一种温度敏感性生物可降解水凝胶及其制法和用途.pdf

一种具有温度敏感性同时可生物降解的水凝胶，由下法制得：甲基丙烯酸羟乙酯与ε-己内酯反应得到甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯；将甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯与羰基二咪唑反应，通过旋转蒸发得到甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯-咪唑；将甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯-咪唑与α-(1→6)-D-葡聚糖溶于二甲亚砜中，加入对-二甲氨基吡啶，室温下反应得到的混合物在异丙醇中沉淀，真空干燥得到甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖；N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液中，然后加入过硫酸铵和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，室温下反应得到水凝胶；将得到的水凝胶用磷酸缓冲液透析，得到温度敏感性生物可降解水凝胶。

1.  一种温度敏感性生物可降解水凝胶，由下法制得：(1)将摩尔比为1：1—1：10的甲基丙烯酸羟乙酯与ε—己内酯在氮气氛围中，以辛酸亚锡为催化剂，100—120℃反应3—12小时；反应后的混合物溶于四氢呋喃中，沉淀，沉淀物溶于乙酸乙酯，用硫酸镁干燥，然后减压浓缩得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯；将得到的甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯与羰基二咪唑以摩尔比1：1—1：2溶于四氢呋喃，在氮气气氛中反应16—24小时，通过旋转蒸发得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑；将上述产物甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑与重均分子量为15000-25000的α-(1→6)-D-葡聚糖以20：1-30:1的摩尔比溶于二甲亚砜中，加入与甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑等摩尔的对—二甲氨基吡啶，室温下反应3—4天，得到的混合物在异丙醇中沉淀，然后用异丙醇洗涤，真空干燥得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖；(2)N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液中，然后加入过硫酸铵和催化量的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，室温下反应12—24小时得到水凝胶；将得到的水凝胶在室温下用磷酸缓冲液透析，得到温度敏感性生物可降解水凝胶。

2.  权利要求1所述温度敏感性生物可降解水凝胶的制备方法，其特征在于：(1)将摩尔比为1：1—1：10的甲基丙烯酸羟乙酯与ε—己内酯在氮气氛围中，以辛酸亚锡为催化剂，100—120℃反应3—12小时；反应后的混合物溶于四氢呋喃中，沉淀，沉淀物溶于乙酸乙酯，用硫酸镁干燥，然后减压浓缩得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯；将得到的甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯与羰基二咪唑以摩尔比1：1—1：2溶于四氢呋喃，在氮气气氛中反应16—24小时，通过旋转蒸发得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑；将上述产物甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑与重均分子量为15000-25000的α-(1→6)-D-葡聚糖以20：1-30:1的摩尔比溶于二甲亚砜中，加入与甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑等摩尔的对—二甲氨基吡啶，室温下反应3—4天，得到的混合物在异丙醇中沉淀，然后用异丙醇洗涤，真空干燥得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖；(2)N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液中，然后加入过硫酸铵和催化量的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，室温下反应12—24小时得到水凝胶；将得到的水凝胶在室温下用磷酸缓冲液透析，得到温度敏感性生物可降解水凝胶。

3.  根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖和过硫酸铵的用量质量比为160—190：10—40：5—10。

4.  根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：磷酸缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠按摩尔配比1：2的比例配制。

5.  权利要求1所述的温度敏感性生物可降解水凝胶作为体外药物控制释放或组织工程支架材料的应用。

6.  权利要求1所述的温度敏感性生物可降解水凝胶在制备治疗心肌梗死的包裹干细胞中的应用。

一种温度敏感性生物可降解水凝胶及其制法和用途
技术领域
本发明涉及一种温度敏感性生物可降解水凝胶及其制备方法和用途。属于高分子化学领域，也属于生物学领域。
背景技术
上世纪80年代，Tanaka报道了聚N—异丙基丙烯酰胺水凝胶具有温敏性特征(J.Chem.Phys.1987，81:1392)，在低温下溶胀，在高温下收缩，其特点是存在一个温度转变区域——低临界相变温度(LCST)，当水凝胶在低于这一温度时凝胶溶胀，超过该温度则体积迅速收缩。这类水凝胶虽然具有良好的温度敏感性，但不能在体内完全降解。
发明内容
本发明的目的是提供一种既具有温度敏感性特征又具有生物降解特性的水凝胶，且制备方法简单，所得到的水凝胶生物相容性好，适合于作为体外药物控制释放或组织工程支架材料。
本发明提供的技术方案是：一种温度敏感性生物可降解水凝胶，由下法制得：(1)将摩尔比为1：1—1：10的甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)与ε—己内酯(CL)在氮气氛围中，以辛酸亚锡的催化，100—120℃反应3—12小时；反应后的混合物溶于四氢呋喃，沉淀，沉淀物溶于乙酸乙酯，用硫酸镁干燥，然后减压浓缩得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯(PCL-HEMA)；将得到的甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯与羰基二咪唑(CDI)以摩尔比1：1—1：2溶于四氢呋喃，在氮气气氛中反应16—24小时，通过旋转蒸发得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑(HEMA-PCL—CI)；将上述产物甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑与重均分子量为15000-25000的α-(1→6)-D-葡聚糖(Dextran)以20：1—30：1的摩尔比溶于二甲亚砜(DMSO)中，加入与甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑等摩尔的对—二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下反应3—4天，得到的混合物在异丙醇中沉淀，然后用异丙醇洗涤，真空干燥得到聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖(Dex-PCL-HEMA)；(2)N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖溶解于pH＝7.4的磷酸缓冲液中，然后加入过硫酸铵和催化量的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，室温下反应12—24小时得到水凝胶；将得到的水凝胶在室温下用磷酸缓冲液透析，得到温度敏感性生物可降解水凝胶。
上述N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖和过硫酸铵的用量质量比为160—190：10—40：5—10。
上述磷酸缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠按摩尔配比1：2的比例配制。
本发明甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖(其中，R为氢或甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯，m＝93—123、n＝3)合成路线：

本发明的温度敏感性生物可降解水凝胶既具有温度敏感性特征又具有生物降解特性，且制备方法简单，所得到的水凝胶生物相容性好，适合于作为体外药物控制释放或组织工程支架材料在组织工程或药物控制释放中的应用；也可以用于包裹干细胞在心肌梗死治疗中的应用。
附图说明
图1为本发明葡聚糖接枝聚己内酯合成产物核磁图；
图2为本发明水凝胶的凝胶化过程示意图；
图3为本发明水凝胶的流变学性质图；
图4为本发明水凝胶的内部形貌图；
图5为本发明水凝胶体内及体外降解图；
图6为本发明水凝胶体外控制释放BSA图；
图7为本发明水凝胶的细胞毒性实验结果图；
图8为本发明水凝胶注射皮肤下的组织切片图；
图9为本发明水凝胶注射后的大鼠的血常规及肝肾功能指标图；
图10为本发明水凝胶注射对左心室重塑以及心肌梗死后的功能影响。
具体实施方式
实施例1：(1)甲基丙烯酸羟乙酯-聚己内酯—g-α-(1→6)-D-葡聚糖的制备：a：将等摩尔比地甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)与ε—己内酯(CL)在氮气氛围中，以辛酸亚锡为催化剂，110摄氏度反应3小时，其中摩尔比为甲基丙烯酸羟乙酯：ε—己内酯：辛酸亚锡＝1:1:0.01。反应后的混合物溶于四氢呋喃，然后在冷水中沉淀，此沉淀物溶于乙酸乙酯，用硫酸镁干燥过夜，然后减压浓缩得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯(PCL-HEMA)。b:将得到的产物甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯与羰基二咪唑(CDI)以摩尔比1：1溶于四氢呋喃，在氮气气氛中反应24小时，通过旋转蒸发的到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑(HEMA-PCL—CL)。C：将上述产物甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑与α-(1→6)-D-葡聚糖(Dextran)以20：1的摩尔比溶于二甲亚砜(DMSO)中，加入与甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯—咪唑等摩尔的对—二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下反应4天，得到的混合物在20倍量的异丙醇中沉淀，然后用异丙醇洗涤三次，真空干燥得到甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖(Dex-PCL-HEMA)，其核磁图如图1所示，由图1C可以看出，甲基丙烯酸羟乙酯双键出现在a峰，说明本发明制得了甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖。
(2)将N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖溶解于磷酸氢二钠和磷酸二氢钠摩尔配比1：2磷酸缓冲液(pH7.4)磷酸缓冲液磷酸缓冲液中，然后加入过硫酸铵和催化量的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，室温下反应12—24小时得到水凝胶；将得到的水凝胶在室温下用磷酸缓冲液透析，得到温度敏感性生物可降解水凝胶；其中，α-(1→6)-D-葡聚糖的重均分子量为15000-25000，甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯的重均分子量为500—3200，甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖的接枝度为每百个葡聚糖单元有三个聚己内酯分子取代α-(1→6)-D-葡聚糖的羟基。
实施例2：水凝胶体外控制释放牛血清蛋白(BSA)
将20毫克的牛血清蛋白(数均分子量为67000)溶于1000毫克的DN2水凝胶的磷酸缓冲溶液中，其中水凝胶的含量为8％。然后，把这种水凝胶的磷酸缓冲溶液与牛血清蛋白充分混合，置于50毫升的离心管中于37℃的水浴中过夜，使水凝胶的溶液变成粘性的水凝胶。20毫升预先升温至37℃的磷酸缓冲溶液慢慢地加入到包裹了牛血清蛋白的DN2水凝胶中。在设定的时间点，每次从20毫升的释药体系中取出4毫升的磷酸缓冲溶液，同时加入新鲜的磷酸缓冲溶液使其体积不变。用紫外光谱仪检测其中的BSA的浓度，紫外吸收波长为280纳米，从而计算出从水凝胶中释放出的BSA含量。BSA的累积释放量％＝M_t/M₀)×100，其中M_t是时间为t时释放的总的BSA质量，M₀是开始投入的20毫克BSA的质量与包裹时没有包裹到水凝胶中的BSA的质量。在此实验中，BSA的包裹效率为98％。凝胶体外控制释放BSA曲线如图6所示，前5小时内释放最快，DN1、DN2、DN3、DN4累积释放的BSA分别为39％，30％，23％，17％。因为第一天交联酯键的降解较快，亲水性的BSA扩散到缓冲溶液中的速率也较快，但在接下来的七天，释放级数几乎为零级。
实施例3：水凝胶携带骨髓间充质干细胞和心肌细胞注射入大鼠体内，比较骨髓间充质干细胞在不同环境下的分化和功能和心肌细胞分化的差别。
大鼠购进七天后，将其随机分为四组：1.心肌梗死组(8只)，2.注射水凝胶组(8只)，3.注射细胞组(8只)，4.注射细胞和水凝胶组(11只)。所有的注射都通过29号针头注射至心肌内层部分，并且每组注射的体积均为200微升。第一组注射200微升DMEM/F12培养基至心肌内层；第二组注射200微升水凝胶；第三组注射200微升悬浮了1*10⁷个骨髓间充质干细胞的DMEM/F12培养基；第四组注射悬浮了1*10⁷个骨髓单核成肌细胞。根据检测时间为30天，过量戊巴比妥钠处死大鼠，然后取左心室包埋后冰冻切片进行病理分析。超声心动图：检测注射了骨髓单核成肌细胞的左室射血分数。组织学检查：HE染色观察梗死区新生组织，Masson’Trichrome染色测量梗死壁厚度，计算梗死面积(梗死区面积/总面积)。从表和图中可知，注射水凝胶后，心肌的血液循环以及心肌梗死都得到了明显改善。
附表1.水凝胶注射对左心室重塑以及心肌梗死后的功能影响。

如图10所示本发明水凝胶注射对左心室重塑以及心肌梗死后的功能影响：其中，LVEF左心室射血分数，LVEDD左心室末端舒张直径，LVESD左心室末端收缩直径，LVSP左心室末端收缩压，LVEDP左心室末端舒张压，dp/dt压力的一阶导数，infarct size心肌梗死尺寸，p<0.005表示有统计学显著差异。
本发明温度敏感性生物可降解水凝胶的性质及实验：

上表表示的是四种不同配比条件下制备的水凝胶，其中Dex-PCL-HEMA指的是甲基丙烯酸羟乙酯—聚己内酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖，NIPAAm指的是N-异丙基丙烯酰胺，APS指的是过硫酸铵，TEMED指的是N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。
1.水凝胶溶胶与凝胶可逆性转变
水凝胶溶胶与凝胶可逆性如图2所示，随着温度的升高，水凝胶溶液在1min内变成凝胶；降低温度，凝胶也很快变成溶胶。由不同浓度的水凝胶溶液的凝胶化过程可知：浓度越高，凝胶化越快。当升到37℃，比其LCST(33.2℃)高时，PNIPAAm链的亲水/憎水平衡改变，PNIPAAm链发生脱水，如图2所示，水凝胶溶液变得不透明。但要注意的是，升温到37℃时，水凝胶只失去少量的水，凝胶化后其仍含有大量的水分。图2表明，温度在LCST上，水凝胶形成一个比较稳定的凝胶体系，这在药物及蛋白质包裹持续释放方面有很好的应用。
图3说明本发明的水凝胶在温度为29—32摄氏度发生相转变，也就是发生溶胶—凝胶转变，并且水凝胶的强度在37摄氏度时达到最大值而且稳定，适合于体内注射而作为组织工程材料。凝胶1、凝胶2、凝胶3凝胶4分别就是DN1、DN2、DN3、DN4。
2.内部形貌
如图4所示：水凝胶的平均孔径随着交联剂的含量的增大而缩小，DN1平均孔径为8微米，然后逐渐减小，DN2、DN3、DN4的平均孔径分别为6、4、2微米，DN4孔直径是DN1的1/4。交联剂的含量与水凝胶孔直径之间的关系：交联密度随交联剂的含量组份的增加而增加。这是由于交联剂的交联基团是位于葡聚糖主链上重复的葡萄糖单元。
3.体内及体外降解
从图5A可以看出：37℃时，水凝胶在前三天降解比较快，第一天降解率为2.8％—10.9％(DN1到DN4逐渐增大)，3天后降解速率明显减缓，在第4—16天间，DN1、DN2、DN3、DN4四种水凝胶的降解率依次增大。前三天，葡聚糖链被缓冲溶液包围，葡聚糖与PCL-HEMA之间酯键发生水解。37℃时，葡聚糖链亲水而PNIPAAm憎水，随着越来越多糖苷键断裂扩散进缓冲溶液，凝胶越来越憎水，因此，水很难扩散到水凝胶网络中。图4显示的DN1、DN2、DN3、DN4在16天后，其重量达到一个稳定状态，基本上不再降解。
以皮下注射组的皮下水凝胶最大横径来大致推测水凝胶的降解，用横径—时间曲线表示(图5B)，我们可以看出与体外降解相似，前5天降解较快，以后降解逐渐减慢，其最终降解率较体外高，可达87％左右。
4.水凝胶体外控制释放牛血清蛋白(BSA)
凝胶体外控制释放BSA曲线如图6所示，前5小时内释放最快，DN1、DN2、DN3、DN4累积释放的BSA分别为39％，30％，23％，17％。因为第一天交联酯键的降解较快，亲水性的BSA扩散到缓冲溶液中的速率也较快，但在接下来的七天，释放级数几乎为零级。这是因为，随着交联酯键的降解，亲水性的葡聚糖链开始扩散到PBS中，水凝胶慢慢变为憎水性。而在37℃，塌陷的PNIPAAm结构可大量包裹着残余的BSA，从而延迟BSA的释放。只有DN降解速率趋于平缓时，BSA释放量才和时间成线性关系。降解完毕，释药也结束。由此可知，BSA药物的释放行为主要是由DN水凝胶的交联剂的降解来决定的，而不是扩散机理。
5.水凝胶的细胞毒性
图7可以看出，通过吸光值与对照组的比较，水凝胶对细胞生长无明显影响。
6.体内生物相容性
试验过程中所有大鼠下肢活动能力无下降，皮下注射组有1只出现局部皮肤坏死，用红霉素软膏涂搽4天后好转，其余大鼠局部未见红肿、坏死，一周后冰冻切片(图8，皮下注射与肌肉注射大鼠局部炎症反应轻微；水凝胶注射一周后各组血白细胞分析无明显统计学差异。
试验过程中大鼠饮食量无明显变化，肝肾功能指标丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、肌氨酸酐、尿素氮各组间在统计学上无明显差异，我们观察了三组间血糖浓度，血细胞个数均无显著性差异。(见图9)