一株 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸高产菌株的筛选方法及该菌株的 发酵方法 【技术领域】
本发明涉及一株 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸高产菌株的筛选方法， 以及用该菌株发酵生 产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸的方法。背景技术
2- 酮基 -D- 葡萄糖酸 (2-keto-D-gluconic acid， 2KGA)， 是目前大规模生产的有 机酸之一， 主要用于食品抗氧化剂 D- 异抗坏血酸钠 (sodium erthorbate， EN) 以及 D- 异抗 坏血酸 (erythorbic acid， EA) 的合成， D- 异抗坏血酸又称异维生素 C， 在食品工业上被广 泛用为食品抗氧化剂。2KGA 的生产方法主要有酶法、 化学合成法、 发酵法 3 种， 目前工业中 主要采用细菌发酵法生产。
国内外 2KGA 发酵通常采用假单胞菌属 (Pseudomonas) 的细菌， 尤其是荧光假单 胞菌 (Pseudomonas fluorescens)。通常以淀粉水解糖作为碳源， 玉米浆作为氮源， 控制 pH6.0-7.0。在较高的溶氧条件下， 添加 18％左右的葡萄糖， 温度维持在 28-30℃， 葡萄糖转 化率在 80％以上， 发酵周期 60h 左右。由于该发酵是一个产酸过程， 需要在培养基中添加 3-5％的 CaCO3， 也可以用 NaOH、 氨气、 氨水代替 CaCO3。而将沙雷氏菌作为发酵菌种在国内 很少有见报道。
国内目前生产 2KGA 主要采用分批发酵， 初始葡萄糖浓度一般不超过 18％， 因为葡 萄糖浓度过高， 发酵周期将延长， 转化率也降低。有关补料发酵生产 2KGA 的工艺也有报道， 用氨水代替 CaCO3， 可以将葡萄糖的浓度提高到 30％左右。
同时我国国内发酵生产 2KGA 也存在一些问题 ： 噬菌体污染严重 ； 发酵周期偏长 ； 发酵生产效率不高， 能源消耗高于国外同类型企业。 发明内容 本发明提供一株 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸高生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵生 产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸， 发酵周期比文献报道缩短 12h 左右， 显著提高了生产强度。
本发明的技术方案 ：
1、 一种产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选方法 ：
1) 沙雷氏菌的初步分离纯化
在江南大学食品与科学国家重点实验室附近采集土样， 称取约 0.2g 土壤于 20ml 0.85％无菌生理盐水中， 振荡混匀之后将菌悬液涂布至 5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基 上 30℃培养 36h， 将产紫红色素的菌落作为进一步筛选的疑似菌株， 编号保存 ；
2) 产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选
将上述分离纯化得到的菌种接种于 5 ％葡萄糖的牛肉膏蛋白胨培养基中， 培 养 36h 后离心收集发酵液， 发酵液采用内标法经高效液相色谱进行定性分析， 使得 2- 酮 基 -D- 葡萄糖酸钙标准品峰高增高的菌株即为产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸的沙雷氏菌。
2、 根据权利要求 1 所述一种产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸沙雷氏菌的筛选方法， 其筛选 得到产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸的沙雷氏菌的鉴定方法如下 ：
1) 形态学鉴定
菌落形态、 细胞形态、 革兰氏染色 ；
2) 生理生化鉴定 ( 见表 1)
3)16S rDNA 分子生物学鉴定
用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组 DNA， 采用通用引物进行 PCR 扩增， 扩增 产物用胶回收试剂盒回收纯化， 并连接至克隆载体 pMD 18T Vector， 转化到大肠杆菌 JM109 中， 利用克隆载体的青霉素抗性筛选到阳性转化子， 并用通用引物对转化子进行质粒 PCR 鉴定。
阳性克隆测序所得 16S rDNA 序列与 GenBank 数据库中的核苷酸序列进行同源性 分析， 得到与之亲缘关系最近的菌种 Serratia sp， 同源性达 99％。
通过形态学、 生理生化及 16S rDNA 分子生物学鉴定确定该菌株为沙雷氏菌， 并命 名为 Serratia sp.FMME043。
3、 本发明公开的一种 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸的高产菌种， 其特征是采用 Serratia sp.FMME043 为出发菌株， 以种子培养和液体发酵生产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸 ； 1) 种子培养 ：
种子培养基以 g/L 计 ： 牛肉浸取物 3， 蛋白胨 5， NaCl 5， 初始 PH 6.8-7.2 ；
培养条件 ： 温度 30℃、 摇床转速 200rpm 条件下， 培养 11-12h ；
2) 液体发酵培养 ：
发酵培养基以 g/L 计 ： 葡萄糖 140-200， (NH4)2SO4 1.93， Na2SO4 0.5， MgSO4·7H2O 0.8， KH2PO4 0.1-0.5， MnCl2·4H2O 0.036， FeSO4·7H2O 0.036， PH6.8-7.2 ；
发酵条件 ： 接种量 10％， 温度 30℃、 摇床转速 200 条件下， 发酵 24-36h。
4、 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸产量的测定
取发酵液 8000rpm 离心 10min， 收集上清液并稀释适当倍数， 并以 2- 酮基 -D- 葡萄 糖酸钙作为标准品， 配制 1、 2.5、 5、 7.5、 10g/L 的标准溶液。 将上清液与标准溶液经 0.22μm 微孔滤膜过滤后， 用高效液相色谱法测定 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸的含量。
色谱条件 ：
高效液相色谱仪 ： Agilent 1200system ；
色谱柱 ： BioRad 公司 Aminex HPX-87H ；
流动相 ： 0.5mmol/L 稀硫酸用 0.45μm 滤膜过滤 ；
柱温 ： 35℃ ；
检测器 ： 示差检测器 (RID) ；
进样量 ： 10μl
流速 ： 0.5ml/min。
标 准 曲 线 在 1-10g/L 之 间 呈 现 良 好 的 线 性 关 系 ( 图 1)， 回归方程： y＝ 2 8.604x-1.2627， R ＝ 0.9991。
附图说明图 1 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸钙标准曲线。 图 2 色谱检测结果， 10g/L 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸钙标样。 图 3 色谱检测结果， 24h 发酵液 ( 稀释 10 倍 )。具体实施方式
以下是沙雷氏菌 (Serratia sp.FMME043) 筛选、 鉴定及发酵生产 2- 酮基 -D- 葡萄 糖酸的实施例。
实施例 1
称取约 0.2g 土壤于 20ml 0.85％无菌生理盐水中， 振荡混匀之后将菌悬液涂布至 5％盐浓度的牛肉膏蛋白胨培养基上 30℃培养 24h， 将产紫红色素的菌落接种至发酵培养 基中进行复筛， 30℃培养 24h 后离心收集发酵液， 发酵液经高效液相方法中的内标法进行 分析， 用 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸钙标准品作内标， 使 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸钙准品峰高增高的 菌株即为产 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸菌株。
实施例 2
对筛选的菌株按 《微生物分类学》 进行形态特征鉴定， 该菌株为短杆状， 革兰氏阴 性菌， 无芽孢， 周生鞭毛， 能运动。菌落呈圆形， 边缘光滑， 表面湿润， 微凸起， 产生紫红色色 素， 有恶臭味。生理生化特性 ( 见表 1)， 并按细菌基因组提取试剂盒提取方法提取基因组 DNA， 以 P1 和 P2 为正向和反向引物 ：
P1 ： 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ，
P2 ： 5’ -GGCTACCTTGTTACGACTT-3’ 。
用 PCR 扩增 16S rDNA 基因， 委托华大基因研究中心进行 16S rDNA 测序， 得到本菌 株部分 16S rDNA 序列 (GenBank 登录号 ： JF794580) 后， 在 NCBI 网站上用 BLAST 检索工具 进行同源性比对分析。基于 16S rDNA 序列分析和生理生化特性鉴定， 结合对该菌的生长和 发酵特性研究， 认为是沙雷氏菌， 命名为 Serratia sp.FMME043。
表 1 菌株 (FMME043) 生理生化鉴定结果
注： 表中 “+” 代表阳性， “-” 代表阴性。
实施例 3
菌株保藏于终浓度为 15 ％的甘油管中， 取 200μl 保藏菌液接入 50ml 5 ％盐浓 度的牛肉膏蛋白胨培养基上 30 ℃培养 12h， 以 10 ％的接种量接入装有 70ml 发酵培养基 的 750mL 二刺三角瓶进行发酵培养。发酵培养基见权利要求 2， 初始葡萄糖为 140g/L。在 30℃， 200rpm 条件下发酵 24h， 用 HPLC 测定发酵液中的 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸的含量。产量 为 119.7g/L， 产率 0.84g/g， 生产强度 3.74g/(L·h)。
实施例 4
菌株保藏于终浓度为 15 ％的甘油管中， 取 200μl 保藏菌液接入 50ml 5 ％盐浓 度的牛肉膏蛋白胨培养基上 30 ℃培养 12h， 以 10 ％的接种量接入装有 70ml 发酵培养基
的 750mL 二刺三角瓶进行发酵培养。发酵培养基见权利要求 2， 初始葡萄糖为 200g/L。在 30℃， 200rpm 条件下发酵 36h， 用 HPLC 测定发酵液中的 2- 酮基 -D- 葡萄糖酸的含量。产量 为 181.2g/L， 产率 0.90g/g， 生产强度 5.03g/(L·h)。