一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法.pdf

一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法，本发明涉及天然植物活性多糖的提取分离技术领域，具体地说涉及一种龙须菜纯多糖的制备方法。其特点是包括如下步骤：1)原料处理，2)多糖提取，3)超滤分级，4)离子柱层析，5)凝胶柱层析，6)成品收集。实施本发明后的积极效果是：本发明提取了龙须菜纯品多糖，不仅可提供市场需要，还为深入研究龙须菜纯多糖其在抗突变、抗肿瘤、清除自由基和抗氧化作用，以及调节免疫活性方面机理的研究创造了条件。

1，  一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法，其特征是：包括如下步骤：
1)、原料处理
龙须菜干品粉碎后，留下过60目筛的龙须菜干品粉，4℃保存备用；
2)、多糖提取
龙须菜藻粉以水重复提取3次，具体方法：以1:20-50重量比加入蒸馏水，每小时搅拌1次，在20-28℃室温下，提取12h，提取液4000r/min离心分离残渣；最后合并提取液；
3)、超滤分级
提取液经截留分子量为10万的膜超滤，截留液减压浓缩、-20℃保存；
4)、离子柱层析
截留液经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0mol/L；收集样品峰，用截留分子量为8,000-12,000Da透析袋，蒸馏水透析3-5天，-20℃保存；
5)、凝胶柱层析
取离子柱下来的样品，进行凝胶柱Sephacryl S500分离；流动相为0.2mol/L亚硝酸纳，流速0.5mL/min，5mL/管收集，示差折光检测器检测并收集样品峰；
6)、成品收集
浓缩后，蒸馏水透析3-5天，冷冻干燥收集，即为龙须菜纯多糖。

一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及天然植物活性多糖的提取分离技术领域，具体地说涉及一种龙须菜纯多糖的制备方法。
背景技术
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是江蓠属(Gracilaria Greville)的一种温带性红藻。原产于我国山东省沿海和日本冲绳岛，近年来在广东、福建等省实现规模化养殖，产量逐年增加。龙须菜其主要用途是作为琼胶生产的原料，也可做为鲍鱼饲料及绿色食品开发，另外龙须菜的栽培有利于改善沿海海水水质，具有环境修复作用。
但有关龙须菜深加工方面的研究很少。目前国外未见有关龙须菜生物活性方面的研究报道，国内也只有少数学者对龙须菜多糖的生物活性进行了初步研究，研究发现其具有抗突变、抗肿瘤、清除自由基和抗氧化作用。有关龙须菜多糖调节免疫活性方面的研究，中国专利CN101100488A正在公示一种在较高温度下提取龙须菜活性多糖的方法。该方法虽获得对小鼠淋巴细胞具有较高增殖效果的龙须菜多糖，但提取的多糖并非纯品多糖，不利于明确活性成分和进一步研究作用途径。
发明内容
本发明提供一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法。
本发明采取的技术方案：采用由一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法，其方案是：包括如下步骤：
1)、原料处理，2)、多糖提取，3)、超滤分级，4)、离子柱层析，5)、凝胶柱层析，6)、成品收集。
实施本发明后的积极效果是：
本发明提取了龙须菜纯品多糖，不仅可提供市场需要，还为深入研究龙须菜纯多糖其在抗突变、抗肿瘤、清除自由基和抗氧化作用，以及调节免疫活性方面机理的研究创造了条件。
附图说明
图1为龙须菜纯多糖制备流程图
图2为制备的龙须菜纯多糖HPSEC层析结果图
具体实施方式
现结合附图对本发明作进一步说明
一种具有免疫调节作用的龙须菜纯多糖的制备方法，包括如下步骤：
1)、原料处理
龙须菜干品粉碎后，留下过60目筛的龙须菜干品粉，4℃保存备用；
2)、多糖提取
龙须菜藻粉以水重复提取3次，具体方法：以1:20-50重量比加入蒸馏水，每小时搅拌1次，在20-28℃室温下，提取12h，提取液4000r/min(或6层纱布过滤后再滤纸抽率)分离残渣。最后合并提取液。
3)、超滤分级
提取液经截留分子量为10万的膜超滤，截留液减压浓缩、-20℃保存；
4)、离子柱层析
截留液经DEAE-Sepharose Fast Flow(琼脂糖凝胶)离子交换柱层析(2.6×100cm)，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0mol/L；收集样品峰，用截留分子量为8,000-12,000Da透析袋，蒸馏水透析3-5天，-20℃保存；
5)、凝胶柱层析
取离子柱下来的样品，进行凝胶柱Sephacryl S500(丙烯葡聚糖凝胶)分离(1.6×100cm)；流动相为0.2mol/L亚硝酸纳，流速0.5mL/min，5mL/管收集，示差折光检测器检测并收集样品峰；
6)、成品收集
浓缩后，蒸馏水透析3-5天，冷冻干燥收集，即为龙须菜纯多糖。
实施例1
①、原料处理
龙须菜干品粉碎后留下过60目筛的龙须菜干品粉，4℃保存备用。
②、多糖提取
称取龙须菜藻粉5Kg，以重量比1:20加入蒸馏水，每小时搅拌1次，室温下提取12h，提取液4000r/min离心10min(或6层纱布过滤后再滤纸抽率)分离残渣，残渣再重复提取2次，合并提取液。
③、超滤分级
提取液经截留分子量为10万的膜超滤，截留液减压浓缩、-20℃保存。
④、离子柱层析
制备浓度为8-10mg/ml截留液。经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析(2.6×100cm)，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0mol/L，上样量：8mg/ml，共48ml。60min后开始收集，15ml/管，样品峰2-20管，浓缩后，用截留分子量为8-12kD透析袋，蒸馏水透析3-5天，-20℃保存。
⑤、凝胶柱层析
取离子柱下来的样品，配置成浓度15-20mg/mL溶液，进行凝胶柱SephacrylS500分离(1.6×100cm)。上样量0.4mL，流动相为0.2mol/L亚硝酸纳，流速0.5mL/min，5mL/管收集，示差折光检测器检测。收集19-29管，浓缩后，蒸馏水透析3-5天，冷冻干燥收集样品，即为龙须菜多糖纯品GCpF2-1B。
实施例2
纯度鉴定
高效渗透色谱层析(HPSEC)
配置测试样品2mg/mL，10000rpm离心10min，取上清20μL上样，记录洗脱曲线。HPSEC的具体测试条件如下：Waters高效液相色谱系统(2695HPLCPump，In-line Degasser，2414 Refractive Index Detector与2487 DualλAbsorbanceDetector平行检测，TSK PWXL 4000-3000串联柱)，流动相为pH为7.0的0.1mol/L NaH₂PO₃和0.3mol/L NaNO₃。流速为0.2mL/min，柱温30±0.1℃。(见图2)
实施例3
GCpF2-1B生物活性检测
颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取脾，置于100目灭菌不锈钢筛网上，用注射器内塞将脾研碎，过筛，用PBS冲洗网筛2-3遍，脾细胞的悬液转入无菌的离心管中，再加入PBS至30-40ml，400g离心6min，收集细胞，在室温下加NH4Cl溶液(1.5ml/只)，不断枪打或摇晃混匀细胞10分钟，以裂解红细胞，加PBS至30-40ml，400G离心5分钟，去上清，加入少量RPMI1640培养基细胞计数仪计数后，用RPMI1640稀释细胞悬液至2×10⁶个/ml。取180μl细胞悬浮液加至96孔板中，分别加入20μl的不同的样品和阳性对照植物血凝素，阴性对照PBS。在37℃和5％ CO₂的条件下培养3天后，用ELISA自动读板仪分别测定570nm和600nm的吸光度，加入20μl Alamar Blue显色剂，培养6-8小时，再次测定570nm和600nm的吸光度，然后根据Alamer Blue Assay给的公式计算各样品对淋巴细胞的激活率。
淋巴细胞增殖率(％)＝[117216×A_λ570(sample)-80586×A_λ600(sample)]
/[117216×A_λ570(control)-80586×A_λ600(control)]×100％；
实验结果显示，在低浓度(50μg/ml)时，增值率为152％；当浓度增加到200μg/ml增值率达到185％；继续增加浓度至500μg/ml时，增值率达到227％(阳性对照60μg/ml植物凝聚素增值率207％)。表明GCpF2-1B具有较高的刺激淋巴细胞增殖作用，且呈现剂量依赖性。