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1、10申请公布号CN102352311A43申请公布日20120215CN102352311ACN102352311A21申请号201110171865022申请日20110624C12M1/34200601C12Q1/68200601C12Q1/56200601C12Q1/28200601G01N27/2620060171申请人湖南师范大学地址410081湖南省长沙市麓山路36号72发明人张友玉赵洁曾跃刘美玲54发明名称基于适体金纳米酶复合物的凝血酶电化学传感器检测法57摘要本发明涉及基于适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶复合物信号放大的电化学适配体传感器检测凝血酶的方法，属于分析化学技术领域。凝。
2、血酶的适配体I固定在金包磁性纳米粒子上作为捕获探针，适配体II用金纳米粒子和辣根过氧化物酶双标记形成适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶复合物作为检测探针。二者与凝血酶结合形成金包磁性纳米粒子适配体I/凝血酶/适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶三明治结构。将三明治结构固定到电极表面，通过酶的催化反应来检测凝血酶。本方法操作简单，响应快，灵敏度高，特异性强，对于凝血酶的检出限为30FMOLL1，线性范围为0160PMOLL1。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书4页附图2页CN102352318A1/2页21首先参考文献LYON，JL，FLEMING，DA。
3、，STONE，MB，ETALSYNTHESISOFFEOXIDECORE/AUSHELLNANOPARTICLESBYITERATIVEHYDROXYLAMINESEEDINGNANOLETTERS，2004，44719723的方法合成金包磁性纳米粒子，然后将凝血酶适配体I捕获探针此适配体I的序列为5SHCH26GGTTGGTGTGGTTGG固定在金包磁性纳米粒子上。具体做法是取50L金包磁性纳米粒子悬浮液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液PH74，包含100MMOLL1氯化钠，5MMOLL1氯化钾，1MMOLL1氯化镁，5MMOLL1氯化钙洗三次，再重新分散到495L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶。
4、液中超声30MIN。5L巯基修饰的适配体I100MOLL1加入到其中，室温下温和搅拌2H。磁性分离，再用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗三次，除去未反应的适配体I。然后将固定有适配体I的金包磁性纳米粒子分散到500L1MMOLL1的6巯基己醇中封闭40MIN，磁性分离用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗三次后得到的纳米粒子分散到500L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，保存于4低温下。2首先参考文献STORHOFF，JJ，ELGHANIAN，R，MUCIC，RC，ETALONEPOTCOLORIMETRICDIFFERENTIATIONOFPOLYNUCLEOTIDESWITHSINGLEBASEIM。
5、PERFECTIONSUSINGGOLDNANOPARTICLEPROBESJOURNALOFTHEAMERICANCHEMICALSOCIETY，1998，120919591964的方法合成金纳米粒子，然后用该金纳米粒子进一步制备适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶检测探针此适配体II的序列为5SHCH26T20AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT。具体做法是首先，将5L100MOLL1带巯基的适配体II溶解于500L的5倍浓度的金纳米粒子溶液中，4下静置24H，使适配体II中巯基与金纳米粒子充分自组装。然后，将适配体II探针标记的金纳米粒子溶液在12000转速离心分离20M。
6、IN，离心分离后弃去上层清液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗涤沉淀并重新分散到三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，再离心分离，以除去未反应的过量适配体II，所制得的适配体II探针标记的金纳米粒子再次分散到1ML三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，向其中加入50L辣根过氧化物酶1MGML1反应1H，再将混合物12000转离心分离15MIN，取出上层清液，红色沉淀用包含2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗涤，再离心分离，以除去未反应的辣根过氧化物酶，所得的适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶复合物分散到包含2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，保存于4低温下。3凝血酶传感器的构建取30。
7、L固定有适配体I的金包磁性纳米粒子悬浮液于离心管中，各加入50L不同浓度的凝血酶溶液，再加入20L适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶探针溶液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液调整到200L，在4下培育反应30MIN。凝血酶蛋白与适配体I和适配体II特异性结合形成金包磁性纳米粒子适配体I/凝血酶/适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶三明治结构。然后，磁性分离沉淀，用200L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗涤三次，以除去未与凝血酶结合的适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶探针，再分散到100L含有2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中。4电化学检测取30L金包磁性纳米粒子适配体I/凝血酶/适配体I。
8、I金纳米粒子辣根过氧化物酶三明治结构的悬浮液滴到处理好的金电极表面，电极后面置放磁铁以将三明治结构的磁性复合物固定到金电极上，再将其插入到对苯二酚2MMOLL1权利要求书CN102352311ACN102352318A2/2页3和双氧水15MMOLL1的底物溶液中，插入参比电极和对电极。5MIN后采用差示脉冲伏安法扫描电位范围01V03VVSSCE，振幅005V，脉冲宽度005S。权利要求书CN102352311ACN102352318A1/4页4基于适体金纳米酶复合物的凝血酶电化学传感器检测法技术领域0001本发明涉及基于适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的方法，属。
9、于分析化学领域。背景技术0002近年来，蛋白质的检测在疾病诊断、基础研究等诸多生物领域引起了广泛关注。在众多蛋白质检测中，传统的技术都是通过抗体来识别蛋白质的。然而，以适配体为识别元件的新型识别技术正在不断地发展研究中。适配体，是一类通过指数富集配基系统进技术筛选得到的具有3D结构的特殊序列的寡聚核苷酸片段，可以是RNA，也可以是DNA。目前，用该技术所筛选出的适配体能特异性识别不同的目标物，主要包括离子、有机小分子、缩氨酸、蛋白质以及完整的细胞等。与抗体相比，适配体具有化学稳定性好、易于化学修饰、高度亲和力和易储存等优点。基于适配体技术检测蛋白质的方法已经研究了很多，如比色法，荧光法，石英晶。
10、体微天平，化学发光，SPR，试剂条和电化学检测等。在这些技术中，电化学方法由于它的灵敏度高，仪器简单，成本低，响应快，可携带以及便宜等特点而备受关注。0003临床检测中，病人体内的关键蛋白质的浓度往往很低，为实现蛋白质的超灵敏检测，发展新的具有信号放大作用的检测方法很有必要。目前，电化学适配体传感器中有很多基于标记的方法而使信号放大。1电活性物质直接标记在生物分子上作为电化学标签来放大电化学响应如二茂铁、亚甲基蓝。2纳米材料也可用作电活性物质标记来放大生物分子的检测信号包括金属纳米粒子和半导体纳米晶等。3酶作为电活性标记，通过酶的催化反应来放大信号。然而，在正常情况下，血液中不存在凝血酶，但当。
11、在血液凝固过程中凝血酶的浓度能达到低微摩尔，故在止血初期产生的低水平的凝血酶低至纳摩尔在整个过程中都起着非常重要的作用。而上述所介绍的蛋白质检测方法的灵敏度都还未达到纳摩尔和皮摩尔水平。因此，迫切需要满足生物分子电化学检测的高灵敏度的新方案。0004目前，电活性和光活性分子标记的纳米粒子已成功用于提高生物分析的灵敏度，在这些纳米材料中，金纳米粒子由于具有极好的电子传递能力，大的比表面积以及对生物分子有强的吸附能力，同时具有良好的生物相容性，而受到广泛的关注。很多光或电活性分子如二茂铁、亚甲基蓝和酶能够固定在金纳米粒子上从而起到信号放大的作用。另外，磁性纳米粒子在生物分析领域也有广泛的应用。如金。
12、包FE3O4磁性纳米粒子它既可以用作固相载体，体系分离，也可以富集样品，为构造灵敏的传感器提供了前景。另外，它可以通过外部的磁场被固定在电极表面，能够很大程度地简化分析过程。发明内容0005基于金纳米粒子具有大的比表面积、强的吸附能力和很好的生物相容性以及辣根过氧化物酶良好的催化性能，本发明提供了一种基于适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的方法。说明书CN102352311ACN102352318A2/4页50006本发明的目的是提供基于适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的方法。该方法可用于凝血酶的灵敏、特异性检测，从01NMOLL1到60P。
13、MOLL1浓度范围内对凝血酶检测呈现良好的线性响应，检测限为30FMOLL1。0007图1为基于适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的示意图。从图1可知，适配体I固定在磁性纳米粒子上作为捕获探针，金纳米粒子作为载体负载大量的辣根过氧化物酶及固定适配体IIA。当凝血酶存在时，两段适配体与凝血酶结合形成三明治结构复合物；通过磁性分离将得到的三明治结构复合物富集至电极表面，用差分脉冲伏安法检测电极表面辣根过氧化物酶的催化信号，可对凝血酶进行灵敏检测B。相反，当不存在凝血酶时，适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶复合物就不会连接到磁性纳米粒子上，从而不能被分离，故不会产生电化学信号。。
14、这样，根据电化学信号实现对凝血酶的高灵敏检测。0008利用电化学技术检测凝血酶的步骤如下00091参考文献方法合成金包磁性纳米粒子并固定凝血酶适配体I捕获探针。此适配体I的序列为5SHCH26GGTTGGTGTGGTTGG。取50L金包磁性纳米粒子悬浮液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液PH74，包含100MMOLL1氯化钠，5MMOLL1氯化钾，1MMOLL1氯化镁，5MMOLL1氯化钙洗三次，再重新分散到495L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中超声30MIN。5L巯基修饰的适配体I100MOLL1加入到其中，室温下温和搅拌2H。磁性分离，再用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗三次，除去未反应的适配。
15、体I。然后将固定有适配体I的金包磁性纳米粒子分散到500L1MMOLL1的6巯基己醇中封闭40MIN，磁性分离用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗三次后得到的纳米粒子分散到500L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，保存于4低温下。00102参考文献方法合成金纳米粒子并制备适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶检测探针。此适配体II的序列为5SHCH26T20AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT。首先，将5L100MOLL1带巯基的适配体II溶解于500L的5倍浓度的金纳米粒子溶液中，4下静置24H，使适配体II中巯基与金纳米粒子充分自组装。然后，将适配体II探针标记的金纳米粒子溶液在1。
16、2000转速离心分离20MIN，离心分离后弃去上层清液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗涤沉淀并重新分散到三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，再离心分离，以除去未反应的过量适配体II，所制得的适配体II探针标记的金纳米粒子再次分散到1ML三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，向其中加入50L辣根过氧化物酶1MGML1反应1H，再将混合物12000转离心分离15MIN，取出上层清液，红色沉淀用包含2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗涤，再离心分离，以除去未反应的辣根过氧化物酶，所得的适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶复合物分散到包含2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，保存于4低温下。。
17、00113取30L固定有适配体I的金包磁性纳米粒子悬浮液于离心管中，各加入50L不同浓度的凝血酶溶液，再加入20L适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶探针溶液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液调整到200L，在4下培育反应30MIN。凝血酶蛋白与适配体I和适配体II特异性结合形成金包磁性纳米粒子适配体I/凝血酶/适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶三明治结构。然后，磁性分离沉淀，用200L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗涤三次，以除去未与凝血酶结合的适配体II金纳米说明书CN102352311ACN102352318A3/4页6粒子辣根过氧化物酶探针，再分散到100L含有2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲。
18、烷盐酸缓冲溶液中。00124取30L金包磁性纳米粒子适配体I/凝血酶/适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶三明治结构的悬浮液滴到处理好的金电极表面，电极后面置放磁铁以将三明治结构的磁性复合物固定到金电极上，再将其插入到对苯二酚2MMOLL1和双氧水15MMOLL1的底物溶液中，插入参比电极和对电极。5MIN后采用差示脉冲伏安法扫描电位范围01V03VVSSCE，振幅005V，脉冲宽度005S。0013利用本发明的电化学方法对凝血酶检测的表征如图2所示。0014从图2数据可以看出，本发明提供的方法对凝血酶有很好的电化学响应，该方法对凝血酶的检出限为30FMOLL1，线性范围为01NMOLL1到60。
19、PMOLL1。0015为考察该方法的特异性，按步骤如下进行了对比试验0016同样的实验条件下用四种其他蛋白质人血清蛋白、溶菌酶、纤维原蛋白、免疫球蛋白G来替代凝血酶作用后测定它的电化学响应，以及四种蛋白质分别与凝血酶共存时的电化学响应。0017利用本发明的电化学方法对凝血酶检测的特异性如图3所示。0018从图3数据可以看出，其它蛋白对该方法检测凝血酶没有干扰，这证明该方法对凝血酶检测有好的特异性。0019本发明的有益效果0020本发明利用金纳米粒子和辣根过氧化物酶，实现了信号放大。该方法具有如下优势1金纳米粒子具有大的比表面积、强的吸附生物分子的性能和很好的生物相容性，可以吸附大量的信号分子辣。
20、根过氧化物酶并保持其高活性；2磁性纳米粒子作为载体既有好的分离效果，又有富集作用；3电化学方法具有快速、便捷、灵敏等优势。附图说明0021图1为利用适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶信号放大的电化学技术测定凝血酶的示意图。0022图2为电流与凝血酶浓度的关系图。凝血酶的浓度从A到J依次为0，01，1，5，15，20，25，30，40，60PMOLL1，底物溶液为包含2MMOLL1对苯二酚、15MMOLL1双氧水和01MOLL1PH70的磷酸盐缓冲溶液。0023图3为该传感器的特异性图。A，B，C，D，E分别为1MOLL1人血清蛋白、1MOLL1溶菌酶、1MOLL1纤维原蛋白、1MOLL1IGG、2。
21、0PMOLL1凝血酶，灰色为这些蛋白单纯存在时的电流响应，黑色代表这些蛋白分别与凝血酶共存时的电流响应。具体实施方式0024实施例10025利用基于适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶复合物信号放大的电化学方法检测凝血酶的步骤如下00261合成金包磁性纳米粒子并固定凝血酶适配体I捕获探针此适配体I的序列为5SHCH26GGTTGGTGTGGTTGG。取50L金包磁性纳米粒子悬浮液，用三羟甲基氨说明书CN102352311ACN102352318A4/4页7基甲烷盐酸缓冲溶液PH74，包含100MMOLL1氯化钠，5MMOLL1氯化钾，1MMOLL1氯化镁，5MMOLL1氯化钙洗三次，再重新分散到49。
22、5L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中超声30MIN。5L巯基修饰的适配体I100MOLL1加入到其中，室温下温和搅拌2H。磁性分离，再用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗三次，除去未反应的适配体I。然后将固定有适配体I的金包磁性纳米粒子分散到500L1MMOLL1的6巯基己醇中封闭40MIN，磁性分离用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗三次后得到的纳米粒子分散到500L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，保存于4低温下。00272合成金纳米粒子并制备适配体金纳米粒子辣根过氧化物酶检测探针此适配体II的序列为5SHCH26T20AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT。首先，将5L100MO。
23、LL1带巯基的适配体II溶解于500L的5倍浓度的金纳米粒子溶液中，4下静置24H，使适配体II中巯基与金纳米粒子充分自组装。然后，将适配体II探针标记的金纳米粒子溶液在12000转速离心分离20MIN，离心分离后弃去上层清液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗涤沉淀并重新分散到三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，再离心分离，以除去未反应的过量适配体II，所制得的适配体II探针标记的金纳米粒子再次分散到1ML三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，向其中加入50L辣根过氧化物酶1MGML1反应1H，再将混合物12000转离心分离15MIN，取出上层清液，红色沉淀用包含2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲。
24、溶液洗涤，再离心分离，以除去未反应的辣根过氧化物酶，所得的适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶复合物分散到包含2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中，保存于4低温下。00283取30L固定有适配体I的金包磁性纳米粒子悬浮液于离心管中，各加入50L不同浓度的凝血酶溶液，再加入20L适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶探针溶液，用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液调整到200L，在4下培育反应30MIN。凝血酶蛋白与适配体I和适配体II特异性结合形成金包磁性纳米粒子适配体I/凝血酶/适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶三明治结构。然后，磁性分离沉淀，用200L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液洗涤三次，以除。
25、去未与凝血酶结合的适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶探针，再分散到100L含有2牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液中。00294取30L金包磁性纳米粒子适配体I/凝血酶/适配体II金纳米粒子辣根过氧化物酶三明治结构的悬浮液滴到处理好的金电极表面，电极后面置放磁铁以将三明治结构的磁性复合物固定到金电极上，再将其插入到对苯二酚2MMOLL1和双氧水15MMOLL1的底物溶液中，插入参比电极和对电极。5MIN后采用差示脉冲伏安法扫描电位范围01V03VVSSCE，振幅005V，脉冲宽度005S。0030实施例20031同样的实验条件下用四种其他蛋白质人血清蛋白、溶菌酶、纤维原蛋白、免疫球G来替代凝血酶作用后测定它的电化学响应，以及四种蛋白质分别与凝血酶共存时的电化学响应。说明书CN102352311ACN102352318A1/2页8图1图2说明书附图CN102352311ACN102352318A2/2页9图3说明书附图CN102352311A。