用于治疗或预防白斑综合症病毒的组合物和方法.pdf

本发明涉及一种组合物和方法，用于治疗或预防节肢动物的白斑综合症病毒。本发明是基于使用牡蒿提取物，和更为优选地是使用牡蒿提取物和三白草提取物的混合物作为有效成分。更优选地，本发明提供一种用于治疗或预防白斑综合症病毒的组合物，包括被一聚合物包覆的牡蒿提取物和三白草提取物。本发明还提供一种用于治疗或预防节肢动物的白斑综合症病毒的方法，其使用被一聚合物包覆的牡蒿提取物和三白草提取物。

1.  一种用于治疗或预防白斑综合症病毒的组合物，包括作为有效成分的牡蒿提取物。

2.  根据权利要求1所述的组合物，还包括作为有效成分的三白草提取物。

3.  根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物的混合重量比为7:3到3:7。

4.  根据权利要求2或3所述的组合物，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物被一聚合物包覆。

5.  根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物在被聚合物包覆之前先被制成颗粒。

6.  根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物首先被一亲水性聚合物包覆，其次再被一非亲水性聚合物包覆。

7.  根据权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述的亲水性聚合物选自下面化合物中的至少一种：羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、纤维素衍生物、藻酸钠、褐藻酸、大豆蛋白、小麦蛋白、角叉胶、黄芪胶、琼脂、阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶、橡胶、胶质、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、聚环氧烷衍生物、聚烷撑基二醇、聚乙烯-聚丙烯聚合物、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷聚合物、玉米蛋白、二乙基胺基乙酸酯、胺基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、环糊精、壳多糖、壳聚糖和明胶。

8.  根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的非亲水性聚合物选自下面化合物中的至少一种：甲基纤维素、乙基纤维素、虫漆、聚醋酸乙烯酯、聚-L-赖氨酸、邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素、高粘度的纤维素衍生物、乙酸琥珀酸羟丙甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、玉米蛋白提取物、玉米蛋白提取物衍生物、大豆蛋白、小麦蛋白、壳多糖、基蒂克酸、琼脂、胶质、橡胶和聚甲基丙烯酸甲酯衍生物。

9.  一种用于治疗或预防白斑综合症病毒的方法，使用牡蒿提取物。

10.  根据权利要求9所述的方法，其特征在于：一起使用牡蒿提取物和三白草提取物。

11.  根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物的混合重量比为7:3到3:7。

12.  根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物被一聚合物包覆。

13.  根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物在被聚合物包覆之前先被制成颗粒。

14.  根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物首先被一亲水性聚合物包覆，其次再被一非亲水性聚合物包覆。

15.  根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述牡蒿提取物和三白草提取物的供给总量为300—700g/每吨普通饲料。

用于治疗或预防白斑综合症病毒的组合物和方法
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防白斑综合症病毒(white spot syndrome virus)的组合物和方法。
背景技术
由于没有遭受任何严重的疾病，世界虾工业得以发展直到20世纪90年代初期。在20世纪80年代后期和90年代初期，弧菌病(Vibriosis)是威胁到虾的养殖产率的主要疾病。然而，在90年代提出了新的致命的病毒，例如黄头病毒、白斑综合症病毒、Taura综合症病毒等，它们对虾养殖产率产生非常坏的影响。
特别是，从包括韩国和日本在内的亚洲各国到中美洲和南美洲的广为传播的虾的白斑综合症病毒，其经济危害性极其严重。白斑综合症病毒是一种宿主为各种甲壳类的双链DNA病毒，其属于Whispovirus种属Nimaviridae族(van Hulten M.C.W等，J.Gen.Virol.，81，pp307-316，2000)。该病毒体相当大(80-120nm×250-380nm)和具有3个表皮，以及其形状为杆状或椭圆形。在例如虾、龙虾、螃蟹等的节肢动物感染白斑综合症病毒之后，在虾的外壳(例如腮、间皮、甲壳、附肢、表皮等)上出现白斑，并且被感染的节肢动物表现为无精打采、行动减缓和食物消耗的突然减少。感染之后的3～5天，被感染的节肢动物死去(J.M.Vlak等，XII International Congress of Virology，Paris，2002)。
根据科学家发现的病毒和区域，该白斑综合症病毒还被称作WSSV(白斑综合症病毒)、WSV(白斑病毒)、WSBV(白斑杆状病毒)、CBV(中国杆状病毒)、HHNBV(皮下的和造血的坏死性杆状病毒)、PV-PJ(日本对虾的杆状病毒)、PRDV(对虾杆状病毒)、PAV(对虾急性病毒败血症)、SEMBV(系统的外胚层和中胚层的杆状病毒)等等。但是，这些病毒都被鉴定为同样的病毒。
有很多对降低白斑综合症病毒的危害的研究和进展，最新的研究和进展聚焦于节肢动物的免疫-刺激。通常使用的是脂多糖、葡聚糖、岩藻依聚糖等等，但是它们的效果不足以充分降低这种病毒的危害。此外，报道了壳聚糖、皂角苷、乳铁传递蛋白、右旋糖苷、菊粉等具有一定程度的药效(Newman S.G.，Fifth Ecuadorian Aquaculture Conference，Oct.pp28-30，1999)。
从很久以前就开始试验使用植物提取物作为抗病毒药物，和在最近系统地研究了一些植物提取物的药效。报道了一些植物提取物具有对虾的白斑综合症病毒的抗病毒效果。例如，研究了鳄嘴花(Clinacanthus nutans)(Direkbusarakom S.，等，Fish Pathology，33(4)，pp410-404，1998)和某些泰国的常规植物(Direkbusarakom S.，等，Fish Pathology，31(4)，pp209-213，1996)和叶下珠Phyllanthus种属植物(Direkbusarakom S.，等，Diseases in Asian Aquaculture II.Manila，pp81-88，1995)。在南韩，还报道了欧亚甘草根、川芎(Cnidiumofficinale)、花生、荞麦、刺松藻(Codium fragile)和紫菜类对白斑综合症病毒具有一定程度的抑制效果。但是，需要一种对白斑综合症病毒具有更好的治疗或预防效果的组合物。
公开
技术问题
因此，本发明的目的在于提供在治疗或预防白斑综合症病毒中有用的组合物和方法。
技术方案
为了达到该目的，本发明提供一种用于治疗或预防诸如虾、龙虾、螃蟹等的节肢动物的白斑综合症病毒的组合物，其包括作为有效成分的牡蒿(Artemisia japonica)提取物。更优选地，本发明提供用于治疗或预防节肢动物的白斑综合症病毒的组合物，其包括作为有效成分的牡蒿提取物和三白草(Saururus chinensis)提取物。
本发明还提供一种用于治疗或预防诸如虾、龙虾、螃蟹等的节肢动物的白斑综合症病毒的方法，其使用牡蒿提取物，和更优选地，使用牡蒿提取物和三白草提取物二者。
更优选地，本发明提供组合物和方法，其中的牡蒿提取物和三白草提取物的混合重量比为7:3到3:7。
优选地，本发明提供组合物和方法，其中牡蒿提取物和三白草提取物被一聚合物包覆，和更优选地提供组合物和方法，其中牡蒿提取物和三白草提取物先被制成颗粒，然后再用一聚合物包覆。
更优选地，本发明提供组合物和方法，其中牡蒿提取物和三白草提取物被制成颗粒，然后首先用一亲水性聚合物包覆，其次再用一非亲水性聚合物包覆。
更优选地，本发明提供用于治疗或预防白斑综合症病毒的方法，其中牡蒿提取物和三白草提取物的供给总量为300—700g/每吨普通饲料。
在下文中，将更为详细地描述根据本发明的用于治疗或预防白斑综合症病毒的组合物和方法。
本发明是基于一个令人惊讶的事实，即在治疗或预防诸如虾、龙虾、螃蟹等的节肢动物的白斑综合症病毒中，牡蒿提取物，优选地是牡蒿提取物和三白草提取物的混合物是有用的。出于这个令人惊讶的事实，本发明提供一种用于治疗或预防白斑综合症病毒的组合物，其包括牡蒿提取物，优选地包括牡蒿提取物和三白草提取物二者，作为有效成分。本发明还提供一种用于治疗或预防白斑综合症病毒的方法，其使用牡蒿提取物，优选地一起使用牡蒿提取物和三白草提取物二者。
本发明还基于这样一个事实，即在治疗或预防白斑综合症病毒中，牡蒿提取物比同为艾属的其它植物更为有用。
本发明还基于这样令人惊讶的事实，即牡蒿提取物和三白草提取物的混合可协同增效治疗或预防白斑综合症病毒。根据本发明的牡蒿提取物和三白草提取物的混合物比单独使用牡蒿提取物或牡蒿提取物显示出协同增强的效应。优选地，牡蒿提取物和三白草提取物的混合重量比为7:3到3:7，和优选为6:4到4:6。
本发明的牡蒿提取物和/或三白草提取物可以根据本领域众所周知的提取方法来制得。例如，按照如下方法制备植物提取物：将大约1-15倍体积的溶剂(例如水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙酸乙酯或它们的混合物)加到牡蒿和/或三白草中，然后通过冷水浸渍法、热提取法、回流-冷却提取法等方法制备植物提取物。然后，使用具有适宜孔径大小(例如，具有10um孔径的滤纸)的滤纸来过滤该植物提取物，并在真空、减压蒸馏或通过在适当温度(例如，约30-70℃)的喷雾干燥来浓缩该滤液以得到牡蒿提取物或三白草提取物。
更为优选的是在包覆之前将植物提取物造粒。使用本领域中常规使用的稀释剂(例如，麦芽糊精、乳糖、微晶的纤维素、蔗糖、甘露醇和淀粉)或普通虾饲料和该提取物混合，然后根据诸如干法造粒法、湿法造粒法、简单混合法等等的本领域众所周知的方法将其制备成颗粒。在与普通饲料的混合效果、容易处理以及后续的包覆过程的方面中这种造粒是更为合适的。
此外，这种造粒对于随后的过程以向已制得的颗粒中添加大约0.1-5％(基于颗粒的总重量)润滑剂(例如，二氧化硅和硬脂酸镁)也是更为合适的。
本发明还提供了令人惊讶的事实，即用聚合物包覆牡蒿提取物和三白草提取物可极大地改善虾的采食率(intake rate)。这种改善被认为是通过包覆的聚合物阻隔了牡蒿提取物和三白草提取物的气味而达到的，但是本发明不被局限于这种假定。
如上所述，优选地，将本发明的牡蒿提取物和三白草提取物制成易于包覆过程的颗粒，然后再用一聚合物包覆。当顾及几个方面时，优选的是用亲水性聚合物第一次包覆该提取物，然后再用非亲水性聚合物第二次包覆该第一次包覆过的提取物。当仅使用亲水性聚合物来包覆时，由于亲水性聚合物很容易溶解在水里，所以很难阻隔该植物提取物的气味。当仅使用非亲水性聚合物时，必需使用大量的非亲水性聚合物来阻隔该提取物的气味或味道，并且这种大量的非亲水性聚合物是很难在水中溶解的，其可能会引起功效的降低。此外，认为第一包覆本身是表现出阻隔不良气味的效果，而认为使用了非亲水性聚合物的第二包覆是改善了该提取物的稳定性以及改善了对不良气味的阻隔效果。
本发明的亲水性聚合物是指即使大量被用于包覆时仍能很容易地被溶解于水中的那些聚合物。这种亲水性聚合物包括但不局限于：羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、纤维素衍生物、藻酸钠、褐藻酸、大豆蛋白、小麦蛋白、角叉胶、黄芪胶、琼脂、阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶、橡胶、胶质、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、聚环氧烷衍生物、聚烷撑基二醇、聚乙烯-聚丙烯聚合物、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷聚合物、玉米蛋白、二乙基胺基乙酸酯、胺基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、环糊精、壳多糖、壳聚糖和明胶。更为优选的是羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、纤维素衍生物、藻酸钠、褐藻酸、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。
本发明的非亲水性聚合物是指很难被溶解在水中或非常缓慢地被溶解在水中的聚合物，所以这些聚合物可以防止提取物在短时间内被溶解到水中。这种非亲水性聚合物包括但不局限于：甲基纤维素、乙基纤维素、虫漆、聚醋酸乙烯酯、聚-L-赖氨酸、邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素、高粘度的纤维素衍生物、乙酸琥珀酸羟丙甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、玉米蛋白提取物、玉米蛋白提取物衍生物、大豆蛋白、小麦蛋白、壳多糖、基蒂克酸(chitic acid)、琼脂、胶质、橡胶和聚甲基丙烯酸甲酯衍生物。更为优选的是乙基纤维素、甲基纤维素和虫漆。
优选地，第一次包覆使用亲水性聚合物的量是基于提取物颗粒的总重量的1-30wt％，和更为优选地是4-15wt％。优选地，第二次包覆使用非亲水性聚合物的量是基于第一次包覆后的颗粒的总重量的1-10wt％，和更为优选地是2-8wt％。
在第一次包覆时，可以使用水制备包覆溶液。在第二次包覆时，可以使用乙醇、甲醇、异丙醇乙腈、丙酮、乙醚、正己烷、氯仿、1，4-二氧六环、二甲亚砜、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸甲酯或它们的混合物制备包覆溶液。
可以使用本领域众所周知的常规装置来实施包覆，例如流化床制粒机、喷雾干燥机、C/F制粒机等。本发明的范围不被局限于这些装置。
在用于治疗或预防(尤其是虾的)白斑综合症病毒的方法中，牡蒿提取物和三白草提取物的供给总量优选为300—700g和更为优选400—600g/每吨按照一只虾体重的1％供给(每天)的普通饲料。因为超过700g后其效果不再改善，所以供给超过700g是不经济的。在供给少于300g时，提取物的药效可能不够治疗或预防虾的白斑综合症病毒。
附图说明
图1显示了牡蒿(Artemisia japonica)提取物、三白草(Saururuschinensis)提取物、茵陈蒿(Artemisia capillaris)提取物、青蒿(Artemisiagmelini)提取物和鱼腥草(Houttuynia cordata)提取物对白斑综合症病毒的效果评价结果。
图2显示了牡蒿提取物和三白草提取物的混合比例对白斑综合症病毒的效果评价结果。
图3和图4显示了每吨普通饲料中包覆的牡蒿提取物和包覆的三白草提取物的供给量对白斑综合症病毒的效果评价结果。
图5和图6是显示了包覆的牡蒿提取物和包覆的三白草提取物的防-白斑综合症病毒作用的药理学机理的评价结果。
具体实施方式
在下文中，非常详细地描述本发明以帮助本领域的技术人员理解本发明。然而，下述实例是被提供为示例性说明而不意图限制本发明的范围。很显然的是可以作出各种变化而不偏离本发明的精神和范围或是损失其材料的所有优势。
<实施例1>制备提取物
将5kg干燥的牡蒿(Artemisia japonica)、三白草(Saururuschinensis)、茵陈蒿(Artemisia capillaris)、青蒿(Artemisia gmelini)和鱼腥草(Houttuynia cordata)分别用50L水、乙醇和它们1:1的混合物在室温下来浸渍-提取。进行3天该浸渍-提取，然后没有耽搁地重新进行2天。用10um滤纸来过滤提取物，并在真空于60℃浓缩该滤液直到滤液的重量减少至起始重量的5％。用约2.5倍浓缩物重量的乳糖和约总重量2％的二氧化硅将浓缩物制成颗粒。
考虑到浓缩物的收率，乙醇提取是最有效的。因此，在下面的所有实施例中使用通过乙醇得到的提取物。
<实施例2>每种提取物对白斑综合症病毒的效果评价
实施例1中制备的提取物对白斑综合症病毒的效果按照下面进行评价：
虾：使用条纹长臂虾(Palaemon paucidens)且它们的平均体重为0.3g。在测试前让虾适应于实验环境1周。在适应期，给虾供应普通饲料。
测试样品：分别使用实施例1中的牡蒿提取物、三白草提取物、茵陈蒿提取物、青蒿提取物和鱼腥草提取物。
测试分组：使用没有提取物的普通饲料作为对照组。分别使用牡蒿提取物、三白草提取物、茵陈蒿提取物、青蒿提取物和鱼腥草提取物作为5个测试组。每组包括30只虾。
测试样品的喂料：在感染病毒之前连续7天每天供应测试样品以评价对白斑综合症病毒的预防和治疗效果。另外，在感染病毒之后连续7天每天供应测试样品。每天在早上10点进行喂料。
虾的养育条件：在10L水浴中养育这些虾。水浴的温度保持在20℃。
白斑综合症病毒的感染：虾被白斑病综合症病毒人工感染且最终死亡。3只死虾在10ml蒸馏水中被细细地磨碎。将该研磨溶液以3500:1的比例加入到水浴中以将水浴中的虾用白斑综合症病毒感染。感染之后，统计虾的死亡率。
结果被示于图1。如图1所示，与对照组相比，牡蒿提取物、三白草提取物和茵陈蒿提取物提高了虾的存活率，这意味着在治疗或预防白斑综合症病毒中那些提取物是有用的。另外，牡蒿提取物比三白草提取物和茵陈蒿提取物更为有效。
<实施例3>提取物混合物的混合对白斑综合症病毒的效果评价
评价了牡蒿提取物和三白草提取物的混合物对白斑综合症病毒的效果，并且按下述方法研究了适当的混合物的混合比例：
虾：使用条纹长臂虾且它们的平均体重为0.3g。在测试前让虾适应于实验环境1周。在适应期，给虾供应普通饲料。
测试样品：分别使用实施例1中制备的牡蒿提取物和三白草提取物。
测试分组：使用没有牡蒿提取物和三白草提取物的普通饲料作为对照组。分别使用混合比例为10:0、6:4、5:5、4:6和0:10的牡蒿提取物和三白草提取物的混合物的作为5个测试组。每组包括30只虾。
测试样品的喂料：在感染病毒之前连续7天每天供应测试样品以评价对白斑综合症病毒的预防和治疗效果。另外，在感染病毒之后连续7天每天供应测试样品。每天在早上10点进行喂料。
虾的养育条件：在10L水浴中养育这些虾。水浴的温度保持在20±1℃。
白斑综合症病毒的感染：虾被白斑病综合症病毒人工感染且最终死亡。3只死虾在10ml蒸馏水中被细细地磨碎。将该研磨溶液以3500:1的比例加入到水浴中以将水浴中的虾用白斑综合症病毒感染。感染之后，统计虾的死亡率。
结果被示于图2。如图2所示，与对照组相比，牡蒿提取物、三白草提取物和它们的混合物提高了虾的存活率。具有几乎相等的混合比例、尤其是6:4重量比例的牡蒿提取物和三白草提取物的混合物，显示出比其它测试样品更高的存活率。
但是，当牡蒿提取物和三白草提取物仅通过与普通饲料简单混合的方式给虾服用时，很多测试样品没有被虾吃掉而是剩下了，这被认为是由于提取物的独特气味造成的。因为这个问题，认为难点在于让虾能吃到足够的提取物，和需要提高虾的饲料采食率。
<实施例4>提取物的包覆
用例如下面实施例中的聚合物包覆提取物以阻隔提取物的独特气味，即以增加虾对牡蒿提取物和三白草提取物的采食率。
<实施例4-1>
①第一次包覆
将100g羟丙甲基纤维素(HPMC2910)溶于1000ml蒸馏水中以制备一包覆溶液。将1000g实施例1中制备的牡蒿提取物颗粒和三白草提取物颗粒的混合物(二者重量比为6:4)在流化床制粒机(GX40，Freund，Japan)上流化，并且通过喷雾包覆溶液而被包覆。流化床制粒机的制备条件如下：
进气温度：约60℃
进气流速：0.3L/min
出气流速：0.5L/min
转子转数：220rpm
喷雾速度：10ml/min
②第二次包覆
将49.5g乙基纤维素溶于385ml丙酮和110ml乙醇的混合液中以制备一包覆溶液。将上述包覆的颗粒在流化床制粒机上流化，并且通过喷雾第二包覆溶液而被包覆。流化床制粒机的制备条件如下：
进气温度：约50℃
进气流速：0.3L/min
出气流速：0.5L/min
转子转数：230rpm
喷雾速度：12ml/min
<实施例4-2>
①第一次包覆
将3g藻酸钠溶于1000ml蒸馏水中以制备一包覆溶液。将1000g实施例1中制备的牡蒿提取物颗粒和三白草提取物颗粒的混合物(二者重量比为6:4)和97g乳糖在流化床制粒机上流化，并且通过喷雾包覆溶液而被包覆。流化床制粒机的制备条件与实施例4-1中的第一次包覆的条件类似。
②第二次包覆
将49.5g羟丙甲基纤维素(HPMCP)溶于247.5ml丙酮和247.5ml乙醇的混合液中以制备一包覆溶液。将上述包覆的颗粒在流化床制粒机上流化，并且通过喷雾第二包覆溶液而被包覆。流化床制粒机的制备条件与实施例4-1中的第二次包覆的条件类似。
<实施例4-3>
①第一次包覆
将100g羟丙甲基纤维素(HPMC2910)溶于1000ml蒸馏水中以制备一包覆溶液。将1000g实施例1中制备的牡蒿提取物颗粒和三白草提取物颗粒的混合物(二者重量比为6:4)在流化床制粒机上流化，并且通过喷雾包覆溶液而被包覆。流化床制粒机的制备条件与实施例4-1中的第一次包覆的条件类似。
②第二次包覆
将49.5g虫漆溶于495ml乙醇中以制备一包覆溶液。将上述包覆的颗粒在流化床制粒机上流化，并且通过喷雾第二包覆溶液而被包覆。流化床制粒机的制备条件与实施例4-1中的第二次包覆的条件类似。
<实施例5>包覆的提取物颗粒的采食率评价
用上述实施例4-1到4-3中制备的包覆的提取物颗粒对虾进行喂料测试。按照下面的方法评价根据包覆聚合物种类而定的采食率：
虾：使用条纹长臂虾且它们的平均体重为0.3g。在测试前让虾适应于实验环境1周。在适应期，给虾供应普通饲料。
测试分组：使用具有实施例1中制备的未包覆的牡蒿提取物颗粒和未包覆的三白草提取物颗粒的混合物(二者重量比为6:4)的饲料的作为对照组。每组包括30只虾。
测试样品的喂料：从第0天到第5天供应测试样品，其中第0天是一周的上述适应期结束之后的那天。一天一次供应2g饲料，每天在早上10点进行喂料。
虾的养育条件：在10L水浴中养育这些虾。水浴的温度保持在20±1℃。
评价项目：从喂料测试样品的第0天到第5天，每天在同一喂料时间记录在前一天供给的饲料的剩余量作为随着在水浴中的剩余量而定的5个点(从1到5)。在剩余量的评价完成后，将水浴打扫干净并给虾供应新饲料。将水浴底部分为6个部分(在宽度上分3份和在长度上分2份)，承认以下几点：等级0(-)-所有6个部分都没有剩余饲料；等级1(+)-6个部分中的一个部分有剩余饲料；等级2(++)-两个部分有剩余饲料；等级3(+++)-三个部分有剩余饲料；等级4(++++)-四个部分有剩余饲料；和等级5(+++++)-五个部分或所有部分有剩余饲料。结果列于下表1。
表1