环糊精分子印迹分离天然产物新方法 (一)技术领域
本发明涉及以环糊精为功能基团合成的凝胶分离介质，用常压液相色谱法制备分离纯化天然产物中活性成分的方法。(二)背景技术
我国幅员辽阔，拥有世界上最丰富的天然产物资源，其中尤其以天然药物资源为主，可用于中医临床的中药资源至少有8000种。而天然产物成分复杂，活性成分含量甚微，因而高效的分离技术越来越显示出其重要性，已经成为国内外研究的重点和难点。分离纯化天然产物的活性成分对于中药化学、炮制、药理和制剂等的研究也具有重要意义。传统的分离方法已经很难满足分离的要求，开发新型分离介质和方法十分必要。
天然产物的活性成分包括有黄酮、苷类、生物碱、多酚等多种。其分子主要特点有：分子量较低，从几百到几千，具有一定极性，可溶解于多种有机溶剂之中。天然产物主要的传统的分离纯化方法有：有机溶剂萃取、吸附法分离、超临界萃取、毛细管电泳等方法。其中，有机溶剂萃取法分辨率低，仅适于分离前阶段的粗级分离。许多天然产物可以采用该吸附分离法进行分离，常使用硅胶、大孔树脂等吸附剂。潘见等(潘见、陈强、谢慧明等，大孔树脂对葛根黄酮的吸附分离特性研究，农业工程学报，1999，Vol.15，No.1，236-240)和杨明毅等(杨明毅、史劲松、孙晓明，葛根的综合利用及深加工，常德师范学院学报(自然科学版)，2001，Vol.13，No.1，74-76)使用大孔吸附树脂对葛根黄酮进行分离纯化。吸附分离虽然具有一定的选择性，但是处理量较小，通用性较差，需要结合其它的分离方法，如萃取等。超临界萃取：是近几年常用的分离技术，已用于卵磷脂、黄酮等物质的分离。超临界萃取具有无溶剂残存。可以保持产品的稳定性，但是需要复杂的设备，而且所得产品纯度较低。赵锁奇等(赵锁奇、石铁磬、王仁安等，硅胶柱超临界流体制备色谱分离极性化合物，西北大学学报(自然科学版)，2001，Vol.31，No.3，229-231)建立了一套克级的制备型超临界流体色谱，该方法设备复杂，最大进样量仅为400μL，浓度为2g/L，需要在高压下操作25Mpa。以上方法仅适用于天然产物的初级分离，分辨率较低。其它一些方法如：毛细管电泳及反相色谱只能用于天然产物的分析。由于常常发生不可逆吸附，而且反相色谱上样量较低(0.01～0.5mg/g)，一般很难将其用于制备分离。近来，张志强等(张志强、王云山，苏志国，紫杉醇在常压反相层析柱上地纯化，高校化学工程学报，2001，Vol.15，No.1，56-60)使用C18-硅胶柱常压反相层析精制紫杉醇，但是该方法要结合使用氧化铝柱层析进行预纯化。
环糊精(cyclodextrin，简称CD)是由环糊精转移酶(CGT)作用于淀粉所产生的由6～8个D(+)-吡喃型葡萄糖形成的疏水空腔的环状低聚糖，其分子呈上宽下窄、两端开口、中空的筒状物，所有的羟基在分子外部。按葡萄糖的数量不同，分别将含有6、7、8个葡萄糖的环糊精称为α、β、γ-环糊精。由于环糊精具有这种特殊结构能够与各种极性、非极性分子或离子形成包含复合物，而在分离中得以应用，如将其直接作为流动相添加剂，适用于手性化合物的分离，例如Jandera Pavel等(J.Pavel，B.Simona，P.Josef，Separation of isomeric naphthalenesulfonic acids by micro high-performance liquid chromatography with mobile phases containingcyclodextrin，J.Chromatrogr.，A，2000，871(1+2)，139-152)将环糊精作为流动相添加剂，分离度得到很大提高。环糊精应用更多的是将其与硅胶键合成为HPLC的固定相，例如Armstrong小组(ArmstrongD.W.，Bonded phase material for chromatographic separation，US Patent4539399，1985)合成了不含氮、硫连接体，不易水解的环糊精手性固定相(CD-CSP)，该类固定相用于分离位置异构体和结构异构体非常有效。因此环糊精在天然产物的分离中有很大的应用潜力。但是环糊精与硅胶键合相应用于层析分离时均为高压液相色谱，对于生产放大困难较大；环糊精与凝胶键合可以解决该问题，而且迄今为止并未见有关合成环糊精与凝胶形成的键合相并应用于天然产物分离的报道。(三)发明内容
本发明环糊精分子印迹分离天然产物新方法提出一种可以通过合成的新型分离介质将其用于天然产物的分离纯化。可以一步得到高纯度的活性成分。
本发明的目的是合成一种可以应用于天然产物制备型液相色谱分离纯化的新型介质，该分离可以在常压或低压下操作完成。
本发明的技术方案先在碱性催化剂存在下，20℃，搅拌反应，活化凝胶；然后用环糊精或者环糊精的低聚物和活化的凝胶共混，在碱性催化剂作用下，20～30℃，搅拌反应，进行交联，洗涤后得到液相色谱分离介质——接有环糊精或者环糊精低聚物的凝胶。将天然产物使用该介质常压下进行分离纯化，可一步得到高纯度的活性成分。本发明的技术要点在于：使用环糊精和凝胶介质交联或聚合，合成新型液相色谱分离介质；用该介质分离纯化天然产物。该方法具有分离天然产物的通用性，常压分离、分辨率高，制备型规模的特点，该方法与反相色谱和毛细管电泳比较见下表。表1 不同分离方法的比较分离方法操作条件放大难易负载量(mg样品/g介质)是否需要结合其它分离方法本发明常压易＞2.5否反相色谱多为高压难0.01-0.5是毛细管电泳需要高压电难＜0.3否
本发明的效果是能够使用该新型层析介质，在常压或低压下一步分离纯化得到高纯度的天然产物活性成分。(四)具体实施方式
本方法采用高效液相色谱法分析所得的活性成分纯度和收率。
本方法采用常压、低压液相色谱分离纯化天然产物的活性成分。实施例1：
用2L超纯水清洗250mL Superose 12 pg凝胶，将凝胶转移至1L烧瓶中，加入100mL超纯水搅拌，再加入40g 50％的氢氧化钠溶液，搅拌，将温度保持在20℃，以3mL/10min的速度加入双环氧化合物(2.5h共加入45mL)，反应再进行2h，持续搅拌。然后用乙酸调节pH值到6～7，再用10L超纯水清洗凝胶。将用环氧氯丙烷活化的Superose 12 pg放回反应器，加入90mL超纯水，再加入20g环糊精，调节温度到30℃，搅拌1h，加入20g 50％的氢氧化钠溶液和0.2g的硼氢化钠，并搅拌，保持混合物30℃，持续18h。用乙酸调节pH到6～7，用大量超纯水清洗凝胶和漏斗，洗掉未溶解的环糊精和其它的反应物。实施例2：
常压条件下，进行天然产物——葛根黄酮的分离，色谱条件如下，色谱柱：环糊精与环氧氯丙烷活化的Sephadex交联(110mm×16mm id.)；流动相：0.5％醋酸；流速：1mL/min；检测器：UV280nm。葛根素的纯度可达90％以上，收率90％以上。负载量可达0.6mg样品/mL湿凝胶。(附图1)实施例3：
常压条件下，进行天然产物——葛根黄酮的分离，色谱条件如下，色谱柱：环糊精低聚物与Superose通过烯丙基交联(420mm×10mm id.)；流动相：10％醋酸；流速：1mL/min；检测器：UV280nm。葛根素的纯度可达90％以上，收率90％以上。负载量可达1.2mg样品/mL湿凝胶。(附图2)实施例4：
常压条件下，进行天然产物——葛根黄酮的分离，色谱条件如下，色谱柱：环糊精低聚物与Superdex交联(420mm×10mmid.)；流动相：10％醋酸；流速：1.5mL/min；检测器：UV280nm。葛根素的纯度可达90％以上，收率90％以上。实施例5：
常压条件下，进行天然产物——银杏黄酮的分离，色谱条件如下，色谱柱：环糊精与环氧氯丙烷活化的Superose 12 pg交联(110mm×16mm id.)；流动相：20％乙醇；流速：1mL/min；检测器：UV280nm。实施例6：
常压条件下，进行天然产物——银杏黄酮水解液的分离，色谱条件如下，色谱柱：环糊精与环氧氯丙烷活化的Superose 12 pg交联(110mm×16mm id.)；流动相：甲醇：醋酸钠缓冲溶液(pH5.0)＝4∶1；流速：1mL/min；检测器：UV280nm。斛皮素、异鼠李素、山奈酚能够得到很好的分离。(附图3)