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一种低温 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 及其基因
    【技术领域】
     本发明涉及基因工程技术领域， 具体地说是一种低温 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 及其基因。 背景技术 α- 半乳糖苷酶 （α-galactosidase， EC 3.2.1.22） 又叫密二糖酶 （Melibiase） ， 是一种外切糖苷酶类， 能特异性水解密二糖、 棉籽糖、 水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖底物及半 乳甘露聚糖等多聚糖底物中的 α- 半乳糖苷键。这些低聚糖和多聚糖广泛存在于食品和饲 料原料中， 尤以豆科类植物种子含量最高 （Karr-Lilienthal et al., Livest Prod Sci, 2005, 97: 1–12.） 。
     α- 半乳糖苷酶可应用于饲料、 食品和医疗等行业中。在饲料行业中， α- 半乳糖 苷酶制剂作为一种促生长类酶制剂， 可以去除或减少 α- 半乳糖苷寡糖类抗营养因子 （棉 籽糖等低聚糖） 对营养物质消化的副作用， 促进动物对营养物质的消化， 提高饲料利用率 ； 在食品行业中， α- 半乳糖苷酶制剂可以减少棉籽糖等在豆奶中的含量， 增加人类对豆类营 养的吸收 ； 在医疗行业中， α- 半乳糖苷酶可将 B 型红细胞改造成 O 型红细胞及治疗 Fabry 疾病 (Yoshimitsu et al., Mol Biol Rep, 2011, 38: 3145–3152.) 等。
     具有低温活性的酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程。 水产动物终生或大部 分时间生活于水中， 体温随水温或气温变化而变化， 一般在 10–20℃（Zhou et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 85: 323–333.） 。因此， 水产饲料中的应用酶需要在此低 温 （10–20℃） 环境下具有催化活性。另一方面， 大多水产动物消化道环境呈中性 （如鲤科 鱼类） 或偏碱性， 水产饲料中添加的外源酶还需在中性或偏碱性等条件下具有催化活性。
     发明内容
     本发明的目的是提供一种低温 α- 半乳糖苷酶。
     本发明的再一目的是提供编码上述 α- 半乳糖苷酶的基因。
     本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
     本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
     本 发 明 所 述 α- 半 乳 糖 苷 酶 AgaAGN14 可 得 自 节 杆 菌 （Arthrobacter sp.） 。 AgaAGN14 的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
     本发明的 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 总共含 702 个氨基酸， 理论分子量为 77.5kDa。 该酶的最适 pH 值为 6.5， 在 pH6.0–9.0 的范围内维持 50% 以上的酶活性 ； 经 pH5.0–10.0 的缓冲液处理 1h， 该酶酶活剩余达 80% 以上 ； 该酶最适温度为 45 ℃， 在 10 ℃和 20 ℃分别 具有 28% 和 30% 以上的酶活 ； 在 pH 6.5 及 37 ℃下， 该酶对 0.5%（w/v）棉籽糖的比活为 −1 0.69±0.01 U mg ， 对 1% 的密二糖、 菜粕和棉籽粕的比活分别为 34.45±2.15， 2.94±0.27 −1 和 2.65±0.22 U mg 。
     本发明提供了编码上述 α- 半乳糖苷酶的基因 agaAGN14 ， 该基因序列如 SEQ IDNO. 2 所示。
     本 发 明 通 过 PCR 的 方 法 分 离 克 隆 了 α- 半 乳 糖 苷 酶 AgaAGN14 的 编 码 基 因 agaAGN14 ， 其全长 2109bp， 起始密码为 ATG， 终止密码为 TGA。经 BLAST 比对， 该 α- 半乳糖 苷酶基因 agaAGN14 编码的氨基酸序列与 GenBank 中 Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3 来源的潜在 α- 半乳糖苷酶 （ADX74417） 具有最高的一致性， 为 53.7% ； 与确证活性的 Streptomyces sp. S27 来源 α- 半乳糖苷酶 （ADK91095） 的一致性为 50.0%。说明 α- 半 乳糖苷酶 AgaAGN14 是一种新的 α- 半乳糖苷酶。
     本发明还提供了包含上述 α- 半乳糖苷酶基因 agaAGN14 的重组载体， 优选为 pET-agaAGN14 。将本发明的 α- 半乳糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之 间， 使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。 作为本发明的一个最优选的实施方案， 将本发 明的 α- 半乳糖苷酶基因插入到质粒 pET-28a（+） 上的 Hind III 和 Xho I 限制性酶切位点 之间， 得到重组大肠杆菌表达质粒 pET-agaAGN14 。
     本发明还提供了包含上述 α- 半乳糖苷酶基因 agaAGN14 的重组菌株， 优选所述菌 株为大肠杆菌、 酵母菌、 芽孢杆菌或乳酸杆菌， 优选为重组菌株 BL21(DE3) /agaAGN14 。
     本发明制备 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的方法按以下步骤进行 ： 1） 用上述的重组载体转化宿主细胞， 得重组菌株 ； 2） 培养重组菌株， 诱导重组 α- 半乳糖苷酶表达 ； 3） 回收并纯化所表达的 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14。 其中， 优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞， 优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞 BL21（DE3） ， 得到重组菌株 BL21(DE3) /agaAGN14 。
     本发明提供了一个新的 α- 半乳糖苷酶基因， 其编码的 α- 半乳糖苷酶最适 pH6.5 ； 在 10℃和 20℃下分别具有 28% 和 30% 以上的酶活 ； 经 0.1M pH5.0–10.0 缓冲液在 25℃下处理 1h， 仍能保持 ~85% 的活性 ； 较好的水解各种自然底物的能力 ； 可作为一种饲料 或食品添加剂应用于饲料与食品行业。
     附图说明
     图1 ： 在大肠杆菌中表达的重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的 SDS-PAGE 分析， 其中， M： 低分子量蛋白质 Marker ； 1： 纯化的重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14。
     图2： 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的最适 pH。
     图3： 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的 pH 稳定性。
     图4： 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的最适温度。
     图5： 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的热稳定性。 具体实施方式
     试验材料和试剂 1、 菌株及载体 ： 节杆菌 （Arthrobacter sp.） 来源于中国普通微生物菌种保藏管理中 心 CGMCC 1.1525 ； 大肠杆菌 Escherichia coli BL21（DE3） 和表达载体 pET-28a（+） 购于 Novagen 公司。
     2、 酶类及其它生化试剂 ： 限制性内切酶、 DNA 聚合酶、 连接酶和 dNTP 购自 TaKaRa公司 ； p NPG（p -nitrophenyl-α-d-galactopyranoside） 和密二糖购自 Sigma 公司 ； 其它都 为国产试剂 （均可从普通生化试剂公司购买得到） 。
     3、 培养基 ： LB 培养基 ： Peptone 10g， Yeast extract 5g， NaCl 10g， 加蒸馏水至 1000ml， pH 自然 （约为 7） 。固体培养基在此基础上加 2.0%（w/v） 琼脂。
     说明 ： 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法， 均参照 《分子克隆实验 指南》 （第三版） J. 萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行， 或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
     实施例 1 ： α- 半乳糖苷酶基因 agaAGN14 的克隆 提取节杆菌基因组 DNA ： 将液体培养 2d 的菌液离心取菌体， 加入 1mL 溶菌酶， 37℃处理 60min， 再加入裂解液， 70℃水浴裂解 60min， 每隔 10min 混匀一次， 在 4℃下 10000rpm 离心 5min。 取上清于酚 / 氯仿中抽提除去杂蛋白， 再取上清加入等体积异丙醇， 于室温静置 5min 后， 4℃下 10000rpm 离心 10min。弃上清， 沉淀用 70% 的乙醇洗涤两次， 真空干燥， 加入适量 TE 溶解， 置于 -20℃备用。
     表 1. α- 半乳糖苷酶基因 agaAGN14 的克隆与表达引物引物序列 （5'---3'） TGTTCRTCCTNGAYGAYKGNTGG GGGYTTAYSATYTCNGGYTCCC AGGCCGAATTCCATGCCCA ACGTGGCTGATCAGCGGATCAA GGGGCTTGATCCGCTGATCA GGGCATGGAATTCGGCCTTTG AATTGGTGGGCCAGCACATCG GCTCTTTGGGCACTTCGGGATG agaAGN14 F CCCAAGCTTGCATGAGCAGCGTAATACTCGAAAG agaAGN14 R CCGCTCGAGTGCACCCTCCGTTCGGCGGGCA 引物名称 GH36F GH36R usp1 usp2 dsp1 dsp2 dsp3 dsp4 引物长度 （bp） 23 22 19 22 20 21 21 22 34 31根 据 糖 苷 水 解 酶 第 36 家 族 的 保 守 序 列 （[F/L/V]-[L/V]-[L/M/V]-D-D-G-W-F 和 E-P-E-M-[V/I]-[N/S]-[P/E]） 设计合成了简并引物 GH36F 和 GH36R（表 1） 。以节杆菌总 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应参数为 ： 94℃变性 5min ； 然后 94℃变性 30sec， 43℃退 火 30sec， 72℃延伸 30sec， 30 个循环后 72℃保温 10min。PCR 结果得到一约 172bp 片段， 将 该片段回收后与 pMD 18-T 载体相连， 然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分 公司测序。
     根据测序得到的核甘酸序列， 设计热不对称交错 PCR（简称 TAIL-PCR） 上游特异性 引物 2 条， 并将它们分别命名为 usp1 和 usp2 ； 另设计下游特异性引物 4 条， 并将它们分别 命名为 dsp1、 dsp2、 dsp3、 dsp4（表 1） 。特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向， sp2 的位置设计在 sp1 的内侧， sp4 的位置设计在 sp3 的内侧。每两个引物之间的距离没有 严格规定， 引物长度为 19–22nt， 引物退火温度在 60–70℃。通过 TAIL-PCR 得到已知基因 序列的侧翼序列， 扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序 结果与已知基因序列片段相拼接， 得到 α- 半乳糖苷酶基因 agaAGN14 ， 该基因序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
     实施例 2 ： 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的制备 以 agaAGN14 F 和 agaAGN14 R 为引物对 （表 1） ， 节杆菌基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增。 PCR 反应参数为 ： 94℃变性 5min ； 然后 94℃变性 30sec， 58℃退火 30sec， 72℃延伸 2min 30sec， 30 个循环后 72℃保温 10min。PCR 结果得到 α- 半乳糖苷酶的基因 agaAGN14 ， 并在 该基因 5’ 和 3’ 端分别引入了 Hind Ш 和 Xho I 酶切位点。将编码 α- 半乳糖苷酶的基因 agaAGN14 进行双酶切 （Hind Ш 和 Xho I） ， 同时将表达载体 pET-28a（+） 进行双酶切 （Hind Ш 和 Xho I） 。将上述酶切的 α- 半乳糖苷酶 agaAGN14 与表达载体 pET-28a （+） 相连接， 获得含 有 α- 半乳糖苷酶基因 agaAGN14 的重组质粒 pET-agaAGN14 并转化大肠杆菌 BL21（DE3） ， 获得重组大肠杆菌菌株 BL21(DE3) /agaAGN14 。
     取含有重组质粒 pET-agaAGN14 的 E. coli BL21（DE3）菌株和只含有 pET-28a （+） 空质粒的 E. coli BL21（DE3） 菌株， 以 0.1% 的接种量接种于 LB（含 50µg/mL Kan） 培 养液中， 37℃快速振荡 16h。然后将此活化的菌液以 1% 接种量接种到新鲜的 LB（含 50µg/ mL Kan） 培养液中， 快速振荡培养约 2–3h（OD600 达到 0.6–1.0） 后， 加入终浓度 0.7mM 的 IPTG 进行诱导， 于 20℃继续振荡培养约 20h 或 26℃振荡培养约 8h。12000rpm 离心 5min， 收集菌体。用适量的 pH7.0 Tris-HCl 缓冲液悬浮菌体后， 于低温水浴下超声波破碎菌体。 以上胞内浓缩的初酶液经 13,000rpm 离心 10min 后， 吸取上清并用 Nickel-NTA Agarose 纯 化目的蛋白。SDS-PAGE 结果 （图 1） 表明， 重组 α- 半乳糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达， 经 Nickel-NTA Agarose 纯化后为单一条带。 实施例 3 ： 纯化的重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的性质测定 1、 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的活性分析 实施例 2 纯化的重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的活性测定方法采用 p NPG 法 ： 将 p NPG 溶于 0.1M 缓冲液中， 使其终浓度为 2mM ； 反应体系含 100μL 适量酶液， 900μL 的 2mM 底物 ； 底物在反应温度下预热 5min 后， 加入酶液再反应 10min， 然后加 1.5mL 1M Na2CO3 终止反应， 冷却至室温后在 405nm 波长下测定释放出的 p NP ； 1 个酶活单位 （U） 定义为每分钟分解 p NPG 产生 1μmolp NP 所需的酶量。对底物棉籽糖、 棉籽粕和菜粕的活性测定方法采用 DNS 法 ： 将 底物溶于 0.1M 缓冲液中， 使其终浓度为 0.5% 或 1.0% （w/v） ； 反应体系含 100μL 适量酶液， 900μL 底物 ； 底物在反应温度下预热 5min 后， 加入酶液后再反应 120min， 然后加 1.5mL DNS 终止反应， 沸水煮 5min， 冷却至室温后在 540nm 波长下测定 OD 值 ； 1 个酶活单位 （U） 定义为 在给定的条件下每分钟分解底物产生 1μmol 半乳糖所需的酶量。对底物密二糖的活性测 定方法采用葡萄糖氧化酶法 ： 将底物溶于 0.1M 缓冲液中， 使其终浓度为 0.5%（w/v） ； 反应 体系含 100μL 适量酶液， 900μL 底物 ； 底物在反应温度下预热 5min 后， 加入酶液后再反应 10min， 然后根据葡萄糖氧化酶试剂盒 （上海荣盛生物药业有限公司 CAT361590） 说明书测定 酶活性 ； 1 个酶活单位 （U） 定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生 1μmol 葡萄糖所需 的酶量。
     2、 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的最适 pH 和 pH 稳定性测定 ： 酶的最适 pH 测定 ： 将 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 在 37℃下和 0.1M pH5.0–11.0 的缓 冲液中进行酶促反应。酶的 pH 稳定性测定 ： 将纯化的酶液置于 0.1M pH4.0–11.0 的缓冲 液中， 在 37℃下处理 1h， 然后在 pH6.5 及 37℃下进行酶促反应， 以未处理的酶液作为对照。 缓冲液为 ： 0.1M McIlvaine buffer（pH4.0–8.0） 和 0.1M glycine-NaOH（pH9.0–11.0） 。 以 p NPG 为底物， 反应 10min， 测定纯化的 AgaAGN14 的酶学性质。结果表明 ： AgaAGN14 的最 适 pH 为 6.5， 在 pH6.0–9.0 的范围内维持 50% 以上的酶活性 （图 2） ； 经 pH5.0–10.0 的缓
     冲液处理 1h， 仍能保持 ~85% 的活性 （图 3） 。
     3、 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的最适温度及热稳定性测定 ： 酶的最适温度测定 ： 在 pH6.5 的缓冲液中， 于 0–60℃下进行酶促反应。酶的热稳定性 测定 ： 将同样酶量的酶液置于 37℃和 50℃中， 处理 0–60min 后， 在 pH6.5 及 37℃下进行酶 促反应， 以未处理的酶液作为对照。 以 p NPG 为底物， 反应 10min， 测定纯化的 AgaAGN14 的酶 学性质。结果表明 ： AgaAGN14 的最适温度为 45℃， 在 10℃和 20℃分别具有 28% 和 30% 以上 的酶活 （图 4） ； 在 37℃下酶 AgaAGN14 很稳定 （图 5） 。
     4、 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 的动力学参数测定 ： 酶的动力学参数一级反应时间测定 ： 在 pH6.5 及 45℃下， 以 0.5mM p NPG 为底物， 依次 在酶促反应的 1–30min 内终止反应并测定酶活性， 计算出酶活性与反应时间的比值， 若在 一定时间内该比值保持稳定， 则此时间为一级反应时间。用 0.1–4.0mM p NPG 为底物， 在 pH6.5、 45℃和一级反应时间下， 根据 Lineweaver-Burk 方法测定 K m、 V max 和 k cat。经测定， 在 −1 − 45℃ pH6.5 条件下， AgaAGN14 对 p NPG 的 K m、 V max 和 k cat 分别为 0.41 mM 、 18.28µmol min 1 − − mg 1 和 25.36 s 1。
     5、 不同金属离子及化学试剂对重组 AgaAGN14 活力的影响 ： 在酶促反应体系中加入 10mM 的金属离子及化学试剂， 研究其对酶活性的影响。在 37℃、 pH6.5 条件下， 以 p NPG 为底物测定酶活性。结果 （表 2） 表明， 10mM 的 Ag+、 Hg2+ 及 SDS 可完全或几乎完全抑制 AgaAGN14 ； K+、 Ca2+、 Mn2+、 Fe3+、 Ni2+、 Cu2+ 和 β-mercaptoethanol 对 AgaAGN14 具一定的抑制作用， 剩余酶活 ~60% ； 其余金属离子和化学试剂对 AgaAGN14 的影响 较小。
     表 2. 金属离子及化学试剂对重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 活力的影响试剂 CK Co2+ Pb2+ Zn2+ Mg2+ Na+ K+ Ca2+ Mn2+ Fe3+ Ni2+ Cu2+ Ag+ Hg2+ EDTA β-mercaptoethanol SDS 相对酶活 (%) 100.0±3.9 94.7±2.8 87.2±8.7 76.5±1.7 74.3±0.9 68.1±3.4 58.7±0.8 57.7±1.5 57.5±5.9 56.8±4.1 55.0±2.2 52.2±4.2 0 0 83.0±4.1 58.7±1.6 0.4±0.26、 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 对底物的降解 ： 在 pH 6.5 及 37℃下， 重组 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 对 0.5%（w/v） 棉籽糖的比活为 −1 0.69±0.01 U mg ， 对 1% 的密二糖、 菜粕和棉籽粕的比活分别为 34.45±2.15， 2.94±0.27 −1 和 2.65±0.22 U mg 。7102321599 A CN 102321605序列表1/7 页SEQUENCE LISTING <110> <120> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <400> 云南师范大学 一种低温 α- 半乳糖苷酶 AgaAGN14 及其基因 2 PatentIn version 3.3 1 702 PRT 节杆菌 （Arthrobacter sp.） 1Met Ser Ser Val Ile Leu Glu Arg Asp Gly Thr Ala Val Ile Leu Asp 1 5 10 15Val Ser Gly Leu Pro Gln Val Leu His Trp Gly Ala Val Leu Pro Gly 20 25 30Gln Ile Pro Thr Ala Ser Asp Leu Ala Ala Pro Val Val His Ser Arg 35 40 45Tyr Asp Phe Pro Val Val Ala Asn Pro Leu Trp Pro Ala Ala Ala Glu 50 55 60Gly Trp Arg Gly Thr Pro Leu Val Ser Gly Ser Arg Asn Arg Ala Asp 65 70 75 80Ala Ser Pro Arg Phe Arg Asn Pro Asp Val Gln Lys Ser Gly Phe Val8102321599 A CN 102321605序85列90表952/7 页Leu Thr Leu Thr Ala Glu Asp Ala Asp Thr Ala Leu Gln Leu Lys Thr 100 105 110Glu Leu Glu Leu Leu Glu Gly Gly Leu Leu Arg Ile Arg Asn Thr Leu 115 120 125Ala Asn Thr Gly Ser Gly Pro Tyr Gln Leu Leu His Leu Ser Val Cys 130 135 140Leu Pro Val Ala Pro Glu Ala Gly Glu Leu Leu Asp Thr Thr Gly Arg 145 150 155 160Trp Thr Arg Glu Arg Ser Pro Gln Arg Leu Pro Phe Gly Gln Gly Thr 165 170 175Trp Leu Arg Glu Gly Arg His Gly Arg Thr Gly His Asp Ala Pro Val 180 185 190Leu Leu Ala Ala Gly Thr Pro Gly Phe Gly Asn Arg His Gly Lys Val 195 200 205Gln Ala Val His Phe Ala Trp Ser Gly Asn Trp Arg Val Arg Ala Glu 210 215 220Arg Thr Pro Asp Pro Ser Arg Met Leu Ala Ala Glu Glu Leu Phe Gly 225 230 235 2409102321599 A CN 102321605序列表3/7 页Pro Gly Glu Ala Glu Leu Ala Pro Gly Glu Ser Tyr Thr Thr Pro Trp 245 250 255Leu Tyr Ala Ala His Ser Asn Ala Gly Leu Asp Gly Ile Thr Ala Ala 260 265 270Phe His Thr Trp Leu Arg Thr Arg Pro Asn His Pro Arg Arg Pro Arg 275 280 285Pro Val Val Leu Asn Thr Trp Glu Ala Val Tyr Phe Asp His Asn Leu 290 295 300Gln Thr Leu Arg Glu Leu Ala Asp Thr Ala Ala Ala Leu Gly Thr Glu 305 310 315 320Arg Phe Val Leu Asp Asp Gly Trp Phe Gly Gly Arg Arg Asp Asp His 325 330 335Arg Gly Leu Gly Asp Trp Thr Val Ser Pro Glu Ala Trp Pro Glu Gly 340 345 350Leu Asp Pro Leu Ile Ser His Val Arg Gly Leu Gly Met Glu Phe Gly 355 360 365Leu Trp Val Glu Pro Glu Met Ile Ser Leu Asp Ser Asp Thr Ala Arg 370 375 380Ser His Pro Glu Trp Ile Cys Arg Ala Arg Thr Glu Glu Leu Pro Pro 385 390 395 40010102321599 A CN 102321605序列表4/7 页Gln Trp Arg His Gln Gln Val Leu Asp Leu Thr Arg Gly Glu Ala Phe 405 410 415Lys His Val Leu Arg Gln Leu Asp Asp Leu Leu Ala Asn His Gln Ile 420 425 430Ser Phe Leu Lys Trp Asp Gln Asn Arg Asp Leu Thr Asp Met Ala Ser 435 440 445Gln Gly Arg Pro Ser Ala Arg Asn Gln Thr Leu Ala Ala Tyr Arg Leu 450 455 460Met Ser Glu Leu Lys Ala Arg His Pro His Val Glu Ile Glu Ala Cys 465 470 475 480Ser Ser Gly Gly Ala Arg Val Asp Leu Gly Val Leu Glu Phe Ala Asp 485 490 495Arg Val Trp Ala Ser Asp Ser Asn Asp Ala Leu Glu Arg Gln Arg Ile 500 505 510Gln Gln Trp Thr Gln Arg Leu Leu Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln His 515 520 525Ile Gly Pro Pro Gln Ala His Thr Ser Gly Arg Thr His Gly Leu Val 530 535 540Phe Arg Gly Leu Thr Ala Leu Phe Gly His Phe Gly Met Glu Trp Asp 545 550 555 56011102321599 A CN 102321605序列表5/7 页Ile Arg Glu Ala Lys Gly Arg Asp Arg Glu Leu Leu Ala Gly Leu Ile 565 570 575Ala Leu Tyr Lys Gln His Arg Thr Leu Ile His Asn Gly Thr Ala Val 580 585 590Arg Ala Asp Leu Ala Asp Pro Gly Leu Gln Leu Tyr Gly Ala Val Ala 595 600 605Pro Asp Arg Ser Glu Ala Leu Tyr Val Tyr Ala Thr Leu Asp Ser Thr 610 615 620Leu Asp Glu Thr Pro Gly Arg Ala Ala Leu Pro Gly Leu Asp Pro Glu 625 630 635 640Gln Gly Tyr Arg Leu Asp Pro Val Ile Leu Asp Glu Pro Gly Thr Phe 645 650 655Leu Gln Arg Thr Pro Pro Ala Trp Leu Ala Thr Gly Leu His Ala Gly 660 665 670Gly Ala Trp Leu Gly Thr Ala Gly Val Pro Leu Pro Val Leu Asn Pro 675 680 685Glu Arg Ala Met Leu Leu His Ala Arg Arg Thr Glu Gly Ala 690 695 700<210>212102321599 A CN 102321605序列表6/7 页<211> <212> <213>2109 DNA 节杆菌 （Arthrobacter sp.）<400> 2 atgagcagcg taatactcga aagggacggc accgccgtca tcctggacgt gtccggcctt ccacaggtcc tgcactgggg agcggtgctg ccgggacaga tccccacagc ttcggacctt gccgcccccg tggtccactc ccggtacgat ttcccagtgg ttgccaaccc gttgtggccg gcggcagctg aagggtggcg gggaactcct ctggtctcgg gttcccggaa ccgtgccgat gcgtctcccc gattccggaa tcccgacgtg cagaagtcag gcttcgtcct caccctgacc gctgaggacg ccgatacagc cctgcagctc aagacagagc tggagcttct tgaagggggc ctgttgagga tacggaacac ccttgcgaac actggaagcg gcccctacca gctgctgcat ctctcggtgt gcctgcctgt ggccccagag gccggggaac tgctggatac tactggccgc tggacccggg aacgttcacc ccagcggctt cccttcggcc agggaacctg gctgcgggag gggcgtcacg ggcgcacagg ccacgatgcc cccgtgctgc tggctgccgg gactccgggg ttcggaaacc ggcacggcaa ggtccaggcg gtgcatttcg cctggagcgg gaactggcgc gtgcgcgccg aacggacacc cgatccctcc aggatgctcg cagccgagga actcttcggt ccgggcgaag 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