少突胶质前体细胞的靶向细胞群及制备与使用方法 【发明领域】
本发明涉及少突胶质前体细胞群的分离、 鉴定、 增殖、 分化和移植。背景技术 中枢神经系统 ( “CNS” ) 发育期间， 多能神经前体细胞， 也被称为神经干细胞， 增殖 并瞬时产生分裂祖细胞， 最终分化成组成成人大脑的细胞类型。干细胞 ( 来自其他组织 ) 通常定义为具有自我更新 ( 例如， 形成更多的干细胞 )、 增殖、 并分化成不同表型谱系的能 力。在神经干细胞中， 包括神经元、 星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞已从若干 种哺乳动物， 包括小鼠、 大鼠、 猪和人体中分离出。参见， 例如， WO 93/01275、 WO 94/09119、 WO94/10292、 WO94/16718， 以及 Cattaneo et al， MoI.Brain Res.， 42， pp.161-66(1996)， 通 过引述全部合并于本文中。 少突胶质细胞的主要功能是高等脊椎动物中枢神经系统轴突的 髓鞘形成。少突胶质前体细胞 (OPCs) 优于少突胶质细胞。
发明内容
本发明提供了富集的靶向少突胶质前体细胞群 (OPCs)， 其可以进一步分化成少突 胶质细胞。根据一些实施方案， 提供了少突胶质前体细胞 (OPCs) 的细胞群， 其充分富集了 表达 PDGFRα 抗原的细胞。
根据一些实施方案， 靶向 OPCs 是 PDGFRα+ 和又是 CD105-。根据一些实施方案， 靶 + 向细胞群富集 OPCs， 呈 PDGFRα(PDGFRAα ) 免疫阳性并且呈 CD105 免疫阴性 (CD 105 )。 根据一些实施方案， 靶向细胞群富集 OPCs， 呈 PDGFRα 免疫阳性 (PDGFRα+)， 并且呈 CD133 + 免疫阳性 (CD133 )， 以及呈 CD105 免疫阴性 (CD 105 )。
根 据 一 些 实 施 方 案， 靶 向 OPCs 是 PDGFRα+ 和 又 是 A2B5lo、 A2B5-， 或其混合物 lo/(A2B5 )。根据一些实施方案， 靶向细胞群富集 OPCs， 呈 PDGFRα 免疫阳性 (PDGFRAα+)， 呈 CD 133 免疫阳性 (CD 133+)， 并且呈 A2B5 免疫阴性 (A2B5-)。根据一些实施方案， 靶向 + lo/OPCs 细胞群是 PDGFRα 、 A2B5 。根据其他一些实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFR α+、 CD133+、 A2B5-。根据其他一些实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFRα+、 CD133+， A2B5lo/-。根 据其他一些实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFRα+、 CD133+、 A2B5-， PSA -NCAM-。根据一 些其他实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFRα+、 CD133+、 A2B5lo/-、 PSA-NCAM-。根据一些其他 实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFRα+、 CD133+、 A2B5-、 PSA-NCAMlo/-。根据一些其他实施方 案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFR α+、 CD133+、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/-。
根据一些实施方案， 靶向 OPCs 是 PDGFRα+、 CD 105-， 又是 A2B5lo、 A2B5-， 或其混 lo/合物 (A2B5 )。根据一些实施方案， 靶向 OPCs 细胞群富集 OPCs， 呈 PDGFRα 免疫阳性 + + (PDGFRα )， 呈 CD133 免疫阳性 (CD133 )， 并且呈 A2B5 免疫阴性 (A2B5-)， 呈 CD 105 免疫阴 + 性 (CD105 )。根据一些实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFRα 、 CD 105 、 A2B5lo/-。根据一 些其他实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFRα+、 CD133+、 CD 105-、 A2B5-。根据其他一些实施 方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFR α+、 CD133+、 CD 105-、 A2B5lo/-、 PSA -NCAM-。根据其他一些实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFR α+、 CD133+、 CD 105-、 A2B5lo/-、 PSA-NCAM-。根据一些 其他实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFR α+、 CD133+、 CD 105-、 A2B5-、 PSA-NCAMlo/-。根据 其他一些实施方案， 靶向 OPCs 细胞群是 PDGFR α+、 CD133+、 CD 105-、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/-。
根据一些实施方案， 鉴别、 分离、 或富集靶向少突胶质前体细胞群的方法， 将一种 试剂接触包含至少一个 OPC 的细胞群， 这种试剂结合表达于 OPC 细胞表面的表面标记抗原。 根据优选的实施方案， 靶向少突胶质前体细胞富集细胞群是通过将含有至少一个 OPC 的细 胞群与结合 PDGFRα 的一种试剂接触而得到。优选地， 该试剂是一种结合 PDGFRα 的抗体。 使用传统的细胞分选技术， 如通过免疫筛选 ( 如， FACS)， 鉴别、 分离、 和 / 或富集细胞， 其中 试剂与 PDGFRα 抗原接触被检测到。
根据一些实施方案， 本发明提供了生产富集靶向少突胶质前体细胞的细胞群的方 法， 用单克隆抗体接触神经细胞或神经来源细胞， 这种单克隆抗体结合不在靶向少突胶质 前体细胞内的负筛择标记 ； 筛选结合单克隆抗体的细胞 ； 并除去标记细胞。细胞群内剩余 细胞富集少突胶质前体细胞。本领域的技术人员应认识到， 一个负选择标记是一个仅存在 于非 OPC 细胞的标记物 ( 如， 抗原 )。在多个实施方案中， 单克隆抗体可能被荧光标记或者 可能结合磁性粒子， 并且筛选可通过荧光激活细胞分选、 高梯度磁筛选、 固定相吸脱附， 或 任何其他常用筛选技术。在优选实施方案中， 含有神经或神经来源细胞的细胞群是从悬浮 培养、 贴壁培养中获得， 或来自新鲜的神经组织。 这些方法还可能涉及使用第二抗体或系列 抗体接触剩余细胞进一步富集少突胶质前体细胞的细胞群。举例来说， 靶向 OPCs 细胞群的 富集可通过采用特异性结合 CD 133 的抗体接触神经或神经来源细胞， 随后采用特异性结 合 PDGFRα 的抗体接触剩余细胞获得富集呈 CD 133 和 PDGFRα 免疫阳性的少突胶质前体 细胞的细胞群。此外， 神经或神经来源细胞培养基可与一种特异性结合 PDGFRα 的抗体接 触， 产生富集了呈 PDGFRα 免疫阳性的 OPCs 细胞群。
根据一些实施方案， 本发明提供了分离少突胶质前体细胞 (OPC) 的方法， 通过从 + 神经或神经来源细胞群筛选呈 CD133 免疫阳性的细胞 (CD133 细胞 ) ； 从细胞群去除非免 疫反应 (CD133 ) 细胞 ； 并从剩余细胞群中筛选至少一个细胞， 该细胞是 PDGFRα 免疫阳性 + 的 (PDGFRα )， 例如， 结合单克隆抗体 PDGFRα。在其它实施方案中， 本发明提供了生产富 集少突胶质前体细胞群的方法， 通过用特异性结合 PDGFRα 的抗体接触神经或神经来源细 hi 胞， 筛选是 PDGFRα 细胞的那些细胞， 其中， 与神经或神经来源细胞对比， 所筛选的细胞富 集少突胶质细胞前体细胞。本领域的技术人员应认识到， 神经或神经来源细胞可以从神经 球培养中获得 ( 细胞团或细胞聚集体 )， 或从贴壁培养中获得。在一些实施方案中， 这种方 lo/med 法还涉及从细胞群中去除 PDGFRα 细胞的步骤。
根据一些实施方案， 本发明提供了分离神经或神经来源细胞 (OPC) 的方法， 通过 从神经或神经来源细胞中筛选呈 CD105 免疫阴性的细胞 (CD105 细胞 ) ； 从细胞群中去除非 + 免疫阳性的细胞 (CD105 ) ； 从剩余细胞群中筛选至少一个细胞， 该细胞呈 PDGFRα 免疫阳 + 性 (PDGFRα )， 例如， 结合单克隆抗体 PDGFRα。 根据一些实施方案， 本发明提供了分离少突 胶质前体细胞 (OPC) 的方法， 通过从神经或神经来源细胞群中筛选呈 PDGFRα 免疫阳性的 + 细胞 (PDGFRα 细胞 )， 例如结合单克隆抗体 PDGFRα ； 从细胞群中去除非免疫阴性的细胞 (PDGFRα ) ； 并从剩余细胞群中筛选至少一个细胞， 该细胞呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105-)。
在其它实施方案中， 本发明提供生产富集了少突胶质前体细胞的细胞群， 通过特异性结合 PDGFRα 的抗体接触神经或神经来源细胞， 神经或神经来源细胞包含至少一个多 能神经干细胞， 其中， 与神经或神经来源细胞对比， 所筛选的细胞富集了少突胶质细胞前体 细胞。本领域的技术人员应了解， 神经或神经来源细胞可以从神经球培养中获得 ( 细胞团 或细胞聚集体 )， 或从贴壁培养中获得。在一些实施方案中， 这种方法还涉及去除细胞群中 lo/med 的 PDGFRα 细胞的步骤。
根据一些实施方案， 本发明提供了生产富集少突胶质前体细胞的方法， 去除神经 或神经来源细胞群中的分化细胞或成纤维细胞标记呈阳性的细胞 ( 例如， CD105)。这可以 通过用抗分化细胞标记的单克隆抗体接触细胞群， 并去除结合单克隆抗体的那些细胞来完 成。所获得的细胞群可能进一步使用本文所述的方法之一进行富集。通过非限制实施例， 该方法可涉及进一步富集少突胶质前体细胞群的步骤， 通过特异性结合 PDGFRα 的抗体接 触剩余细胞。在多种其他优选实施方案中， 部分可以任选通过剩余细胞中筛选的细胞进行 + 富集， 所筛选的细胞是 PDGFRα 、 CD 105 、 CD133+、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/- 和其混合物及组合。
根据额外的实施方案， 本发明提供了增殖富集少突胶质前体细胞群的方法， 将至 少一个所选细胞引入到无血清培养基中， 无血清培养基包含一个或多个生长因子， 该生长 因子选自由 LIF、 EGF、 bFGF、 PDGF-AA、 PDGF-AB、 PDGF-BB、 Sonic hedgehog(Shh)、 IGF1、 CTNF、 Noggin、 和 NT3， 及其组合组成的组 ； 增殖至少一个选自培养基的细胞。优选地， 增殖富集少 突胶质前体细胞群的方法包括 ： 将至少一个所选细胞引进到无血清培养基， 无血清培养基 包含一个或多个生长因子， 生长因子选自 PDGF-AA、 NT3、 bFGF、 IGF1 及其组合组成的组 ； 增 殖选自培养基的至少一个细胞。 另外提供了增殖并分化靶向 OPCs 的方法。根据一些实施方案， 诱导 OPCs 的增殖 ( 和分化 ) 可以通过将细胞培养在悬浮液中或细胞附着在基板上培养来完成。 可供选择地， 在适当条件下， OPCs 的增殖和分化可按下列组合在宿主体内被诱导 ： (1) 在体外增殖和分 化， 然后移植， (2) 体外增殖， 移植， 然后体内再增殖并且分化， (3) 体外增殖， 移植， 体内分 化， 以及 (4) 体内增殖和分化。体内或原位增殖和分化可涉及非手术方法， 采用制药操作使 OPCs 在体内增殖。
根据一些实施方案， 提供了治疗或改善哺乳动物脱髓鞘或髓鞘形成不良性疾病或 紊乱的方法， 包括对哺乳动物给药靶向 OPC 或靶向 OPCs 细胞群。
哺乳动物优选患有脱髓鞘或髓鞘形成不良性疾病， 包括， 但不限于， 多发性硬化 症、 急性播散性脑脊髓炎、 弥漫性脑硬化、 出血性坏死性脑炎， 辐射诱导髓鞘形成病症、 横贯 性脊髓炎、 Pelizaeus-Merzbacher 病 (PMD)、 脑瘫 (CP) 和脑白质营养不良。疾病优选多发 性硬化症、 Pelizaeus-Merzbacher 病， 或脑瘫。哺乳动物可以另外服用至少一种生物制剂， 它可提高 OPCs 数量和 / 或至少一个因素是众所周知刺激少突胶质细胞分化、 生长、 增殖、 或 存活。该 OPCs， 少突胶质细胞促进因子 (S)， 生物试剂 (S)， 和 / 或其他因素 (S) 可能以任何 方式施用， 接触哺乳动物的该因子和 / 或 / 具有目标 OPCs 的试剂， 例如全身 ( 例如， 皮下 ) 或原位。优选的， OPCs、 少突胶质细胞促进因子 (S)、 生物剂 (S)、 和 / 或其他因子 (S)， 可施 用进大脑， 更优选施药进大脑侧脑室或施药进脑实质。
附图说明
图 1. 采用甲基绿复染 shiverer/scid 小鼠加亮细胞核矢状面。 箭头表示用人 OPCs 注入脑部的 3 个区域。缩写 ： cc， 胼胝体 ； fb， 菌毛 ； cb， 小脑。
图 2. 在新生儿 shiverer/scid 小鼠中植入 OPC 的实施例。上排显示 scl21 染色， 加亮所有供体来源细胞。下排显示一系列完全相同部分进行 MBP 染色。划出的虚线地区指 出植入区和对应的髓鞘形成区。在该实施例中， 靶向上丘。细胞系信息 ： FBR 2711， P6， 移植 后第 8 周。使用的缩写 ： str， 纹状体 ； cc， 胼胝体 ； sc， 上丘。
图 3. 在新生儿 shiverer/scid 小鼠中植入 MBP-GFP 转导的 OPC 的实施例。上排 显示绿色荧光蛋白染色， 加亮活性转录 MBP 基因的供体来源细胞。下排显示一系列完全相 同部分进行 MBP 染色。小脑周围划出虚线地区， 在右侧放大显示。请注意， MBP 图上如白色 箭头指出的小脑数字错位。细胞系信息 ： FBr 2703， P6， 移植后第 8 周。使用的缩写 ： cb， 小 脑。 具体实施方式
除非另外定义， 本文中使用的所有科技术语具有普遍被本发明所属领域的技术人 员所理解的相同涵义。 尽管类似于或等同于本文描述的方法和材料可以在本发明的实施或 测试中使用， 适宜的方法和材料在下文进行了描述。本文中提到的所有出版物、 专利申请、 专利以及其他参考文献通过引述全部合并于本文中。发生冲突情况下， 本说明书， 包括定 义， 将进行调节。此外， 材料、 方法和实施例只是举例说明性的， 不是故意限制。本发明的其 它特征和优势从下面的详细描述和权利要求书来看是显而易见的。 节标题在这里只用于组织目的， 而不是被视为以任何方式限制主旨。
定义
为了促进理解本文所述的实施例， 以下将参照本发明优选实施方案， 具体的语言 将用来描述同样的事情。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案， 而不是为了限制本发 明的范围。除非本文另外清楚说明， 正如本公开内容中使用的， 单数形式的 “a” 、 “an” 和 “the” 包括复数。因此， 举例来说， 一种 “细胞” 的提法包括多种这种细胞， 一种 “抗体” 的提 法是一个或更多的抗体， 等等。
本文中所使用的术语 “靶向细胞群” 是指那些刻意被提纯或富集的细胞。优选地， 靶向细胞群是少突胶质前体细胞， 显示如本文所述的独特模式的细胞标记。
“少突胶质细胞” (OLs) 或少突神经胶质周知为中枢神经系统 (CNS) 的成髓鞘胶质 细胞。术语 “少突胶质前体细胞” 或 “OPC” 指的是未成熟的少突胶质细胞， 在一定条件下能 够分化成中枢神经系统的成髓鞘胶质细胞。 该术语包括从原发性组织分离出来的少突胶质 前体细胞和体外培养成 OPCs 的细胞， 以及少突胶质前体细胞的后代， 因此包括 OPCs 和子代 OPCs。
术语 “神经干细胞” 是用于未分化、 多能、 自我更新、 神经细胞的更普遍的术语。神 经干细胞是一种克隆多能干细胞， 它能够分化， 适当条件下， 具有自我更新能力， 并且可以 在其后代子细胞内， 可以分化形成神经元、 星形胶质细胞、 和少突胶质细胞。 因此， 神经干细 胞是 “多能的” ， 因为干细胞后代具有多种分化途径。 神经干细胞能够自我维护， 即伴随每次 细胞分裂， 一个子细胞也将成为干细胞。
神经干细胞的非干细胞后代通常称为 “祖细胞” 或 “前体” 细胞， 能够在一个或多个 谱系内产生多种细胞类型。术语 “神经祖细胞” 或 “神经前体细胞” 指的是源自神经干细胞 的未分化细胞， 本身不是干细胞。一些祖细胞能产生后代， 能够分化成多种细胞类型。举例
来说， O-2A 细胞是一种神经胶质祖细胞， 生成少突胶质细胞和Ⅱ型星形胶质细胞， 因此， 可 称为 “双向” 祖细胞。祖细胞的一个显着特点是， 不像干细胞， 它不会出现自我维护。此外， 祖细胞通常被认为是分化的特殊路径， 适当条件下， 将最终分化成胶质细胞或神经元。
术语 “神经细胞” 或 “神经来源细胞” 广泛地指与有机体的中枢神经系统 (CNS) 相 关的细胞， 例如神经元、 神经胶质细胞、 和前体细胞。如本文中所使用的神经细胞可能是从 神经组织分离出来或者源自神经组织， 以及任何细胞， 不论其起源如何， 至少具有神经元或 神经胶质表型的显示， 如对一个或多个神经元或神经胶质标记进行染色， 或者将分化成显 示神经元或神经胶质标记的细胞。因此， 术语可作为一般术语提到， 举例来说， 被分离且体 外培养的原代细胞， 培养的源自神经组织的永生细胞， 神经组织细胞 ； 和 / 或者培养表现神 经表型的细胞。 术语， 就是包括所有表现神经细胞表型和 / 或神经组织中分离出的细胞。 因 此， 术语神经细胞还包括是神经前体细胞和分化神经细胞的细胞。 本文中所使用的术语 “神 经细胞” 是指神经元。
术语 “阳性选择” 是指具有亲合力的试剂直接结合靶向细胞群从混合细胞群中除 去靶向细胞群对进行靶向细胞群进行纯化和富集的方法。
相反， 术语 “阴性选择” 是指具有亲合力的试剂直接结合非靶向细胞群从混合细 胞群中除去非靶向细胞群对进行靶向细胞群进行纯化和富集的方法。举例来说， CD45 是 T200/ 白细胞共同抗原。人中枢神经系统干细胞 (CNS-SC)， 优选那些可以诱发神经球， 并将 其包含在内的培养基， 另外的特征是缺乏某些细胞表面标记如 CD45。因此， 识别 CD45 的试 剂可能在阴性选择方法中有助于去除非靶细胞。
“原代克隆球” 是由脑组织培养产生的神经球。典型地， 脑组织在适当培养基 内培养之前经解剖并机械分离， 形成神经球。对示范性方法进行了描述， 例如， 美国专利 5,750,376， 通过引述全部并入本文中。
“次级神经球体” 是由分离 ( 传代 ) 原代神经球体并在由单细胞形成神经球体的条 件下培养被分离的细胞而生成的一种神经球体。 “哺乳动物” 是哺乳动物家庭内的任何成 员。哺乳动物优选灵长类动物、 啮齿类动物、 猫、 狗、 家畜 ( 如牛、 羊、 山羊、 马、 猪 )， 最优选 人。
一个 “脱髓鞘疾病” 或 “髓鞘形成不良症” 是一种疾病、 紊乱， 或病症， 由髓磷脂数 量不足造成或与其有关。脱髓鞘是髓鞘去除的过程， 例如原来存在的髓磷脂的损失。没有 髓磷脂形成或者数量不足的髓磷脂形成， 发生了髓鞘形成障碍， 例如， 由于功能失调的 OPCs 或少突胶质细胞 (OLS)。 脱髓鞘和髓鞘形成障碍的最终结果是髓鞘形成减少。 这些疾病、 紊 乱或病症的实施例包括， 举例来说， 多发性硬化症 ( 包括复发和慢性进展型多发性硬化症、 急性多发性硬化症、 视神经脊髓炎 (Devic 病 ))、 弥漫性脑硬化 ( 包括 Shilder 弥漫性轴周 脑炎和 Balo 同心圆性硬化 )。脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍还包括多种疾病， 其中脱髓鞘是 由病毒感染、 疫苗、 脊髓损伤、 和遗传性疾病引发的。这些脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍的实 施例包括急性播散性脑脊髓炎 ( 患得麻疹、 水痘、 风疹、 流感、 腮腺炎之后发生的 ； 或者接种 狂犬病疫苗或牛痘疫苗之后发生的 )、 坏死性出血性脑炎 ( 包括出血性白质脑炎 ) 和脑白质 营养不良 ( 包括 Krabbe globboid 脑白质营养不良、 异染性脑白质营养不良、 肾上腺脑白质 营养不良、 肾上腺脊髓神经病变、 肾上腺脊髓神经病变， 辐射诱导髓鞘化障碍、 横贯性脊髓 炎， 佩 - 梅病 (PMD)， 海绵状脑白质营养不良症和亚历山大病 )。脱髓鞘疾病或髓鞘形成障碍优选多发性硬化症、 脑性麻痹、 弥漫性脑硬化、 或佩 - 梅病 (PMD)， 并且， 最优选佩 - 梅病。
“治疗” 或 “改善” 是指减少或彻底消除了疾病或身体状况的症状。
“有效剂量” 是一种足以达到预期目的的治疗剂用量。一种给定治疗药物的有效剂 量会随一些因素如药物性质、 给药途径、 接受这种治疗剂的动物大小和动物品种以及给药 目的而有所不同。在个别情况下， 有效剂量可能会由医师根据本领域制定的方法凭经验确 定。
术语 “脑室” 是指中枢神经系统内脑脊髓液流过的任何腔或者通道。因此， 该术 语不仅包括侧脑室、 第三脑室和第四脑室， 也包括中央管、 中脑水管和其他中枢神经系统腔 室。
细胞标记
本发明提供了鉴别、 分离、 或富集靶向少突胶质前体细胞群的方法。 少突胶质前体 细胞 (OPCs) 靶向细胞群的表征为细胞表面标记物的表达。虽然本领域普遍根据特定标记 物将细胞称为 “阳性的 “或” 阴性的 “， 实际表达水平是数量性状的。细胞表面的分子数量 可以几个对数级变化， 仍然被定性为 “阳性的” 。 本领域技术人员也应了解， 那些细胞是阴性 染色， 标记物特异性试剂结合水平没有检测出不同于对照组， 例如， 同型匹配对照组 ； 可表 达少量标记物。染色水平的鉴别在细胞群之间存在微妙差别。 细胞染色强度可以用流式细胞仪进行监测， 其中激光检测定量水平的荧光染料 ( 与特异性试剂 ( 如抗体 ) 结合的细胞表面标记物的数量成正比 )。流式细胞仪， 或 FACS， 也可基于结合特异性试剂的强度以及其他参数如细胞大小和光散射来分离细胞群。 虽然染 色的绝对水平可能不同于特定荧光染料和反应制剂， 可以将数据归一化到对照组。
为了归一化分布进行对照， 每个细胞记录为具有特定强度染色的数据点。这些数 据点可根据对数坐标绘制， 度量单位是任意的染色强度。在一个实施例中， 细胞群中的最 大细胞被指定为 4 个对数级 ( 即 10,000 倍 )， 远远高于具有最低水平染色的细胞。当以这 种方式绘制时， 很明显， 最高对数级染色强度的细胞是亮的， 而最低强度染色的细胞是阴性 的。 “低” 染色细胞， 2-3 个对数级 ( 即 100-1000 倍 ) 染色强度， 可具有不同于阳性细胞和 阴性细胞的属性。可供选择的对照组可利用其表面具有确定密度的标记物的底物， 举例来 说， 制备的微珠或细胞株， 提供了强度的阳性对照。 “低” 标记表明， 染色水平高于同型相匹 配对照组的亮度， 但并不像细胞群中通常发现的最明亮的染色细胞那么强。
为界定特定抗体染色强度的目的， 同型匹配对照将界定 “非特异性” 或 “阴性” 染色 的信号强度。而任何导致信号强度高于对照组的染色被认为是 “阳性” 染色。划定阴性和 阳性染色的界线按常规设定， 使得事件频率在边界左边， 低于边界， 边界＞ 0.99 且＜ 1.0。 阳性染色强度可以被进一步细分和归类为低、 中、 高， 分别定义任意标度从对照组边界至最 rd th 高记录信号强度， 并且确定在 33 和 66 百分点处划分另两条线。 这些定义的组间低段、 中 段、 高段测量的信号可以分别被命名为低、 中、 高染色强度。
细胞分选
使用细胞表面抗原分离、 筛选、 或富集少突胶质前体细胞 (OPCs) 提供了靶向 OPC 细胞群阳性免疫筛选和阴性免疫筛选， 以及使用流式细胞仪表型分析靶向 OPC 细胞群的方 法。制备大体纯化的靶向 OPC 细胞群， 经 PDGFRα 结合， OPCs 亚群从其他细胞中分离出来。 OPCs 可能进一步通过结合本领域周知的其他表面标记物被分离。 筛选出的表达 PDGFRα 抗
原的细胞， 举例来说， 可能通过本文中公开的其他靶向 OPC 标记物的阳性和阴性免疫筛选 进一步纯化。
分离步骤可能包括磁分离， 采用抗体包被磁珠， 亲和层析和采用附着于固体载体 ( 如平板 ) 的抗体 “淘选” ， 或者其他简便技术。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分 选机， 它可能具有不同程度的掺杂， 例如多种颜色通道、 低角度和钝光散射探测通道、 阻抗 通道等。死细胞染色后通过筛选被除去 ( 碘化丙啶 [PI]， LDS)。选取对所筛选细胞的存活 没有太大不利的任何技术。
合宜地， 抗体与标记物结合， 以便分离特定细胞类型， 如磁珠 ； 生物素， 高亲和力结 合抗生物素蛋白或者链霉亲和素 ； 荧光染料， 可以与荧光激活细胞分选器一起使用 ； 半抗 原； 和类似物质。可能采用多色分析与 FACS 或者多色分析与免疫磁性分离和流式细胞仪 组合。利用多表面抗原， 如 PDGFRα+、 CD 105-、 CD133+、 CD24- 等， 多色分析利于细胞分离。 荧光染料， 发现在多色分析方法中采用， 包括， 举例来说， 藻胆蛋白， 如藻红蛋白和别藻蓝蛋 白； 荧光素和得克萨斯红。 阴性标记表明， 染色水平是同型匹配阴性对照组的亮度或低于其 亮度， “dim” 、 “lo” 或 “low” 标记表明， 染色水平可能接近负染色的水平， 但也可能比同型匹 配对照组亮。 举例来说， PDGFRα 抗体直接或间接地结合到磁化剂， 如超顺磁性微粒 ( 微粒 )。 通过使用如本领域周知的多种化学连接基团直接结合到磁性粒子上。 抗体可通过侧链氨基 或巯基和杂官能交联试剂耦合至微粒上。大量的杂官能化合物用于连接实体。优选的连接 基团为与抗体上的活性巯基和磁性粒子上的活性氨基连接的 3-(2- 吡啶二硫 ) 丙酸 N- 羟 基琥珀酰亚胺酯 (SPDP) 或 4-(N- 马来酰亚胺基甲基 ) 环己烷 -1- 羧酸 N- 羟基琥珀酰亚胺 酯 (SMCC)。
或者， 抗体间接耦合于磁性粒子。该抗体可直接结合到半抗原上， 半抗原特异性、 第二阶段抗体结合于粒子上。 适宜的半抗原的实施例包括， 举例来说， 地高辛、 地高辛配基、 FITC、 二硝基苯基、 硝基苯基、 抗生物素蛋白、 生物素等。 半抗原结合蛋白质的方法， 例如， 本 领域已知的， 市面上有售的用于这种结合的试剂盒。
靶向 OPC 细胞群通过引入神经或神经来源细胞与抗体或结合表面标记物的试剂 接触进行筛选。举例来说， 抗体被添加到细胞样本中。结合特定的细胞亚群所必需的抗体 或其他试剂的用量由执行测试分离和分析经验确定。举例来说， 细胞和抗体 / 试剂被孵育 足够长时间形成配合物， 优选至少约 5 分钟， 更优选至少约 10 分钟， 通常不超过一个小时， 更通常不超过约 30 分钟。这些细胞另外可以与对细胞表面标记物具有特异性的抗体或结 合分子一起孵育， 细胞标记物已知存在于 OPCs 中或不存在于 OPCs 中。
标记的细胞按照特异性抗体制备所述进行分离。荧光标记抗体对流式细胞仪分 离、 免疫磁性细胞分选的磁性粒子、 尤其高梯度磁性分选 (HGMS) 等等是有用的。示范性磁 性分离器在 WO 90/07380、 PCT/US96/00953、 和 EP 438520 中进行了描述， 通过引述其公开 内容合并于本文中。
纯化的细胞群可从任何适当培养基中收集。多种培养基市面有售并可以与 5mM EDTA 一起使用， 包括达氏修正依氏培养基 (DMEM)， 汉克平衡盐缓冲液 (HBSS)， Dulbecco′ s 磷酸缓冲盐 (DPBS)、 RPMI、 IMDM 细胞培养基 (IMDM)、 磷酸盐缓冲液 (PBS)， 等等， 经常附加小 牛血清 (FCS)、 牛血清白蛋白 (BSA)、 人血清白蛋白 (HSA)， 等等。
靶向 OPCs 高度富集细胞群以这种方式获得。所需的细胞会占细胞组合的 30％或 者 30％以上， 优选为细胞群的 50％或以上 ( 例如， 60％或以上， 70％或以上， 75％或以上， 80％或以上， 85％或以上， 90％或以上， 95％以上 )， 更优选为细胞群的 90％或以上 ( 例如， 92％或以上， 94％或以上， 96％或以上， 或 98％或以上 )， 最优选为细胞群的 95％或以上 ( 例 如， 97％、 99％ )( 大体纯化的 )。 获得的富集程度， 实际采用的， 取决于一些因素， 包括， 但不 限于， 筛选方法、 生长方法、 和 / 或放置在细胞培养基内的细胞量。
细胞的分离、 富集、 和筛选
本发明提供了 OPCs 的分离和鉴定。使用特异性结合 PDGFRα 的抗体或其他试剂， 本发明的方法可以用来从 PDGFRα 细胞中分离 PDGFRα+ 细胞， 抗体或试剂结合包含一小部 + 分 OPCs 的神经或神经来源细胞群， 然后筛选 PDGFRα 细胞， 与分选前的神经或神经来源细 + 胞群比较， 产生富集在 PDGFRα OPCs 中所筛选出的细胞群。
OPCs 被分离出来的细胞群优选为神经组织， 神经组织分离出的细胞群， 产生神经 细胞或神经组织的细胞群， 或者细胞培养基中的细胞群， 例如， 神经球培养或者贴壁神经干 细胞培养中的细胞。少突胶质细胞前体细胞 (OPC) 鉴别涉及采用结合细胞表面标记物的试 剂接触细胞群或神经细胞群 ( 或者包含神经或神经来源细胞的组织 )， 细胞表面标记物由 OPCs 靶向细胞群表达。举例来说， 该方法可包括采用结合 PDGFRα( 如， 一种单克隆抗体 ) 的试剂接触神经或神经来源细胞群， 并检测结合 PDGFRα 的试剂和细胞表面上的 PDGFRα 之间的接触反应。靶向 OPCs 包括在试剂结合试剂的细胞群内。这些细胞的鉴别可通过本 领域已知的一些测试方法证实， 证明细胞是， 事实上， OPCs， 如能够增殖并分化为成熟的少 突胶质细胞。 根据一些实施方案所述的 OPCs 可进一步表现为呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105-)。 因此， 鉴别、 分离、 或富集少突胶质前体细胞群的方法可以另外包括从神经或神经来源细胞 中筛选呈 CD105 免疫阴性的细胞 (CD 105- 细胞 )， 并从细胞群中去除 CD 105+ 细胞。筛选 CD 105- 细胞之后， 从现有细胞群中筛选出至少一个呈 PDGFRα 免疫阳性 (PDGFRα+) 的细 胞。在备选方案中， 本发明提供了分离少突胶质前体细胞 (OPC) 的方法， 通过从神经或神经 + 来源细胞群筛选呈 PDGFRα 免疫阳性 (PDGFRα ) 的细胞， 例如， 结合单克隆抗体 PDGFRα ； 从细胞群中去除呈免疫阴性 (PDGFRα ) 细胞， 并从现有细胞群中筛选出呈免疫阴性 CD 105(CD105 ) 的细胞， 例如从细胞群中去除 CD105- 细胞。
根据一些实施方案所述的 OPCs 可进一步表现为呈 CD 133 免疫阳性 (CD 133+)。 因此， 鉴别、 分离、 或富集少突胶质前体细胞群的方法可以另外包括从神经或神经来源细胞 中筛选呈 CD133 免疫阳性的细胞 (CD 133+ 细胞 )， 并从细胞群中去除 CD133+ 细胞。筛选 CD 133+ 细胞之后， 从现有细胞群中筛选出至少一个 PDGFRα 免疫阳性 (PDGFRα+) 的细胞。
因 此， 本发明进一步提供了从神经组织或神经干细胞培养基中富集靶向 OPCs( 如， 悬浮培养或贴壁培养 ) 的方法。本发明的方法和组合物是有利于从神经组织中 富集靶向 OPC， 其中干细胞和祖细胞出现频率低， 或者可能已经所剩无几， 如后期胚胎、 青少 年和成人组织。因此， 本领域的一个技术人员可以使用一种试剂结合包含了一部分 OPCs 的 神经或神经来源细胞， 这种试剂特异性结合如 PDGFRα 细胞， 然后筛选出 PDGFRα + 细胞。 与筛选前的神经或神经来源细胞群比较， 采用这种方式， 筛选的 PDGFRα+ 细胞在一部分 OPCs 中富集。依据优选的实施方案， 靶向 OPCs 可基于中表达到高表达来进行定性 ( 例如，
PDGFRαmed 或者 PDGFRαhigh)。 举例来说， 基于中表达到高表达 (PDGFRαmed 或者 PDGFRαhigh)， 靶向 OPCs 包括在悬浮神经球中分选出的 PDGFRα+ 细胞中。靶向 OPCs 可进一步依据本发 明所述的标记 CD105、 CD133、 A2B5、 PSA-NCAM、 O4、 和 / 或 NG2 的表达来鉴别。
基于本领域中已知的细胞标记表达， 筛选细胞群的方法可用于筛选本发明的 OPCs + + 细胞。举例来说， PDGFRα 和 / 或 CD133 靶向细胞群的鉴别可能涉及采用结合到 PDGFRα 和 / 或 CD133 的试剂接触神经细胞群 ( 或组织， 其包含神经或神经来源细胞 )， 检测结合到 PDGFRα 和 / 或 CD133 的试剂和在细胞表面上的 PDGFRα 和 / 或 CD133 之间的接触。靶向 OPCs 包括在该试剂结合的那些细胞群内。而这些细胞的鉴别可以通过一些测试方法证实， 证明细胞是， 事实上， OPCs， 如它们能够分化为成熟的少突胶质细胞。细胞分选的利用传统 技术， 如采用免疫反应筛选 ( 例如， 荧光激活细胞分离 (FACS))， 进行细胞的鉴别、 分离和 / 或富集， 其中试剂和 PDGFRα 抗原之间的接触被检测出。
本领域中的一个技术人员将分离出的靶向 OPC(s) 引入到培养基中 ； 培养基中分 离出的靶向 OPC(s) 增殖 ； 该条件下孵育分离出的靶向 OPC(s) 的后代细胞， 其中被分离出的 靶向 OPC(s) 分化为少突胶质细胞 ； 检测到少突胶质细胞的存在。分离出目标 OPC(s) 的特 征是存在少突胶质细胞。
本领域已知的一些细胞标记也可用于 OPCs 细胞的阳性和阴性筛选。例如， 抗人 CD45 单克隆抗体 (mAb) 可以用来排除胎儿组织中的血液细胞污染。在某些情况下， 抗人 CD34 单克隆抗体 (mAb) 可以用来排除内皮细胞和内皮 - 神经祖细胞配合物。在某些情况 下， 抗人 CD24 抗体可以用来排除不太可能诱发神经球的那些细胞。这些抗体中一些可单独 使用、 组合使用、 或在本方法中按顺序富集本文中公开的靶向细胞群。
使用本文所公开的技术和方法， 使用适宜抗体或优选抗体系列， 本领域中的一位 技术人员可以通过免疫筛选得到靶向 OPCs 细胞群。根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至 + + 少 30％的 PDGFRα OPCs 细胞， 优选至少 50-70％的 PDGFRAα OPCs 细胞， 更优选大于 90％ + PDGFRα OPCs 细胞 ( 例如， 92 ％或以上， 94 ％或以上， 96 ％或以上， 或 98 ％或以上 )。更优 + + 选大体纯化的 PDGFRα OPCs 细胞群， 包括至少 95 ％的 PDGFRα OPCs 细胞 ( 例如， 97 ％或 99％ )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群含有至少 30％的 PDGFRα+、 CD105-OPCs， 优选至少 + + 50-70％的 PDGFRα 、 CD 105 OPCs， 更优选大于 90％的 PDGFRα 、 CD105 OPCs( 例如， 92％ + 或以上， 94％或以上， 96％或以上， 或 98％或以上 )。最优选大体纯化的 PDGFRα 、 CD105OPCs 细胞群， 包括至少 95％的 PDGFRα+、 CD105- OPCs( 例如， 97％或 99％ )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至少 30％的 PDGFRα+、 A2B5-OPCs， 优选至少 + + 50-70％的 PDGFRα 、 A2B5 OPCs， 更优选大于 90％的 PDGFRα 、 A2B5 OPCs( 例如， 92％或以 + 上， 94％或以上， 96％或以上， 或 98％或以上 )。最优选大体纯化的 PDGFRα 、 A2B5- OPCs 细 胞群， 包括至少 95％的 PDGFRα+、 A2B5- OPCs( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施方案， 靶 向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至少 30％的 PDGFRα+、 A2B5lo/-OPCs， 优选至少 + lo/+ lo/50-70％的 PDGFRα 、 A2B5 OPCs， 更优选大于 90％的 PDGFRα 、 A2B5 OPCs( 例如， 92％ + 或以上， 94％或以上， 96％或以上， 或 98％或以上 )。最优选大体纯化的 PDGFRα 、 A2B5lo/OPCs 细胞群， 包括至少 95％的 PDGFRα+、 A2B5lo/- OPCs( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施方案， 靶向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105-)。
根 据 一 些 实 施 方 案， 靶 向 细 胞 群 包 含 至 少 30 ％ 的 PDGFRαmed/high、 A2B5-OPCs， 优 选 至 少 50-70 ％ 的 PDGFRαmed/high、 A2B5- OPCs， 更 优 选 大 于 90 ％ 的 PDGFRαmed/high、 A2B5-OPCs( 例如， 92％或以上， 94％或以上， 96％或以上， 或 98％或以上 )。最优选大体纯化 med/high 的 PDGFRα 、 A2B5 OPCs 细胞， 包括至少 95％的 PDGFRαmed/high、 A2B5-OPCs( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施方案， 另外， 靶向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至少 30％的 PDGFRαmed/high、 A2B5lo/- OPCs， 优 med/high lo/med/high lo/选至少 50-70％的 PDGFRα 、 A2B5 OPCs， 更优选大于 90％的 PDGFRα 、 A2B5 OPCs( 例如， 92 ％或以上， 94 ％或以上， 96 ％或以上， 或 98 ％或以上 )。最优选大体纯化的 med/high lo/PDGFRα 、 A2B5 OPCs 细胞群， 包括至少 95％的 PDGFRαmed/high、 A2B5lo/- OPCs， ( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施方案， 靶向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至少 30％的 PDGFRα+、 PSA-NCAM- OPCs， 优选 + + 至少 50-70％的 PDGFRα 、 PSA-NCAM OPCs， 更优选大于 90％的 PDGFRα 、 PSA-NCAM OPCs( 例 如， 92％或以上， 94％或以上， 96％或以上， 或 98％或以上 )。最优选大体纯化的 PDGFRα+、 PSA-NCAM- OPCs 细胞群， 包括至少 95％的 PDGFRα+、 PSA-NCAM- OPCs， ( 例如， 97％或 99％ )。 根据一些实施方案， 目标细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至少 30 ％的 PDGFRα+、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 优 选 至 少 50-70 ％ 的 PDGFRα+、 PSA-NCAMlo/-OPCs，更 优 选 大 于 90 ％ 的 PDGFRα+、 PSA-NCAMlo/-OPCs( 例如， 92 ％或以上， 94 ％或以上， 96 ％或以上， 或 98 ％或以上 )。最优选 + lo/大体纯化的 PDGFRα 、 PSA-NCAM OPCs 细胞群， 包括至少 95％的 PDGFRα+、 PSA-NCAMlo/OPCs， ( 例如， 97 ％或 99 ％ )。根据一些实施方案， 目标细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至少 30％的 PDGFRαmed/high、 PSA-NCAM- OPCs， 优选至少 50-70 ％的 PDGFRαmed/high、 PSA-NCAM- OPCs， 更优选大于 90 ％的 PDGFRαmed/high、 PSA-NCAM- OPCs( 例如， 92％或以上， 94％或以上， 96％或以上， 或 98％或以上 )。最优选大 med/high 体纯化的 PDGFRα 、 PSA-NCAM OPCs 细胞群， 包括至少 95％的 PDGFRαmed/high、 PSA-NCAMOPCs， ( 例如， 97 ％或 99 ％ )。根据一些实施方案， 靶向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至少 30％的 PDGFRαmed/high、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 优 选 至 少 50-70 ％ 的 PDGFRαmed/high、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 更 优 选 大 于 90 ％ 的 PDGFRαmed/ high 、 PSA-NCAMlo/-OPCs( 例 如， 92 ％ 或 以 上， 94 ％ 或 以 上， 96 ％ 或 以 上， 或 98 ％ 或 以 上 )。 med/high lo/最 优 选 大 体 纯 化 的 PDGFRα 、 PSA-NCAM OPCs， 包 括 至 少 95 ％ 的 PDGFRαmed/high、 PSA-NCAMlo/-OPCs， ( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施方案， 靶向细胞群呈 CD 105 免疫阴 性 (CD 105 )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群包含至少 30％的 PDGFRα+、 CD133+、 A2B5lo/-OPCs， 优选至少 50-70％的 PDGFRα+、 CD133+、 A2B5lo/-OPCs， 更优选大于 90％的 PDGFRα+、 CD133+、 A2B5lo/-OPCs( 例如， 92 ％或以上， 94 ％或以上， 96 ％或以上， 或 98 ％或以上 )。最优选大 + + lo/体 纯 化 的 PDGFRα 、 CD133 、 A2B5 OPCs 细 胞 群， 包 括 至 少 95 ％ 的 PDGFRα+、 CD133+、 A2B5lo/-OPCs( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施方案， 靶向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性(CD 105-)。
根 据 一 些 实 施 方 案，靶 向 细 胞 群 包 含 至 少 30 ％ 的 PDGFRα+、 CD133+、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 优 选 至 少 50-70 ％ 的 PDGFRα+、 CD133+、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 更优选大于 + + lo/90％的 PDGFRα 、 CD 133 、 PSA-NCAM OPCs( 例如， 92％或以上， 94％或以上， 96％或以上， + + lo/或 98％或以上 )。最优选大体纯化的 PDGFRα 、 CD133 、 PSA-NCAM OPCs 细胞群， 包括至少 + + lo/95％的 PDGFRα 、 CD133 、 PSA-NCAM OPCs( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施方案， 靶向 细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根 据 一 些 实 施 方 案， 靶 向 细 胞 群 包 含 至 少 30 ％ 的 PDGFRα+、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 优选至少 50-70 ％的 PDGFRα+、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 更优选大于 + lo/lo/90％的 PDGFRα 、 A2B5 、 PSA-NCAM OPCs( 例如， 92％或以上， 94％或以上， 96％或以上， + lo/lo/或 98％或以上 )。最优选大体纯化的 PDGFRα 、 A2B5 、 PSA-NCAM OPCs 细胞群， 包括至 + lo/lo/少 95％的 PDGFRα 、 A2B5 、 PSA-NCAM OPCs( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施方案， 靶向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根 据 一 些 实 施 方 案， 靶 向 细 胞 群 包 含 至 少 30 ％ 的 PDGFRαmed/high、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 优选至少 50-70％的 PDGFRαmed/high、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/-OPCs， 更优选大 med/high lo/lo/于 90％的 PDGFRα 、 A2B5 、 PSA-NCAM OPCs( 例如， 92％或以上， 94％或以上， 96％或 以上， 或 98％或以上 )。最优选大体纯化的 PDGFRαmed/high、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/-OPCs 细胞 群， 包括至少 95％的 PDGFRαmed/high、 A2B5lo/-、 PSA-NCAMlo/-OPCs， ( 例如， 97％或 99％ )。根 据一些实施方案， 靶向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。
根据一些实施方案， 靶向细胞群含有至少 30 ％的 PDGFRα+、 O4-OPCs， 优选至少 + + 50-70 ％的 PDGFRα 、 O4 OPCs， 更优选大于 90 ％的 PDGFRα 、 O4 OPCs( 例如， 92 ％或以上， + 94 ％或以上， 96 ％或以上， 或 98 ％或以上 )。最优选大体纯化的 PDGFRα OPCs 细胞群、 O4 OPCs 细胞群， 包括至少 95％的 PDGFRα+、 O4-OPCs( 例如， 97％或 99％ )。根据一些实施 方案， 靶向细胞群又呈 CD 105 免疫阴性 (CD 105 )。富集程度， 实际使用的， 取决于一些因 素， 包括分选方法、 增长方法、 和 / 或培养基中放入的细胞量。
深低温保存和处理
根据一些实施方案， 本实施方案的 OPCs 可按常规程序深低温保存。在一些实施方 案中， 深低温保存涉及在冷冻介质中冷冻约一个至一千万个细胞， 其中可能包括增殖培养 基和抗氧化剂如 NAC(0.1 至 2mM， 例如， 0.5mM， 1mM 等 )。 增殖培养基优选无生长因子有丝分 裂原。举例来说， 悬浮细胞可被离心分离， 吸出一些生长介质， 用冷冻介质取代。然后， 细胞 慢慢被冻结， 例如， -80℃下放置在容器内或冷冻在液氮中。细胞在 37℃浴器内旋转解冻， 再悬浮在新鲜的增殖培养基中， 并正常生长。
根据一些实施方案， 本实施方案的 OPCs 可以准备使用的形式 ( 如医药级小瓶或容 器 ) 冻存。在一些实施方案中， OPCs 在使用前解冻并培养。在一些实施方案中， OPCs 在使 用前解冻和在悬浮液中培养。 在一些实施方案中， OPCs 在使用前解冻并在贴壁基质上培养。 解冻后培养期可能是 1 至 24 个小时。在一些实施方案中， 解冻后培养期可能从 1 到 2 天。
根据一些实施方案， 本发明的 OPCs 可处于悬浮培养液中。根据一些实施方案， 本 发明的 OPCs 细胞从培养板脱离后 ( 如， 胰蛋白酶后处理 ) 可处于悬浮培养液中。举例来 说， 粘附的 OPCs 用胰蛋白酶处理脱离， 并转移到悬浮培养液中。OPCs 保存在悬浮液的时间可称为 “保存” 期。悬浮液中的保存期至少有以下 3 个原因的优势 ： 1) 移植和 / 或冷冻保存 之前将使细胞从潜在破坏性酶处理中恢复 ； 2) 动物手术安排中更灵活 ； 3) 等待移植的 OPCs 能够装运到非现场处 ( 实验室或诊所 )。根据一些实施方案， 保存期可能是 2、 4、 6、 8、 12、 18 或 24 个小时。根据一些实施方案， 保存期可能是 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 天。
组织源
任何合适的组织源可用于得到本发明的 OPCs。成人中枢神经系统已被证明包含 具有增殖能力的少突胶质前体细胞， 适当的条件下能长成为髓鞘少突胶质细胞。 因此， 细胞 群可以从后期胚胎、 青少年和成年哺乳动物中枢神经系统组织得到， 也可能从神经干细胞 现有培养基中得到， 如 Weiss 申请的美国专利 5,750,376， 或者 Johe 申请的美国专利介绍 5,753,506 中描述的。OPCs 也可从能够产生神经组织的任何组织或细胞源中得到。在一个 优选的实施方案中， OPCs 来自人。
OPCs 可从几种哺乳动物的神经或神经来源细胞中分离得到， 包括， 但不限于， 小 鼠、 大鼠、 猪、 非人灵长类动物、 和人。神经或神经来源细胞可从胚胎、 胎儿、 产后、 青少年、 成人神经组织中得到， 包括脑和脊髓。举例来说， 神经或神经来源细胞可以从大脑皮层、 小 脑、 中脑、 脑干、 脊髓和心室， 以及包括颈动脉体和肾上腺髓质的 PNS 区域得到。其他优先区 域包括基底神经节内的区域， 优选由尾和壳组成的纹状体， 或多种细胞群如苍白球、 丘脑底 核、 基地核、 黑质致密部， 以及来自发现衬里中枢神经系统脑室的脑室组织， 包括室管膜下 区。在脑室下区和腹侧神经上皮是在成年动物中 OPCs 的优选来源。 除了 OPCs， 存在于成人中枢神经系统的细胞群， 其表现出干细胞特性， 能够自我更 新并产生成人中枢神经系统的分化成熟细胞表型如少突胶质细胞。 这些干细胞被发现在整 个中枢神经系统内， 尤其是在脑室下区和海马齿状脑回中， 表明靶向 OPCs 细胞可从其中分 离出的神经或神经来源细胞群的来源。 神经干细胞也从多种成人中枢神经系统脑室区中分 离出， 包括额叶、 圆锥脊髓、 胸椎脊髓、 脑干和丘脑下部。
生长因子响应干细胞可以从小鼠、 鼠、 哺乳动物和人中枢神经系统组织的神经轴 的许多区域分离出并且处于不同发展阶段。这些细胞根据生长因子如 EGF、 碱性 FGF(bFGF、 FGF-2) 和转化生长因子 (TGFα) 的应答而变化， 可以未分化状态在培养基内保持并扩增一 段较长时间。( 参见， 例如 WO93/01275 和 WO94/16788， 通过引述合并于本文中 )。
增殖
OPCs 可以在悬浮液或贴壁基质上培养细胞诱发增殖。参见， 例如， 美国专利 5,750,376 和 5,753,506( 通过引述全部都合并于本文中 )， 这里描述的培养基。同种异体 移植和自体移植都拟用于移植目的。
通常情况下， 本实施方案的 OPCs 在培养基中培养， 使其生长和增殖。分离的 OPCs 增殖的培养基可能为一种无血清培养基， 其包含有效诱导增殖的一个或多个预定的生长因 子。培养液可附加生长因子， 该生长因子选自血小板衍生生长因子 (PDGF)、 表皮生长因子 (EGF)、 碱性成纤维细胞生长因子 (FGF-2， bFGF)、 NT3、 IGF1 或其组合。培养基可进一步附 加 N2 和 B27。OPCs 分化成少突胶质细胞的条件包括在培养基内涂有层粘连蛋白或层粘连 蛋白加纤维连接蛋白的表面上培养 OPC 后代， 培养基含有胎牛血清 (FBS) 或 T3( 三碘甲状 腺氨酸 ) 而无 EGF、 bFGF、 PDGF、 NT3、 IGF1 或 LIF。
根据一些实施方案， 本实施方案的 OPCs 可能为从初生组织源分离后被传代 1 到 20
倍 ( 如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 和 20 倍 )， 并可在悬浮液或 者贴壁基板上培养细胞而诱发增殖。传代 (a.k.a， 接种或分裂 ) 通常涉及采用胰蛋白酶消 化或机械手段从主要培养容器表面分离细胞。然后， 由此产生的细胞悬液再细分， 或补种， 成新的培养基。 二级培养基定期检查生长和进料， 随后可能继代培养产生三级培养基等。 细 胞传代之间次数变化， 取决于增长速度。
增殖培养基可以是本领域中已知的培养基， 在无诱导其分化的情况下诱导 OPCs 的增殖。本文的实施例 3 提供了用于增殖本实施方案的 OPCs 的示范性培养基。细胞传代 或分裂是维持细胞呈指数增长所必需的。细胞传代或分裂的方法是本领域中众所周知的。 OPCs 可使用本领域中周知的任何已知方法进行传代。
分化
当 OPCs 在分化的条件下培养， 祖细胞分化为少突胶质细胞。细胞的分化能够采用 本领域中已知的任何方法进行诱导， 包括释放三磷酸肌醇和细胞内 Ca2+、 释放甘油二酯、 激 活蛋白激酶 C、 和其他细胞激酶， 以及类似方法。采用佛波醇酯处理， 诱导分化的生长因子、 激素和其他化学信号可以诱导分化。生长因子耗尽可诱导分化， 例如， 通过去除有丝分裂 原， 细胞留在没有介质更新的培养基中， 或者无传代的情况。
可以通过在悬浮液或在粘附基质上培养细胞实现诱导 OPCs 增殖 ( 和分化 )。或 者， 在适当条件下， 在宿主体内， 按照下列组合可诱发 OPCs 的增殖和分化 ： (1) 在体外增殖 和分化， 然后移植， (2) 在体外增殖， 移植， 然后体内再增殖和分化， (3) 体外增殖， 移植， 体 内分化， 以及 (4) 在体内增殖和分化。在体内或者原位增殖和分化可能涉及非手术方法， 采 用制药操作让 OPCs 在体内增殖。涉及 OPCs 移植的这些方法在下文中进一步详细讨论。
纯化干细胞 / 祖细胞的使用。
使用本文所述的方法鉴别靶向 OPC 细胞群在多种方法中是有效的， 包括药物筛 选、 诊断、 移植和治疗。OPCs 可被用于重建宿主， 宿主细胞已因疾病或受伤而丧失。细胞相 关遗传性疾病的治疗可采用自体或异体 OPCs 的基因改造， 以纠正基因缺陷或者治疗而对 疾病有抵抗力。或者， 正常的异体 OPCs 可被移植。除了细胞相关那些疾病之外的疾病也可 进行治疗， 这种疾病涉及一种特定的分泌物不足， 如激素、 酶、 生长因子、 或类似物质。
中枢神经系统疾病包括许多病痛如神经退行性疾病 ( 例如， 老年痴呆症和帕金森 氏 )、 急性脑损伤 ( 例如， 中风、 局部缺血、 颅脑损伤、 脑性麻痹 ) 和许多中枢神经系统功能障 碍 ( 如抑郁症、 癫痫和精神分裂症 )。 近年来， 神经退行性疾病已成为一个重要的问题， 不断 扩大的老龄人口成为这些疾病的最大风险。 这些疾病， 包括， 举例来说， 阿尔茨海默氏症、 多 发性硬化症 (MS)、 亨廷顿氏病、 肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森氏病， 关系到中枢神经系 统特定位置的神经细胞变性， 导致这些细胞或者大脑区域失去能力执行其预定功能。通过 特异性不同的生长因子， 达到成熟、 增殖并分化为少突胶质细胞， 少突胶质祖细胞可被用作 少突胶质细胞的来源。
靶向 OPC 细胞群也可能用在细胞分化和成熟相关的分离以及因素评估中。因此， 这些细胞可在检测中使用， 以确定培养基的活性， 如条件培养基， 评估液体的生长因子活 性， 参与建立谱系， 或类似行为。
靶向 OPC 细胞群可在液氮温度下冻结并存储较长时间， 解冻， 能够被重复使用。这 些细胞通常会被储存在 7.5％ DMSO 和 4％ HSA( 人血清白蛋白 ) 中。一旦解冻， 使用生长因子或 OPC 增殖和分化相关的细胞， 这些细胞可被扩增。
移植
从神经细胞群或神经组织中获得的靶向 OPC 细胞群可引入到哺乳动物中 ( 例如， 通过移植 )， 尤其用于补偿损失的或不正常的少突胶质细胞。 哺乳动物优选是人、 犬、 猫、 鼠、 羊、 山羊、 牛、 马、 猪、 或者非人类灵长类动物。最优选的， 哺乳动物是人。由于 OPCs 可能来 自任何年龄的哺乳动物的脑组织， 包括成人， 优选采用哺乳动物自己的组织自体移植生长 神经干细胞。 同种异体和异种移植也是可能的， 尤其是当移植部位在大脑或眼睛， 由于血脑 或血液视网膜屏障， 免疫排斥反应不严重。
在某些实施方案中， 本实施方案的 OPCs 以至少大于 1X1020 个总有核细胞等级的 剂量移植， 或至少在 1019、 或 1018、 或 1017、 或 1016、 或 1015、 或 1014、 或 1013、 或 1012、 或 1011、 或 10 9 8 7 6 5 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 个细胞等级。 在一些实施方案中， 本实施方案的 OPCs 6 12 6 9 8 10 可能被移植剂量为 1X 10 至 1X10 、 1X 10 至 1X 10 、 1X 10 至 1X 10 、 1X 109 至 1X 1012、 1X 109 至 1X 1010 个细胞。在一些实施方案中， 细胞配制在一个密封制药瓶中， 以备对患者 给药。
靶向 OPCs 可被移植到哺乳动物体中并诱导少突胶质细胞在体内形成。因此， 采用 已有的方法， 靶向 OPC 细胞群可在培养基中扩增， 移植到哺乳动物体中， 并在体内接触少突 胶质细胞促进因子产生少突胶质细胞。任选地， 通过对哺乳动物给药已知用于增加 OPCs 数 量的一些生物制剂， 移植的 OPCs 能够在体内再扩增。
根据一些实施方案， 本发明的 OPCs 是介于传代后 1 至 5 天内被移植， 优选在传代 后 1 至 2 天内被移植。本实施方案的 OPCs 可能以细胞团或没有关联的细胞悬液移植。使 用这种方式获得的细胞的移植数据 ( 未显示 ) 是健康的， 导致含有大量的髓鞘少突胶质细 胞的移植。根据一些实施方案， 本实施方案的 OPCs 在传代后可在制药瓶内的悬浮液中保存 10 分钟至 5 天 ( 例如， 30 分钟、 1 小时、 2 小时、 4 小时、 8 小时、 12 小时、 24 小时、 36 小时、 48 小时、 3 天、 4 天等 )， 以备对患者给药。 本实施方案一些 OPCs 在悬浮液中的剂量可能至少在 20 大于 1X10 个总有核细胞的等级， 或至少在 1019、 或 1018、 或 1017、 或 1016、 或 1015、 或 1014、 或 13 12 11 10 9 8 7 6 5 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 、 或 10 个细胞的等级。在一些实施 6 例中， 本实施例的 OPCs 在悬浮液中的剂量可能在 1X 10 至 1X 1012、 1X 106 至 1X109、 1X 108 至 1X 1010、 1X 109 至 1X 1012、 1X 109 至 1X 1010 个细胞之间。在一些实施方案中， 细胞配制 在一个密封制药瓶中， 以备对患者给药。
少突胶质细胞促进因子或生物制剂可通过本领域的任何适宜路线给药， 包括， 举 例来说， 口服、 局部给药、 直肠给药、 阴道给药、 鞘内注射、 血管内给药、 静脉注射、 肌肉注射、 腹腔给药、 透皮给药、 皮层内给药、 皮下给药、 鼻腔给药或吸入给药。 给药途径主要取决于试 剂的性质。举例来说， GM-CSF 能够穿越血脑屏障， 因此它可以全身给药， 以及施药给大脑。 优选的给药方法是注射 ( 例如， 用针或导管 ) 或输液。
按 照 常 规 技 术， 靶 向 OPCs 可 移 植 给 患 者 中 枢 神 经 系 统， 举 例 来 说， 美国专利 5,082,670 和 5,618,531， 公开内容通过引述合并于本文中， 或者移植进体内的任何其他适 宜部位。在一些实施方案中， OPCs 直接移植到中枢神经系统。实质和鞘内位置也被考虑。 应了解， 中枢神经系统内确切部位会根据疾病状态而变化。
根据一些实施方案， OPCs 可能在植入前积聚， 或可能直接以分离的单个细胞被采用。当使用 OPC 聚集体时， 移植优选使用约 10-500 微米直径的小尺寸聚集体进行移植， 优 选直径 40-50 微米。优选地， 从约 100 万个细胞至约 10 亿个细胞被移植。举例来说， 总数 约 100 万、 约 500 万、 约 1000 万、 约 2500 万、 约 5000 万、 约 7500 万、 约 1 亿、 约 2.5 亿、 约5 亿、 约 7.50 亿， 或者约 10 亿个细胞被移植。
OPCs 优选引入到哺乳动物的大脑或脊髓中， 尤其是在少突胶质细胞不足和 / 或功 能失调的位置， 举例来说， 已脱髓鞘轴突周围。 人体中， 脱髓鞘区域一般与斑块结构有关。 采 用磁共振成像 (MRI) 可视化。这些细胞也可能被移植到中枢神经系统其它区域。一个特别 有效的方法是移植到在另一半球靶病变的 “镜像” 位置， 因为细胞已知有效地通过胼胝体迁 移到对侧半球的相应位置。
根据一些实施方案， OPCs 直接引入到大脑或脊髓区域。OPCs 直接引入可使用本领 域中已知的任何方法实施。因此， 根据一些实施方案， OPCs 通过注射引入到靶向大脑区域。 优选地， OPCs 引入到严重有髓的大脑区域 ( 白质丰富 )。菌毛是沿海马内侧边缘的主条带 的白质。白质构成了大脑深部的主体及脊髓表面部分。胼胝体是大脑中的最大白质结构， 连接左、 右大脑半球。在一些实施方案中， 靶向脑区包括菌毛、 胼胝体、 大脑脚、 内囊、 脊髓、 脑干、 运动皮质、 嗅皮质、 体感皮层、 前扣带回、 下颞叶、 背外侧前额叶皮层和延髓。
灰质聚集体， 如基底神经节 ( 尾状核、 壳核、 苍白球、 丘脑底核、 伏隔核 ) 和脑干核 ( 红核、 黑质、 颅神经核 ) 分布在大脑白质内。这些区域也是靶向脑区。靶向脑区包括， 但 不限于， 端脑 ( 大脑半球、 前脑 )、 间脑 ( 丘脑、 下丘脑、 上丘脑、 prethalamus 或丘脑底部和 前顶盖 )、 中脑 ( 脑 )、 小脑、 桥脑和延髓。中脑包括顶盖 ( 下丘和上丘 ) 和大脑脚 ( 中脑被 盖、 小腿脑瘤、 黑质 )。 黑质是基底神经节的一部分 ； 基底神经节的其他部分包括纹状体 ( 尾 状核、 壳核和伏隔核 )、 苍白球和丘脑底核。 靶向脑区可能包括脑干、 纹状体、 内囊、 尾状核和 壳核。
OPCs 的遗传改良
本实施例 OPCs 细胞可通过遗传改良提供一种治疗有效的生物活性分子。在一些 实施方案中， 遗传改良 OPCs 可能被移植或引入到如上所述需要治疗的主体内。
在某些实施方案中， 本实施方案的 OPCs 细胞可能进行遗传改良表达一种特殊形 式的髓鞘蛋白脂质 (PLP)， 如在自体移植中。此外， 本实施方案的 OPCs 可进行遗传改良表 达下列中一个或多个 ： 端粒酶 ( 防止端粒侵蚀 )、 生长因子、 成形素、 酶、 抗凋亡基因 ( 例如， SHH 蛋白、 FGF2、 NT3、 BDNF、 PDGF、 IGF、 NGF)、 arylsuphatase A( 异染性脑白质病变 )、 半乳 糖神经鞘氨醇酶 (krabbe′ s)、 超氧化物歧化酶和抗氧化防御的其他蛋白， 和 Bc1-XL。
根据已知的方法， 本文中描述的 OPCs 可进行遗传工程或改良。术语 “遗传改良” 是 指通过引进外来 DNA 稳定或瞬时改变细胞基因型。DNA 可为合成的， 或者天然来源， 可包含 基因， 部分基因， 或者其他有效的 DNA 序列。术语 “遗传改良” 并不意味着包括自然存在改 变， 例如通过自然病毒活性、 天然基因重组、 或类似情况而发生。
使用标准技术， 目的基因 ( 例如， 编码一种生物活性分子的基因 ) 可插入到适宜表 达载体的克隆位点。 这些技术是本领域中的技术人员众所周知的。 参见， 例如， WO94/16718， 通过引述合并于文本中。
包含目的基因的表达载体可被用来转染预期细胞株。标准转染技术如磷酸钙共 沉淀、 DEAE- 葡聚糖转染、 电穿孔、 基因枪法、 或病毒转染可被采用。市售哺乳动物转染试剂盒可从如 Stratagene 公司购买。人腺病毒转染可按照 Berg et al.Exp.Cell Res.， 192， pp.(1991) 中描述的方法完成。同样， 脂质体基转染可以按照 Cattaneo， MoI.Brain Res.， 42， pp.161-66(1996) 中描述的方法完成。
一个宿主 / 表达载体的多种组合可以用来表达编码目的生物活性分子的基因。参 见， 例如， 美国专利 5,545,723， 通过引述合并于本文中， 适宜的细胞基生产表达载体。
生物活性分子的表达增加， 可以使用本领域中已知扩增方法通过增加或扩增转基 因拷贝数实现。 这种扩增方法包括， 如 DHFR 扩增 ( 参见， 例如， Kaufman et al. 申请的美国 专利 No.4,470,461) 或谷氨酰胺合成酶 (“GS” ) 扩增 ( 参见， 例如， 美国专利 5,122,464， 欧洲公开申请 EP 338,841)， 通过引述全部合并于本文中。
本领域中已知的任何表达载体可用于表达生物活性分子。在一些实施方案中， 慢 病毒衍生载体对外源基因传输尤其有效。这种慢病毒载体是本领域已知的。在一些实施方 案中， 外源基因可能需要将其引入到靶向 OPCs 表达中。这种基因可能在影响最佳共表达的 组成型或诱导启动子控制下。外源 DNA 可能通过病毒载体 ( 逆转录病毒、 改性疱疹病毒、 疱 疹病毒、 腺病毒、 腺相关病毒、 慢病毒和类似病毒 ) 或直接 DNA 转染 ( 脂质体转染、 CaPO4 转 染、 DEAE- 葡聚糖、 电穿孔和类似方法 ) 引入到前体细胞中。
本实施方案的 OPCs 可能通过基因改良用于药物筛选目的或用于检测少突胶质细 胞或 OPC 谱系。在一些实施方案中， OPCs 可使用一个或多个报告基因进行基因改良。这些 报告基因包括荧光蛋白基因 ( 例如， 绿色荧光蛋白、 黄色荧光蛋白、 蓝色荧光蛋白、 青色荧 光蛋白， 等等 )、 DsRed2、 mCherry、 tdTomato 和 AmCyanl。优选的启动子包括以下启动子中 的一个或多个 ： MBP、 CNPase、 OLig2、 Sox10、 P1p、 和 PDGFR 启动子。
治疗
许多神经系统疾病都与髓鞘和神经元动态平衡和功能中的缺陷有关。 这些脱髓鞘 疾病或病症或脱髓鞘紊乱的实施例包括， 但不限于， 多发性硬化症 ( 包括复发和慢性进展 型多发性硬化症、 急性多发性硬化症、 视神经脊髓炎 (Devic′ s 病 ))、 弥漫性脑硬化 ( 包 括 Shilder 弥漫性轴周脑炎和 Balo 同心圆性硬化 )。脱髓鞘疾病还包括多种疾病， 其中脱 髓鞘是由病毒感染、 疫苗、 脊髓损伤、 和遗传性疾病引发的。这些脱髓鞘疾病或髓鞘形成障 碍的实施例包括， 但不限于， 急性播散性脑脊髓炎 ( 患得麻疹、 水痘、 风疹、 流感、 腮腺炎之 后发生的 ； 或者接种狂犬病疫苗或牛痘疫苗之后发生的 )、 坏死性出血性脑炎 ( 包括出血性 白质脑炎 ) 和脑白质营养不良 ( 包括 Krabbe globboid 脑白质营养不良、 异染性脑白质营 养不良、 肾上腺脑白质营养不良、 肾上腺脊髓神经病变、 肾上腺脊髓神经病变， 辐射诱导髓 鞘化障碍、 横贯性脊髓炎， 佩 - 梅病 (PMD)， 海绵状脑白质营养不良症和亚历山大病 )。脱髓 鞘疾病或髓鞘形成障碍优选多发性硬化症、 脑性麻痹、 弥漫性脑硬化、 或佩 - 梅病 (PMD)， 并 且， 最优选佩 - 梅病。
本发明的细胞和方法可以有效地治疗多种神经退行性疾病、 脱髓鞘疾病和 / 或脱 髓鞘紊乱。假定这些细胞将取代宿主体内病变、 损坏或功能丧失的组织。或者， 移植的组织 可能增加内源性影响宿主组织的功能。
根据一些实施方案， 提供了提高体内少突胶质细胞生产的方法， 在导致少突胶质 细胞形成条件下， 给哺乳动物施用靶向 OPCs。产生的少突胶质细胞具有哺乳动物体内髓鞘 形成 ( 或髓鞘再生 ) 脱髓鞘神经元的能力， 从而哺乳动物体内髓鞘发育不良性疾病和 / 或脱髓鞘疾病是可以治愈或改善。
根据一些实施方案， 提供了提高体内少突胶质细胞生产的方法， 通过鉴别和分离 靶向 OPCs 细胞群， 促进其增殖的条件下培养靶向 OPCs 细胞群， 在导致少突胶质细胞形成条 件下给哺乳动物施用靶向 OPCs。 产生的少突胶质细胞具有哺乳动物体内髓鞘形成 ( 或髓鞘 再生 ) 脱髓鞘神经元的能力， 从而哺乳动物体内髓鞘发育不良性疾病和 / 或脱髓鞘疾病是 可以治愈或改善。
根据一些实施方案， 提供了提高体内少突胶质细胞生产的方法， 通过鉴别和分离 靶向 OPCs 细胞群， 促进其增殖的条件下培养靶向 OPCs 细胞群， 靶向 OPCs 细胞群分化成少 突胶质细胞， 在导致少突胶质细胞形成条件下给哺乳动物施用靶向 OPCs。产生的少突胶质 细胞具有哺乳动物体内髓鞘形成 ( 或髓鞘再生 ) 脱髓鞘神经元的能力， 从而哺乳动物体内 髓鞘发育不良性疾病和 / 或脱髓鞘疾病是可以治愈或改善。
根据一些实施方案， 提供了提高体内少突胶质细胞生产的方法， 通过鉴别和分离 靶向 OPCs 细胞群， 在导致少突胶质细胞形成条件下给哺乳动物施用靶向 OPCs。 产生的少突 胶质细胞具有哺乳动物体内髓鞘形成 ( 或髓鞘再生 ) 脱髓鞘神经元的能力， 从而哺乳动物 体内髓鞘发育不良性疾病和 / 或脱髓鞘疾病是可以治愈或改善。
药物筛选
本发明的 OPCs 也可用在药物筛选和药物发现的方法中。本领域已知的任何细胞 基药物筛选方案可与本发明的 OPCs 结合使用。多种检测可用于此目的， 包括毒理学试验 ； 蛋白质结合免疫测试 ； 细胞生长、 分化和功能活性的确定 ； 激素产生， 类似测试。该检测可 在体外、 原位、 体内和间接体内进行。举例来说， 本发明的 OPCs 可用在药物筛选方法中， 包 括 a) 选自富集靶向 OPC 细胞群 ； b) 对非人的哺乳动物移入所产生的富集细胞群 ； c) 对非人 的哺乳动物施用一种测试化合物 ； 和 d) 施用上述测试化合物的移入哺乳动物和未施用上 述测试化合物的对照非人哺乳动物进行比较。
根据一些实施方案， 本发明提供了一种筛选化合物的方法， 这种化合物影响富集 靶向少突胶质前体细胞的细胞群的生物功能， 包括 ： (a) 测试化合物接触由权利要求 1 所述 的方法获得的靶向少突胶质前体细胞 ； (b) 检测少突胶质前体细胞生物功能的变化。生物 功能变化可能包括， 但不限于， 下列中的一种或多种变化 ： 髓鞘、 分化为少突胶质细胞、 增殖 率、 细胞迁移、 细胞活力、 基因表达、 蛋白表达、 培养基中蛋白质水平、 去分化、 生长特性， 和/ 或细胞形态。
通过向至少一个、 通常多个细胞样本中加入药剂筛选药剂的生物活性。测量响应 该药剂的参数变化， 结果与参照培养基比较， 例如， 存在和不存在药剂的情况， 使用其他药 物获得， 等等。药物可方便地加入到溶液中， 或易于可溶解形式， 加入到细胞培养基内。这 些药物可加在流动体系中， 如流体， 间歇或连续的， 或者， 单独地或增量地向另外的静态溶 液中加入化合物丸剂。在流动体系中， 使用两种液体， 其中一种是生理中性溶液， 另一种加 入了测试化合物的是相同溶液。第一种液体穿过细胞， 随后第二种液体穿过细胞。在单一 溶液中方法中， 测试丸加到细胞外围介质中。培养基成分的整体浓度不应随着丸剂加入显 著改变， 或者在流动方法中两种溶液之间浓度不应随着丸剂加入显著改变。
多种方法可以用于定量所选定的标记物。为了测量分子的数量， 一种简便方法使 用检测基团标记分子， 这可能具有荧光、 发光、 放射性、 酶活性， 等等， 尤其是特异性结合与高亲和力的荧光基团的分子都是极易标记生物分子、 结构或细胞类型。免疫荧光基团可不 仅直接结合特定蛋白质， 而且结合特异性构象、 裂解产品， 或者像磷酸化位点的改变。单个 肽和蛋白质可以设计自动发荧光， 如通过细胞内表达的绿色荧光蛋白嵌合体。 因此， 对抗体 进行改良， 提供作为其一部分结构的一种荧光染料。根据所选择的标记， 不采用荧光标记， 采用如放射免疫法 (RIA) 或酶联免疫吸附试验 (ELISA)、 同质酶免疫测定法， 以及相关的非 酶法技术测量参数。核酸量化， 尤其是信使 RNAs， 也作为参数。采用杂交技术测量， 取决于 核酸核苷酸序列。这些技术包括聚合酶链反应方法， 以及基因芯片技术。
封装
本领域已知的任何封装方案可用于本发明的 OPCs。本发明的 OPCs 可能被封装 并且用于运载生物活性分子， 根据已知的封装技术， 包括微胶囊 ( 参见， 例如， 美国专利 4,352,883 ； 4,353,888 ； 和 5,084,350， 通过引述合并于本文中 )， 大胶囊 ( 参见， 例如， 美国 专利 5,284,761、 5,158,881、 4,976,859 和 4,968,733 和公布的 PCT 专利申请 WO92/19195、 WO 95/05452， 通过引述都合并于本文中 )。
如 果 OPCs 被 封 装， 大 胶 囊 如 美 国 专 利 5,284,761 ； 5,158,881 ； 4,976,859 ； 4,968,733 ； 5,800,828 和公布的 PCT 专利申请 WO 95/05452 中描述的大胶囊， 优选通过引 3 9 述都合并于本文中。设备中细胞数量可以变化。优选地， 每个设备包含 10 -10 个细胞， 最 优选 105-107 个细胞。大量大胶囊装置可植入到患者体内 ； 优选 1 个至 10 个装置。
下列实施例为了举例说明性的， 但不限制于， 本发明的方法和组合物。 在本实施方 案的精神和范围内， 通常在治疗中遇到的条件和参数变化进行适当修正和更改对本领域中 技术人员将变得显而易见的。
实施例 1 ： PDGFR 阳性细胞的筛选
胎儿大脑 (16-20 孕周 ) 采用胶原酶 / 透明质酸酶和胰蛋白酶组合进行酶处理， 生 成一种单细胞悬液。 细胞再悬浮在 Hank′ s 平衡盐溶液中， 并用 CD 133 抗体染色， Hank′ s 平衡盐溶液含有 1mM 丙酮酸钠和 0.1％人血清白蛋白 ( 染色缓冲液 )。富集模式下， CD133+ 细胞无菌条件下使用 BD 流式细胞仪进行分选。CD133+ 富集片断进行离心分离， 再悬浮在染 色缓冲液中， 用 1 ∶ 100 的兔抗 PDGFRα 多克隆抗体 (IgG)4℃下孵育 2 个小时。染色缓冲 液冲洗两次后， PDGFRα 标记细胞孵育多克隆羊抗兔 IgG-FITC 抗体 (Caltag)。纯化模式 下， PDGFRα 阳性 (FITC 标记 ) 细胞无菌条件下使用 BD 流式细胞仪进行分选。分选细胞在 涂有聚 -L- 鸟氨酸、 层粘连蛋白和纤维连接蛋白的培养瓶内 DMEM 培养基中孵育， DMEM 培养 L- 谷氨酰胺、 丙酮酸钠、 FGF2、 PDGF-AA 和 NT3( 完全培养基 )， 添加 基添加了 B27、 N2、 NAC、 或没有添加胰岛素样生长因子 1。 轻度胰蛋白酶处理和同一培养基中再接种达到细胞传代。
用 于 PDGFRα 阳 性 细 胞 纯 化 的 另 一 种 方 法 使 用 小 鼠 单 克 隆 抗 体 1 ∶ 50 PDGFRα-PE(Pharmingen 公司 )4℃下对全部脑细胞 ( 有 CD 133 富集或者没有 CD 133 富 集 ) 染色 2 个小时， 随后， 使用 BD 流式细胞仪进行纯化无菌分选。
实施例 2 ： CD105 阴性细胞的筛选
CD105 细胞作为筛选标记是基于本发明者发现， 纯化 PDGFRα+ 细胞的培养基以比 其它更快的速度扩增。 这种加速增长一般伴随着具有不同于少突胶质细胞祖细胞形态的细 胞类型的外观。 基于形态和培养基中的加速增长， 这些细胞很可能是 PDGFRα+ 成纤维细胞 ； 包含介质的 FGF2 中成纤维细胞生长优势是被证实。此外， 除了耗尽有丝分裂原， 成纤维细胞也可能不适应培养基， 在体外和体内， 影响少突胶质细胞祖细胞到少突胶质细胞的生长 动力学和分化过程。成纤维细胞的存在， 因此降低了获得少突胶质细胞祖细胞扩增培养基 的效率。
我们预期， 尤其是在受污染细胞具有生长优势情况下， 确定更纯净和同种少突胶 质细胞祖细胞群。 因此， 启动搜索成纤维细胞内特异性表达细胞表面标记， 用于将其区分于 PDGFRα+ 少突胶质祖细胞。 一组抗体用与于对含有成纤维细胞和少突胶质细胞的混合物的 培养基进行染色。结果显示， 单克隆抗体至 CD 105， 识别出糖蛋白 endoglin， 是将 PDGFRα+ 细胞群细分成两个亚群的有效试剂 ： PDGFRα+CD 105+( 成 纤 维 细 胞 ) 和 PDGFRα+CD 105-( 少突胶质前体细胞 )。
胎 儿 来 源 的 人 少 突 胶 质 前 体 细 胞 的 分 选 方 案 包 括 两 种 抗 体， CD 105-APC 和 PDGFRα-PE。采用两种抗体方案产生多种细胞批。结果表明， 这些细胞批具有相似的生长 特性和少突胶质细胞分化潜能。 此外， 成纤维细胞的出现没有在这些培养基中观察到， 直到 第 15 代， 最高传代检测到。结果表明， CD 105 是获得预期的少突胶质前体细胞群中使用的 有效阴性筛选标记物。
实施例 3 ： OPCs 增殖介质
增殖培养基采用下列组分按照指定浓度制备 ： 组 分 最 终 浓 度 DMEM， 谷氨酰 胺 (Invitrogen 公 司， cat#25030-081)2mM，丙 酮 酸 钠 (Sigma 公 司， cat#S8636)， 1mM， NAC(Sigma 公司， cat#A9165)， 1mM， N2 补充 (Invitrogen 公司， cat#17502-048 ； 含有铁传递 蛋白、 胰岛素、 腐胺、 硒和孕激素 )， B27 补充 (Invitrogen 公司， cat#17504-044)， 20ng/ml 人 bFGF(Biosource 公司， cat#PHG0024)， 20ng/ml PDGF-AA(Peprotech， cat#100-13A)， 10ng/ ml NT3(Peprotech 公司， cat#450-03)， 100ng/mlIGF1(Peprotech 公司， cat#AF-100-11)。
实施例 4 ： OPCs 分化
在第一个分化方案中， 通过加入三碘甲状腺氨酸 (T3) 物理去除或耗尽细胞培养 基中的生长因子有丝分裂原， OPCs 增殖被诱导分化。
少突胶质细胞染色方案如下 ：
少突胶质细胞 O4 染色。细胞采用一抗至 O4( 杂交瘤细胞上清液， 小鼠单克隆 ； 按 1 ∶ 2 比例使用 ) 在室温下孵育 30 分钟。 细胞用 0.1M PBS 洗涤一次， pH 值＝ 7.4。 细胞用冰 冷的 4％多聚甲醛固定 20 分钟。 细胞用 0.1M PBS5 在分钟内洗涤 2 次， pH 值＝ 7.4。 室温下， 细胞制备在 0.1M PBS 稀释的 10％马血清 ( “HS” ) 中封闭 30min， pH 值＝ 7.4。细胞用第二 抗体 ( 驴抗小鼠 IgG/Alexa488， 按 1 ∶ 500 比例使用， Invitrogen 公司， Cat#A21202) 孵育 ； 或者， 采用羊抗小鼠 IgM/Alexa488(Invitrogen 公司， Cat#A21042) 孵育， 黑暗中室温下用 1％ HS 稀释 1 小时。 细胞用 0.1M PBS 于黑暗中 5 分钟内洗涤 2 次。 用封固剂 (Vectashield 封固剂， 载体实验室， Cat#H-1000) 面向下将细胞固定在载玻片上或者留在培养孔内量化和 评定染色并于 4℃下保存。
在某些情况下， Hoechst( 核染色 ) 染色可按照如下使用。上述准备的细胞用 Hoechst 液 ( 按照 1 ∶ 10000 比例用 0.1％皂角苷稀释， Sigma 公司， Cat#S4521) 洗涤。室 温下， 细胞在 Hoechst 液中孵育 5 分钟， 随后用 0.1M PBS 洗涤 2 次。
实施例 5 ： OPCs 分化
在第二分化方案中， 通过去除生长因子有丝分裂原并加入 1 ％血清诱导 OPCs 分化。该分化方案产生高产量少突胶质细胞培养基。
在第三分化方案中， 通过去除生长因子有丝分裂原并加入 30nM T3(Sigma 公司， cat#T5516) 诱导 OPCs 分化。该分化方案产生高产量少突胶质细胞培养基。
实施例 6 ： 封装
如果封装 OPCs， 可采用下列步骤 ： 中空纤维由聚醚砜 (PES) 制得， 外径 720 米， 壁 厚 100 米 (AKZO-Nobel Wuppertal， 德国 )。这些纤维在美国专利 4,976,859 和 4,968,733 中进行了描述， 通过引述合并于本文中。 该纤维用于截留分子量。 PES #5 膜， 具有大约 280kd MWCO， 偶尔使用。在其他研究中， PES #8 膜， 具有大约 90KD MWCO， 也可使用。
该装置通常包括 ： 1) 半透聚醚砜中空纤维膜， AKZO Nobel Faser AG 公司制造 ； 2) 轮轴膜结构 ； 3) 光固化丙烯酸甲酯 (LCM) 树脂前端 ； 和 4) 有机硅系绳。
使用的半透膜通常具有以下特点 ： 内径 500+30m 壁厚 100+15m 扯断力 100+15cN 断裂伸长率 44+10％液压渗透率 63+8(ml/min m2 mmHg)nMWCO( 右旋糖酐 )280+20kd。
该装置组件是市面有售的。该 LCM 胶由 Ablestik 实验室 (Newark， Del.) 提供 ； Luxtrak 粘合剂 LCM23 和 LCM24)。系绳由特种有机硅材料加工商 (Robles， Calif.) 提供。 系绳尺寸是外径 0.79mm X 内径 0.43mm X 长度 202mm。该装置形状如下 ： 内表面有选择性 渗透皮肤。壁上有一个开孔泡沫结构。外表面有一个开放式结构， 孔达 1.5 米， 占外表面的 30+5％。
纤维材料第一次切成 5 厘米长段， 用光敏聚合的丙烯酸胶 (LCM-25， ICI) 密封每一 段的远端。经环氧乙烷灭菌和除气， 利用汉密尔顿注射器， 使用 25 号针头从附加进样口向 4 7 纤维段填充 10 -10 个细胞的悬浮液， 或者液体培养基， 或者水凝胶基质 ( 例如， 胶原蛋白溶 TM 液 (Zyderm )， 藻酸钠， 琼脂或壳聚糖 )。胶囊的近端使用同种丙烯酸胶密封。
有机硅系绳 ( 特种有机硅制造， Taunton， Ma.)( 内径 ： 690m ； 外径 ： 1.25mm) 放置在 便于操作和取出装置的纤维近端处。
实施例 7 ： OPCs 移植
靶向 OPCs 可被移植到啮齿动物大脑中， 用于评估移植可行性、 整合、 移植细胞的 表型， 以及健康动物体内细胞移植相关的行为改变。
移植按照标准技术执行。 举例来说， 成年老鼠用戊巴比妥钠麻醉 (45mg/kg， 腹腔注 射 )， 安置在 Kopf 立体定位仪中。中线切口设计在头皮中和螺旋钻孔用于注射细胞。使用 连接在 10μl 汉密尔顿注射器上的玻璃毛细管将靶向 OPCs 移植到大鼠纹状体内。每个动 物接收到约 250,000-500,000 个细胞， 总体积为 2μl。 传代后 1-2 天细胞被移植， 细胞悬液 由 5-20 个细胞的未分化的 OPC 细胞群构成。植入之后， 皮肤被缝合。
实施例 8 ： OPCs 移植到患有脱髓鞘疾病的啮齿动物模型中
靶向 OPCs 可能被移植到啮齿动物大脑中， 用于评估移植可行性、 整合、 移植细胞 的表型， 以及损伤或患病动物体内细胞移植相关的行为改变。
移植按照标准技术执行。举例来说， 新生儿老鼠或小鼠低温麻醉， 安置在 Kopf 立 体定位仪中。中线切口设计在头皮中和螺旋钻孔用于注射细胞。使用连接在 10μl 汉密尔 顿注射器上的玻璃毛细管将靶向 OPCs 移植到动物的胼胝体、 菌毛、 大脑脚和 / 或脊髓中。 每 个动物接收到约 300,000-600,000 个细胞， 总体积为 6μl。传代后细胞立即移植或 1-2 天 后移植， 细胞悬液由 5-20 个细胞的未分化的 OPC 细胞群构成。植入之后， 皮肤被缝合或者钉住。或者， 新生儿或少年 shiverer 小鼠低温麻醉或者采用异氟醚麻醉， 安置在 Kopf 立体 定位仪中。中线切口设计在头皮中和螺旋钻孔用于注射细胞。使用连接在 10μl 汉密尔顿 注射器上的玻璃毛细管将靶向 OPCs 移植到老鼠的胼胝体、 菌毛、 大脑脚和 / 或脊髓中。每 个动物接收到约 300,000-600,000 个细胞， 总体积为 6μl。传代后细胞立即移植或 1-2 天 后移植， 细胞悬液由未分化的单个 OPC 或者 5-20 个细胞群构成。植入之后， 皮肤被缝合或 者钉住。
实施例 9 ： 采用靶向 OPCs 后代体外治疗神经退行性疾病
常规吸入流产后， 从胎儿脑组织得到靶向 OPCs， 收集进无菌收集装置中。 按照实施 例 1 或 2 所述， 2x4x1 毫米组织被解剖分离。然后， 靶向 OPCs 增殖。靶向 OPC 后代神经移植 进血型匹配并患有神经退行性疾病的宿主体内。使用 BRW 电脑断层扫描 (CT) 立体定向引 导完成手术。病人静脉注射咪唑安定与局部麻醉 suppiemencea。该病人进行 CT 扫描， 建 立接受移植区域的坐标。注射插管由 17 号不锈钢外层插管和 19 号细针组成。插入脑内校 正坐标， 然后取出并替换为 19 号注射插管， 19 号注射插管预装了 30μL 组织悬液。插管被 撤回时， 细胞以 3μL/ 分钟的速度慢慢注入。多个立体定位核芯针穿过目标区， 相隔约 4 毫 米。病人进行 CT 扫描检查术后出血或水肿。手术后不同时间间隔进行神经评价， 以及 PET 扫描， 确定被植入细胞的代谢活性。
实施例 10 ： 使用磷酸钙转染进行靶向 OPC 后代遗传改良
靶向 OPC 后代按照本文所述方法繁殖。然后， 使用磷酸钙转染技术转染细胞。为 了标准磷酸钙转染， 细胞机械分离成单个细胞悬液， 涂在组织培养基处理过的器皿上， 汇合 2 度 50％ (50,000-75,000 个细胞 / 厘米 )， 并且附着过夜。
改进后的磷酸钙转染程序执行如下 ： 用 TE 将含有 DNA(15-25 微克 ) 的无菌 TE 缓冲 液 (10mM Tris， 0.25mM EDTA， pH 值＝ 7.5) 稀释至 440μL， 向 DNA/TE 缓冲液中加入 60μl 的 2M 氯化钙 (pH 值至 5.8， 1M HEPES 缓冲液 )。总体积 500μl 的 2XHeBS(HEPE S- 缓冲盐 水； 275mM 氯化钠， 10mM 氯化钾， 1.4mM 磷酸氢二钠， 12mM 葡萄糖， 40mM HEPES 缓冲剂粉末， pH 值＝ 6.92) 滴加到该混合物中。该混合物室温下放置 20 分钟。细胞用 IX HeBS 和 1ml 沉淀 DNA 的磷酸钙溶液进行简单洗涤， 加入到每个培养板内， 细胞在 37℃下孵育 20 分钟。 孵育之 后， 10mis 完全培养基添加到细胞中， 培养板又放置在孵化器内 (37℃， 充有 9.5％ CO2)3-6 个小时。DNA 和培养基在孵化期结束被抽除， 而细胞用完全培养基洗涤 3 次， 然后放回到孵 化器中。
实施例 11 ： 使用病毒载体进行靶向 OPCs 的遗传改良
靶向 OPCs 按照本文所述方法增殖， 然后用含有除了报告基因如 GFP( 绿色荧光蛋 白 ) 之外的目的基因的慢性病毒载体感染。慢病毒悬浮液加入到培养基里， OPCs 增殖并孵 育 24 个小时。24 个小时后， 培养基被除去， 用新鲜培养基替换， OPCs 又孵育 3 天。收集细 胞， 离心分离， 用流式细胞仪分选表达目的基因的细胞。阳性细胞返回到增殖培养基。
采用前述实施例中描述的程序， 转导 OPC 后代移植到啮齿动物或人患者体内。
实施例 12 ： OPCs 移植到脊髓损伤的啮齿动物模型中
靶向 OPCs 可能被移植到啮齿动物脊髓中， 评估移植可行性、 整合、 移植细胞的表 型， 以及脊髓损伤动物体内细胞移植相关的行为改变。
动物接受椎体高度 T9 椎板切除手术。使用脊髓打击器 ( 精密系统和仪表， 列克星敦， 肯塔基州 )， 动物则受到 50 千达因 (KD) 脊髓挫伤损伤。 脊髓损伤七天后， 使用的 Basso、 Beattie、 和 Bresnahan 评分表 (BBB 评分法 ) 测试小鼠， 随机接受 OPCs 或载体对照。使用 贴附到纳米管注射器上的斜面轻型微吸管， 将细胞从病灶中心前后两侧注入。每个动物接 收 5 万至 8 万个细胞。
实施例 13 ： OPCs 移植到 MS 啮齿类动物模型中
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG) 诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 是研 究多发性硬化症的临床和病理特点被广泛接受的模型。
移植按照标准技术执行。举例来说， MOG 诱导 EAE 影响的成年老鼠用异氟醚气体 麻醉， 并安置在 Kopf 立体定位仪中。中线切口设计在头皮中和螺旋钻孔用于注射细胞。使 用连接在 10μl 汉密尔顿注射器上的玻璃毛细管将靶向 OPCs 移植到动物胼胝体、 菌毛、 大 脑脚、 侧脑室空间和 / 或脊髓中。每个动物接收到约 300,000-600,000 个细胞， 总体积为 6μl。传代后细胞立即移植或 1-2 天后移植， 细胞悬液由未分化的单个 OPC 或者 5-20 个细 胞群构成。植入之后， 皮肤被缝合或者钉住。
实施例 14 ： 扩增 PDGFR+CD105- 少突胶质细胞祖 (OPC) 细胞群移入能力的鉴定
为了确定是否 FACS 被分离， 体外扩增少突胶质细胞祖细胞存活， 迁移， 并具有体 内髓鞘化的能力， 使用 shiverer 小鼠、 脱髓鞘的啮齿类动物模型， 进行一系列移植研究。 shiverer 小鼠天然具有大部分 mbp 基因缺失， 导致不完全的中枢神经系统髓鞘形成。为 了避免人体细胞异种排斥反应， shiverer 小鼠与免疫缺陷的 NOD-Scid 小鼠回交。研究两 种不同的 shiverer/Scid 年龄组的少突胶质细胞祖细胞植入 ： 青少年 (P21-P30) 和新生儿 (P0-P1)。shiverer/Scid 小鼠有大约 8 周相对较短的寿命， 因此研究的移植后最长的时间 点针对新生儿注射是 8 周和幼年注射是 5 周。
少突胶质祖细胞生长为单层。为了准备用于移植的细胞， 采用类似于传代 OPCs 的 方案之后， 使用胰蛋白酶 OPCs 从烧瓶中剥离。然后， 细胞接触到胰蛋白酶抑制剂阻止蛋白 水解消化， 用培养液洗涤两次， 再悬浮在体外培养基中， 体外培养基含有最终密度 105 个细 胞 /μl 的抗氧化剂 NAC(1mM)。
对 OPCs 以悬浮培养形式在胰蛋白酶处理后保存至少一天的能力进行测试。悬浮 液中的保存期 1 天有以下 3 个原因的优势 ： 1) 移植和 / 或冷冻保存之前将使细胞从潜在破 坏性酶处理中恢复 ； 2) 动物手术安排中更灵活 ； 3) 等待移植的 OPCs 能够装运到非现场处 ( 实验室或诊所 )。最后， 考虑到 OPCs 的临床应用潜力， 对深低温冷冻保存后 OPCs 的植入 能力和髓鞘化潜力进行了测试， 取得积极成果。
实施例 15 ： 移植
少年或新生儿 shiverer/Scid 小鼠放置在立体定位框架内， 1μlOPC 悬浮液注射 在 2-3 大脑位置， 双侧注射 (4-6 注射 / 小鼠 )。注射靶向胼胝体、 菌毛和小脑脚 ( 见图 1)， 髓鞘型动物的脑区严重髓鞘化 ( 白质丰富 )， 但 shiverer/Scid 小鼠严重脱髓鞘。小鼠在 不同时间点死掉， 直到第 8 周， 使用单克隆抗体 SC 121 分析小鼠脑部存在的人体细胞， 使用 MBP 抗体分析存在的人来源少突胶质细胞， 能够形成髓鞘的小鼠神经轴突。由于 shiverer 小鼠突变， 删除了大部分 MBP 基因， MBP 蛋白不是由小鼠少突胶质细胞产生， 因此抗 MBP 抗 体检测到的任何 MBP 是来自人。
表 15-1- 源自 4 种不同供体组织的 4 种 OPC 细胞株中获得的植入数据汇总。注射了含有人细胞 (SC121 染色确定 ) 的 OPCs 的所有幼年和新生儿动物测试了所 有年龄段。当 MBP 染色时， 所有动物也证实阳性染色 ( 参见图 2， 系列部分 SC121 和 MBP 染 色的一个实施例 )。
也测试了使用慢病毒载体基因改良的 OPCs 的可能性。为证明该想法， 在 MBP 启动 子控制下， 我们使用了表达报告基因 GFP 的慢病毒载体 ( 绿色荧光蛋白 )。直接目测观察 OPCs( 无抗体染色 )， OPCs 活跃转录 MBP 基因 ( 亮绿色细胞 )， 并具有成熟的髓鞘化少突胶 质细胞形貌 ( 如具有像电缆的形貌， 与轴突束平行排列 )。图 3 显示 MBP-GFP OPCs 移植的 shiverer/Scid 小鼠的一个实施例， 移植后第 8 周死掉。
体内研究表明， 新生儿和青少年 shiverer 小鼠是适于测试扩增 OPCs 的植入和髓 鞘形成能力的模型。没有观察到新生儿和青少年 shiverer/scid 小鼠之间植入质量的主要 差异。
体内研究表明， OPCs 植入和髓鞘形成未显著受到传代数量的影响 ； 例如， 注射供 体 2703 的新生儿， 在人细胞总数量和髓鞘化程度上没有性质上的区别， 表明效力 ( 能够植 入和髓鞘化的能力 ) 没有随着第 16 次传代而减少， 最大传代数被测出。
体内研究表明， 新鲜传代的 OPCs( 从未冻结 ) 的效力与相同传代或类似传代的预 先深低温冷冻保存的 OPCs 的效力对比时， 植入和髓鞘化没有主要性质上的差别。虽然只 有新生动物移植了先前深低温冷冻保存的细胞， 我们并不期望在少年动物中得到不同的结 果。这一结果表明， 在效力没有检测到任何损失的情况下 OPC 培养可以深低温保存。同样， 由于停药时间 1 天， 没有效力损失 ( 植入或髓鞘化能力 )， 这表明该方案可以被用来促进以 备用形式 OPC 培养基转移至非现场处。
等同物
本发明的一个或多个实施方案在上述描述中进行了阐述。 虽然相似或等同于本文 中描述的方法和材料可在本发明的实施或测试中使用， 对优选的方法和材料进行了描述。 本发明的其他特征、 目标、 和优势从描述和权力要求书来看是显而易见的。 在说明书和附加 权利要求书中， 除非另外清楚说明， 单数形式包括复数。除非另外规定， 本文中使用的所有 科技术语具有普遍被本发明所属领域的技术人员所理解的相同涵义。