一种制备微粉化蛋白的方法 【技术领域】
本发明涉及由含人血管内皮抑制素的原料溶液制备固体形式的微粉化人血管内皮抑制素的方法。特别涉及一种能得到高活性的微粉化人血管内皮抑制素的方法。
背景技术
生物技术的革新和发展使重组蛋白和多肽药物得以实现大规模的生产和应用。蛋白与多肽在水溶液中不稳定，易失活，阻碍了将此类药物制备成药用制剂。例如将蛋白溶液与有机溶剂接触后，由于油水界面表面张力的存在，使蛋白构象改变而失活。现有的在蛋白原液中直接添加冻干保护剂的冷冻干燥法也可得到干燥的固态蛋白，但得到的蛋白颗粒大，辅料占的比重大，多用于制成冻干粉针剂，用途不广泛。
在蛋白与多肽类药物给药系统的研究中，以药物微粉化为前提的剂型日益增多，这些剂型的应用和发展，其前提和关键是药物的微粉化。但现有的生产固态蛋白的技术无法生产出粒径小于3um的微粉化蛋白，故不能满足新剂型研发的需要。本发明独特的优点在于：一、将蛋白制备成固态，提高了蛋白被制备成其他剂型的稳定性；二、固态的蛋白，其粒子极小，是微粉化的固态蛋白，扩展了其制剂应用范围，不仅可用于制备粉末注射剂，由于其粒径极小(1um以下)，还可用于制备干粉吸入剂、粉末注射剂等等。
现有微粉化蛋白的方法已经有很多，总体归纳可分为以下几种：喷雾干燥法、冷冻干燥法、喷雾冷冻干燥法、超临界流体技术。喷雾干燥是利用雾化器将药物溶液分散为细小的雾滴，并在热干燥介质中迅速蒸发溶剂形成干粉的过程，该技术制得的微粉粒径均匀，但是该法需使用热空气，不适合用于干燥对温度不敏感的蛋白和多肽药物。喷雾冷冻干燥法将喷雾干燥中的雾化步骤与冷冻干燥相结合，步骤是将雾化的药物水溶液喷入液氮中，以冷冻干燥的步骤将其干燥，得到粒径均匀的药物微粉。该方法批处理量大，但成本较高，得到的微粉粒径较大。超临界流体技术是新近发展的技术，可用于超临界流体的性质来提取溶剂，干燥蛋白，但是，该技术仍存在许多需要研究和解决的问题：如蛋白和多肽类药物在有机溶剂中的溶解度普遍较小，如何通过改变溶剂组成来增加药物的溶解度，以及不同的操作条件与最终得到的不同性质微粉之间的关系。
发明内容：
本发明的目的是为了解决现有的微粉化蛋白方法中存在的问题，提供一种活性保持良好且微粉化效率极高的微粉化蛋白方法。
本发明制备的微粉化蛋白可应用于多种用途：干粉吸入剂、粉末注射剂以及微球微囊缓释制剂等。
本发明公开了一种制备微粉化蛋白的方法，它包括以下步骤：
(1)在含有可溶性蛋白的缓冲盐溶液中加入可溶性金属盐，然后调整该溶液的pH至蛋白的等电点(pI)，得到蛋白的细小颗粒沉淀，蛋白溶液变为混悬液；
(2)将混悬液与冻干保护剂混合均匀后，冻干；
(3)将冻干后的固体粉块用溶剂洗涤，除去冻干保护剂，得到微粉化蛋白。
本工艺利用的原理是“等电点+金属盐”两种方法共同作用得到蛋白细小的沉淀颗粒，适用于绝大多数可溶性蛋白。
上述可溶性蛋白可以是重组人血管内皮抑制素Endostar，重组人生长激素，干扰素α2-b(IFNα2-b)，重组人胰岛素等。
本发明中利用聚乙二醇这种聚合物作为冷冻干燥的保护剂，在冻干中起到空间赋形和稳定的作用，沉淀下来的蛋白颗粒可吸附在聚乙二醇的骨架上。
上述聚乙二醇分子量范围在1000至8000道尔顿。聚乙二醇有着良好的悬浮稳定性，分子量范围在1000至8000道尔顿均可很好的稳定蛋白颗粒，保持其在冻干中不聚集，不下沉。
上述微粉化蛋白的制备方法，步骤(2)中混悬液和冻干保护剂地体积比为1∶99～99∶1，优选15∶85～90∶10；混悬液中的蛋白浓度为0.01mg/ml～500mg/ml，冻干保护剂的浓度为1％～50％(w/v)。冻干保护剂的浓度不可小于1％，否则悬浮稳定性很差，蛋白沉淀会很快下沉聚集；冻干保护剂的浓度过高也不适合，因为冻干后为了得到蛋白微粉，需使用有机溶剂洗涤除去该保护剂，若保护剂占的比例过高，需消耗大量有机溶剂，反复清洗，给操作带来不便。保持1％～50％(w/v)的浓度较适宜。
上述微粉化蛋白的制备方法，步骤(3)中的洗涤溶剂是可溶解聚乙二醇的溶剂，例如：丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈。优选乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈。
本发明属于将蛋白沉淀技术与冷冻干燥技术结合的一项新的制备蛋白微粉的工艺。本发明的工艺温和简单，成本小，得到的微粉粒径小于1um，且蛋白活性保持良好，是一项有广泛医药应用前景的微粉化蛋白方法。
本发明的优点有：
一本发明将蛋白沉淀颗粒与冻干保护剂冷冻干燥，蛋白的沉淀颗粒附着在保护剂的骨架上，保持了蛋白微粉的分散性，和蛋白多级结构的完整性。制备的微粉化蛋白可保留制备前85％以上的活性。
二冻干后，蛋白呈固态，不含水，此时使用有机溶剂洗涤除去聚乙二醇时，不会使固态蛋白发生油水界面上的变性，干燥的蛋白微粉性质稳定，便于下一步的制备或长期储存。
三蛋白经过微粉化后，扩展了其制剂应用范围，不仅可用于制备微球制剂，由于其粒径极小(1um以下)，还可用于制备干粉吸入剂、粉末注射剂、植入泵制剂。
【附图说明】
图1实施例一中蛋白微粉的SEM扫描电镜照片
左图的标尺为5μm，右图的标尺为10μm，可见蛋白微粒的直径小于1μm。
图2实施例二中蛋白微粉的SEM扫描电镜照片
左图的标尺为5μm，右图的标尺为1μm，可见蛋白微粒的直径小于1μm。
图3实施例二中蛋白微粉对HUVEC细胞增殖活性
【具体实施方式】
本发明通过以下实施例作更详细的描述，但不能将其解释为限制本发明的保护范围。
实施例一
等电聚焦电泳法测定重组人血管内皮抑制素蛋白的等电点，测定结果为PI＝8.8～9.3，量取50ml重组人血管内皮抑制素蛋白溶液(9.1462mg/ml，PH＝5.5)，加入0.004％的醋酸锌，至锌盐完全溶解后，用氢氧化钠溶液(1mol/L)调蛋白溶液的PH至8.8-9.3这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为50％(w/v)的PEG-8000溶液，磁力搅拌5min使之混合均匀。
将上述制备好的溶液分装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。用二氯甲烷溶解冻干物，PEG-8000在二氯甲烷中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化蛋白，常温减压干燥之，得到干燥的微粉化蛋白，粒径0.01-1um之间。(图1)
实施例二
等电聚焦电泳法测定重组人血管内皮抑制素蛋白的等电点，测定结果为PI＝8.8～9.3，量取50ml蛋白溶液(102.8mg/ml，PH＝6.5)，加入0.001％的硫酸镁，至镁盐完全溶解后，用氢氧化钠溶液(1mol/L)调蛋白溶液的PH至8.8-9.3这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为20％(w/v)的PEG-6000溶液，磁力搅拌5min使之混合均匀。
将上述制备好的溶液分装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。冻干时间为一天。用二氯甲烷溶解冻干物，PEG-6000在二氯甲烷中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化蛋白，常温减压干燥之，得到干燥的微粉化重组人血管内皮抑制素蛋白。
粒径0-1um之间。(图2)
实施例三
等电聚焦电泳法测定重组人生长激素的等电点，测定结果为PI＝5.30～5.80，量取50ml蛋白溶液(86.90mg/ml，PH＝7.4)，加入0.04％的硫酸钙，至钙盐完全溶解后，用醋酸溶液(1mol/L)调蛋白溶液的PH至5.30～5.80这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为30％(w/v)的PEG-4000溶液，磁力搅拌8min使之混合均匀。
将上述制备好的溶液分装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。冻干时间为一天。用二氯甲烷溶解冻干物，PEG-4000在二氯甲烷中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化重组人生长激素，常温减压干燥之，得到干燥的微粉化的重组人生长激素。
实施例四
等电聚焦电泳法测定干扰素α2-b(IFNα2-b)的等电点，测定结果为PI＝5.20～6.10，量取50ml蛋白溶液(117.2mg/ml，PH＝7.4)，加入0.025％的醋酸锌，至锌盐完全溶解后，用醋酸溶液(1mol/L)调蛋白溶液的PH至5.20～6.10这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为8％(w/v)的PEG-8000溶液，磁力搅拌5min使之混合均匀。
将上述制备好的溶液分装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。冻干时间为一天。用二氯甲烷溶解冻干物，PEG-8000在二氯甲烷中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化干扰素α2-b，常温减压干燥之，得到干燥的微粉化干扰素α2-b。
实施例五
等电聚焦电泳法测定重组人胰岛素的等电点，测定结果为PI＝5.30～5.50，量取50ml蛋白溶液(98.36mg/ml，PH＝7.4)，加入0.04％的硫酸钙，至钙盐完全溶解后，用醋酸溶液(1mol/L)调蛋白溶液的PH至5.30～5.50这个区间内。此时，大量蛋白沉淀，溶液呈现乳白色，加入50ml浓度为40％(w/v)的PEG-6000溶液，磁力搅拌10min使之混合均匀。
将上述制备好的溶液分装在规格30ml的西林瓶中，装量规格为5ml/瓶，冻干。冻干时间为一天。用二氯甲烷溶解冻干物，PEG-4000在二氯甲烷中溶解，离心后，在离心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化重组人胰岛素，常温减压干燥之，得到干燥的微粉化重组人胰岛素，
实施例六
精密称取实施例一中制备的微粉化蛋白，用缓冲液复溶，稀释至1500ng/ml、1200ng/ml、1000ng/ml、800ng/ml、600ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml。用市售ELISA(酶联免疫测定)试剂盒测定其免疫学活性。方法：作一条未经微粉化的蛋白标准曲线，再作一条微粉化蛋白复溶后的标准曲线，比较两曲线在100ng/ml-1000ng/ml的吸光值(OD)差异，得免疫学活性保持率。活性保持率计算方法为：活性保持率＝100％-(未微粉化蛋白OD-微粉化后蛋白OD)/(未微粉化蛋白OD-空白值0.0392)*100％。表一显示，微粉化后的蛋白活性保持率大于90％(表一)
实施例七
精密称取实施例二中制备的微粉化蛋白，用缓冲液复溶，进行HUVEC生物学活性测定。HUVEC细胞用添加5％FBS、1％ECGS、1％P/O Solution的ECM培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞状态良好并进入对数生长期后进行接种，选用第四代细胞接种。细胞用0.25％胰酶消化，1000rpm离心5分钟，弃上清，用培养基重新混悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为5000个/ml，每孔加入160μl细胞悬液。加药：接种后即刻加入药物每孔40μl，药物终浓度：200，100，50，25，12.5，6.25，0μg/ml，每个浓度设置3个复孔，37℃5％CO2培养箱中培养96小时。加入MTT试剂，每孔20μl，置37℃5％CO2培养箱中培养4小时，加入三联试剂置37℃5％CO2培养箱中培养过夜，使用酶标仪570nm波长下测定OD值。通过下列公式求得抑制率：样品的抑制率％＝(阴性对照OD值-药物OD值)/(阴性对照OD值一无细胞对照孔OD值)×100％。(图3)