一种评价 HER2 靶位治疗药物及手段的体外检测方法 技术领域 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种评价 HER2 靶位治疗药物及手段的 体外检测方法。
背景技术 乳腺癌具有高发病率和高致命性， 是女性最常见的恶性肿瘤之一。 世界范围内， 每 年约有超过 1200 万的女性被确诊患有乳腺癌， 严重影响着女性的健康生活。目前治疗乳腺 癌仍主要依赖放疗和化疗， 毒副作用较大， 并且特异性差， 易产生并发症状。随着乳腺癌发 病理论研究的不断深入， 研究人员发现乳腺癌其实是某些与细胞增殖相关的原癌基因发生 突变所导致的一种复杂分子疾病。而人表皮生长因子受体 2(HER2) 则是公认的与乳腺癌发 病密切相关的原癌基因之一。研究表明， 约 25％ -30％乳腺癌患者的癌细胞存在 HER2 的过 度表达， 而它的过量表达能够不断与人表皮生长因子受体家族的其他成员如 HER1， HER3 形 成异源二聚体， 通过磷酸化作用激活各种下游信号转导途径如 MAPK， P13K/AKT/mTOR 等， 从 而引起一系列的细胞反应包括促血管生成， 抗凋亡， 促细胞生长等， 使癌细胞一直处于失控 的持续增殖状态之中。基于此， HER2 是研究治疗和诊断乳腺癌的一个最重要的靶分子， 而 围绕该靶分子所开发出的包括单克隆抗体， 激酶抑制剂， 反义寡核苷酸等生物治疗药物及 手段也因其高效， 特异性强和毒副作用较小等特点迅速引起了研究人员的高度重视和大量 投入。此外， HER2 的高表达在宫颈癌细胞中同样存在， 因此该靶点也是研究治疗和诊断宫 颈癌的重要突破口之一。
在生物治疗药物及手段的开发过程中， 为了便于大量具有生物活性治疗药物及手 段的筛选， 研究人员需要通过一种快速， 高效的检测手段能够准确的评价候选治疗药物及 手段的生物活性， 效果及其稳定性。 这种方法必须满足下列几个条件 ： 首先该法最好是体外 实验， 基于细胞水平， 如增殖抑制， ADCC， CDC 等， 或基于酶促反应 ； 其次， 该方法的实验机理 与药物及手段在体内的作用机理应尽可能一致， 通过体外实验能够真实的反应该治疗药物 及手段在体内作用的疗效， 包括在细胞系的选择上也应尽量与真实病患情况接近 ； 第三， 该 法必须通过方法验证， 满足方法专属性， 准确性， 精密度以及耐用性等方面的要求， 如针对 同一样品检测的重复性， 日间差， 人员操作误差等结果的 RSD 应该满足小于 10％。 在此基础 上， 才能保证生物活性检测结果的可靠， 并用于指导治疗药物及手段筛选工作。最后， 在相 同的实验条件下， 该方法越简单， 操作步骤越少越好， 因为这样的方法更加灵活， 更有利于 推广， 并且适用于高通量工作。
以基于靶分子 HER2 进行生物治疗药物及手段研发为例， 关于该原癌基因的作用 机制已经逐渐阐明。乳腺癌细胞过量表达 HER2， 随之通过一系列级联反应， 并最终处于失 控的持续增殖状态中。根据实验设计作用机理一致性原则， 研究人员通常利用该治疗药物 及手段对高表达 HER2 细胞的体外增殖抑制作用来评价其生物活性及效果。常用的高表达 HER2 的细胞系主要是人乳腺腺癌细胞 SK-BR-3 和人乳腺导管癌细胞 BT-474。 然而到目前为 止， 从文献报道来看， 该增殖抑制的细胞学活性方法并未得到公认或标准化， 例如细胞系的
选择， 细胞铺板密度， 治疗药物及手段作用时间， 显色时间以及显色方式等都各不相同。更 重要的是， 在已经报道的增殖抑制活性方法中， 也缺乏对检测体系专属性， 准确性， 重复性 等方面的相关评价， 包括对实验结果的评价方式也存在不同， 难以保证检测结果的稳定性 与可靠性。 发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上存在的问题与不足， 提供一种在评价 HER2 靶位治疗药物及手段过程中， 对具有生物活性治疗药物及手段进行筛选以及稳定性评价的 细胞增殖抑制生物活性检测方法。 该方法能够满足方法验证过程中对专属性， 准确性， 精密 度包括重复性， 日间差， 人员操作误差， 以及耐用性等方面的要求， 能够对大量生物活性治 疗药物及手段进行快速， 准确， 高通量的筛选， 满足治疗药物及手段在研发过程中的需求。 。
为此， 本发明公开了一种评价 HER2 靶位治疗药物及手段的体外检测方法， 包括下 列步骤 ：
a 取对数生长期表达 HER2 的细胞经酶消化后， 用完全培养基制成细胞悬液， 计数 5 并计算细胞密度及活率， 调整至合适的活细胞密度为 n×10 个 /ml， n ＝ 1-3， 将细胞悬液等 体积加入细胞培养板孔中， 同时设立空白对照孔， 空白对照孔被加入等体积完全培养基， 然 后将细胞培养板置于 37℃、 5％二氧化碳培养箱中培养过夜 ； b 取对照品及待测样品， 用完全培养基进行系列梯度稀释， 得到系列稀释浓度的 对照品及待测样品 ；
c 取步骤 a 的细胞培养板， 除去上清。
d 将系列稀释浓度的对照品及待测样品依次等体积加入步骤 a 所述细胞培养板 不同孔中， 空白对照孔则加入等体积完全培养基， 然后将细胞培养板放置于 37℃、 5％二氧 化碳培养箱中培养 72-74h ；
e 采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应 ；
f 显色反应完成后， 测定显色反应的结果， 并根据测定结果计算待测样品的细胞 增殖抑制生物活性。
本发明术语 “对照品” 是指已公知其对表达 HER2 的细胞表现出细胞增殖抑制作用 活性的化合物或组合物。
在一些实施例中， 所述及 HER2 靶位治疗药物是单克隆抗体、 激酶抑制剂、 反义寡 核苷酸、 化合物、 中药提取物或中药复方提取物中之一或它们的任何组合， 其中优选为单克 隆抗体。
在一些实施例中， 所述对数生长期表达 HER2 的细胞是人乳腺腺癌细胞 SK-BR-3 或 人乳腺导管癌细胞 BT-474， 其中优选人乳腺导管癌细胞 BT-474。BT-474 细胞相对 SK-BR-3 细胞而言， 对针对 HER2 的单克隆抗体治疗药物及手段更加敏感， 治疗药物及手段对其细胞 增殖抑制作用更强， 这有利于扩大方法对不同活性治疗药物及手段的筛选范围。
在一些实施例中， 所述完全培养基是含 10％ FBS 的 RPMI1640 完全培养基 ；
在一些实施例中， 所述系列梯度稀释是 2 倍系列梯度稀释。
在一些实施例中， 在步骤 e 中， 所述检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑 类化合物氧化还原检测体系、 ATP 总量检测体系或 LDH 释放量检测体系等。
在一些实施例中， 所述四唑类化合物为 MTT、 MTS、 CCK-8， 其中优选为 CCK-8。相对 于其他四唑类化合物如 MTT， MTS 而言， CCK-8 所形成的还原显色物质可直接溶于水相， 无需 添加 DMSO 助溶， 因此使用更加方便， 检测灵敏度也较高。
在一些实施例中， 所述细胞培养板为 96 孔细胞培养板， 以便于高通量地进行药物 评价。
本发明能够快速， 准确， 高效的对针对 HER2 靶位治疗药物及手段的细胞增殖抑制 生物活性进行检测。 该方法专属性好， 特异性强， 准确性高， 测定活性范围达到 50％ -150％； 精密度高， 重复性， 日间差以及人员操作误差 RSD 均小于 10 ％， 并且双复孔的 CV ％小于 2 10％， 4 参数拟合的拟合常数 R 均大于 0.98。此外， 本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁 琐的操作， 便于推广以及高通量操作， 完全能够满足其在进行具有针对 HER2 靶位， 抑制肿 瘤细胞生长， 具有生物活性治疗药物及手段的筛选及其稳定性评价的需要。 附图说明
图 1Herceptin 及参考品 4 参数拟合图。
图 2 参考品及 Avastin4 参数拟合图。
图 3 细胞铺板后直接加药条件下 Herceptin 及参考品 4 参数拟合图。
图 4 加药后细胞孵育 24h 条件下 Herceptin 及参考品 4 参数拟合图。
图 5 加药后细胞孵育 48h 条件下 Herceptin 及参考品 4 参数拟合图。
图 6 加药后细胞孵育 96h 条件下 Herceptin 及参考品 4 参数拟合图。
图 7MTT 显色条件下 Herceptin 及参考品 4 参数拟合图。
图 8AlamarBlue 显色条件下 Herceptin 及参考品 4 参数拟合图。 具体实施方式
以下结合具体实施例， 进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
一、 材料和试剂
材料 ： 针对 HER2 靶位单克隆抗体药物 Herceptin( 产于 Roche， 批号 ： B3403)， 针对 HER2 靶位单克隆抗体药物参考品 ( 嘉和生物药业制备 )， 针对 HER2 靶位单克隆抗体药物待 测样品 ( 嘉和生物药业制备 )， 不针对 HER2 靶位的单克隆抗体药物 Avastin( 产于 Roche， 批号 ： B9005B02)。
试剂 ： 染色液 CCK-8(Dojindo， Cat.No.CK04-20)， RPMI1640 培养基粉末 (GIBCO， Cat.No.31800-022)， 链霉素 / 青霉素双抗 (GIBCO， Cat.No.15070-063)， 胰蛋白酶 (GIBCO， Cat.No.25200-07)， FBS(GIBCO， Cat.No.10099-141)， MTT 粉 末 (Sigma， Cat.No.M2128)， AlamarBlue(Invitrogen， Ca t.No.DAL1100)。
溶液配制 ：
RPMI1640 培养基 ： 取 1000ml 烧杯， 倒入 RPMI 1640 培养基粉末 1 袋， 碳酸氢钠2.0g， 加入约 900ml 超纯水， 避光磁力搅拌直至溶解， 用稀盐酸调 pH 值至 7.00±0.05， 将溶 液倒入量筒， 定容至 1000ml， 经 0.22μm 滤膜无菌过滤即得， 分装后 4℃避光保存。
RPMI1640 完全培养基 ： 量取胎牛血清 (FBS)50ml， 加 RPMI 1640 培养基 445ml， 再 加入链霉素 / 青霉素双抗 5ml， 即得， 4℃避光保存。
细胞株 ： SK-BR-3 细胞株 ( 购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库， 目录 号： TCHu49)， BT-474 细胞株 ( 购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库， 目录号 ： TCHu143)
二、 检测方法步骤
1) 细胞铺板 ： 取对数生长期的 BT-474 细胞经胰蛋白酶消化后用 RPMI1640 完全培 养基制成单细胞悬液。计数， 并计算细胞密度及活率， 调整活细胞密度至 1.0-3.0×105 个 / ml， 以 100μl/ 孔加入 96 孔细胞培养板中。 空白对照孔则以 100μl/ 孔加入 RPMI1640 完全 培养基。完成后将细胞培养板置于 37℃， 5％二氧化碳培养箱中培养 24-26h， 使细胞贴壁。
2) 参考品及待测样品稀释 ： 取对照品及待测样品， 根据标示浓度， 用 RPMI1640 完 全培养基稀释至合适浓度， 在新的 96 孔细胞培养板中做 2 倍系列梯度稀释， 得到 11 个稀释 度。 3) 加样 ： 取贴壁后的细胞培养板， 除去上清。接着将稀释好的系列稀释浓度的 对照品及待测样品以 100μl/ 孔依次加入铺好细胞的细胞培养板中， 空白对照孔则以 100μl/ 孔加入完全培养基， 2-3 复孔。 完成后将细胞培养板放置于 37℃， 5％二氧化碳培养 箱中培养 72-74h。
4) 显色 ： 采用 CCK-8 显色体系分别对细胞培养板中对照品孔， 待测样品孔， 空白对 照孔中以 10μl/ 孔加入 CCK-8。完成后将细胞培养板放置于 37℃， 5％二氧化碳培养箱中 继续孵育 2-4h。
5) 读数 ： 取出细胞培养板混匀， 放入酶标仪， 以 650nm 为参比波长， 在 450nm 下测 定对照品孔， 待测样品孔及空白对照孔的 OD450-650， 记录测定结果。
6) 结果分析 ： 扣除空白对照孔的 OD 值后， 分别用对照品孔和待测样品孔 OD 值与 加药浓度的量效关系进行 4 参数拟合， 确定对照品与待测样品的 EC50 值， 曲线拟合常数 R2， 复孔 CV％。按照下列公式计算待测样品的细胞增殖抑制生物活性 ：
实施例 1 评价 HER2 靶位治疗药物及手段的体外检测方法
以参考品和 Herceptin 为材料， Herceptin 作为对照品， 用 RPMI1640 完全培养基 稀释至合适浓度， 在新的 96 孔细胞培养板中做 2 倍系列梯度稀释， 得到 11 个稀释度， 采用 上述检测方法步骤考察参考品相对 Herceptin 的生物学活性。
结果如图 1 所示， Herceptin 及参考品 4 参数拟合情况良好， 曲线拟合常数 R2 均满 足＞ 0.98， 不同加药稀释浓度下 3 复孔检测 OD 值的 CV％均满足＜ 10％。 通过与 Herceptin EC50 值的比较， 参考品的细胞增殖抑制生物活性为 97％。
实施例 2 专属性评价试验
以 Avastin 和参考品 ( 同实施例 1) 为材料， 用 RPMI1640 完全培养基稀释至合适
浓度， 在新的 96 孔细胞培养板中做 2 倍系列梯度稀释， 得到 11 个稀释度， 采用上述检测方 法步骤检测其增殖抑制活性。
结果如图 2， 将该方法应用于 Avastin 时， 尽管不同加药稀释浓度下 3 复孔检测 OD 值的 CV％均满足＜ 10％， 但无法对结果进行 4 参数拟合， 该药物并不能对高表达 HER2 的人 乳腺导管癌细胞 BT-474 的增殖产生抑制作用。相对的， 参考品的检测结果则能够正常进行 2 4 参数拟合， 同时满足拟合常数 R ＞ 0.98， 3 复孔的 CV％＜ 10％。该实验结果表明， 本发明 所述方法具有特异性。
实施例 3 准确性评价试验
以参考品 ( 同实施例 1) 为材料， 用 RPMI1640 完全培养基将其稀释成效价水平分 别为 50％， 75％， 100％， 125％， 150％的待测样品， 3 名实验人员 (Analyst1、 2、 3) 各自独立 的采用上述检测方法步骤对这 5 个待测样品进行细胞增殖抑制生物活性检测。
结果如表 1， 对效价水平分别为 50％， 75％， 100％， 125％， 150％的 5 个待测样品， 3 名不同实验人员利用本发明方法对这些样品的检测结果均满足参考品的 4 参数拟合曲线 的拟合常数 R2 ＞ 0.98， 3 复孔的 CV％均满足＜ 10％， 并且不同人员对不同效价水平的实测 值相对于理论值的平均偏差均满足＜ 5％。 这说明在检测针对 HER2 靶位生物治疗药物及手 段的细胞增殖抑制生物活性时， 本发明方法对活性范围在 50％ -150％内待测样品， 能够达 到准确性要求。
表 1. 针对 HER2 靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测准确性评价结果汇总表
实施例 4 精密度评价试验以参考品 ( 同实施例 1) 及待测样品为材料， 对本发明所述方法的精密度进行评 价。首先由 1 名实验人员采用上述检测方法步骤对同一待测样品进行细胞增殖抑制生物活 性检测， 平行实验 6 次， 考察方法的重复性， 接着由 1 名实验人员在不同的 3 天内采用上述 检测方法步骤对同一待测样品进行细胞增殖抑制生物活性检测， 考察方法的日间差， 最后 由 3 名实验人员 (Analyst1、 2、 3) 采用上述检测方法步骤对同一待测样品进行细胞增殖抑 制生物活性检测， 考察方法的人员操作误差。
如表 2， 利用上述检测方法， 由 1 名实验人员对同一待测样品进行 6 次平行检测， 结 2 果均满足参考品和待测样品的 4 参数拟合曲线的拟合常数 R ＞ 0.98， 3 复孔的 CV％均满足 ＜ 10％， 并且 6 次检测结果的 RSD 满足＜ 10％， 说明在检测针对 HER2 靶位生物治疗药物及 手段的细胞增殖抑制生物活性时， 本发明方法的重复性能够达到精密度要求。
如表 3， 由 1 名实验人员在不同的 3 天内对同一待测样品进行平行检测， 结果均 2 满足参考品和待测样品的 4 参数拟合曲线的拟合常数 R ＞ 0.98， 3 复孔的 CV ％均满足 ＜ 10％， 并且 3 次检测结果的 RSD 满足＜ 10％， 说明在检测针对 HER2 靶位生物治疗药物及 手段的细胞增殖抑制生物活性时， 本发明方法的日间差能够达到精密度要求。
如表 4， 由 3 名实验人员对同一待测样品进行平行检测， 结果均满足参考品和待测 2 样品的 4 参数拟合曲线的拟合常数 R ＞ 0.98， 3 复孔的 CV％均满足＜ 10％， 并且 3 次检测 结果的 RSD 满足＜ 10％， 说明在检测针对 HER2 靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑制生 物活性时， 本发明方法的人员操作误差能够达到精密度要求。
表 2. 针对 HER2 靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测重复性评价结果 汇总表
表 3. 针对 HER2 靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测日间差评价结果汇总表
表 4. 针对 HER2 靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测人员操作误差评 价结果汇总表
实施例 5 耐用性评价试验
以参考品 ( 同实施例 1) 及待测样品为材料， 选择不同细胞代次 (10、 19、 29、 40) 的 BT-474 细胞， 采用上述检测方法步骤对同一待测样品进行细胞增殖抑制生物活性检测。
表 5. 针对 HER2 靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测耐用性 ( 细胞代 次 ) 评价结果汇总表
如表 5， 使用不同细胞代次的 BT-474 细胞， 利用该检测方法对同一待测样品进行 检测， 结果均满足参考品和待测样品的 4 参数拟合曲线的拟合常数 R2 ＞ 0.98， 3 复孔的 CV％ 均满足＜ 10％， 并且不同细胞代次条件下 (40 代以内 )， 同一待测样品检测结果的 RSD 满足 ＜ 10％， 说明在检测针对 HER2 靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性时， 本发 明方法能够达到耐用性对细胞代次的要求。
实施例 6 不同加药时间的影响
以参考品 ( 同实施例 1) 和 Herceptin 为材料， 步骤和条件同实施例 1， 只对加药时 间进行调整， 调整包括 2 个方面 ：
BT-474 细胞铺板结束后， 随即进行样品稀释， 并按照调整前的方案进行加样 ；
加样结束后， 将细胞培养板放置于 37℃， 5％二氧化碳培养箱中培养 72-74h， 接着 向各个样品孔以及空白对照孔中以 20μl/ 孔加入 CCK-8， 并完成后续读数检测。
按照调整后的步骤， 考察参考品相对 Herceptin 的生物学活性， 结果见图 3。在这 2 种实验条件下， 复孔间的 CV％值相对较大， 曲线拟合 R ＜ 0.98， 并且药物对细胞的最大增 殖抑制率仅为约 40％， 药物对细胞的增殖抑制作用并未完全表现， 细胞与药物的相互作用 并未处于稳定状态， 该方法无法对样品的生物学活性进行准确判断。 此外， 拟合曲线的斜率 较大， 也容易产生波动。 因此， 在实际应用过程中， 应该待细胞铺板生长过夜后， 再进行后续 加药并完成检测。
实施例 7 加药后不同细胞孵育时间的影响。
以参考品 ( 同实施例 1) 和 Herceptin 为材料， 在完成 BT-474 细胞铺板以及加药 操作后， 选择不同的细胞孵育时间 (24h， 48h， 96h)， 采用上述检测方法步骤考察参考品相对 Herceptin 的生物学活性。
加药后细胞孵育 24h 时的检测结果见图 4。 可以发现在这种实验条件下， 由于药物 作用时间较短， 药物对细胞的最大细胞增殖抑制率仅为 24％， 药物对细胞的增殖抑制作用
并未完全表现， 无法对药物的生物学活性进行准确判断。
加药后细胞孵育 48h 时的检测结果见图 5。 可以发现在这种实验条件下， 由于药物 作用时间较短， 药物对细胞的最大细胞增殖抑制率仅为 37％， 药物对细胞的增殖抑制作用 并未完全表现， 无法对药物的生物学活性进行准确判断。
加药后细胞孵育 96h 时的检测结果见图 6。 可以发现在这种实验条件下， 由于药物 作用时间较长， 药物浓度差异引起的药效差异逐渐变小， 导致拟合曲线的斜率较大 ( 接近 3)， 线性范围内的样品点较少， 这种情况下的线性拟合容易产生偏差， 难以对药物的生物学 活性进行准确判断。此外孵育时间过长还将增加时间成本。
而在加药后细胞孵育时间在 72-74h 时 ( 图 1) 除了能够满足复孔 CV％， 曲线拟合 2 R 之外， 还能控制时间成本， 并保证药物与细胞完全作用 ( 最大细胞增殖抑制率约 50％ ) 的 同时， 控制曲线拟合的斜率。
实施例 8 不同显色方式的影响
以参考品 ( 同实施例 1) 和 Herceptin 为材料， 除了显色步骤外其他同实施例 1， 采 用不同的显色方法 (MTT/AlamarBlue) 完成对参考品相对 Herceptin 生物学活性的考察。
MTT 显色方法 ： 向各个样品孔以及空白对照孔中以 100μl/ 孔加入 MTT 的 PBS 水溶 液 (0.5mg/ml)。完成后将细胞培养板放置于 37℃， 5％二氧化碳培养箱中继续孵育 3h。接 着小心吸去细胞培养板中的上清， 再以 150μl/ 孔加入 DMSO(0.22μm 过滤 )， 轻轻振荡混 匀， 30mi n 后， 显色物完全溶解， 将细胞培养板放入酶标仪， 在 590nm 下测定各个样品孔及 空白对照孔的 OD590， 记录测定结果。 AlamarBlue 显色方法 ： 与上述 CCK-8 法完全一致， 只是在酶标仪上读板时， 设置 544nm 处激发， 检测 590nm 发射波长下的荧光强度。
利用 MTT 法检测结果见图 7。 该显色方法步骤繁琐， 并且存在样品点 3 复孔的 CV％ 2 超过 10％， 并且曲线拟合 R ＜ 0.98， 相对 CCK-8 显色方法而言， 该显色方式稳定性较差。
利用 AlamarBlue 法检测结果见图 8。该显色方法步骤简单， 但在相同显色时间条 2 件下， 存在样品点 3 复孔的 CV％超过 10％， 并且曲线拟合 R ＜ 0.98， 相对 CCK-8 显色方法 而言， 该显色方式稳定性较差。
由此， 为了保证本发明方法的稳定性与可靠性， 我们最终确定利用 CCK-8 显色方 式来进行活细胞数的定量分析。
综上所述， 本发明建立了一种针对 HER2 靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑 制生物活性检测方法， 该方法快速， 高效， 易推广， 适合高通量作业， 通过对方法专属性， 准 确度， 精密度以及耐用性等多方面验证和考察证实了该发明方法具有稳定性强， 适用性好 等特点， 能够满足针对 HER2 靶位生物治疗药物及手段的研发过程中， 对具有细胞增殖抑制 生物活性物质的筛选以及稳定性评价。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制， 所述实施方案只作为阐明本发明各 个方面的单个例子， 本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。 实际上， 除了本文所述的 内容外， 本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所 述改进也落入所附权利要求书的范围之内。 上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为 参考。