编码二氢青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列.pdf

从黄花蒿克隆的分离的核酸分子编码青蒿醛双键还原酶和青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶。青蒿醛双键还原酶将青蒿醛酶促还原为二氢青蒿醛。青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶将二氢青蒿醛酶促氧化为二氢青蒿酸和将青蒿醛氧化为青蒿酸。因此，这些核酸分子及其所编码的酶可以用于在宿主细胞中制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸或青蒿酸的方法中。二氢青蒿酸是抗疟化合物青蒿素的晚期前体。

1.  分离的核酸分子，包含与SEQ ID No：3具有至少70％核苷酸序列同一性的核苷酸序列并且编码青蒿醛双键还原酶。

2.  分离的核酸分子，包含编码青蒿醛双键还原酶的核苷酸序列，该还原酶具有与SEQ ID No：2具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

3.  权利要求1或2的分离的核酸分子，具有SEQ ID No：1的核苷酸序列。

4.  分离的核酸分子，包含与SEQ ID No：7具有至少70％核苷酸序列同一性的核苷酸序列并且编码青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶。

5.  分离的核酸分子，包含编码青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的核苷酸序列，该青蒿醛脱氢酶具有与SEQ ID No：6具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

6.  权利要求4或5的分离的核酸分子，具有SEQID No：5的核苷酸序列。

7.  权利要求1至6任一项的分离的核酸分子，其来源于黄花蒿。

8.  纯化的青蒿醛双键还原酶，其具有与SEQ ID No：2具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

9.  权利要求8的还原酶，其具有SEQ ID No：2的核苷酸序列。

10.  纯化的青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶，其具有与SEQ ID No：6具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

11.  权利要求10的脱氢酶，其具有SEQ ID No：6的核苷酸序列。

12.  权利要求1至7任一项的一种或多种分离的核酸分子在制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸中的用途。

13.  权利要求1至7任一项的一种或多种分离的核酸分子编码的一种或多种纯化的青蒿醛双键还原酶或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶在制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸中的用途。

14.  一种制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包括在宿主细胞中表达或过表达权利要求1至7任一项的一种或多种分离的核酸分子。

15.  权利要求14的方法，进一步包括在宿主细胞中表达或过表达编码紫穗槐-4，11-二烯合酶和/或紫穗槐-4，11-二烯羟化酶的一种或多种核酸分子。

16.  一种制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包括在宿主细胞中制备或超量制备蛋白，该蛋白具有与SEQ ID No：2具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID No：6具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

17.  权利要求14至16任一项的方法，其中宿主细胞是植物细胞、酵母细胞或细菌细胞。

18.  一种在天然产生二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素的植物群体中选择或开发二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平改变的植物的方法，包括：
检测与相似条件下对照植物相比二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平改变的靶植物；
分离靶植物青蒿醛双键还原酶基因或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶基因的至少一部分，并将该至少一部分的核苷酸序列与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7进行比较，检测与SEQID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的差异；
检测其他植物中的该差异；
选择性繁育植物，该植物与在相似条件下产生的对照植物群体相比二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平发生改变。

19.  一种改变天然产生二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸的植物群体中二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平的方法，包括：
提供突变的植物群体；
检测突变植物群体内靶突变植物，该靶突变植物与在相似条件下产生的对照植物相比，其青蒿醛双键还原酶基因或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶基因的表达改变或青蒿醛双键还原酶或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的活性改变，
所述检测包括使用从权利要求1至7任一项限定的核酸分子开发的引物，通过PCR从突变植物群体中的突变植物扩增青蒿醛双键还原酶基因或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶基因的区域，鉴定扩增区域和野生型基因相应区域之间的引起表达改变或活性改变的错配，并鉴定含有错配的突变植物；和
选择性繁育靶突变植物以产生植物群体，该植物群体与在相似条件下产生的对照植物群体相比，其青蒿醛双键还原酶基因或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶基因的表达改变或青蒿醛双键还原酶或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的活性改变。

编码二氢青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列
相关申请的相互参考
本申请要求2006年4月5日提交的美国临时专利申请USSN60/789,138和2006年11月8日提交的USSN 60/857,503的优先权，这两篇文献的全部内容引入这里作为参考。
发明领域
本发明涉及具有健康和商业益处的来源于植物的化合物的制备。更特别地，本发明涉及编码酶的核苷酸序列，由该核苷酸序列编码的酶和用该酶制备(11S)-二氢青蒿醛、(11R)-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的方法。
发明背景
通常植物含有无数次级代谢产物，这些产物常常以仅在外来种中起作用的独特的生物化学过程合成。对于来源于植物的产品，如药物，1997全世界的销售额是US$ 100亿(Rotheim 2002)。在很多情况下，与这些药物相关的植物材料的供应是有限的或易变的。开发制备这些药物的方法的一个途径是应用生物化学、分子生物学和基因组方法阐明对人类健康有价值的化合物的生物合成和与化合物生物合成相关的基因。
由于认识到参与天然产物生物合成的很多酶在已知类别的酶中表现出变异，表达序列标记(EST)分析(与异源表达相结合)提供了鉴定它们的相应基因的有效方法(Cahoon等人1999，Gang等人2001，Lange等人2000和Van de Loo等人1995)。
一个令人感兴趣的领域是菊科(Asteraceae，Compositae)亚科中的Anthemideae族的生物活性化合物(Torrell等人1999和Watson等人2000)。Anthemideae(菊科，Asteroideae亚科)是包括109个属的族，包括雏菊(daisies)、菊花(chrysanthemums)、龙蒿(tarragon)、甘菊(chamomile)、蓍草(yarrow)和蒿(sagebrushes)(Watson等人2000)。这些植物在自然界中气味芳香，这是由高浓度单萜烯和倍半萜烯产生的。这个族中的许多种的价值在于对健康有益或具有杀虫性能。
特别令人感兴趣的是来自黄花蒿或青蒿的青蒿素。1972年，中国科学家从艾属(Artemisia)中分离了含内过氧化物基团的倍半萜烯内酯(见图1)，并把它称作青蒿素(van Agtmael等人1999b)。在此之前，青蒿在中药中已经应用了几个世纪。青蒿素对于东南亚和其他地方疟疾，尤其是对于多抗药性恶性疟原虫形式的疾病的治疗已经变得非常重要(O′Neill 2005，Rathore等人2005，Robert等人2002，Wilairatana等人2002和Wu 2002)。自从发现青蒿素以来，已经开发了很多半合成衍生物专门应用于疟疾治疗。
疟疾仍然是严重的健康问题，其波及4亿以上的人群，尤其是非洲和东南亚人，导致每年超过200万人死亡。疟疾寄生虫、恶性疟原虫对当前抗疟药的抗性不断增加是担心的原因。Bayer AG对青蒿酮(Artemisone)的开发说明了基于青蒿素结构的抗疟药的未来价值，青蒿酮是一种青蒿素衍生物，据报道比目前正在进行临床试验的青蒿琥酯活性高10-30倍。而且，Walter Reed Army Institute of Research(USA)的研究人员目前正在开发用于静脉内治疗严重疟疾的的对羧基苯甲醚。
青蒿素以0.01至1.0％干重的相对较小的量制备，使得它及其衍生物相对昂贵(Gupta等人2002)。几个研究描述了倍半萜烯的化学合成，但是无一是从植物分离青蒿素的经济的替换方案(Yadav等人2003)。因此为了使青蒿素可尽可能经济地获得，尤其是用于第三世界国家，在植物中浓度更高或在备选宿主中制备是令人期望的。对生物合成途径和参与的基因的了解应该使改善的青蒿素的制备技术可行。或者，也存在制备具有商业价值的生成青蒿素途径中的中间体的可能性。例如，已经由青蒿醇合成了一种在体外比青蒿素抗恶性疟原虫效力高15倍的化合物(Jung等人2001)。
有证据表明青蒿素位于植物某些组织表面的腺毛状体上(Duke等人1994和Duke等人1993)。这些毛状体的数量且甚至这些毛状体的存在和青蒿素的量在不同的生物型中变化很大。
典型地，在植物中发现并被认为有效的化合物在商业上通过以下方法来制备：i)在可能和经济的情况下，通过化学合成，ii)从培养的或野生的植物中提取，或iii)细胞或组织培养(这很少是经济的)。在那些化学合成不是经济的情况下，它使尽可能多地得知天然产物的生物合成，以致可以在植物或细胞/组织培养中最有效地制备它。就青蒿素而言，化学合成在商业上是不可行的。由于该化合物是在艾属中小量制备的，所以来源于青蒿素的药物相对昂贵，尤其是对于使用它们的第三世界国家。而抗疟药，氯喹和磺胺多辛-乙胺嘧啶，对于成年人治疗，费用少至20分，相反来源于青蒿素的化合物可昂贵100倍。氯喹抗性很普遍且磺胺多辛-乙胺嘧啶抗性不断增加。世界卫生组织最近将来源于青蒿素的药物蒿甲醚增加至它们的基本医药的模型列表(Model List of Essential Medicines)，推荐始终以足够的量和适当的剂型可利用，且价格是个人和团体有能力负担的。因此，能够更经济地提供来源于青蒿素的药物将是有用的。
有很多涉及青蒿素和来源于青蒿素的药物的专利。这些专利涵盖药物合成和配制，艾属培养(Kumar 2002)和组织培养及青蒿素提取(Elferaly 1990)。2005年10月24日提交的共同拥有的美国专利申请60/729,210，其公开内容引入这里作为参考，且现在作为PCT专利申请提交的，公开了编码紫穗槐-4，11-二烯羟化酶的基因，该酶催化青蒿素生物合成中的第一个关键步骤(图1)。
过去五年中，青蒿素生物合成的相当清晰的图片如图1所示(Bertea等人2005)。根据艾属提取物中存在微量紫穗槐-4，11-二烯和代表紫穗槐-4，11-二烯合酶-萜烯环化酶的cDNA的克隆和表达，确立了紫穗槐-4，11-二烯作为生物合成中间体的身份(Bouwmeester等人1999和Wallaart等人2001)。最近克隆和表征了命名为cyp71av1的细胞色素P450基因(Teoh等人2006)。cyp71av1基因编码催化紫穗槐-4，11-二烯转变为青蒿醇的羟化酶。酵母中表达的CYP71AV1也能够将青蒿醇氧化为青蒿醛和将青蒿醛氧化为青蒿酸。
发明概述
这里描述的发明涉及药物和商业利益的青蒿素和青蒿素相关化合物包括前体的制备。
提供了分离的核酸分子，包含与SEQ ID No：3具有至少70％核苷酸序列同一性的核苷酸序列并且编码青蒿醛双键还原酶。
提供了分离的核酸分子，包含与SEQ ID No：7具有至少70％核苷酸序列同一性的核苷酸序列并且编码青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶。
提供了分离的核酸分子，包含编码青蒿醛双键还原酶的核苷酸序列，该还原酶具有与SEQ ID No：2具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
提供了分离的核酸分子，包含编码青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的核苷酸序列，该醛脱氢酶具有与SEQ ID No：6具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
提供了纯化的青蒿醛双键还原酶，该还原酶具有与SEQ ID No：2具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
提供了纯化的青蒿醛双键还原酶，该还原酶具有与SEQ ID No：6具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
提供了本发明一种或多种分离的核酸分子制备(11S)-二氢青蒿醛、(11R)-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的用途。
提供了本发明一种或多种分离的核酸分子编码的一种或多种纯化的青蒿醛双键还原酶或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶制备(11S)-二氢青蒿醛、(11R)-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的用途。
提供了制备(11S)-二氢青蒿醛、(11R)-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包括在宿主细胞中表达或过表达本发明的一种或多种分离的核酸分子。
提供了制备(11S)-二氢青蒿醛、(11R)-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包括在宿主细胞中制备或超量制备本发明的青蒿醛双键还原酶和/或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶。
分离的核酸分子优选来源于黄花蒿。
一种或多种核酸分子的过表达或青蒿醛双键还原酶和/或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的超量制备可以在黄花蒿中进行。一种或多种核酸分子的表达或青蒿醛双键还原酶和/或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的表达可以在其他宿主中进行，例如植物、酵母或细菌。本发明一种或多种分离的核酸分子的过表达或表达可以与参与青蒿素生物合成的一种或多种其他核酸分子的过表达或表达联合进行，后者例如紫穗槐-4，11-二烯合酶和/或紫穗槐-4，11-二烯羟化酶。
以经济和及时方式制备青蒿素的问题的部分解决方案是分离和开发参与青蒿素生物合成的基因。如在其他代谢工程实例中，这种基因可通过在天然植物(黄花蒿)、不同植物或微生物例如细菌或酵母中过表达而用于增加产量。这个实例是紫穗槐二烯合酶基因在大肠杆菌中表达来制备青蒿素前体紫穗槐二烯(Martin等人2003)和在酵母中制备青蒿醛(Ro等人2006)。制备青蒿素本身的途径的两个重要步骤是将青蒿醛还原为(11R)-二氢青蒿醛和将(11R)-二氢青蒿醛氧化为(11R)-二氢青蒿酸。因此，参与这些步骤的基因可以单独或与一种或多种紫穗槐二烯合酶和紫穗槐二烯羟化酶彼此组合用来在宿主中制备(11R)-二氢青蒿酸。
接着所产生的(11R)-二氢青蒿酸通过化学方法可以转变为有商业价值的青蒿素或相关化合物。推测二氢青蒿酸是青蒿素的中间体，并且已经表明自发存在通过光氧化，无需酶介入的它转变为青蒿素(Sy等人2002和Wallaart等人1999)。因此，使用(11R)-二氢青蒿酸而不是青蒿素半合成的起始原料青蒿醛，减少了青蒿素制备所需的步骤数量，因此简化了制备方法。这可以引起青蒿素制备时间缩短和制备成本降低。最终结果将是更廉价的青蒿素和青蒿素相关药物。可供选择地，(11S)-二氢青蒿酸可以通过化学方法转变为预计具有抗疟活性的(11S)-青蒿素。
本发明的基因(核酸分子)可以从黄花蒿得到，例如从黄花蒿克隆。克隆的核酸分子被测序并通过在大肠杆菌中表达被表征。一个克隆的核酸分子编码双键还原酶，其将青蒿醛的C11-C13双键还原形成作为主要产物的二氢青蒿醛。另一个克隆的核酸分子编码将二氢青蒿醛转变为二氢青蒿酸的醛脱氢酶。醛脱氢酶进一步能够将青蒿醛脱氢为青蒿酸。
本发明的核酸分子也可以用于DNA标记的开发和靶向诱变技术(例如TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))。
遗传标记(DNA标记)是染色体上具有可鉴定的物理位置和与特定基因或性状相关的DNA区段且其遗传可被继承。标记可以是基因，或它可以是功能未知的DNA的某一些区段。因为染色体上位置彼此接近的DNA区段倾向于一起遗传，所以标记常常被用作追踪尚未鉴定但其大概位置已知的基因的遗传模式的间接方法。因此，标记可以帮助育种家开发具有特定的感兴趣性状的生物群体。基因特异性标记可用于检测个体间的遗传变异，其更可能影响与特定基因功能相关的表型。例如，基于AaALDH1的基因特异性标记的变异，而不是无名DNA标记的变异，由于其与相关生物合成途径相关，将更可能与青蒿素或相关化合物的含量变化相关联。在一个实施方案中，对从很多黄花蒿单株植物通过聚合酶链式反应扩增的AaALDH1基因进行测序可以开发AaALDH1的DNA标记。这种序列将提供关于该基因内序列多态性的信息。本领域技术人员可获得的很多方法可用于检测这种多态性，包括切割扩增多态性序列(CAP)(Konieczy等人1993)。
这种基因特异性多态性的存在可能与青蒿素或相关化合物的水平相关并用于育种计划以选择和/或培育青蒿素或相关化合物水平提高的黄花蒿株系。也就是说，可能在其他植物中检测遗传结构的变异，并且具有变异的植物选择性繁育以产生与在相似条件下产生的对照植物群体相比二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平增加的植物群体。Bagge等人2007，Pfaff等人2003，Sandal等人2002和Stone等人2002中更详细地讨论了遗传标记。
TILLING(Bagge等人2007，Comai等人2006，Henikoff，等人2004和Slade等人2005)涉及用诱变剂处理种子或各个细胞以引起点突变，然后使用对单核苷酸突变检测灵敏的方法找到感兴趣基因中的这个点突变。期望的突变(例如引起感兴趣基因产物表达改变的突变)的检测可以通过例如PCR方法完成。例如，可制备来源于感兴趣基因(核酸分子)(例如本发明的核酸分子)的寡核苷酸引物并可使用PCR由诱变的群体中的植物扩增感兴趣基因的区域。扩增的突变基因可以退火为野生型基因以找到突变基因与野生型基因之间的错配。检测到的差异可以追溯到具有突变基因的植物，由此揭示诱变的植物将具有期望的表达。然后这些植物可以选择性繁育以产生具有期望的表达的群体。
在下列详细说明过程中将描述本发明的另外的特征或该特征将变得很明显。
为了更清楚理解本发明，现在将参照附图，通过举例详细描述其实施方案，其中：
图1描述了提出的青蒿素生物合成的生物合成途径。
图2描述了pKT104的cDNA插入物的核苷酸序列(SEQ ID No：1)，其编码黄花蒿AaDBR1。
图3描述了黄花蒿基因AaDBR1编码的蛋白的预测氨基酸序列(SEQID No：2)。
图4描述了pKT032中DNA插入物的可读框的核苷酸序列(SEQ IDNo：3)。
图5描述了pKT032中AaDBR1插入物的产物的预测氨基酸序列(SEQ ID No：4)，读框带有N末端His标记序列。
图6描述了pKT150的cDNA插入物的核苷酸序列(SEQ ID No：5)，其编码黄花蒿AaALDH1。
图7描述了黄花蒿基因AaALDH1编码的蛋白的预测氨基酸序列(SEQ ID No：6)。
图8描述了pKT041中DNA插入物的可读框的核苷酸序列(SEQ IDNo：7)。
图9描述了pKT041中AaALDH1插入物的产物的预测氨基酸序列(SEQ ID No：8)，读框带有N末端His标记序列。
图10描述了用青蒿醛与(a)和不与(b)添加的NADPH检测的表达AaDBR1的大肠杆菌无细胞提取物的GC/MS。在14.94和15.03分钟的保留时间和质谱峰分别相当于标准青蒿醛(M_r⁺ 218)和(11S)-二氢青蒿醛(M_r⁺ 220)。
图11描述了用(11R)-二氢青蒿醛与(a)和不与(b)添加的NADPH检测的表达AaALDH1的大肠杆菌无细胞提取物的GC/MS。二乙醚提取物分析为重氮甲烷衍生物。在15.8分钟峰的保留时间和质谱相当于(11R)-二氢青蒿酸的标准重氮甲烷衍生物(M⁺ 250)。
材料和方法
青蒿醛
根据Chang等人2000描述的方法，从黄花蒿花芽和叶子的二氯甲烷提取物中分离青蒿醛并用于合成青蒿醛，其公开内容引入这里作为参考。
二氢青蒿酸
使用Teoh等人2006对于青蒿醛描述的方法，从得自含有相对高水平二氢青蒿酸的“2/39系”的黄花蒿叶材料中分离和纯化二氢青蒿酸，其公开内容引入这里作为参考。
二氢青蒿醛
从分离的二氢青蒿酸合成二氢青蒿醛。该酸在二乙醚中，于0℃，历时5分钟转变为含过量重氮甲烷的二氢青蒿酸甲酯。在氮气流下除去该醚和重氮甲烷，并在甲苯中，室温下，氮中，历时10分钟，用过量1.5M二异丁基氢化铝将该甲酯还原成(11R)-二氢青蒿醇。随后提取，用氯铬酸吡啶氧化为醛(Corey & Suggs 1975)并通过HPLC纯化产生了(11R)-二氢青蒿醛，根据GC分析，总产率48％，纯度>99％。
植物材料
黄花蒿种子(2/39系)从美国密苏里州Brixey，Elixir FarmBotanicals和巴西Campinas州立大学的Pedro Melillo de 获得。使该种子在人工气候室的土壤中发芽和生长，16小时白天/25℃和8小时黑夜/20℃。将高度达到大约1.2m(约3个月)的植物转移到开花室，12小时白天/25℃和12小时黑夜/20℃。收集在开花室19-21天后发育的花蕾进行总RNA分离。
cDNA文库的构建和表达序列标记(EST)分析
使用Logeman等1987描述的改进方法从腺毛状体和花蕾提取和分离总RNA cDNA。由1.5微克总RNA的cDNA合成和毛状体和花蕾cDNA文库的构建用Creator^TMSMART^TMcDNA文库构建试剂盒(Clontech)来进行。分别随机挑选毛状体和花蕾文库的共6,239个克隆和2,208克隆并对它们的DNA序列进行测序。测序在AB13700DNA测序仪上，使用BigDye终止剂循环测序试剂盒(Applied Biosystems)和M13反向引物进行。解释DNA序列迹线并使用PHRED(Ewing等人1998)和LUCY(Chou & Holmes 2001)消除载体和低质量序列。使用STACKPACK(等人1999)和对所产生的EST数据集进行聚类和用BLAST(Altschul等人1990)鉴定序列相似性。
全长AaDBR1 cDNA的分离
使用基因特异性引物5′-CACCATGGAACAGCAACAAGAAG-3′(SEQ IDNo：9)和5′-TCATTCATGCGCAACCACCACCA-3′(SEQ ID No：10)和Vent聚合酶(New Engl and BioLabs，剑桥，MA，美国)通过PCR获得EST克隆pkt104编码的命名为AaDBR1的双键还原酶的可读框(ORF)。产生的PCR产物通过Gateway进入载体pENTR/D/TOPO(Invitrogen)克隆入Gateway目的载体pDEST17(Invitrogen)，产生细菌表达克隆pKT032。在AaDBR1的N末端上带有6X His标记的框内克隆AaDBR1的ORF(SEQ ID No：13)。
全长AaALDH1 cDNA的分离
使用基因特异性引物5′-CACCATGAGCTCAGGAGCTAAT-3′(SEQ IDNo：11)和5′-TTAAAGCCACGGGGAATCATAT-3′(SEQ ID No：12)和Vent聚合酶(New England BioLabs，剑桥，MA，美国)通过PCR获得EST克隆pKT150编码的命名为AaALDH1的醛脱氢酶的可读框(ORF)。产生的PCR产物通过Gateway进入载体pENTR/D/TOPO(Invitrogen)克隆入Gateway目的载体pDEST17(Invitrogen)，产生细菌表达克隆pKT041。克隆AaALDH1的ORF，在AaALDH1的N末端读框带有6X His标记序列(SEQ ID No：13)。
在大肠杆菌中表达
使用热休克在42℃将质粒pKT032或pKT041导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)。GUS基因(Invitrogen)克隆入pDEST17以替换ccdB基因，和导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)的构建体pDEST-GUS用作对照。转化体在Luria肉汤培养基(LB)中生长并在氨苄青霉素(100μg/mL)上37℃选择24小时。含有pKT032或pKT041的单个菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基(LBA)并在37℃摇动生长过夜。过夜培养物接种于250mL LBA液体培养基中并在37℃摇动生长至OD₆₀₀为每毫升0.6，随后用1mM IPTG诱导并在30℃摇动生长过夜。细胞在2，000g，4℃沉淀10分钟。沉淀细胞重悬于由50mM磷酸钠，pH 8.0，0.1M NaCl，20mM咪唑和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)组成的6mL裂解缓冲液中。在冰上用溶菌酶(0.2mg/mL的细胞)裂解细胞30分钟，所后在冰上以30s脉冲(5X)超声处理。用Bradford试验(Bio-Rad)测定蛋白浓度。在SDS凝胶上银染检测AaDBR1蛋白并用抗His抗体(Invitrogen)通过Western印迹证实。用Rapid染料(Bioscience，St.Louis，MO)在SDS凝胶上检测AaALDH1蛋白。
重组AaALDH1的纯化
如上所述制备重组AaALDH1的无细胞提取物。无细胞提取物在20,000g，4℃离心15分钟以除去任何残存不可溶物质，之后装填到用结合缓冲液(含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5)平衡过的His-Trap FF柱(Amersham Bioscience，NJ)上。用5柱体积的结合缓冲液洗涤柱子，并用含浓度以递增方式不断增加的咪唑的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl，pH 7.5)洗脱重组AaALDH1。洗脱馏分在离心过滤装置(Amicon Ultra-15)(Millipore，MA)中根据制造商的方案浓缩并脱盐。用Rapid染料(Biosciences，St.Louis，MO)染色的SDS凝胶检测重组AaALDH1的纯度。
体外无细胞试验
用青蒿醛检测重组His标记AaDBR1蛋白的无细胞提取物，随后用气相色谱法/质谱法分析。向含有10％山梨醇，1mM NADPH，2mM DTT和0.8μg酶的500μL磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.5)中添加底物(5μg)启动酶反应。用沸腾蛋白，不含NADPH和含有已导入构建体pDEST17-GUS的大肠杆菌提取物，来进行阴性对照。允许反应在30℃摇动进行30分钟并用700μL二乙醚提取两次立即终止。混合醚提取物、蒸发和吸收入20μL乙酸乙酯(Sigma)，随后进行GC-MS分析。
用二氢青蒿醛和其他底物检测重组His标记AaALDH1蛋白的无细胞提取物，随后用气相色谱法/质谱法分析。向含有1mM NADP和1.0μg酶的500μLTris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.5)中添加底物(5μg)启动酶反应。用沸腾蛋白，不含NADPH和含有已经导入构建体pDEST17-GUS的大肠杆菌提取物，来进行阴性对照。允许反应在30℃摇动进行30分钟，和用700μL二乙醚提取两次立即终止。混合醚提取物，用重氮甲烷衍生、蒸发和吸收入20μL二氯甲烷(Sigma)，随后进行GC-MS分析。
纯化的重组AaALDH1的表征
首次建立了试验相对于时间和蛋白浓度的线性度并测定了底物和辅因子的操作饱和度。用标准试验测定含有1mM NADP和1.5微克纯化重组AaALDH1的50mM缓冲液(磷酸钠，Tris-HCl和CHES)从pH 6.0至10.0，以0.5单位间隔的最佳pH。通过改变底物浓度测定50mMTris-HCl缓冲液，pH 8.5中的动力学参数。使用GraphPad软件(GraphPad Software Inc.San Diego，CA)通过非线性回归分析测定动力学常数，以三个独立试验方式提供结果。用估计的Km值10倍的底物浓度在最佳反应条件下测定底物特异性。检测的底物包括青蒿醛、(11R)-二氢青蒿醛、青蒿醇、二氢青蒿醇、辛醛、壬醛、2-苯基丙醛、3-环己基丙醛、2-己-1-醛、丁香醛。
结果：
从发育的黄花蒿毛状体和花蕾得到表达序列标记(随机挑选的cDNA克隆的序列)并进行分析。
具有与单萜烯双键还原酶类似的序列的cDNA克隆再次进行测序并拼接这些序列。这些被认为源自于称作AaDBR1的单个黄花蒿基因。图2示出了AaDBR1 mRNA的共有核苷酸序列(SEQ ID No：1)。图3示出了相应的氨基酸序列(SEQ ID No：2)。
具有与醛脱氢酶类似的序列的cDNA克隆再次进行测序并拼接这些序列。这些被认为源自于称作AaALDH1的单个黄花蒿基因。图6示出了AaALDH1 mRNA的公认核苷酸序列(SEQ ID No：5)。图7示出了相应的氨基酸序列(SEQ ID No：6)。
对于AaDBR1初步的功能研究，制备RT-PCR产物并克隆入大肠杆菌表达载体pDEST17，得到克隆pKT032。图4给出了pKT032的DNA插入物的可读框的核苷酸序列(SEQ ID No：3)和图5给出了包括N末端His标记融合的相应蛋白产物(SEQ ID No：4)。质粒pKT032导入大肠杆菌(DE3)菌株(Novagen)和用各种类异戊二烯底物测定无细胞提取物，随后用气相色谱法/质谱法分析。图10显示了这个分析结果，表明NADPH依赖性(11S)-二氢青蒿醛形成作为主要产物。在分开的实验中，未导入pKT032的大肠杆菌提取物不支持在NADPH存在下产生二氢青蒿醛。可以预料AaDBR1的野生型产物将具有与pKT032 His标记融合蛋白产物类似的青蒿醛双键还原酶活性。
对于AaALDH1初步的功能研究，制备PCR产物并克隆入大肠杆菌表达载体pDEST17，得到克隆pKT041。图8给出了pKT041的DNA插入物的可读框的核苷酸序列(SEQ ID No：7)和图9给出了包括N末端His标记融合的相应蛋白产物(SEQ ID No：8)。质粒pKT041导入大肠杆菌(DE3)菌株(Novagen)和用(11R)-二氢青蒿醛测定无细胞提取物，随后用气相色谱法/质谱法分析。从无细胞提取物纯化重组AaALDH1蛋白并测定其动力学参数。在pH 8.5，纯化的重组AaALDH1蛋白功能最好。用不同底物(见材料和方法)在最佳试验条件下检测重组蛋白。发现除(11R)-二氢青蒿醛之外的青蒿醛是重组AaALDH1的底物。测定二氢青蒿酸的K_m和V_max值分别是8.79μM和143.8pkat/μg蛋白，和对于青蒿醛，K_m和V_max分别是2.62μM和和28.6pkat/μg蛋白。图11显示了对于(11R)-二氢青蒿醛的分析结果，表明NADPH依赖性(11S)-二氢青蒿醛形成。在分开的实验中，未导入pKT041的大肠杆菌提取物不支持在NADPH存在下产生二氢青蒿酸。可以预料AaALDH1的野生型产物将具有与pKT041 His标记融合蛋白产物类似的青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶活性。
参考文献：下列参考文献所公开内容的全部引入这里作为参考。
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该结构所固有的其他优点对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这里描述的实施方案是说明性的且并不意味着限制所要求保护的本发明的范围。上述实施方案的变型对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的并且本发明人意欲将其包括在下列权利要求中。
序列表
<110>NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA
     TEOH，KEAT(THOMAS)H.
     REED，DARWIN W.
     POLICHUK，DEVIN R.
     COVELLO，PATRICK S.
<120>编码二氢青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列
<130>11803-98
<140>
<141>
<150>60/789,138
<151>2006-04-05
<150>60/857，503
<151>2006-11-08
<160>13
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>1296
<212>DNA
<213>黄花蒿
<400>1


<210>2
<211>347
<212>PRT
<213>黄花蒿
<400>2


<210>3
<211>1128
<212>DNA
<213>黄花蒿
<400>3

<210>4
<211>375
<212>PRT
<213>黄花蒿
<400>4



<210>5
<211>1786
<212>DNA
<213>黄花蒿
<400>5


<210>6
<211>499
<212>PRT
<213>黄花蒿
<400>6



<210>7
<211>1584
<212>DNA
<213>黄花蒿
<400>7


<210>8
<211>527
<212>PRT
<213>黄花蒿
<400>8



<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>9

<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>10

<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>11

<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>12

<210>13
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成6x

<400>13