得各自上面的LIC序列进行互补配对，产生具有缺口的环状质粒，从而转化细菌，通过细菌自身修复能力进行补缺。
为克服构建hpRNA中存在的问题，如酶切连接系统中酶切位点受限，Gateway系统中耗时耗钱过高，其它一些系统中PCR步骤过于复杂等，本发明提供了一种表达盒以及含有该表达盒的重组载体。实验结果表明，用本发明的重组载体构建hpRNA载体，只需要进行一步克隆，不需要传统的酶切连接系统，大大提升了hpRNA载体构建的效率，节约了成本，几乎100％阳性，表现出良好的性能及稳定性，可以有效诱导转录后基因沉默。应用本发明的hpRNA载体，可以高效稳定的沉默目标基因，可进行高通量筛选，重复性高，十分可靠。本发明提供的表达盒、重组载体和hpRNA载体，在当今基因序列爆发的时代为大规模基因功能组学的研究提供了途径。
附图说明
图1为pRNAi-LIC载体中hpRNA表达盒示意图。
图2为OZ-LIC方法流程图。
图3为实施例2中的GFP亮度检测结果。
图4为实施例2中的RT-PCR检测结果。
图5为实施例3中的GUS染色检测结果。
图6为实施例3中的RT-PCR检测结果。
图7为实施例4中根长对Auxin激素敏感性检测结果
图8为实施例4中RT-PCR检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
利用了LIC反应的原理，用含有图1所示表达盒的重组质粒进行hpRNA构建，具体步骤及原理(如图2所示)如下：
(1)第一轮PCR
用引物对甲PCR扩增DNA片段.；
(2)第二轮PCR
用引物对乙扩增DNA片段II；或者以DNA片段I为模板，用引物对丙(通用引物)进行PCR扩增，得到DNA片段II(下述实施实例中采用此通用引物进行)。
(3)用限制性内切酶酶切重组质粒，得到3个片段：两端分别为LIC1序列和LIC4序列的质粒骨架片段(DNA片段III)、两端分别为LIC2和LIC3序列的Pdk内含子(DNA片段IV)、ccdB基因片段(DNA片段V)。
(4)用限制性内切酶SmaI酶切所述重组载体，用与dTTP和T4DNA聚合酶处理酶切产物，得到产物甲；用dATP相和T4DNA聚合酶处理DNA片段I和DNA片段II，得到产物乙；使得各个DNA片段上产生粘性末端；将产物甲和产物乙混合，具有粘末端的DNA片段III、DNA片段I、反向的DNA片段IV、DNA片段II依次首尾连接，形成完整的环状质粒(hpRNA载体)；通过细菌的负筛选机制，含有ccdB基因片段(DNA片段V)的重组子不会形成克隆；该过程利用了T4DNA聚合酶的特性：①T4DNA聚合酶具有3’至5’外切酶的活性，；②在dNTP存在时T4DNA聚合酶同样有5’至3’聚合酶活性的性质。利用这个特性，按照LIC序列设计原则设计特殊的LIC序列，便可以得到具有各个带粘性末端的目的片段。
(5)将步骤(4)得到的质粒转化DH5α或DH10b大肠杆菌，在抗生素平板上进行筛选。由于采用ccdB负筛选基因排除酶切不完全载体再生，阳性克隆效率接近零背景。
实施例中所用的引物见表1。
表1实施例中所用的引物

  引物  序列  特征  OX1  5’-AGAGCACACGACCCTTCGACGACAAGACCCT-3’  LIC4-CCC-TT-LIC1-CCC-T  OX2  5’-CCAGCACGGAACCCTTGAGGAGAAGAGCCCT-3’  LIC3-CCC-TT-LIC2-CCC-T  OX3  5’-CGACGACAAGACCCTgacgggaactacaagacacg-3’  LIC1-CCC-T-GFP 5’
  OX4  5’-GAGGAGAAGAGCCCTgttacaaactcaagaaggacc-3’  LIC2-CCC-T-GFP 3’  OX5  5’-CGACGACAAGACCCTagcgttgaactgcgtgat-3’  LIC1-CCC-T-GUS 5’  OX6  5’-GAGGAGAAGAGCCCTcgaaaccaatgcctaaag-3’  LIC2-CCC-T-GUS 3’  OX7  5’-CGACGACAAGACCCTcgccgttgacctttacactc-3’  LIC1-CCC-T-NbSGT15’  OX8  5’-GAGGAGAAGAGCCCTcaccacctcctctggcttct-3’  LIC2-CCC-T NbSGT1 3’  OX9  5’-CGACGACAAGACCCTcgatgttcaggcacgagttc-3’  LIC1-CCC-T-AtSGT1b 5’  OX10  5’-GAGGAGAAGAGCCCTtgctggcttagaagatgg-3’  LIC2-CCC-T-AtSGT1b 3’
备注：大写粗体字母为LIC′序列，小写字母为基因特异的序列。
实施例1、重组质粒的制备
一、pRNAi-LIC质粒的制备
用序列表的序列9所示的表达盒制备重组载体pRNAi-LIC。pRNAi-LIC的DNA序列见序列表的序列10。pRNAi-LIC质粒利用卡那霉素作为细菌及植物中的抗性筛选基因。
序列9所示的表达盒中，自5′→3′，第1-769位核苷酸为串联的35S启动子；第852位核苷酸为LIC处理单核苷酸终止位点；第853-863位核苷酸为LIC1片段；第864-869位核苷酸为SmaI位点；第870-880位核苷酸为LIC3片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段；第881位核苷酸为LIC处理单核苷酸终止位点互补位点；第887-2485位核苷酸为反向互补的Pdk内含子；第2493位核苷酸为LIC处理单核苷酸终止位点；第2494-2504位核苷酸为LIC2片段；第2505-2510位核苷酸为SmaI位点；第2792-3097位核苷酸为ccdB基因；第3119-3124位核苷酸为SmaI位点；第3125-3135位核苷酸为LIC4片段反向互补的脱氧核糖核苷酸；第3136位核苷酸为LIC处理单核苷酸终止位点互补位点；第3150至3406位核苷酸为Nos终止子。
pRNAi-LIC质粒中，第1-3412位核苷酸为表达盒序列。
实施例2、应用pRNAi-LIC质粒沉默GFP基因
烟草Nc89：中烟种子有限责任公司。大肠杆菌DH5α：宝生物工程(大连)有限公司)
一、外源DNA片段的获得
以pCAMBIA1302(购自Canberra，ACT，Australia)为模板，利用引物OX3和OX4克隆长度为368bp的GFP基因片段(序列参见11)利用通用引物OX1和OX2进行第二轮PCR。
二、hpRNA载体(pRNAi-GFP)的构建
常规方法提取pRNAi-LIC质粒。在50ul体系中加入1-2ug质粒，3ul Sma I(Fermentas)以及5ul Buffer Tango，37℃，2h至过夜酶切。加入dTTP以及DTT至终浓度5mM，再加入10units T4 DNA聚合酶(Fermentas)，22℃反应30min，75℃，10min热灭活。两个靶基因片段可以在同一体系或者分别处理，加入50ng纯化后的PCR片段，加入dATP以及DTT至终浓度5mM，再加入0.5unit T4 DNA聚合酶(Fermentas)，同样条件反应并且灭活。将上述处理好的DNA片段以及载体按照一定比例混合，22℃孵育15min。转化大肠杆菌DH5α(用DH10b也可)，在含有卡那霉素和氯霉素平板中筛选重组子。提取重组子质粒通过BamH I和Sac I双酶切鉴定以及测序鉴定。最终获得具有反向重复序列的hpRNA表达质粒。
三、应用hpRNA载体沉默GFP基因
分别将pRNAi-GFP、pRNAi-LIC和pCAMBIA-1302转入LBA4404农杆菌(购于Clontech公司)中。
1、GFP亮度检测
将含pRNAi-GFP的农杆菌与含pCAMBIA-1302的农杆菌1∶1混合，5000rpm离心五分钟，沉淀用注射缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES，200mM acetosyringone)重悬，室温放置4小时，进行注射。将含pRNAi-LIC的农杆菌与含pCAMBIA-1302的农杆菌混合做相同处理，作为阴性对照。将实验组与对照组注射到烟草Nc89的同一叶片上，3天后在紫外光下观察GFP亮度。
结果见图3。阴性对照(左)中有强GFP荧光，而实验组(右)中GFP表达被抑制。
2、RT-PCR检测
将含pRNAi-GFP的农杆菌与含pCAMBIA-1302的农杆菌1∶1混合，5000rpm离心五分钟，沉淀用注射缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES，200mM acetosyringone)重悬，室温放置4小时，进行注射。将含pRNAi-LIC的农杆菌与含pCAMBIA-1302的农杆菌混合做相同处理，作为阴性对照。将实验组与对照组注射到不同的烟草Nc89上，3天后采集叶片提取RNA。进行RT-PCR检测(引物序列为：5’-atgaagactaatctt-3’；5’-ttaaagctcatcatgtttgt-3’)。
结果见图4；1：阴性对照；2：实验组。结果显示，实验组中GFP基因的表达确实被沉默掉了。
实施例3、应用hpRNA沉默GUS基因
一、外源DNA片段的获得
以pCAMBIA1301(购自Canberra，ACT，Australia)为模板，利用引物OX5和OX6扩增GUS基因片段(序列参见序列12)，以GUS基因片段为模板，利用通用引物OX1和OX2进行第二轮PCR。
二、hpRNA载体(pRNAi-GUS)的构建
同实施例2的步骤二。
三、应用hpRNA载体沉默GUS基因
分别将pRNAi-GUS、pRNAi-LIC和pCAMBIA-1301转入LBA4404农杆菌(购于Clontech公司)中。
1、GUS染色检测
将含pRNAi-GUS的农杆菌与含pCAMBIA-1301的农杆菌1∶1混合，5000rpm离心五分钟，沉淀用注射缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES，200mM acetosyringone)重悬，室温放置4小时，进行注射。将含pRNAi-LIC的农杆菌与含pCAMBIA-1301的农杆菌混合做相同处理，作为阴性对照。将实验组与对照组注射到烟草Nc89的同一叶片上，注射植物4天后收集叶片浸入GUS染液中，0.1MPa真空处理5分钟，37℃温育直至蓝色显现。用PH7.0的50mM磷缓冲液洗，再依次用50％，75％和100％的乙醇各浸置五分钟。最终浸入75％的乙醇，直至脱色完全。
GUS染色结果见图5。阴性对照(左)中有蓝色，而实验组(右)中GUS表达被抑制。证明了hpRNA载体可以有效沉默目标基因。
2、RT-PCR检测
将含pRNAi-GUS的农杆菌与含pCAMBIA-1301的农杆菌1∶1混合，5000rpm离心五分钟，沉淀用注射缓冲液(10mM MgCl₂，10mM MES，200mM acetosyringone)重悬，室温放置4小时，进行注射。将含pRNAi-LIC的农杆菌与含pCAMBIA-1301的农杆菌混合做相同处理，作为阴性对照。将实验组与对照组注射到不同的烟草Nc89上，3天后采集叶片提取RNA。进行RT-PCR检测(引物序列为：5’-cgaaaccaatgcctaaag-3’；5’-cacgccgtatgttattgc-3’)。
结果见图6；1：阴性对照；2：实验组。实验结果显示，GUS基因的表达确实被沉默掉了。
实施例4、hpRNA转基因拟南芥沉默效果检测(转基因水平)
本实施例从转基因水平证明hpRNA能够有效沉默目的基因。SGT1基因除参与到植物抗病反应中，还能够对常见的激素有反应。本实施中所沉默基因为拟南芥中基因SGT1b，其能够响应激素Anxin，引起根长发育受到抑制(Gray，W.，Muskett，P.，Chuang，H.and Parker，J.(2003)Arabidopsis SGT1b is required forSCF(TIR1)-mediated auxin response.Plant Cell，15，1310-1319)，而突变体则对Auxin变得不敏感。利用这个特点，构建AtSGT1b的转基因拟南芥植物，检测hpRNA在转基因水平上具有有效沉默靶基因的作用。
一、AtSGT1b基因片段的获得
从拟南芥Col-0(购买自Arabidopsis Biological Resource Center)中提取RNA，反转获得cDNA文库，通过引物OX9和OXi0从中将AtSGT1b片段扩增出来(序列参见序列13)。以AtSGT1b基因片段为模板，利用通用引物OX1和OX2进行第二轮PCR。
二、hpRNA载体(pRNAi-AtSGT1b)的构建
同实施例2的步骤二。
三、转基因植物的获得
将pRNAi-AtSGT1b转入LBA4404农杆菌(购于Clontech公司)中。
利用文献报道方法获得拟南芥转基因植株(Zhang，X.，Henriques，R.，Lin，S.，Niu，Q.and Chua，N.(2006)Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana using the floral dip method.Nat Protoc，1，641-646.)。对抗生素筛选阳性植株收取种子为T1代。
四、转基因植物的鉴定
1、通过植物根长对Auxin激素敏感性检测沉默AtSGT1b的效果
在含有0.06μM Auxin的MS平板上铺上野生型拟南芥种子(WT)作为对照，另一边铺上转基因植株T1代种子(AtSGT1b hpRNAi)。观察根长的生长情况。
结果见图7。转基因植株根长相对对照更长，表现为对Auxin不敏感(其中部分敏感植株则是由于基因分离的原因)。
2、RT-PCR检测
将两棵上述对Auxin不敏感植株(样本2和样本3)和一棵野生型植株(样本1)继续转移至土壤中培养，取叶片提取RNA，进行RT-PCR(引物为：5’-CGATGTTCAGGCACGAGTTC-3’；5’-CGACAGTACCGTCCCATTC-3’)。
结果见图8。结果显示，Auxin不敏感植株中该基因的RNA水平明显被抑制。
序列表
<110>清华大学
<120>一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用
<130>CGGNARY92543
<160>13
<210>1
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
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<210>2
<211>11
<212>DNA
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<220>
<223>
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<210>3
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
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<210>4
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
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<210>5
<211>769
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
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atcaaagata cagtctcaga agaccagagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata  120
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gaaaaggaag atggcttcta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa  240
gatgcctcta ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggaa catcgtggaa  300
aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatgg tcaacatggt  360
ggagcacgac actctcgtct actccaagaa tatcaaagat acagtctcag aagaccagag  420
ggctattgag acttttcaac aaagggtaat atcgggaaac ctcctcggat tccattgccc  480
agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt agaaaaggaa gatggcttct acaaatgcca  540
tcattgcgat aaaggaaagg ctatcgttca agatgcctct accgacagtg gtcccaaaga  600
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<210>6
<211>1599
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
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ttgtttattc atgttcgact aattcattta attaatagtc aatccattta gaagttaata  120
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<210>7
<211>306
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
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atataa                                                             306
<210>8
<211>257
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
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gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct  240
atgttactag atcaaaa                                                 257
<210>9
<211>3412
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
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gaaaaggaag atggcttcta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa  240
gatgcctcta ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggaa catcgtggaa  300
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<210>10
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<220>
<223>
<400>10
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<210>11
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<212>DNA
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<220>
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<220>
<223>
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<220>
<223>
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