一种甲烷氧化菌菌剂的制备方法.pdf

一种甲烷氧化菌菌剂的制备方法，涉及一种甲烷氧化菌的混合培养方法。先利用矿化垃圾作为甲烷氧化菌载体和种源，将矿化垃圾进行甲烷氧化菌的富集，然后将富集的矿化垃圾加入常规甲烷氧化菌培养使用的NMS培养液的改进配方培养液，再通入甲烷∶氧气＝1∶1～1∶1.5体积比的混合气体进行培养。采用该方法，甲烷氧化菌培养的效果好、启动较快，两天左右即出现最大甲烷氧化率。本发明混合培养甲烷氧化菌，避免了传统培养方法菌株培养和纯种分离过程复杂和纯菌种不易保存的问题。本发明菌剂的制备方法简单，甲烷氧化效果明显，而且菌液容易保存和运输。菌剂可方便用于垃圾填埋场的甲烷排放控制，也可为工业化生产中提供甲烷氧化菌菌种。

1.  一种甲烷氧化菌菌剂的制备方法，先利用矿化垃圾作为甲烷氧化菌载体和种源，按常规方法将矿化垃圾进行甲烷氧化菌富集，其特征在于：在甲烷氧化菌富集的矿化垃圾中加入改进的NMS培养液，混合均匀，NMS培养液与甲烷氧化菌富集的矿化垃圾的配比是：100mLNMS培养液中加入0.5g～2g的甲烷氧化菌富集的矿化垃圾；接着，通入甲烷∶氧气＝1∶1～1∶1.5体积比的混合气体进行培养，混合气体的通入量为130～180mL/d·100mLNMS培养液，在pH值6～9，温度25～34℃下培养3～5天，甲烷氧化率超过1.5mL/h即制得甲烷氧化菌菌剂。

2.  根据权利要求1所述的一种甲烷氧化菌菌剂的制备方法，其特征在于：改进的NMS培养液是在常规甲烷氧化菌培养使用的NMS培养液的改进配方，其组成为：1L培养液含KH₂PO₄ 1.06g，Na₂HPO₄·12H₂O 4.34g，NaNO₃ 1.70g，K₂SO₄ 0.34g，MgSO₄·7H₂O 0.074g，FeSO₄·7H₂O 22.4mg。

一种甲烷氧化菌菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种甲烷氧化菌的混合培养方法，尤其是利用矿化垃圾作为菌种来源进行甲烷氧化菌的培养，制备甲烷氧化菌菌剂。
背景技术
甲烷是一种长期存在于大气中的温室气体，它对温室效应的贡献率是二氧化碳的26倍。生活垃圾填埋场是甲烷的主要产生源之一，由其产生的甲烷约占全球甲烷排放总量的1.5％～15％。因此控制和减少垃圾填埋场的甲烷释放量，对减少全球温室气体排放有重要的意义。我国大部分填埋场没有设置填埋场气体回收系统，这些填埋场的甲烷气体的释放给周围的环境带来安全隐患，(填埋气释放到周围环境达到一定浓度存在爆炸的危险，而进入大气层的甲烷气体具有温室效应，会加剧全球气候变暖)，需要对填埋场的甲烷排放进行控制。即使建有填埋场气体回收系统的填埋场，在气体回收系统停止运行的阶段，也存在相似的问题。
为获得高效甲烷氧化微生物体系，已从农业、水稻田、油田地表土壤、海洋和湖泊的底泥或沉积物等分离得到甲烷氧化菌。甲烷氧化菌所具有的甲烷单加氧酶是能够在常温常压下选择性氧化甲烷生成甲醇的酶系，具有转化效率高，选择性好的优点，并且能在常温常压下进行，因此甲烷氧化菌被用于生物催化甲烷制甲醇的工业生产。但是甲烷氧化菌生长速率慢、所得细胞浓度低是限制甲烷氧化茵工业化使用的主要因素。为了提高甲烷氧化菌的生长速度，不同的添加剂被加入到培养基中。“一种生活垃圾填埋场甲烷氧化覆盖材料”(申请号：200710040358.7)是用矿化垃圾与矿化污泥混合作填埋场覆盖材料，该材料可减少填埋场甲烷的排放量。矿化垃圾同矿化污泥混合后，压实和甲烷聚集条件下甲烷氧化效果明显增强。该覆盖材料通过其中甲烷氧化菌的作用对生活垃圾发酵产生的甲烷气体进行生物氧化，实现填埋场温室气体的减排。利用矿化垃圾培养甲烷氧化菌菌剂，可用于缺乏矿化垃圾的填埋场强化覆盖层的甲烷氧化过程，实现填埋场温室气体的减排。用矿化垃圾作为菌种来源培养甲烷氧化菌比用其它来源的菌种有优势，矿化垃圾中的甲烷氧化菌长期处于填埋场填埋气的环境中，所含有的菌种对填埋气适应性较强。此外，用矿化垃圾培养甲烷氧化菌或用作填埋覆土，可以消耗矿化垃圾。我国在填埋场和堆场填入的垃圾达几千万吨，其中的一些垃圾经多年的降解后，基本上达到了稳定化状态。这些矿化垃圾的资源非常充足，其利用对于垃圾资源化和填埋场土地利用均有重要意义。矿化垃圾开采后，腾出的空间可再填埋新鲜垃圾，使填埋单元的大部分可以重新利用，必然极大地缓解由于城市生活垃圾量不断增长给现有填埋场带来的压力。“一种促进甲烷氧化菌生长的方法”(申请号：200410077987.3)提出在培养基中加入有机酸，以提高甲烷氧化菌Mtrichosporium OB3b纯菌培养的细胞浓度。在甲烷氧化菌常规培养方法的基础上，“甲烷氧化菌的一种培养方法”(申请号：200710100154.8)在培养基中添加正十六烷。在对甲烷氧化菌Methylosinus.trichosporium R和M.trichosporium OB3b的纯菌种培养中，在培养基中添加正十六烷，可以提高甲烷氧化菌的生长速度和细胞密度。
工业生产上甲烷氧化菌的高密度快速培养均要求在纯菌种的基础上进行。而纯菌种的获得需要菌株的筛选，要经过多次的传代培养，菌株培养和纯种分离过程十分复杂。而且纯菌种的保存复杂，如需加保护剂零度以下低温保存，还要避免杂菌的污染。
发明内容
本发明的目的是公开一种工艺简单、成本低廉、易操作的混合甲烷氧化菌菌剂的培养方法。
为了达到上述目的，本发明考虑到甲烷氧化菌菌液是通过喷施于填埋场实施的，而填埋场的微生物所处的环境复杂，所以采用传统筛选培养方法得到的菌液难以适应环境。本发明经过对填埋场覆土中的甲烷氧化菌的研究证实该甲烷氧化菌对垃圾填埋场的甲烷排放具有天然的调控作用，可以明显减少甲烷的排放量，同时填埋场的生活垃圾在稳定化后形成的矿化垃圾经由填埋气体的长期驯化而诱导产生丰量的甲烷氧化菌。本发明以矿化垃圾为甲烷氧化菌载体和种源，混合培养制备甲烷氧化菌菌液。甲烷氧化菌菌液的制备方法简单，菌液容易保存和运输。此菌液可用于垃圾填埋场的甲烷排放控制，也可以培养甲烷氧化菌用于工业化生产。为了获得该甲烷氧化菌菌液，本发明分析了国内外已有的用于甲烷氧化菌的分离筛选和大规模培养的培养基配方，其中NMS培养液是基于甲烷氧化菌可以利用甲烷作为唯一碳源和能源这一特点来选择和配制。很多研究提出不同已有的甲烷氧化菌培养液是甲烷氧化菌除碳元素之外其它元素的唯一来源，营养元素种类比较全面，但如果在填埋场甲烷排放控制中使用较多的营养成分添加会增加成本。如果使用矿化垃圾来培养甲烷氧化菌，则可以利用矿化垃圾中的部分营养成分，因此本发明对已有营养液配方进行改进，使其成分更简单，使用更经济。
具体工艺如下：
先利用矿化垃圾作为甲烷氧化菌载体和种源，按常规方法将矿化垃圾进行甲烷氧化菌富集，其特点是，在甲烷氧化菌富集的矿化垃圾中加入改进的NMS培养液，混合均匀，加入计量为：100mL改进的NMS培养液中加入0.5g～2g的甲烷氧化菌富集的矿化垃圾；接着，通入甲烷∶氧气＝1∶1～1∶1.5体积比的混合气体进行培养，混合气体的通入量为130～180mL/d·100mLNMS培养液，在pH值6～9，温度25～34℃下培养3～5天，甲烷氧化率超过1.5mL/h即制得甲烷氧化菌菌剂。
上述改进的NMS培养液是在常规甲烷氧化菌培养使用的NMS培养液的改进，改进后的组成为：1L培养液含KH₂PO₄ 1.06g，Na₂HPO₄·12H₂O 4.34g，NaNO₃1.70g，K₂SO₄ 0.34g，MgSO₄·7H₂O 0.074g，FeSO₄·7H₂O 22.4mg。与常用的NMS培养液相比，改进的培养液不再添加微量元素溶液。常用的NMS培养液配方组成为：1L培养液含KH₂PO₄ 1.06g，Na₂HPO₄·12H₂O 4.34g，NaNO₃ 1.70g，K₂SO₄0.34g，MgSO₄·7H₂O 0.074g，FeSO₄·7H₂O 22.4mg，微量元素溶液2mL。微量元素溶液组成(mg/L)：ZnSO₄·7H₂O 0.57，MnSO₄·7H₂O 0.446，H₃BO₃ 0.124，Na₂MoO₄·2H₂O 0.096，CoCl₂·6H₂O 0.096，KI0.166，CaCl₂·2H₂O 7.0。pH 7.0。
本发明具有如下的优点：
1.本发明将矿化垃圾应用于填埋场温室气体的排放控制，以废治废，形成了垃圾填埋-矿化垃圾开采回用-温室气体控制的循环。
2.用矿化垃圾作为菌种来源培养甲烷氧化菌比用其它来源的菌种有优势。矿化垃圾中的甲烷氧化菌长期处于填埋场填埋气环境中，所含有的菌种对填埋气适应性较强。
3.本发明混合培养甲烷氧化菌，避免了传统培养方法菌株培养和纯种分离过程复杂和纯菌种不易保存的问题。本发明菌剂的制备方法简单，甲烷氧化效果明显，而且菌液容易保存和运输。菌剂可方便用于垃圾填埋场的甲烷排放控制，也可用于工业化生产中甲烷氧化菌的培养。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图
图2为本发明的甲烷氧化菌的培养效果图
图3为本发明的甲烷氧化菌的培养效果图
图4为本发明的甲烷氧化菌的培养效果图
图5为本发明的填埋柱模拟填埋场覆盖土施加甲烷氧化菌菌剂效果图
具体实施方式
实施例1.
矿化垃圾取自上海老港生活垃圾填埋场。从1号～5号不同填埋单元各提取1个矿化垃圾做样品，共5个样品，将5个样品的矿化垃圾过筛去杂后调pH值为7，含水率25％左右，再装入血清瓶，通入CH₄和空气(甲烷和氧气体积比为甲烷∶氧气＝1∶1～1∶1.5)，30℃左右进行甲烷氧化菌的富集培养，直至检测到血清瓶中的甲烷氧化率超过10％以上，筛选得到甲烷氧化菌富集培养效果好的矿化垃圾，见表1。
表1不同填埋单元矿化垃圾富集培养效果
填埋单元初始甲烷体积(mL)富集后甲烷体积(mL)甲烷氧化率(％)
1号单元    97.3     42.1     56.76
2号单元    100.9    88.0     12.77
3号单元    100.4    101.4    -0.97
4号单元    93.5     90.5     3.16
5号单元    101.4    51.5     49.21
由表1所示的试验结果可知，矿化垃圾经过富集培养，大部分样品中的甲烷氧化菌对通入的甲烷有明显地氧化效果。其中1号填埋单元的矿化垃圾富集培养的效果最好，通入甲烷的体积97.3mL，富集后甲烷的体积42.1mL，甲烷的氧化率达到56.76％，其次是5号填埋单元的矿化垃圾，甲烷的氧化率达到49.21％。
将取富集效果最好的1号填埋单元的矿化垃圾2g装入血清瓶，加入100mL改进的NMS培养液。混合后置于115～140r/min的摇床震荡，并调节pH为6，然后通入CH₄和空气(甲烷和氧气的体积比为甲烷∶氧气＝1∶1.5；混合气体的通入量为140～150mL/d·100mL培养液)，温度25～34℃下摇床培养。定期分析血清瓶中的甲烷含量，分析甲烷的氧化量和甲烷氧化率的变化情况，甲烷氧化率超过1.5mL/h即制得甲烷氧化菌菌剂。
通过图2所示的试验结果可以看出，甲烷氧化菌培养的启动较快。与空白相比，20h密闭的血清瓶内即有甲烷氧化效果。最大甲烷氧化率出现两天左右：最高甲烷氧化率为2.83mL/h，出现在培养47h时。
实施例2
取实施例1的富集效果最好的1号填埋单元的矿化垃圾0.5g装入血清瓶，加入改进的NMS培养液100mL混合，并置于115～140r/min摇床震荡，调节pH为9，然后通入CH₄和空气(甲烷和氧气的体积比为甲烷∶氧气＝1∶1；混合气体的通入量为130～150mL/d·100mL培养液)，温度25～34℃下摇床培养。定期分析血清瓶中的甲烷含量，分析甲烷的氧化量和甲烷氧化率的变化情况，甲烷氧化率超过1.5mL/h即制得甲烷氧化菌菌剂。
通过图3所示的试验结果看出，甲烷氧化菌培养的启动较快。最大甲烷氧化率出现两天后：最高甲烷氧化率为2.87mL/h，出现在培养56h时。
实施例3
取富集效果最好的1号填埋单元的矿化垃圾装入血清瓶，加入改进的NMS培养液，矿化垃圾和培养液的配比为1g∶100mL。混合液置于摇床震荡后调节pH值，然后通入CH₄和空气(甲烷和氧气的体积比为甲烷∶氧气＝1∶1.2；混合气体的通入量为170～180mL/d·100mL培养液)，温度25～34℃，115～140r/min条件下摇床培养。定期分析血清瓶中的甲烷含量，分析甲烷的氧化量和甲烷氧化率的变化情况，甲烷氧化率超过1.5mL/h即制得甲烷氧化菌菌剂。
通过图4所示的试验结果看出，甲烷氧化菌培养的启动较快。最大甲烷氧化率出现两天左右：最高甲烷氧化率为3.07mL/h，出现在培养47h时。
实施例4
通过实验室填埋柱试验，模拟甲烷氧化菌菌剂施用于填埋场的效果。将经过三天培养得到的甲烷氧化菌菌剂与土壤按照0.5mL∶10g干基土壤的比例混合后(土壤湿度调为25％左右)，装入高1m的填埋柱(土层厚度约60cm)。填埋柱装好后，按照甲烷的进气负荷为280g/(m²·d)通入甲烷和空气的混合气，通过监测填埋柱进出口的甲烷含量来了解覆盖层喷洒甲烷氧化菌菌液的效果。
通过7天的试验，由图5的实验数据发现未施加菌剂的填埋柱几乎没有甲烷氧化的效果；施加甲烷氧化菌菌剂的填埋柱2天内甲烷的氧化率就明显提高，3天后甲烷氧化率达到80％以上。甲烷氧化菌菌剂的添加可以明显提高覆盖层的甲烷氧化率，更重要的是可以大大缩短覆盖层氧化甲烷的迟滞期。因此对覆盖材料施加本发明的甲烷氧化菌菌剂对提高其甲烷氧化能力有明显地效果。