利用新型核质互作雄性不育型萝卜系植物以及选育该植物的DNA标记生产杂交种子的方法.pdf

本发明涉及采用新型核质互作不育型(CGMS)萝卜系植物和用于选育所述植物的DNA标记，更准确地，采用新型CGMS(D-CGMS)萝卜系植物生产杂交种子的方法，本发明还涉及采用上述植物、基于叶绿体DNA的标记、基于线粒体DNA的SNP标记生产杂交种子的方法，其中所述用于选育D-CGMS萝卜系植物的基于叶绿体DNA的标记具有SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列，选育，所述用于选育D-CGMS萝卜系植物的基于线粒体DNA的SNP(单核苷酸多态性)标记位于SEQ.ID.NO：12所示核苷酸序列的第171位核苷酸选育。本发明的D-CGMS萝卜系植物，由于其雄性不育的高稳定性，可有效地用于生产杂交种子。用于选育D-CGMS萝卜系植物的基于叶绿体DNA的标记和基于线粒体DNA的SNP标记，在育种过程中可有效地选育D-CGMS萝卜系植物。

1、  一种新型核质互作不育型(CGMS)D-CGMS萝卜系植物，其包含SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列，以及位于SEQ.ID.NO：12所示核苷酸序列的第171核苷酸的D-CGMS特异性SNP(单核苷酸多态性)。

2、  根据权利要求1所述的D-CGMS萝卜系植物，其中位于SEQ.ID.NO：12所示的核苷酸序列的第171核苷酸为鸟嘌呤。

3、  根据权利要求1所述的D-CGMS萝卜系植物，其中所述D-CGMS萝卜系植物由D-CGMS萝卜系愈伤组织(登录号：KCTC11101BP)诱导得到。

4、  一种以登录号KCTC11101BP保藏的D-CGMS萝卜系愈伤组织。

5、  一种生产具有核质互作不育型CGMS萝卜系植物杂交种子的方法，其包括将权利要求1所述的D-CGMS萝卜系植物作为母本，与雄性可育系植物进行杂交的步骤。

6、  根据权利要求5所述的生产CGMS萝卜系杂交种子的方法，其中所述雄性可育系植物选自不含D-CGMS萝卜系的育性恢复基因的雄性可育系植物。

7、  一种用于选育D-CGMS萝卜系植物的DNA标记，所述D-CGMS萝卜系植物具有SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列，或具有能够在严格条件下与含有SEQ.ID.NO：5所示核苷酸序列的DNA杂交的核苷酸序列。

8、  一种用于扩增权利要求7所述的DNA标记的引物对。

9、  根据权利要求8所述的引物对，其中所述引物对由SEQ.ID.NO：3和SEQ.ID.NO：4各自所示的核苷酸序列组成。

10、  一种用于选育D-CGMS萝卜系植物的SNP标记，其包括选自SEQ.ID.NO：12所示的寡核苷酸序列，并由上述序列的包括第171核苷酸的含有15-225个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补核苷酸序列组成。

11、  根据权利要求10所述的用于选育D-CGMS萝卜系植物的SNP标记，其中位于SEQ.ID.NO：12所示核苷酸序列的第171核苷酸残基为鸟嘌呤。

12、  一种用于扩增权利要求10所述SNP标记的引物对。

13、  根据权利要求12所述的引物对，其中所述引物对由SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16各自所示的核苷酸序列组成。

14、  一种用于选育D-CGMS萝卜系植物的试剂盒，其含有引物对或者检测权利要求7所述核苷酸序列或权利要求10所述寡核苷酸的探针。

15、  根据权利要求14所述的用于选育D-CGMS萝卜系植物的试剂盒，其中所述引物对由SEQ.ID.NO：3和SEQ.ID.NO：4各自所示序列或由SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16各自所示序列组成。

16、  一种选育D-CGMS萝卜系植物的方法，包括下述步骤：
1)提取靶植物的DNA样本；
2)采用权利要求8所述的引物对或权利要求12所述的引物对，通过PCR扩增步骤1)的DNA样本；以及
3)采用步骤2)的扩增样本，通过电泳检测权利要求7所述的DNA标记或权利要求10所述的SNP标记。

17、  一种选育D-CGMS萝卜系植物的方法，包括下述步骤：
1)提取靶植物的DNA样本；
2)采用权利要求14所述的试剂盒扩增步骤1)的DNA样本；以及
3)采用步骤2)的扩增样本，通过电泳检测权利要求7所述的DNA标记或权利要求10所述的SNP标记。

18、  权利要求7所述的DNA标记或权利要求10所述的SNP标记在选育D-CGMS萝卜系植物中的应用。

利用新型核质互作雄性不育型萝卜系植物以及选育该植物的DNA标记生产杂交种子的方法
技术领域
本发明涉及利用核质互作雄性不育型(CGMS)萝卜系植物(Raphanus sativus line plant)以及用于选育该植物的DNA标记生产杂交种子的方法，具体的说，本发明涉及新型CGMS(D-CGMS)萝卜系植物，利用该萝卜系植物，选育D-CGMS萝卜系植物的叶绿体DNA标记，其具有SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列，以及选育D-CGMS萝卜系植物的基于线粒体DNA的单核苷酸多态性(SNP)标记，其中SNP标记位于SEQ.ID.NO：12所示核苷酸序列的第171残基，生产杂交种子的方法。
背景技术
在植物培育领域，F₁代杂种育种已持续利用杂种优势。市场上的大部分蔬菜种子都是F₁代杂交种子。F₁代杂交种子的制种方法可以下述方法为例：人工杂交、自交不亲和、雌雄蕊异熟、雄性不育和种间杂交等。但是，除了基于雄性不育的方法，这些方法不仅需要投入很长的时间和巨大的精力，还难于保持种子的纯度和保证经济效益，因此，持续进行各种研究以开发雄性不育资源并以此育种。
萝卜系(Raphanus sativus L.)一般采用自交不亲和生产F₁代杂交种子。但是，利用自交不亲和的方法受限于减少自交授粉(污染)种子。即使自交不亲和被良好控制的母本也不能免于末期授粉导致的自交授粉(污染)。如果F1代杂交种子中包括自交授粉(污染)种子，种子的纯度会降低，而且供应者和顾客之间，伴随着索赔的关于种子的纠纷将会增加。
雄性不育表明是由于雄性器官，如花粉、花药和雄蕊的异常导致的不育，在各种植物中都可以观察到。这种不育是自然或人工地通过自然突变、种间/属间杂交或突变处理等获得的。雄性不育的诱导机制可分为两类：一类是基因的作用，另一类是环境的作用。用于育种的雄性不育大部分通过基因原因诱导。基因诱导雄性不育可分为三种：核雄性不育(GMS)，胞质雄性不育(CMS)和核质互作雄性不育(CGMS)。CMS和CGMS都归因于胞质中的线粒体的雄性功能不良，并根据是否存在核育性恢复基因相互区别(Rundfeldt，J.，Z.Pflanzenzuchtung，I960，44：30-62；Shivanna，K.R.和B.M.Johri.，Pollen sterility，in the angiosperm pollen，structure and function.1985.Wiley Eastern Ltd.New Delhi)。
核雄性不育(GMS)以隐性遗传传递，这意味着包含纯合隐性基因的对象不育。因此，当通过GMS生产F1代杂交种子，获得的种子中只有50％是不育的。因此，为维持和生产雄性不育系，各对象必须开花，也必须保证产生花粉，这需要较高的成本和精力。胞质雄性不育(CMS)和核质互作雄性不育(CGMS)的特点是都为母本遗传，主要由于胞质中的线粒体的雄性功能不良，使花粉异常，从而产生育性缺失。
由于CMS不包含育性恢复基因，因此无论与育性配子如何杂交，下一代都全部不育(100％)。CMS的优势在于可以保持这种雄性不育，但劣势在于由于没有雄性不育的恢复机制，在利用种子生产的植物，如油菜的商业应用方面受限，只限于用叶和根生产的植物。当CGMS与不包含雄性不育恢复基因的雄性育性配子杂交时，100％的后代是雄性不育的；当CGMS与包含雄性不育恢复纯合优势基因的雄性育性配子杂交时，100％的后代是雄性可育的。因此，为产生叶和根繁殖的植物的F1代种子，可通过与不包含不育恢复基因的种系杂交来实现CGMS的保持和增殖。为生产利用种子繁育的植物，如油菜的F1代种子，应通过原生质体融合或种间杂交引入育性恢复基因，并利用这种植物生产F1代杂交种子。来自这种植物的F1代杂交制种只可能在具有育性恢复机制的CGMS系植物，不能在CMS系植物提供可用的种子。
雄性不育萝卜系目前已知的有NWB-CMS(Raphanus sativus varNWB)，Ogura-CGMS(Raphanus sativus var Ogura)和Kosena-CGMS(Raphanus sativus cv Kosena)等。已经知道NWB-CMS是纯胞质因素引起的，其育性恢复基因资源还没有公开(韩国专利号No.0399333，Nahm等，Theor.Appl.Genet.Ill：1191-1200，2005)；同时，Ogura-CGMS和Kosena-CGMS是核质互作雄性不育，其不仅受实际的胞质因素，也受核因素的影响。
Ogura-CGMS和Kosena-CGMS是已知的由胞质的线粒体DNA生成新ORF而引起的，据推测，在其细胞核中具有育性恢复基因(Desloire S.et al.，EMBO report 4：588-594，2003)。特别的，据报道，Ogura-CGMS和Kosena-CGMS的雄性不育诱导基因和育性恢复基因的特性有很多相同之处，因此在其雄性不育机制方面也相似(Koizuka，et.al.，Theor.Appl.Genet.100：949-955，2000；Koizuka et.al.，Plant J.34：407-415，2003；Koizuka N，et.al.，Plant J.34：407-415，2003；Koizuka N，et.al.，Theor.Appl.Genet.100：949-955，2000)。由于其相对稳定的雄性不育性，Ogura-CGMS已经广泛用于生产萝卜系的F1代杂交种子，特别是由于雄性育性恢复机制有利于生产F1代杂交种子，向油菜中引入Ogura-CGMS。因此，Ogura-CGMS是最优选的雄性不育资源，但在保证雄性不育的种系上有困难，因此需要开发具有育性恢复基因的雄性不育资源，以便于种系保持并具有较高的雄性不育诱导率。该资源可有效生产萝卜系的F₁代杂交种子，在提供种子产品的植物诸如油菜中也可有效诱导出雄性不育。
根据传统的育种方法，生态学标记已经用于选育目标种系，但这种方法受限于有用的形态标记的数量，并受各种环境因素的制约。因此，在育种的目标表型中采用DNA标记进行分子育种方面，人们积极进行了各种研究。由于能使在早期传代中进行选育成为可能，并能够排除环境因素，保证表型分析的数量，DNA标记非常有用。因此，在很多植物中已经积极开发了DNA标记，作为新型的育种技术，DNA标记提高了选育效率。大部分用于诊断雄性不育的DNA标记都是基于具有大量遗传变异的线粒体DNA的分子标记。但是，线粒体基因组包含各种类型的亚基因组DNA，由于经常利用短重复序列进行重组和重排，具有非常复杂的结构(M.Bellaoui，et.al.，MoI.Gen.Genet.257：177-185，1998；M.Arrieta-Montiel et.al.，Genetics，158(2)，851-864，2001)，此外，线粒体基因组是由具有不同数量的不同基因结构组成的，因此在开发DNA标记时，有必要确认导致雄性不育或可育植物的基因组的数量。
叶绿体DNA是已知的具有较少遗传变异的DNA，它在基因的特定结构上没有数量的差异。因此，基于分子标记的叶绿体DNA有利于确认更稳定和精确的雄性不育(M.J.Havey，et.al.，Appl Genet.90：263-268，1995；T.Motegi，et.al.，Euphytica 129：319-323，2003)。
植物育种中分子标记的不稳定已经被充分地认识，但新型的分子标记可利于节约、快速和大量筛选本领域技术人员选育目标的样本。由于分子标记筛选方法的优点，各种类型的分子标记，如已经开发了RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)，RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)和AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增内切酶片段长度多态性)。但是这些标记受限于样本分析，需要花费较高的成本。能够更有效和更大量地进行筛选的SSR(SimpleSequence Repeat，简单重复序列)和SNP(Single NucleotidePolymorphism，单核苷酸多态性)标记的开发正在积极进行。特别的，由于荧光技术和毛细管电泳的发展，SNP标记非常便于自动筛选和大量的分析，因此可有效地用于育种。
因此，为开发新型的不同于普通NWB-CMS和CGMS(Ogura和Kosena)资源的雄性不育资源，以及筛选的CGMS(D-CGMS)萝卜系，本发明人收集了各种资源，并公开了其特征。本发明人还进一步确认了与普通Ogura-CGMS相比，能提供更高的雄性不育诱导速率、并便于种系保持的D-CGMS。因此，本发明人通过开发稳定的基于叶绿体DNA的分子标记，以及基于线粒体DNA的SNP(单核苷酸多态性)分子标记，以筛选D-CGMS萝卜系而完成本发明。
发明内容
【技术问题】
本发明的目的是提供一种新型的核质互作雄性不育(CGMS)萝卜系植物，以及利用它和用于选育该萝卜系植物的DNA标记生产杂交种子的方法。
【技术方案】
为了实现上述目的，本发明提供一种新型核质互作不育型(D-CGMS)萝卜系植物，其具有SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列和位于SEQ.ID.NO：12所示核苷酸序列的第171位残基上的D-CGMS特异性SNP(单核苷酸多态性)。
本发明还提供D-CGMS萝卜系愈伤组织(登录号：KCTC11101BP)。
本发明进一步提供了产生核质互作不育型的萝卜系杂交种子的方法，包括使D-CGMS萝卜系植物(作为杂交母本)与雄性不育植物杂交以诱导雄性不育的步骤。
本发明还提供了用于选育D-CGMS萝卜系植物的DNA标记，其具有能在严格条件下与SEQ.ID.NO：5所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列或含有SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列的DNA。
本发明还提供了用于选育D-CGMS萝卜系植物的SNP标记，其包含选自SEQ.ID.NO：12所示的寡核苷酸序列，并由上述序列的包括第171核苷酸的含有15-225个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补核苷酸序列组成。
本发明还提供了D-CGMS萝卜系植物的选育试剂盒，包括能够检测DNA标记的核苷酸序列或SNP标记的寡核苷酸的引物对或探针。
本发明还提供了一种选育D-CGMS萝卜系植物的方法，包括下述步骤：
1)提取靶植物的DNA样本；
2)采用扩增DNA标记或SNP标记用的引物对，通过PCR扩增步骤1)的DNA样本；以及
3)采用步骤2)的扩增样本，通过电泳检测DNA标记或SNP标记。
本发明还提供了一种选育D-CGMS萝卜系植物的方法，包括下述步骤：
1)提取靶植物的DNA样本；
2)采用D-CGMS萝卜系植物的选育试剂盒，扩增步骤1)的DNA样本；以及
3)采用步骤2)的扩增样本，通过电泳检测DNA标记或SNP标记。
此外，本发明提供了DNA标记或SNP标记在选育D-CGMS萝卜系植物中的应用。
以下详细描述本发明。
本发明中，“D-CGMS(萝卜变种D-CGMS)萝卜系”是指由本发明分离和鉴定的，并证实具有与普通CGMS完全不同的新基因型的萝卜系。
本发明中的“植物”包括植物器官、植物组织、植物细胞、种子和愈伤组织。
本发明提供一种新型核质互作不育型(D-CGMS)萝卜系植物，其具有SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列和位于SEQ.ID.NO：12所示核苷酸序列的第171位残基上的D-CGMS特异性单核苷酸多态性(SNP)核苷酸。
本发明人试图开发一种新型核质互作不育型萝卜系以改良F₁代杂交制种。因此，本发明人首先研究了来自韩国国立园艺研究所(20种萝卜系，收集自乌兹别克斯坦等)的萝卜系花器和花粉的发育。结果，检测到其中一个系的雄性不育显示出异常的花粉发育，命名为“D-CGMS(萝卜变异D-CGMS)”。与普通可育植物相比，该新发现的CGMS(D-CGMS)萝卜系具有较少的花粉，并已用于杂交制种。与Ogura-CGMS完全没有花粉不同，D-CGMS具有少量的不育花粉(见图1)。
D-CGMS花粉的形态和活力通过FDA(二乙酸荧光素)染色测定，并在扫描电镜下观察。结果，D-CGMS产生少量、形态异常且无活力的花粉(见图2)。该表型不同于普通Ogura-CGMS表型，但由于其具有类似于普通植物的花器，期望其能够有效地用于昆虫介导的混合授粉以吸引昆虫。
本发明人进一步进行了细胞组织观察以更精确地研究雄性不育机制。结果，证实在普通可育植物中花粉发育正常，而在Ogura-CGMS萝卜系植物观察到花粉发育早期的四分体阶段出现异常。在D-CGMS萝卜系植物中，直到四分体时期花粉发育正常，而在小孢子成熟期观察到异常，其导致了雄性不育(见图3)。
当D-CGMS萝卜系植物的花粉与作为母本的普通可育植物进行杂交，无法生成种子，表明D-CGMS萝卜系植物是无花粉活力的雄性不育系。然而，当D-CGMS作为母本用于杂交，正常地生成种子(见表1)。上述结果表明雌生殖器没有问题，仅是花粉发育异常导致了雄性不育系。因此，如果将D-CGMS作为母本用于育种，不必去除F₁代杂交制种中的花粉，其提高了杂交种子的效力，并增强了通过杂交优势育种产生F₁代种子的效力。
D-CGMS萝卜系植物的雄性不育机制完全不同于普通的Ogura-CGMS。即，雌生殖器没有问题，仅是花粉发育异常导致了雄性不育，花器的形态与普通可育植物相似，但花粉没有活力，因此它能够有效地用于由昆虫介导的混合授粉的F₁代杂交制种以吸引昆虫。
本发明还提供了D-CGMS萝卜系愈伤组织(登录号：KCTC11101BP)。
本发明还提供了产生具有核质互作不育型的CGMS萝卜系杂交种子的方法，包括使D-CGMS萝卜系植物(作为母本)与雄性可育植物杂交以诱导雄性不育的步骤。
本发明中，核质互作不育型的F₁代种子可通过将D-CGMS萝卜系植物与雄性可育植物进行杂交而产生。为比较核质互作不育型的D-CGMS萝卜系与Ogura-CGMS萝卜系的诱导率，将D-CGMS和Ogura-CGMS作为母本分别与相同的雄性可育植物进行杂交。结果，D-CGMS的雄性不育诱导率大大高于Ogura-CGMS，并且更易于形成D-CGMS萝卜系的保持系。通过萝卜系植物杂交产生的具有Ogura-CGMS的育性恢复基因和D-CGMS萝卜系植物的F₁代杂交种子为100％雄性不育。该结果表明此处的育性恢复基因完全不同于普通Ogura-CGMS萝卜系。因此，证实采用核质互作不育型的D-CGMS萝卜系产生F₁代杂交种子的方法比普通Ogura-CGMS萝卜系具有较高的雄性不育诱导效力，因此，D-CGMS萝卜系植物能够作为母本有效地用于产生F₁代杂交种子(见表2)。
为了证实D-CGMS萝卜系中育性恢复基因的存在，将D-CGMS作为母本与收集自乌兹别克斯坦和俄罗斯的10个系进行杂交。结果，一些通过与“DB112系”和“DB117系”杂交而产生的F₁代杂交种子是可育的，表明DB112系和DB117系含有育性恢复基因。因此，证实该新型D-CGMS萝卜系为含育性恢复基因的核质互作不育型(CGMS)萝卜系(见表3)。
综上所述，与普通Ogura-CGMS相比，证实D-CGMS为含育性恢复基因的核质互作不育型(CGMS)萝卜系，并在育种期间显示出较高的雄性不育诱导率，其克服了采用常规育种方法Ogura-CGMS生产雄性不育的局限。因此，F₁代杂交种子可通过将D-CGMS萝卜系植物与作为引入雄性不育目标的普通可育植物进行杂交而产生。本发明的方法可应用于任何不含D-CGMS恢复系的恢复基因的雄性可育系。所述雄性可育系优选分离自“JungSangYeoreum”(DB002)，HannongYeoreum(DB003)的SamYang(R012)、SungKong(R015)、JungSangYeoreum(R020)、HaChu(R029)系，分离自“HannongYeoreum”(DB111)，DeaBuRyeongYeoreum(DB084)的系，分离自“HaChu”(DB092)的系或收集自外国的如DB019、DB421、DB037、DB067、DB121、DB261、DB321、DB401、DB501和DB901等，但不限于此。
本发明人分化D-CGMS萝卜系种子以诱导愈伤组织，然后于2007年3月27日将该诱导的D-CGMS萝卜系愈伤组织保藏在韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)(登录号：KCTC11101BP)。
本发明还提供了用于选育D-CGMS萝卜系植物的DNA标记，其具有能在严格条件下与SEQ.ID.NO：5所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列或含有SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列的DNA。
如上文描述，与普通Ogura-CGMS萝卜系相比，D-CGMS萝卜系是完全不同的雄性不育系，并且可有效生产F₁代杂交种子。基于此，本发明人基于稳定的叶绿体DNA开发用于选育D-CGMS萝卜系植物的DNA标记。
根据十字花科结球白菜(Brassica rapa ssp.Pekinensis)的叶绿体核苷酸序列信息(GenBank登录号：DQ231548)，依据种间相对保守区域构建了20对引物，并对普通可育系、Ogura-CGMS萝卜系和D-CGMS萝卜系进行PCR。通过PCR反应，证实将普通可育系划分为两个具有不同叶绿体核苷酸序列的系，其分别命名为“DBRMF1”和“DBRMF2”。该结果与先前报告的基于线粒体核苷酸序列，可将普通可育萝卜系分为两个不同的系(Kim等，Theor.Appl.Genet.115：1137-1145，2007)一致。
采用SEQ.ID.NO：1(5′-AGGGCGGTGCTCTGACCAATTGAACTA-3′)所示的正向引物和SEQ.ID.NO：2(5′-GAGCGGTTAATGGGGACGGACTGTAAA-3′)所示的反向引物进行PCR反应，产物的D-CGMS不同(见图4)。与其它植物不同，D-CGMS的基因型中“ATATATTGATATCTATA”序列重复出现。为了容易地选育D-CGMS萝卜系，采用SEQ.ID.NO：3(5′-GCGGGTAGCTTACATATTCCTTCTTATG-3′)所示的正向引物和SEQ.ID.NO：4(5′-CGGCCTTGCTATCACTAAAGTGATATC-3′)所示的反向引物进行PCR反应，又一次证实该核苷酸序列。结果，在普通可育系、Ogura-CGMS系和D-CGMS系中，仅D-CGMS萝卜系产生156bp的PCR产物(见图5)，且本文中该产物的核苷酸序列为SEQ.ID.NO：5(5′-GCGGGTAGCTTACATATTCCTTCTTATGATTTAATCTTAATCATTTAAATTTTAGATTCAAATTAGTGTTTTGTAACAAAGAAAGTCACAAGTAATATATTGATATCTATAATATATTGATATCTATATGGATATCACTTTAGTGATAGCAAGGCC-3′)所示。
然而，任何能够扩增SEQ.ID.NO：5所示DNA标记的引物，都可用作D-CGMS特异性DNA标记扩增的引物。优选SEQ.ID.NO：3和SEQ.ID.NO：4所示的引物，但不限于此。
此处的DNA标记优选在严格条件下可与含有SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列DNA杂交的核苷酸序列，更优选SEQ.ID.NO：5所示的核苷酸序列。该严格条件可由杂交后的冲洗处理来确定。其中的一个严格条件为：于室温用含0.2％SDS的6×SSC冲洗15分钟，于室温用6×SSC，0.2％SDS冲洗15分钟，于45℃用2×SSC，0.2％SDS冲洗30分钟，于50℃用2×SSC，0.2％SDS冲洗30分钟，重复两次该冲洗处理。可通过本领域已知技术建立该严格条件。
为证实本发明的DNA标记是否可以用于D-CGMS特异性选育，采用了SEQ.ID.NO：3所示的正向引物和SEQ.ID.NO：4所示的反向引物对30个市售的系进行了PCR反应。结果，证实156bp的PCR产物仅存在于D-CGMS萝卜系中(见图6)，表明该标记可用于选育D-CGMS萝卜系。
因此，基于相对稳定的叶绿体DNA本发明的DNA标记可有效地用于选育D-CGMS萝卜系植物和新型栽培品种的培育。
本发明还提供了用于选育D-CGMS萝卜系植物的SNP标记，其包含选自SEQ.ID.NO：12所示的寡核苷酸序列，并由上述序列的包括第171核苷酸的含有15-225个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补核苷酸序列组成。
SEQ.ID.NO：12所示的第171核苷酸序列残基优选1bp鸟嘌呤，但不限于此。
本发明人开发的D-CGMS萝卜系特异性SNP标记易于经济、快速和大量地筛选样品。
基于萝卜的atp6核苷酸序列(GenBank登录号：M24671)，按照atp6 ORF基因的5′方向构建了SEQ.ID.NO：6(5′-AATCAAATAGGGCTGGTGGCGCAGT-3′)所示的第一个正向引物和SEQ.ID.NO：7(5′-CGCAGTCCCCACTTGACCAATTTGA-3′)所示的第二个正向引物，接着进行3′-基因组步移。结果，得到SEQ.ID.NO：8(5′-AAAAGGGGAGGAGGAAACTTAGTCCCAAATGCTTGGCAATCCTTGGTAGAGCTTCTTTATGATTTCGTGCTGAACCTGGTAAAGGAACAAATTTTAAGATTTTGAAATAAATTGAATTTCAAGACAGTTAGTCTAATCAACCAAGCTAGACCATGGTTGAGGCCGGTTATTAGTTTCTATTGCAAGGTTTTTGCACTATTGGAAATGTATAATTTAAGTGCATTTCTTTAATAAAGAAAAAGAAAACCCACAAATTGTATTTATAACTTCGGTCAGAGGTCACACCAAATGGCTAATTATTTTGGACAAAAAGAGAAACATAATCAGTCAGAGCTACACATAGAGTAGTTGTGTCAAGCTACTTTATTTAATGATCTTCTTCTTGTATTCTCGTCTTCCTCCATCATAATCACATCATAGATATTGGTGCCAATGAAAAGAGTAAAGATCATAGAAGGAAGTCCAAAATAGAGTGAGGGCTAAAGCAGTAGAGATTGCGTCAGCATTCCTATTGCAACAGGTCCAGTCAAAGAGGCGGCCCATTATCTTTTCTTCTTCGTTAAATACAATTATTTCTGTAAAAAAATCTTTGATAACCAGTTGGTTAATTCTTATTTCTAAATGGTGCCGGTGAAAAAGCATCGAGGTTATTTTACGATTAGTGAACCTGAACTGACATTGGTTCACCTTTGTAAGCCAGTTTATTATGTTTACTGTTCCCCATGATCGCATCAAATGTTAAAAATGGTTACATTTGTGCAAAATTCAACCACAATTTTACCCCAAAAAAGGGAAAAGAAAATCAACCACAGCGTAGCCTCCGCAGTGCACAGACTTGTGTTTCAAGTTTGAACCACAAAATAGTTTTGACTAGATATTCTTGTTCTATCCCTAAAAACAGACTAAGAAACTTTTTGAATGATGTACTTTTCTGGTAGTATGTAGGTGCCTAGGTGGTGACTCGGTACTATAATATGCCATAGCAAAGTCATCGATCAATATATACCCATCGAACGTATGGTTTGTATT-3′)所示的核苷酸序列。如图7所示，发现新型含嵌合基因的Atp6在正常atp6基因的3′区域是缺失的，在此处连接了一个新型核苷酸序列。与普通萝卜的atp6基因不同，在正常的atp6基因的ORF中，插入了额外核苷酸(见图7)。
为证实新型atp6基因5′方向的核苷酸序列，基于SEQ.ID.NO：8所示的核苷酸序列，构建了SEQ.ID.NO：9(5′-TAGCCATTTGGTGTGACCTCTGACCG-3′)所示的第一个反向引物和SEQ.ID.NO：10(5′-TAACCGGCCTCAACCATGGTCTAGC-3′)所示的第二个反向引物，接着进行5′-RACE(cDNA末端快速扩增)PCR。结果，得到SEQ.ID.NO：11所示的核苷酸序列(5′-GGAGTGATCTTTCTCGAAATGAATTAAGTAAGGGCGCTATGTTCAGATTCTGAACCAAAGCACTAGTTGAGGTCTGAAAGCCTTATGAGCAGAAGTAATAAATACCTCGGGGAAGAAGCGGGGTAGAGGAATTGGTCAACTCATCAGGCTCATGACCTGAAGATTACAGGTTCGAATCCTGTCCCCGCACTAAGTAAGGGTTTCATTCTGCATCACTCTCCCCGTCGTTCTCGACCTCGCAAGGTTTTTGAAGCGGCCGAAGCGGGAAGTGACAATACCGCTTTTCTTCAGCACATTTTGGATGATTTGAGCGAAAACGGAGTACAAAGTTCAGCCTTTAAGGAGGCTATGAATCAAATAGGGCTGGTGGCGCAGTCCCCACTTGACCAATTTGAGATTGTCCCATTGATTCCTATGAATATCGGAAACTTCTATTTCTCATTCACAAATCCATCTTTGTTCATGCTGCTAACTCTGAGTTTTTTCCTACTTCTGATTCATTTTATTACTAAAAAGGGGAGGAGGAAACTTAGTCCCAAATGCTTGGCAATCCTTGGTAGAGCTTCTTTATGATTTCGTGCTGAACCTGGTAAAGGAACAAATTTTAAGATTTTGAAATAAATTGAATTTCAAGACAGTTAGTCTAATCAACCAAGCTAGACCATGGTTGAGGCCGGTTA-3′)。如图8所示，将该序列与萝卜的正常atp6基因(GenBank登录号：M24671)相比较。D-GCMS植物的新型含嵌合基因的Atp6的植物5′区域与正常atp6基因的核苷酸序列相同，在ORF中插入1bp核苷酸，3′区域通过重组转化。通过上述1bp核苷酸的插入和重组，证实生成新型含嵌合ORF的Atp6，该基因命名为“orf225”，如SEQ.ID.NO：12所示(5′-ATGAATCAAATAGGGCTGGTGGCGCAGTCCCCACTTGACCAATTTGAGATTGTCCCATTGATTCCTATGAATATCGGAAACTTCTATTTCTCATTCACAAATCCATCTTTGTTCATGCTGCTAACTCTGAGTTTTTTCCTACTTCTGATTCATTTTATTACTAAAAAGGGGAGGAGGAAACTTAGTCCCAAATGCTTGGCAATCCTTGGTAGAGCTTCTTTATGA-3′)(见图8)。为检测新型含嵌合基因的Atp6的表达，以正常可育系(DBRMF2)和D-GCMS系的cDNAs为模板进行PCR反应，正向引物如SEQ.ID.NO：13所示(5′-GTACAAAGTTCAGCCTTTAAGGAGGC-3′)、引物如SEQ.ID.NO：10所示(5′-TAACCGGCCTCAACCATGGTCTAGC-3′)用于5′-RACE。结果，如图9所示，无法比较PCR产物的大小，但可证实在正常可育系和D-CGMS系中的表达(见图9)。
本发明人基于由3′基因组步移和5′-RACE PCR获得的核苷酸序列，得到核苷酸序列如SEQ.ID.NO：14所示(5′-GGAGTGATCTTTCTCGAAATGAATTAAGTAAGGGCGCTATGTTCAGATTCTGAACCAAAGCACTAGTTGAGGTCTGAAAGCCTTATGAGCAGAAGTAATAAATACCTCGGGGAAGAAGCGGGGTAGAGGAATTGGTCAACTCATCAGGCTCATGACCTGAAGATTACAGGTTCGAATCCTGTCCCCGCACTAAGTAAGGGTTTCATTCTGCATCACTCTCCCCGTCGTTCTCGACCTCGCAAGGTTTTTGAAGCGGCCGAAGCGGGAAGTGACAATACCGCTTTTCTTCAGCACATTTTGGATGATTTGAGCGAAAACGGAGTACAAAGTTCAGCCTTTAAGGAGGCTATGAATCAAATAGGGCTGGTGGCGCAGTCCCCACTTGACCAATTTGAGATTGTCCCATTGATTCCTATGAATATCGGAAACTTCTATTTCTCATTCACAAATCCATCTTTGTTCATGCTGCTAACTCTGAGTTTTTTCCTACTTCTGATTCATTTTATTACTAAAAAGGGGAGGAGGAAACTTAGTCCCAAATGCTTGGCAATCCTTGGTAGAGCTTCTTTATGATTTCGTGCTGAACCTGGTAAAGGAACAAATTTTAAGATTTTGAAATAAATTGAATTTCAAGACAGTTAGTCTAATCAACCAAGCTAGACCATGGTTGAGGCCGGTTATTAGTTTCTATTGCAAGGTTTTTGCACTATTGGAAATGTATAATTTAAGTGCATTTCTTTAATAAAGAAAAAGAAAACCCACAAATTGTATTTATAACTTCGGTCAGAGGTCACACCAAATGGCTAATTATTTTGGACAAAAAGAGAAACATAATCAGTCAGAGCTACACATAGAGTAGTTGTGTCAAGCTACTTTATTTAATGATCTTCTTCTTGTATTCTCGTCTTCCTCCATCATAATCACATCATAGATATTGGTGCCAATGAAAAGAGTAAAGATCATAGAAGGAAGTCCAAAATAGAGTGAGGGCTAAAGCAGTAGAGATTGCGTCAGCATTCCTATTGCAACAGGTCCAGTCAAAGAGGCGGCCCATTATCTTTTCTTCTTCGTTAAATACAATTATTTCTGTAAAAAAATCTTTGATAACCAGTTGGTTAATTCTTATTTCTAAATGGTGCCGGTGAAAAAGCATCGAGGTTATTTTACGATTAGTGAACCTGAACTGACATTGGTTCACCTTTGTAAGCCAGTTTATTATGTTTACTGTTCCCCATGATCGCATCAAATGTTAAAAATGGTTACATTTGTGCAAAATTCAACCACAATTTTACCCCAAAAAAGGGAAAAGAAAATCAACCACAGCGTAGCCTCCGCAGTGCACAGACTTGTGTTTCAAGTTTGAACCACAAAATAGTTTTGACTAGATATTCTTGTTCTATCCCTAAAAACAGACTAAGAAACTTTTTGAATGATGTACTTTTCTGGTAGTATGTAGGTGCCTAGGTGGTGACTCGGTACTATAATATGCCATAGCAAAGTCATCGATCAATATATACCCATCGAACGTATGGTTTGTATT-3′)。如图10所示，orf225基因由225个核苷酸组成，并编码75个蛋白密码子。该核苷酸序列的第1个残基至第603残基区域如SEQ.ID.NO：14所示，与萝卜的正常atp6基因相同。但是，证实SNP的第519残基(该核苷酸序列的第171残基如SEQ.ID.NO：12所示)增加1bp鸟嘌呤。第604残基的重组使得该基因完全不同于正常atp6基因(见图10)。
为证实正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS是否具有orf225基因，本发明人构建正向引物如SEQ.ID.NO：15所示(5′-ATACCTCGGGGAAGAAGCGGGGT-3′)以及反向引物如SEQ.ID.NO：16所示(5′-TAGCCATTTGGTGTGACCTCTGACCG-3′)，接着进行PCR反应并进行核苷酸测序。结果，如图11所示，琼脂糖凝胶上的PCR产物没有差异。如图12所示，正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS萝卜系的核苷酸序列没有差异。但是，证实在D-CGMS萝卜系中SNP(单核苷酸多态性)插入1bp核苷酸(见图11和图12)。
如图13所示，在正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS系中，重组发生在正常atp6基因ORF的第254核苷酸上，因此生成267bp新型ORF，其命名为“orf267”，如SEQ.ID.NO：17所示(5′-TGAATCAAATAGGGCTGGTGGCGCAGTCCCCACTTGACCAATTTGAGATTGTCCCATTGATTCCTATGAATATCGGAAACTTCTATTTCTCATTCACAAATCCATCTTTGTTCATGCTGCTAACTCTGAGTTTTTTCCTACTTCTGATTCATTTTATTACTAAAAAGGGAGGAGGAAACTTAGTCCCAAATGCTTGGCAATCCTTGGTAGAGCTTCTTTATGATTTCGTGCTGAACCTGGTAAAGGAACAAATTTTAAGATTTTGA-3′)。同时，在D-CGMS系中，在正常atp6基因ORF的第171核苷酸插入1bp鸟嘌呤，并且第255核苷酸发生重组，证实了SNP(单核苷酸多态性)，因此生成225bp新型ORF(orf225)(见图13)。
如图14所示，由于在正常atp6基因的ORF中插入1bp鸟嘌呤产生了SNP(单核苷酸多态性)，该D-CGMS萝卜具有改变特征的蛋白密码子。同时，观察到正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS系的C末端区域的变化(见图14)。
为证实插入1bp鸟嘌呤的SNP是否可用于选育D-CGMS萝卜系，本发明人进行了下述试验，分别采用正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS系，每系3株。结果，如图15所示，正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS系全部产生PCR产物，并通过核苷酸测序证实产生相同的D-CGMS特异性SNP(见图15)。
综上所述，如图16所示，正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS系具有序列“GGG”，D-CGMS萝卜系具有序列“GGGG”，表明额外插入1bp鸟嘌呤导致了SNP。此外，正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS系产生orf225基因，且由于SNP，D-CGMS产生orf267基因。因此，正常可育系(DBRMF1，DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS系不含有D-CGMS特异性SNP，表明位于如SEQ.ID.NO：12所示的核苷酸序列第171残基的D-CGMS特异性SNP可有效地用作选育D-CGMS萝卜系植物的分子标记(见图16)。
本发明还提供D-CGMS萝卜系植物的选育试剂盒。
该选育试剂盒含有能够检测DNA标记的分子序列或SNP标记的寡核苷酸的引物对或探针和PCR反应混合物。
用于扩增该D-CGMS萝卜系特异性DNA标记的引物对可特异性地扩增如SEQ.ID.NO：5所示的DNA标记，其可以为本领域已知的任何引物，但优选由SEQ.ID.NO：3和SEQ.ID.NO：4组成的引物对。用于扩增该D-CGMS SNP标记的引物对可扩增D-CGMS特异性SNP标记，其可以为本领域已知的任何引物，但优选由SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16组成的引物对。
此处的PCR反应混合物可包括普通PCR反应原料，例如，Tag聚合酶、反应缓冲液、dNTP、MgCl₂、BSA和蒸馏水，此外可包括检测PCR产物用的琼脂糖和电泳缓冲液。
本发明还提供了一种选育D-CGMS萝卜系植物的方法，包括下述步骤：
1)提取靶植物的DNA样本；
2)采用扩增DNA标记或SNP标记用的引物对，通过PCR扩增步骤1)的DNA样本；以及
3)采用步骤2)的扩增产物，通过电泳检测D-CGMS特异性DNA标记或SNP标记。
本发明提供了一种选育D-CGMS萝卜系植物的方法，包括下述步骤：
1)提取靶植物的DNA样本；
2)采用D-CGMS萝卜系植物的选育试剂盒，扩增步骤1)的DNA样本；以及
3)采用步骤2)的扩增产物，通过电泳检测D-CGMS特异性DNA标记或SNP标记。
此外，本发明提供了D-CGMS特异性DNA标记或SNP标记在选育D-CGMS萝卜系植物中的应用。
【有益效果】
本发明的D-CGMS萝卜系植物中的F₁代植物具有高的核质互作不育型诱导率，表明该D-CGMS可有效地用于产生CGMS系杂交种子。由本发明SEQ.ID.NO：3和SEQ.ID.NO：4所示引物扩增的D-CGMS萝卜系特异性DNA标记可有效地用于快速、方便地选育D-CGMS萝卜系植物。该D-CGMS萝卜系植物还可采用SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16所示的引物，通过位于SEQ.ID.NO：12所示核苷酸序列的第171核苷酸的D-CGMS特异性SNP(单核苷酸多态性)进行选育。上述引物还可有效地用于生产D-CGMS萝卜系植物选育试剂盒。
附图说明
可参考附图更好地理解本发明优选实施方案的应用，其中：
图1是一组显示正常可育系、Ogura-CGMS萝卜系和新型CGMS(D-CGMS)萝卜系植物花器和雄蕊形态的照片：
A：正常可育系的花器；
B：Ogura-CGMS萝卜系的花器；
C：D-CGMS萝卜系的花器；
D：正常可育系的雄蕊；
E：Ogura-CGMS萝卜系的雄蕊；以及
F：D-CGMS萝卜系的雄蕊。
图2是一组显示正常可育系和D-CGMS萝卜系植物花粉的照片：
A：正常可育系花粉粒的SEM照片；
B：D-CGMS萝卜系花粉粒的SEM照片；
C：正常可育系花粉粒的FDA染色照片；以及
D：D-CGMS萝卜系花粉粒的FDA染色照片。
图3是一组显示正常可育系、Ogura-CGMS萝卜系和D-CGMS萝卜系植物细胞组织学观察的照片：
A、D、G、J和M：照片显示了每种正常可育系花粉发育时期的细胞组织学观察；
B、E、H、K和N：照片显示了每种Ogura-CGMS萝卜系花粉发育时期的细胞组织学观察；以及
C、F、I、L和O：照片显示了每种D-CGMS萝卜系花粉发育时期的细胞组织学观察。
图4是一组显示由SEQ.ID.NO：1和SEQ.ID.NO：2所示引物扩增的PCR产物核苷酸序列的照片。
图5是一组显示由SEQ.ID.NO：3和SEQ.ID.NO：4所示引物扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶上的照片。
图6是一组显示采用D-CGMS特异性DNA标记对D-CGMS萝卜系和市售的30个其它系进行PCR反应后所得结果的照片。
M：标记；1：D-CGMS；2：GiIJo；3：Beak Yang；4：Sam Yang；5：JeongJinJu；6：CheongHak；7：TeaYang；8：YoungSan；9：PyonGyangKimJang；10：HaChu；11：HannongYeoreum；12：D-CGMS；13：HanGaEul；14：MyoungSan；15：BeakKyung；16：YoungKwang；17：JangWon；18：CheongKwang；19：PalKwang；20：CheongWoon；21：TeaBeak；22：KwandongYeoreum；23：D-CGMS；24：DeaHyeongChooSeok；25：JoongAngKimJang；26：CheongBok；27：TeaWang；28：TeaPyong；29：HanAllDeaHyeongbom；30：NokDoBom；31：BeakKwang；32：BeakBong；33：CheongilPum。
图7是一组显示采用SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7所示引物进行3′基因组步移而获得的核苷酸序列的照片。
图8是一组显示将采用SEQ.ID.NO：9和SEQ.ID.NO：10所示引物进行5′-RACE(cDNA末端快速扩增)PCR而获得的核苷酸序列与报告的萝卜正常atp6基因(GenBank登录号：M24671)核苷酸序列进行对比的照片。
下划线部分：新型D-CGMS特异性orf225的ORF(开放阅读框)。
图9是一组显示正常可育系和D-CGMS萝卜系植物cDNA的新型含嵌合基因Atp6表达的照片。
图10是一组显示植物通过3′基因组步移和5′-RACE PCR从D-CGMS萝卜系植物获得的新型含嵌合基因Atp6核苷酸序列的照片：
箭头(102-124和781-806)：分别为用于开发D-CGMS特异性SNP标记的、SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16所示的正向引物和反向引物。
图11是显示采用SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16所示引物扩增的、琼脂糖凝胶上PCR产物的对比照片。
图12是显示采用SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16所示引物扩增的PCR产物核苷酸序列的对比照片。
图13显示了普通萝卜系正常atp6基因的结构，正常可育系(DBRMF1，DBRM2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS的新型含嵌合基因ORF(orf267基因)Atp6的结构，以及D-CGMS萝卜系特异性新型含嵌合基因ORF(orf225基因)Atp6的结构。
图14是显示正常系(DBRMF1，DBRM2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS萝卜系，以及通过D-CGMS萝卜系特异性SNP修饰蛋白密码子得到的D-CGMS萝卜系之间差异的照片。
图15是显示采用SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16所示引物扩增的正常可育系(DBRMF1，DBRM2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS萝卜系(每系三株)的每种PCR产物在琼脂糖凝胶上对比的照片。
图16是一组显示采用SEQ.ID.NO：15和SEQ.ID.NO：16所示引物扩增的正常可育系(DBRMF1，DBRM2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS萝卜系的每种PCR产物色谱峰的照片，通过核苷酸测序确定：
A：DBRMF1系；
B：DBRMF2系；
C：Ogura-CGMS系；
D：NWB-CMS系；以及
E：D-CGMS系。
具体实施方式
本发明实践中和目前优选的实施方案在如下的实施例中予以阐明。然而本领域的技术人员将会理解，考虑到本发明公开的内容，可以在本发明的精神和范围内，对本发明作出修改和改进。
实施例1：新型D-CGMS萝卜系的开发及其特征的研究
<1-1>新型D-CGMS的选育
本发明人收集了新型雄性不育资源，以期改善F₁代杂交种子的生产能力。然后，本发明人研究了分布在韩国国立园艺研究所的从乌兹别克斯坦等处采集的20株萝卜系植物的花的器官组织和花粉发育。
结果选择了通过抑制花粉发育而呈现雄性不育(核质互作不育型：CGMS)的系，并将其命名为“D-CGMS(萝卜变种D-CGMS)”。
在解剖显微镜下观察了所选D-CGMS、正常可育系和Ogura萝卜系(Ogura-CGMS)的花和雄蕊。一般将Ogura-CGMS用于生产杂交种子，因此本文将其用作对照。
结果，与正常可育系相比，新型雄性不育系(D-CGMS)中花粉发育非常弱，但与先前报道的已知根本无花粉的Ogura-CGMS不同，这种新型系具有花粉发育，即使产生的花粉量很小(见图1)。
<1-2>D-CGMS花粉的活力
为了研究选自实施例<1-1>的D-CGMS花粉的活力，在电子显微镜(扫描电镜：SEM)下，通过FDA染色(二乙酸荧光素)全面观察了新型雄性不育系花粉的形态和活力。从盛开期的正常可育系和D-CGMS萝卜系采集花粉，用FDA染色，并在电子显微镜下观察。但是，因为Ogura-CGMS中不含花粉，所以从观察中排除。为了研究花粉的活力，从正常可育系和D-CGMS萝卜系的花中采集花粉，用0.002％FDA(二乙酸荧光素)溶液染色，然后在荧光显微镜下观察。
结果，与正常可育系植物不同，采集自新型雄性不育系的花粉的形态学产生畸变，且从新型雄性不育系中观察到无活力的花粉粒(图2)。
<1-3>对D-CGMS细胞组织学的观察
本发明人对D-CGMS进行了细胞组织学观察，以更精确的研究其雄性不育机制。首先，在相同的发育阶段，获得正常可育系、Ogura-CGMS和D-CGMS萝卜系植物的花药，在4℃于固定剂(Pipes 50mM，4％对-甲醛)中固定24小时。然后，在室温下分别用25％、50％、75％和100％的乙醇逐步脱水，各2小时，随后再用100％的乙醇脱水一次24小时。室温下用25％、50％、75％和100％不同浓度的二甲苯处理，各2小时，随后用100％的二甲苯处理两次，每次2小时。在完成预处理后，用液体石蜡处理样品三次，每次2小时，然后将样品包埋于石蜡中。用旋转式切片机将石蜡块制备成薄切片(10μm厚)，粘在白蛋白涂布的载玻片上。于40±3℃在载玻片加温器(Fisher Scientific，USA)上干燥载玻片。用二甲苯除去干燥的载玻片上的石蜡，将载玻片用乙醇脱水，然后用0.25％甲苯胺蓝和0.05％苯胺蓝染色。用乙醇和二甲苯处理染色的组织，然后用密封剂将载玻片密封，在60℃的载玻片加温器上干燥一天。在光学显微镜下进行观察并拍照。
结果，正常可育系植物中的花粉正常发育(图3，A、D、G、J和M)，而Ogura-CGMS萝卜系植物中的花粉根本未发育(图3，B、E、H、K和N)，从其四分体的发育阶段(图3，E)观察到了异常，这表明Ogura-CGMS具有雄性不育机制。在D-CGMS萝卜系植物中(图3，C、F、I、L和O)，花粉在四分体阶段以前均正常发育(图3，F)，但在小孢子发育阶段观察到了异常(图3，I和L)，导致雄性不育(图3)。
<1-4>通过杂交研究D-CGMS花粉的活力
本发明人通过杂交研究了D-CGMS花粉的活力。结果，当D-CGMS萝卜系植物的花粉与作为母本的正常可育植物杂交时，未产生种子。然而，当将D-CGMS萝卜系植物作为母本与其他花粉杂交时，正常产生了种子(表1)，通过对雌性器官的发育检查证实了这一点。为了研究D-CGMS的雌性器官发育是否正常，作为父本用于杂交的雄性可育植物选自由SamYang(R012)、SungKong(R015)、JungSangYeoreum(R020)和HaChu(R029)组成的组。以及为了研究D-CGMS的雄性器官发育是否正常，雄性可育植物选自DeaHyeongChooSeok(R049)、BeakBong(R106)和由本发明人从外国采集并保藏的资源，诸如“R122”、“R126”和R127。
表1通过人工授粉对D-CGMS萝卜系花粉活力的检查及其雌性器官的研究

-：未产生种子；+：产生了种子。
实施例2：D-CGMS萝卜雄性不育的诱导以及产生F₁代杂交种子的证实
将选自实施例1的D-CGMS萝卜系植物作为母本与雄性可育系植物杂交，产生具有核质互作不育型的CGMS萝卜系F₁代杂交种子。为了比较D-CGMS萝卜系的CGMS诱导率与Ogura-CGMS萝卜系的CGMS诱导率，将用于与D-CGMS萝卜系进行杂交的雄性可育植物与作为母本的Ogura-CGMS进行杂交。研究了花粉发育和活力，以证实在产生的F₁杂交种子中是否引入了雄性不育。雄性可育系植物(父本系)选自从″JungSangYeoreum″(DB002)、HannongYeoreum(DB003)中分离的系，从″HannongYeoreum″(DB111)、SamYang(DB021)、DeaBuRyeongYeoreum(DB084)中分离的系，从″HaChu″(DB092)中分离的系，以及本发明人采集的那些雄性可育系植物，如″DB019″和″DB421″。对于对照Ogura-CGMS萝卜系，将DeaHyeongChooSeok(R049)、Beakbong(R106)作为母本。
结果，在8个不同雄性可育系与Ogura-CGMS杂交组合的6个组合中产生的F₁代杂交种子均为100％的雄性可育子代，在其余的两个杂交组合之一(R106x DB421)中，雄性可育子代和雄性不育子代大约以1∶1的比例分离。在另一个杂交组合(R106x DB019)中，产生的F₁代杂交种子均为100％的雄性不育子代。然而，D-CGMS萝卜系植物与8个不同雄性可育系的杂交组合产生了100％雄性不育F₁代杂交种子(表2)。因此，可以证实D-CGMS雄性不育的诱导率要明显高于Ogura-CGMS雄性不育的诱导率，且培育D-CGMS萝卜系的保持系要更容易。
由具有Ogura-CGMS育性恢复基因的萝卜系植物与D-CGMS萝卜系植物杂交产生的F₁代杂交种子为100％雄性不育。该结果表明本文的雄性育性恢复基因完全不同于普通Ogura-CGMS萝卜系。因此，采用核质互作不育型从D-CGMS萝卜系中产生F1代杂交种子的方法，被证实与普通Ogura-CGMS萝卜系相比，具有较高的雄性不育诱导效率，因此将D-CGMS萝卜系植物作为母本能有效地用于产生F₁代杂交种子。
表2通过杂交向Ogura-CGMS和D-CGMS中引入雄性不育

实施例3：D-CGMS萝卜系的雄性育性恢复基因资源的开发
为了筛选选自实施例1中D-CGMS萝卜系的雄性可育恢复系，将从乌兹别克斯坦和俄罗斯采集的10个雄性可育系与作为母本的D-CGMS萝卜系植物杂交。作为父本系的那10个雄性可育系从外国(乌兹别克斯坦和俄罗斯)采集，因此它们变异体的名称未知，所以本文中只给出了它们系的名称。为了研究在F₁代杂交种子中是否引入了雄性不育，研究了花粉的发育和活力。
结果，在具有雄性可育系的10个组合中，有两个杂交组合证实出现了雄性可育子代。在由D-CGMS与DB112杂交产生的F₁代杂交种子中，将雄性不育子代和雄性可育子代分离，这表明DB112萝卜系具有D-CGMS萝卜系的杂合型雄性育性恢复基因。由D-CGMS与DB117杂交产生的F₁代杂交种子为100％雄性可育，表明DB117具有D-CGMS萝卜系的纯合型主导的雄性育性恢复基因。因此，新型D-CGMS萝卜系被证实为具有育性恢复基因的核质互作不育型(CGMS)萝卜系。
表3通过对D-CGMS萝卜系进行杂交得到雄性可育恢复系的判断

实施例4：D-CGMS萝卜系愈伤组织的诱导
将D-CGMS萝卜系种子在70％(v/v)乙醇中浸泡1分钟，然后用无菌水冲洗两次。将种子在2％次氯酸钠(NaOCl)溶液中浸泡15分钟，然后用无菌水冲洗三次。将无菌的种子分布在发芽培养基(1/2MS盐，3％蔗糖，0.8％琼脂)中萌发。在第7天，每隔5mm剪下生长的胚轴，在MS培养基(含有BAP 4mg/L和NAA 2mg/L)中分化，进行愈伤组织诱导。每间隔4周将愈伤组织在MS培养基(含有BAP 1mg/L和IBA 0.5mg/L)中进行次培养。选择生长稳定的愈伤组织(D-CGMS萝卜系的愈伤组织)，并于2007年3月27日保藏在韩国典型菌种保藏中心(KCTC)，韩国生物科学与生物技术研究所(KRIBB)(登录号：KCTC11101BP)。
实施例5：用于选育D-CGMS的基于叶绿体分子标记的开发
在实施例1-3中，本发明人证实了D-CGMS萝卜系是完全不同于普通Ogura-CGMS萝卜系的雄性不育系，通过采用D-CGMS萝卜系能够有效地产生F₁代杂交种子。为了开发基于稳定叶绿体DNA(能够选育D-CGMS萝卜系)的DNA标记，对正常可育系、Ogura-CGMS和D-CGMS的叶绿体进行了PCR和核苷酸测序，结果证实了叶绿体核苷酸序列存在差异。
<5-1>D-CGMS的叶绿体DNA变异体
根据十字花科结球白菜(Brassica rapa ssp.Pekinensis)叶绿体核苷酸序列(GenBank登录号：DQ231548)的信息，在种间相对保守的区域构建了20个引物对，然后对每个正常可育系、Ogura-CGMS萝卜系和D-CGMS萝卜系的5株植物进行PCR。用液氮将每个植物上采集的0.1g叶子完全捣碎，用试剂盒(DNeasy植物试剂盒，Qiagen，USA)提取DNA。将50ng提取的DNA作为模板，采用试剂盒(Advantage 2PCR试剂盒，Clontech，USA)按如下方法进行PCR：94℃预变性5分钟，94℃变性3分钟，65℃退火30秒，72℃聚合2分钟，从变性到聚合重复40个循环，最后在72℃延伸1min。反应结束后，分析PCR产物的核苷酸序列。结果，观察到正常可育系、Ogura-CGMS系和D-CGMS系的叶绿体核苷酸序列之间存在差异。由Genotech Co.，Ltd.完成核苷酸测序。
分析基于叶绿体DNA的PCR产物的核苷酸序列。结果，证实了正常可育系被分为具有不同叶绿体核苷酸序列的两个不同的系，分别命名为″DBRMF1″和″DBRMF2″。在基于叶绿体DNA的PCR产物中，通过采用在D-CGMS中呈现不同特征的SEQ.ID.NO：1所示正向引物和SEQ.ID.NO：2所示反向引物产生PCR产物。分析该PCR产物的核苷酸序列，结果证实仅在D-CGMS中插入了17bp核苷酸序列(ATATATTGATATCTATA)(图4)。
<5-2>D-CGMS特异性DNA标记的开发
如实施例<5-1>所示，与其他植物不同，D-CGMS系有插入序列′ATATATTGATATCTATA′，所述序列重复两次。为了方便选育D-CGMS萝卜系，用SEQ.ID.NO：3所示正向引物和SEQ.ID.NO：4所示反向引物进行PCR。
用从正常可育系、Ogura-CGMS系和D-CGMS系中提取的50ngDNA作为模板，以如实施例<5-1>所述相同的方式采用试剂盒(Advantage 2PCR试剂盒，Clontech，USA)按如下方法进行PCR：94℃预变性5分钟，94℃变性25秒，68℃退火25秒，72℃聚合25秒，从变性到聚合重复40个循环，最后在72℃延伸1min。反应结束后，在琼脂糖凝胶上研究每个PCR产物的大小。结果，来自D-CGMS萝卜系的PCR产物较大(图5)。分析所述PCR产物的核苷酸序列。结果，证实了156bp大小的PCR产物，如SEQ.ID.NO：5所示。
<5-3>采用特异性DNA标记选育D-CGMS
为了证实实施例<5-2>中开发DNA标记对新型D-CGMS特异性选育的可用性，采用30种市售的普通变种，用SEQ.ID.NO：3所示正向引物和SEQ.ID.NO：4所示反向引物，以如实施例<5-2>所述相同的方式进行PCR。
结果，只有D-CGMS的PCR产物较大，这表明本发明的DNA标记能有效地对新型D-CGMS萝卜系植物进行选育(图6)。分析了PCR产物(156bp)的核苷酸序列。结果，该序列被鉴别为SEQ.ID.NO：5所示序列。
实施例6：含有嵌合ORF的D-CGMS特异性Atp6的证实和用于选育D-CGMS的基于线粒体DNA的SNP标记的开发
<6-1>通过基因组步移技术证实D-CGMS中的含有嵌合ORF的Atp6
本发明人通过基因组步移技术研究了D-CGMS特异性Atp6基因型。Atp6基因是在线粒体基因组中发现的，在ATP合成中该基因编码ATP酶亚基6个蛋白。根据先前的报告，雄性可育系和雄性不育系具有不同的Atp6基因结构(Makaroff CA等，J.Biol.Chem.264：11706-11713，1989；Kim等，Theor.Appl.Genet.115：1137-1145，2007)。尤其是在辣椒雄性不育系中，雄性不育系具有独特的含有局部缺失3′-区的基因组织的Atp6。利用上述特征，开发了辣椒雄性不育特异性SCAR(序列特征性扩增区域)标记，并将其用于选育辣椒雄性不育资源(Kim等，MoI.Cells，20：416-422，2005)。
首先，为了研究D-CGMS的Atp6基因的结构特征，根据普通萝卜Atp6基因的核苷酸序列(GenBank登录号：M24671)，从Atp6ORF的5′至3′进行基因组步移，构建了SEQ.ID.NO：6所示第一正向引物和SEQ.ID.NO：7所示第二正向引物。用液氮将D-CGMS萝卜系的0.1g叶子完全捣碎，用试剂盒(DNeasy植物试剂盒，Qiagen，USA)提取DNA。采用基因组步移库试剂盒(Universal GenomeWalkerTM Kit，Clontech，USA)，用3ug提取的DNA构建基因组步移库。以1ul基因组步移库为模板，采用SEQ.ID.NO：6所示引物按如下方法进行第一次PCR：94℃预变性3分钟，94℃25秒，72℃3分钟(7个循环)，然后94℃25秒，67℃3分钟(32个循环)，最后在67℃延伸7min。反应结束后，对反应物进行50倍稀释。以1ul稀释液为模板，采用SEQ.ID.NO：7所示引物按如下方法进行第二次PCR(嵌套式PCR)：94℃预变性3分钟，94℃25秒，72℃3分钟(5个循环)，然后94℃25秒，67℃3分钟(20个循环)，最后在67℃延伸7min。
结果在琼脂糖凝胶上的PCR产物中观察到了很多条带。分析了这些产物的核苷酸序列。如图7所示，发现在新型含有嵌合基因的Atp6中，正常Atp6基因的3′-区缺失，在该位点上通过重组结合了新核苷酸序列(SEQ.ID.NO：8)。甚至在正常Atp6基因的ORF区，观察到了一个核苷酸插入(图7)。
<6-2>通过5′-RACE证实D-CGMS中新型含有嵌合基因的Atp6的转录
如实施例<6-1>所示，证实了新型重组体Atp6的3′-区缺失，以及在该位点上插入了另一个核苷酸序列。为了证实新型含有嵌合基因的Atp6的5′-方向的核苷酸序列，进行了5′-RACE(cDNA末端快速扩增)PCR。用于构建RACE cDNA的RNA按如下方法制备：用液氮将从D-CGMS获得的0.1g花完全捣碎，采用Tri Reagent RNA分离试剂盒(Sigma，USA)从中提取总RNA。采用PolyATtract mRNA分离系统IV(Promega，USA)，从上述提取的总RNA中分离mRNA。采用RACEcDNA扩增试剂盒(SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒，Clontech，USA)，用1ug分离的mRNA构建RACE cDNA。根据SEQ.ID.NO：8所示核苷酸序列，构建了新型Atp6基因的特异反向引物如SEQ.ID.NO：9和NO：10所示。以1ul RACE cDNA为模板，采用SEQ.ID.NO：9所示反向引物，按如下方法进行第一次5′-RACE PCR：94℃预变性5分钟，94℃30秒，70℃3分钟(5个循环)，然后94℃30秒，68℃30秒，72℃3分钟(25个循环)，最后在72℃延伸10min。反应结束后，对反应物进行50倍稀释。以1ul稀释液为模板，采用SEQ.ID.NO：10所示引物按如下方法进行第二次5′-RACE PCR(嵌套式PCR)：94℃预变性5分钟，94℃30秒，72℃3分钟(5个循环)，然后94℃30秒，68℃30秒，72℃3分钟(35个循环)，最后在72℃延伸10min。反应结束后，在琼脂糖凝胶上证实PCR产物。将扩增的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体(Promega，USA)，然后进行核苷酸测序。获得的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：11所示。如图8所示，将该序列与先前报道的萝卜正常Atp6基因(GenBank登录号：M24671)进行对比，结果，D-CGM的新型含有嵌合基因的Atp6的5′-区与正常Atp6基因的一致，但是1bp核苷酸插入ORF，3′-区经重组修饰，这与实施例<6-1>的结果一致。证实了新型含有嵌合基因的Atp6的ORF，并将其命名为″orf225″，如SEQ.ID NO：12所示。
通过对正常可育系(DBRMF2)和D-CGMS系植物的cDNA进行RT-PCR，再次证实了新型含有嵌合基因的Atp6的表达。用液氮将从正常可育系和D-CGMS中获得的0.1g花完全捣碎，采用Tri ReagentRNA分离试剂盒(Sigma，USA)从中提取总RNA。采用cDNA合成试剂盒(SuperScriptTM First-strand Synthesis System for RT-PCR，Invitrogen，USA)，用2ug RNA合成cDNA。用SEQ.ID.NO：13所示正向引物和SEQ.ID.NO：10所示反向引物(用于5′-RACE)，按如下方法进行RT-PCR：94℃预变性5分钟，94℃30秒，64℃退火30秒，72℃聚合40秒，从变性到聚合重复45个循环，最后在72℃延伸5min。反应结束后，在琼脂糖凝胶上证实PCR产物。结果，如图9所示，不仅在D-CGMS系，而且在正常可育系中均证实了扩增的PCR产物，表达的基因鉴别为新型含有嵌合基因的Atp6(图9)。
<6-3>orf225核苷酸分析和SNP筛选
根据实施例<6-1>和<6-2>中证实的核苷酸序列，获得了图10中所示的核苷酸序列，如SEQ.ID.NO：14所示。SEQ.ID.NO：14所示核苷酸序列包含1540bp核苷酸，如图10所示，orf225基因包含225bp核苷酸，范围从第349个核苷酸到第573个核苷酸，编码75个蛋白密码子(图10)。SEQ.ID.NO：14所示序列的从第一个核苷酸到第603个核苷酸的序列与萝卜的正常Atp6基因序列一致。该序列具有在第519个核苷酸(SEQ.ID.NO：12所示的第171个核苷酸)处插入1bp鸟嘌呤的SNP。在第604个核苷酸处也观察到了重组，表明该序列完全不同于正常Atp6基因序列。采用BlastN分析了从第604个核苷酸到第1540个核苷酸的重组体基因序列。结果，部分序列与Arabidopsis thaliana基因核苷酸序列的同源性较低(同源性：73％)，整体未检测到高的同源性基因。
为了证实orf225基因是否包含在正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS系中，用SEQ.ID.NO：15所示正向引物和SEQ.ID.NO：16所示反向引物进行PCR，然后进行核苷酸测序。正向和反向引物的位置如图10所示。用液氮将从正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS系植物中获得的0.1g叶子完全捣碎，采用试剂盒(DNeasy植物试剂盒，Qiagen，USA)从中提取DNA。以1ul提取的DNA为模板，采用SEQ.ID.NO：15所示正向引物和SEQ.ID.NO：16所示反向引物按如下方法进行PCR：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，66℃退火30秒，72℃聚合1分钟，从变性到聚合重复45个循环，最后在72℃延伸5min。
结果，如图11所示，正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS萝卜系的PCR产物没有不同(图11)。对PCR产物进行核苷酸测序。如图12所示，正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS系的核苷酸序列没有差异，但是D-CGMS的核苷酸序列显示了通过添加1bp核苷酸插入物产生的SNP(单核苷酸多态性)(图12)。结果，如图13所示，正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS系的atp6基因在ORF的第254个核苷酸处重组，导致产生267bp大小的新型ORF，将其命名为″orf267(SEQ.ID.NO：17)″。假定orf267基因总共编码89个蛋白密码子。
在D-CGMS中，正常atp6基因ORF的第171个核苷酸添加了1bp鸟嘌呤，产生SNP(单核苷酸多态性)，并在第255个核苷酸处发生重组，导致产生225bp大小(orf225)的新型OFR(图13)。如图14所示，在D-CGMS中，在正常atp6基因ORF的第171个核苷酸处插入1bp鸟嘌呤产生了SNP(单核苷酸多态性)，其改变了蛋白密码子。而且，证实了正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS系的C-末端区的差异(图14)。
<6-4>D-CGMS萝卜系特异性SNP标记的开发
为了确认在实施例<6-3>中证实的SNP对D-CGMS萝卜系的选育是否有效，选择正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS系、每系3株进行试验。D-CGMS-2和D-CGMS-3是由作为母本的D-CGMS萝卜系与正常可育系杂交产生的子代。还研究了D-CGMS特异性SNP是否传给了下一代，从15株正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS系植物中获得了0.1g叶子，用液氮将其完全捣碎，采用试剂盒(DNeasy植物试剂盒，Qiagen，USA)从中提取DNA。以1ul提取的DNA为模板，采用SEQ.ID.NO：15所示正向引物和SEQ.ID.NO：16所示反向引物，以如实施例<6-3>所述相同的条件进行PCR。
如图15所述，正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS、NWB-CMS和D-CGMS系全部产生了PCR产物，对这些产物进行了序列分析。结果证实了D-CGMS特异性SNP(图16)。如图16所示，正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS的核苷酸序列具有″GGG″，而D-CGMS的核苷酸序列具有″GGGG″，表明添加1bp鸟嘌呤能产生SNP(图16)。将D-CGMS作为母本与正常可育系杂交，结果产生D-CGMS-2和D-CGMS-3。在那些子代中，证实了D-CGMS特异性SNP，表明SNP通过母系传代。上述证实的D-CGMS特异性SNP未在正常可育系(DBRMF1、DBRMF2)、Ogura-CGMS和NWB-CMS萝卜系中发现。因此，可将D-CGMS特异性SNP有效用于分子标记来选择D-CGMS萝卜植物。
本领域的技术人员将会理解，前面说明书中公开的内容和具体实施方案可以很容易的作为修改和设计其他实施方案的基础，以实现与本发明相同的目的。本领域的技术人员还将理解，这种不脱离本发明的精神和范围的等同的实施方案如所附的权利要求所述。
序列表
<110>(株)东部HITEK
<120>利用新型核质互作雄性不育萝卜系以及选育该种的DNA标记生产杂交种子的方法
<130>8fpo-03-13
<160>17
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1
<400>1
agggcggtgc tctgaccaat tgaacta    27
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物2
<400>2
gagcggttaa tggggacgga ctgtaaa    27
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物3
<400>3
gcgggtagct tacatattcc ttcttatg   28
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物4
<400>4
cggccttgct atcactaaag tgatatc    27
<210>5
<211>156
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>D-CGMS萝卜的PCR产物
<400>5
gcgggtagct tacatattcc ttcttatgat ttaatcttaa tcatttaaat tttagattca    60
aattagtgtt ttgtaacaaa gaaagtcaca agtaatatat tgatatctat aatatattga    120
tatctatatg gatatcactt tagtgatagc aaggcc                              156
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物6
<400>6
aatcaaatag ggctggtggc gcagt    25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物7
<400>7
cgcagtcccc acttgaccaa tttga    25
<210>8
<211>1029
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>D-CGMS萝卜的染色体步移产物
<400>8
aaaaggggag gaggaaactt agtcccaaat gcttggcaat ccttggtaga gcttctttat    60
gatttcgtgc tgaacctggt aaaggaacaa attttaagat tttgaaataa attgaatttc    120
aagacagtta gtctaatcaa ccaagctaga ccatggttga ggccggttat tagtttctat    180
tgcaaggttt ttgcactatt ggaaatgtat aatttaagtg catttcttta ataaagaaaa    240
agaaaaccca caaattgtat ttataacttc ggtcagaggt cacaccaaat ggctaattat    300
tttggacaaa aagagaaaca taatcagtca gagctacaca tagagtagtt gtgtcaagct    360
actttattta atgatcttct tcttgtattc tcgtcttcct ccatcataat cacatcatag    420
atattggtgc caatgaaaag agtaaagatc atagaaggaa gtccaaaata gagtgagggc    480
taaagcagta gagattgcgt cagcattcct attgcaacag gtccagtcaa agaggcggcc    540
cattatcttt tcttcttcgt taaatacaat tatttctgta aaaaaatctt tgataaccag    600
ttggttaatt cttatttcta aatggtgccg gtgaaaaagc atcgaggtta ttttacgatt    660
agtgaacctg aactgacatt ggttcacctt tgtaagccag tttattatgt ttactgttcc    720
ccatgatcgc atcaaatgtt aaaaatggtt acatttgtgc aaaattcaac cacaatttta    780
ccccaaaaaa gggaaaagaa aatcaaccac agcgtagcct ccgcagtgca cagacttgtg    840
tttcaagttt gaaccacaaa atagttttga ctagatattc ttgttctatc cctaaaaaca    900
gactaagaaa ctttttgaat gatgtacttt tctggtagta tgtaggtgcc taggtggtga    960
ctcggtacta taatatgcca tagcaaagtc atcgatcaat atatacccat cgaacgtatg    1020
gtttgtatt                                                            1029
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物9
<400>9
tagccatttg gtgtgacctc tgaccg    26
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物10
<400>10
taaccggcct caaccatggt ctagc    25
<210>11
<211>680
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>D-CGMS萝卜的5′-RACE PCR产物
<400>11
ggagtgatct ttctcgaaat gaattaagta agggcgctat gttcagattc tgaaccaaag    60
cactagttga ggtctgaaag ccttatgagc agaagtaata aatacctcgg ggaagaagcg    120
gggtagagga attggtcaac tcatcaggct catgacctga agattacagg ttcgaatcct    180
gtccccgcac taagtaaggg tttcattctg catcactctc cccgtcgttc tcgacctcgc    240
aaggtttttg aagcggccga agcgggaagt gacaataccg cttttcttca gcacattttg    300
gatgatttga gcgaaaacgg agtacaaagt tcagccttta aggaggctat gaatcaaata    360
gggctggtgg cgcagtcccc acttgaccaa tttgagattg tcccattgat tcctatgaat    420
atcggaaact tctatttctc attcacaaat ccatctttgt tcatgctgct aactctgagt    480
tttttcctac ttctgattca ttttattact aaaaagggga ggaggaaact tagtcccaaa    540
tgcttggcaa tccttggtag agcttcttta tgatttcgtg ctgaacctgg taaaggaaca    600
aattttaaga ttttgaaata aattgaattt caagacagtt agtctaatca accaagctag    660
accatggttg aggccggtta                                                680
<210>12
<211>225
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>orf225
<400>12
atgaatcaaa tagggctggt ggcgcagtcc ccacttgacc aatttgagat tgtcccattg    60
attcctatga atatcggaaa cttctatttc tcattcacaa atccatcttt gttcatgctg    120
ctaactctga gttttttcct acttctgatt cattttatta ctaaaaaggg gaggaggaaa    180
cttagtccca aatgcttggc aatccttggt agagcttctt tatga                    225
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物13
<400>13
gtacaaagtt cagcctttaa ggaggc    26
<210>14
<211>1540
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>D-CGMS萝卜的新型atp6
<400>14
ggagtgatct ttctcgaaat gaattaagta agggcgctat gttcagattc tgaaccaaag    60
cactagttga ggtctgaaag ccttatgagc agaagtaata aatacctcgg ggaagaagcg    120
gggtagagga attggtcaac tcatcaggct catgacctga agattacagg ttcgaatcct    180
gtccccgcac taagtaaggg tttcattctg catcactctc cccgtcgttc tcgacctcgc    240
aaggtttttg aagcggccga agcgggaagt gacaataccg cttttcttca gcacattttg    300
gatgatttga gcgaaaacgg agtacaaagt tcagccttta aggaggctat gaatcaaata    360
gggctggtgg cgcagtcccc acttgaccaa tttgagattg tcccattgat tcctatgaat    420
atcggaaact tctatttctc attcacaaat ccatctttgt tcatgctgct aactctgagt    480
tttttcctac ttctgattca ttttattact aaaaagggga ggaggaaact tagtcccaaa    540
tgcttggcaa tccttggtag agcttcttta tgatttcgtg ctgaacctgg taaaggaaca    600
aattttaaga ttttgaaata aattgaattt caagacagtt agtctaatca accaagctag    660
accatggttg aggccggtta ttagtttcta ttgcaaggtt tttgcactat tggaaatgta    720
taatttaagt gcatttcttt aataaagaaa aagaaaaccc acaaattgta tttataactt    780
cggtcagagg tcacaccaaa tggctaatta ttttggacaa aaagagaaac ataatcagtc    840
agagctacac atagagtagt tgtgtcaagc tactttattt aatgatcttc ttcttgtatt    900
ctcgtcttcc tccatcataa tcacatcata gatattggtg ccaatgaaaa gagtaaagat    960
catagaagga agtccaaaat agagtgaggg ctaaagcagt agagattgcg tcagcattcc    1020
tattgcaaca ggtccagtca aagaggcggc ccattatctt ttcttcttcg ttaaatacaa    1080
ttatttctgt aaaaaaatct ttgataacca gttggttaat tcttatttct aaatggtgcc    1140
ggtgaaaaag catcgaggtt attttacgat tagtgaacct gaactgacat tggttcacct    1200
ttgtaagcca gtttattatg tttactgttc cccatgatcg catcaaatgt taaaaatggt    1260
tacatttgtg caaaattcaa ccacaatttt accccaaaaa agggaaaaga aaatcaacca    1320
cagcgtagcc tccgcagtgc acagacttgt gtttcaagtt tgaaccacaa aatagttttg    1380
actagatatt cttgttctat ccctaaaaac agactaagaa actttttgaa tgatgtactt    1440
ttctggtagt atgtaggtgc ctaggtggtg actcggtact ataatatgcc atagcaaagt    1500
catcgatcaa tatataccca tcgaacgtat ggtttgtatt    1540
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物15
<400>15
atacctcggg gaagaagcgg ggt       23
<210>16
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物16
<400>16
tagccatttg gtgtgacctc tgaccg    26
<210>17
<211>267
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>orf267
<400>17
atgaatcaaa tagggctggt ggcgcagtcc ccacttgacc aatttgagat tgtcccattg    60
attcctatga atatcggaaa cttctatttc tcattcacaa atccatcttt gttcatgctg    120
ctaactctga gttttttcct acttctgatt cattttatta ctaaaaaggg aggaggaaac    180
ttagtcccaa atgcttggca atccttggta gagcttcttt atgatttcgt gctgaacctg    240
gtaaaggaac aaattttaag attttga                                        267