获得用于生产维生素K2的有益乳酸菌变种的方法及在食品制造中的应用.pdf

1.  获得乳酸菌菌株自然变种的方法，所述变种在标准发酵条件下可以比在相同条件下培养的所述乳酸菌菌株生产更多的维生素K2，倍数至少等于1.2，所述方法至少包括：
a)标准发酵条件下在选择性介质上培养所述乳酸菌菌株，所述介质诱发细胞内氧化还原状态的改变；以及
b)将与相同条件下培养的乳酸菌菌株相比，生产至少1.2倍的维生素K2的变种选择出来。

2.  根据权利要求1记载的方法，其特征在于，所述乳酸菌菌株选自乳球菌属、明串珠菌属、肠球菌属和丙酸杆菌属。

3.  根据权利要求2记载的方法，其特征在于，所述乳酸菌菌株选自乳酸乳球菌、乳明串珠菌、假肠膜明串珠菌、肠膜明串珠菌、葡聚糖明串珠菌、屎肠球菌和丙酸杆菌属的种。

4.  根据权利要求1至3任意一项记载的方法，其特征在于，所述选择性介质选自含有杆菌肽或氧化剂如过氧化物的培养基。

5.  根据权利要求1至4任意一项记载的方法，其特征在于，选自下述1～27号基因中的至少一种基因的表达在所述变种中相对于所述乳酸菌菌株被改变：

  基因号  基因名  对应蛋白质的功能  NCBI存取号  1  cysD  O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶  llmg_0091  2  gpo  Gpo蛋白(谷胱甘肽过氧化物酶)  llmg_1088  3  metE  5-甲基四氢化蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸  甲基转移酶  llmg_1225  4  推测的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)  脱氢酶  llmg_0195  5  metF  MetF蛋白质亚甲基四氢叶酸还原酶  llmg_1226
  6  trxH  H型硫氧还蛋白  llmg_0406  7  fur  铁摄取调节蛋白  llmg_1023  8  qor  醌氧化还原酶  llmg_1850  9  frdc  延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基  llmg_1441  10  adhE  醇醛脱氢酶  llmg_2432  11  purC  磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酰胺合成酶  llmg_0973  12  cydB  细胞色素d泛醇氧化酶，亚基II  llmg_1863  13  purE  磷酸核糖氨基咪唑羧化酶催化亚基  llmg_0999  14  purQ  磷酸核糖甲酰甘氨酸脒合成酶I  llmg_0975  15  trxA  硫氧还蛋白  llmg_0779  16  noxB  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶  lmg_1734  17  cpo  非血红素过氧化物酶氯化物  llmg_1737  18  metK  MetK蛋白质S-腺苷甲硫氨酸合成酶  llmg_2160  19  trxB1  TrxB1蛋白质硫氧还蛋白还原酶  llmg_1588  20  cysK  O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶  llmg_1775  21  metC  胱硫醚β裂解酶  llmg_1776  22  metS  MetS蛋白甲硫胺酰tRNA合成酶  llmg_1764  23  feoB  铁离子转运蛋白B的同系物  llmg_0199  24  citB  钨头酸水合酶  llmg_0636  25  icd  异柠檬酸脱氢酶  llmg_0637  26  fhuD  铁色素ABC转运蛋白底物结合蛋白  llmg_0349  27  ldh  L-乳酸脱氢酶  llmg_1120

6.  根据权利要求5记载的方法，其特征在于，1～27号基因的表达在所述变种中相对于所述乳酸菌菌株被改变。

7.  根据权利要求5或6记载的方法，其特征在于，选自1～15号基因中的至少一个基因的表达在所述变种中相对于所述乳酸菌菌株被增加。

8.  根据权利要求5至7任意一项记载的方法，其特征在于，选自16～27号基因中的至少一个基因的表达在所述变种中相对于所述乳酸菌菌株被减少。

9.  通过权利要求1至8的任意一项记载的方法获得的乳酸菌菌株自然变种以及所述变种的生物学纯培养物和培养级分，所述乳酸菌菌株自然变种在标准发酵条件下可以比在相同条件下培养的所述乳酸菌菌株生产更多的维生素K2，倍数至少等于1.2。

10.  根据权利要求9记载的自然变种，其特征在于，它是2006年1月20日保藏在法国微生物保藏中心(CNCM，巴斯德研究院，25，胡博士大街，75724巴黎投递编码15，法国)的自然变种I-3557。

11.  根据权利要求9记载的自然变种，其特征在于，它是2006年1月20日保藏在法国微生物保藏中心(CNCM，巴斯德研究院，Docteur Roux25街，75724巴黎投递编码15，法国)的自然变种I-3558。

12.  杆菌肽抗性在用于获得乳酸菌菌株自然变种中的用途，所述变种在标准发酵条件下生产的维生素K2是相同条件下培养的乳酸菌菌株生产的维生素K2的至少1.2倍。

13.  对氧化剂如过氧化物的抗性在用于获得乳酸菌菌株自然变种中的用途，所述变种在标准发酵条件下生产的维生素K2是相同条件下培养的乳酸菌菌株生产的维生素K2的至少1.2倍。

14.  包括权利要求9至11任意一项记载的至少一个变种的乳酸酵素。

15.  制造富含维生素K2食品的方法，其至少包括：
a)在所述产品的中间制备阶段，使用权利要求9至11任意一项记载的至少一个变种和/或者权利要求14记载的至少一种酵素；以及
b)获得所述富含维生素K2的产品。

16.  根据权利要求15记载的方法获得的富含维生素K2的食品。

17.  根据权利要求16记载的食品，其特征在于，它是一种发酵产品和/或鲜乳制品。

18.  权利要求9至11任意一项记载的至少一个变种和/或者权利要求14记载的至少一种酵素的用途，其用于制备富含维生素K2的食品。

19.  根据权利要求18记载的用途，其特征在于，所述富含维生素K2的食品使食用者的骨骼更强壮。

获得用于生产维生素K2的有益乳酸菌变种的方法及在食品制造中的应用
本发明涉及富含维生素和/或痕量元素营养食品的领域，以便改善人类的营养摄入量及在质和量上的营养平衡。
本发明特别涉及使食物富含维生素K的方法。
更具体地，本发明涉及获得乳酸菌菌株变种的方法，所述乳酸菌变种在标准发酵条件下生产的维生素K2是相同条件下培养的初始乳酸菌菌株获得的维生素K2的至少约1.2倍。
本发明还涉及一种食品的制造方法，尤其是富含维生素K2的发酵产品和/或鲜奶产品的制造方法，以及由此获得的食品。
维生素K是一种脂溶性维生素，它呈现两种自然形态：维生素K1(或叶绿醌)和维生素K2(或甲基萘醌)。
维生素K1由植物合成。人们主要在绿色蔬菜(叶状蔬菜)和豆油中获得它。维生素K1直接参与凝血过程。
维生素K2由肠道菌群的细菌生产。它也微量存在于某些发酵食品(奶酪、基于发酵黄豆的亚洲典型产品如味噌和日本水豆豉等等)中。多数细菌有能力合成维生素K2。因此，除了肠道菌群的细菌以及，特别是大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌和类杆菌属的种，还可以列举某些乳酸菌的种和亚种，如乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis spp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcus lactisspp.cremoris)、乳明串珠菌、肠膜明串珠菌和丙酸杆菌的种。由所述细菌合成的维生素K2的含量通常在29至90微克/升发酵乳之间变化(Morishita等人，1999)。需要强调的是对维生素K2产量的测量通常从沉淀细胞的真空冷冻干燥制品实现，并且这些测量结果随不同测试菌株在生产水平上呈现出很大的不均匀性，可能在一倍至三倍多之间变化(Morishita等人，1999；Parker等人，2003)。关于生物活动，维生素K2因其在软组织钙化上的作用而尤其被熟知。
维生素K最初因为它在凝血过程中的重要作用而被描述。因此，严重缺乏维生素K会导致溢血，凝血时间异常延长，以及淤血。很长时间以来人们认为严重缺乏维生素K在成年中极为少见，对维生素K的需求可以靠多样平衡的膳食以及体内肠细菌的生产来大大满足。在这一方面，有严重缺乏可能的人主要是：
-新生儿，它们在出生时肠内没有能产生维生素K的细菌；
-肝脏、胆或肠道功能紊乱者(肝病患者、先天性粘液稠厚症患者、结肠炎患者、痢疾患者等)；以及
-长期服用抗生素的人。
近期，人们发现维生素K对人类健康的影响不仅限于其在凝血机制中的作用。事实上，自从80年代起，维生素K也因其在骨代谢中的作用而闻名(Hart等人，1984；Hart等人，1985)。
这种维生素在调节骨形成中的调节骨钙蛋白活动的酶化学反应中作辅助因子(Hauschka PV等人，1989；Ducy P等人，1996)。它的作用更精确地说包括调节骨钙蛋白的羧化，骨钙蛋白是调节成骨过程的关键蛋白。如果缺乏维生素K，这一反应无法进行，会引发血液中脱羧骨钙蛋白对羧化骨钙蛋白比率的升高(Vaananen等人，1999)。
西方国家人口统计学的发展表现为人口的逐渐老龄化，结果导致变性病理流行病的增长，尤其是骨质疏松。在这一方面，骨质疏松从此被认为是公众健康的重大问题。
在90年代建立的人口统计学估计敲响了警钟，预计在未来的50年内这种病的发生率会显著增长，尤其在老年人当中。所以采取措施预防这种疾病成为当务之急，事先稀少地检查出并随后处理。
从此人们认为预防骨质疏松应该从幼年开始，经过最佳的骨质增长阶段，并在一生中继续维护骨量(bone mass)。众所周知营养因素在骨储备(bonereverse)的发展和维护中起重要作用。直到现在，设想和建议用来预防骨质疏松的营养策略主要集中在两个重要因素上，它们是钙质和维生素D。然而，人们现在知道其他营养因素可以有显著的益处。
因其在成骨过程中的重要作用，维生素K在文献中越来越成为维持人类一生中骨健康的有前途的途径。
建议的人类含维生素K的营养供给(1.5微克/天/千克体重)是只考虑到维生素K凝血作用而确定的。然而，近期研究提出，如果同时考虑到维生素K在骨代谢中的作用，这一建议的营养供给最终估计不足(Ronden等人，1998)。
虽然维生素K的需求仍然不被了解，但不足的供给导致成人骨量低并增大骨折的危险(Hart等人，1985；Knapen等人，1989；Szulc等人，1993；Booth等人，2000)。此外，对绝经期女性治疗措施的研究指出维生素K可以在这一目标减少骨质亏损(Shiraki等人，2000；Braam等人，2003)。最终，对动物的研究提出它在骨量增长的高峰过程中起到促进作用，协同维生素D会起到更好的效果。然而，明确地联系维生素K和骨质增长的研究目前只在动物中进行过。
另外，最近研究为维生素K在骨代谢和，尤其在骨量的组成和维持上的作用提供了额外的有利证据(Booth等人，2000；Shiraki等人，2000；Braam等人，2003；Hirano和Ishi，2002)。
与成人情况不同的是，目前没有可利用的数据证明维生素K对儿童的骨代谢有促进的作用。人们只知道为了最大量储备骨质并保护成人不得骨质疏松，在增长期优化骨量十分重要。
不管怎样，如今全部数据表明改善食品中维生素K的含量是使人构造和维护优良骨结构(bone structure)的有利的和有前途的途径。
在这种情况下，在食品市场上已经存在富含维生素K的工业产品。特别可以列举某些含有乳酸菌的乳制品，如“Petits Gervais aux Fruits”在法国被Demanderesse出售。然而可以注意到，一方面，这些产品的维生素K含量通常依赖于使用的发酵类型，另一方面，传统在乳制品中使用的乳球菌属的菌株不能生产足量的维生素K来真正满足人口的需求，甚至不足以减缓可能出现的维生素K的缺乏。
因此目前需要一种食品生产技术，特别是生产富含维生素K满足需求的发酵制品和/或鲜乳制品，如有必要，能够弥补维生素K的缺陷，无论是在儿童和青少年还是在成年人和老年人中。
在下文中，术语“维生素K2”和“维生素K”不加区别，指代维生素K2。
本发明目的是满足这一需要提出使用乳酸菌菌株新变种制备食品，特别是发酵制品和/或鲜乳制品，生产的维生素K远远多于衍生它们的最初菌株。
此外，在他们工作过程中，发明者校准了乳酸菌的实现条件，相对于传统生产条件明显促进了维生素K的生产。因此，在食品制备的后期，如发酵制品和/或鲜乳制品的制备，增加维生素K2的含量，可以在发明者认为能特别促进维生素K2生产的实现条件下有利地使用“过剩生产者”这一维生素K的变种，它是本发明的目标也是2006年10月4日的法国专利申请No.06/08690的发明目的。
术语“变种”在这里包括：
-自然变种，也就是说在选择压力作用下从一种参照乳酸菌菌株自发获得的变种；自然变种不经过任何人工基因处理，而是主要从参照菌株通过突变和选择而获得；以及
-突变株，在其染色体组中有一个或多个由基因工程技术诱发的突变，也就是说靠应用在参照菌株上的诱导突变技术，特别是借助载体的转基因技术。
可以注意到，在某些国家(特别是在欧洲)，食品工业在开发含有微生物特别是活体微生物的用于人类和/或动物食品的产品时应采取预防措施。实际上，转基因有机体(这里是微生物)(转基因有机体或突变体)会在消费者中引起畏惧和担忧。这种对转基因有机体不利的负面形象在某些国家表现为公众倾向于“抵制”含有转基因有机体的食品。另外，消费者总是苛求推荐给他们的食品内容以及产品包含的各成分来源的透明度，在这一情况下，工业界会被迫推荐近乎专一的，甚至是专一的无转基因有机体的产品。在本发明所处的情况下，专一地利用自然菌株或来自自然菌株的变种来生产源于工业并含有微生物的食品是很有优势的。
根据第一方面，本发明涉及获得某乳酸菌菌株自然变种的方法，所述变种在标准发酵条件下可以比在相同条件下培养的所述乳酸菌菌株生产更多的维生素K2，倍数至少等于1.2，所述方法至少包括：
a)标准发酵条件下在选择性介质上培养所述乳酸菌菌株，所述介质诱发细胞内氧化还原状态的改变；以及
b)将与相同条件下培养的乳酸菌菌株相比，生产至少1.2倍的维生素K2的变种选择出来。
所述“变种”在本发明的意义下是能够比衍生它们的菌株生产更多维生素K2的乳酸菌菌株。更精确地，本发明的变种能够生产的维生素K2是初始菌株生产的维生素K2的至少1.2倍。更优的是，根据本发明的变种生产维生素K2的产量比相同标准发酵条件下培养的初始乳酸菌菌株的产量更多，倍数至少约等于1.5。这个倍数还可以更好，更优选约等于1.7，更优选约等于1.8，更优选约等于1.9。这个倍数值更优的是至少约等于2、2.2、2.4、2.5、2.7、2.8、2.9、3。
“参照”或“初始”的乳酸菌菌株是衍生了本发明的变种的菌株。这些菌株可以是自然菌株或者它们本身就是某个变种，也就是说自然变种或突变株。
在本发明的范围内，“实验室条件”是完全标准的发酵条件并被所属领域技术人员所熟知。因此，词组“实验室条件”和“标准发酵条件”在这里完全是同意词。在本发明意义下最优的“实验室条件”如下：在商用介质M17(DifcoTM M17)或等同的介质上预先培养菌株。接下来的培养中借助预培养实现1％的接种。培养温度为大约30℃。要记住实验室条件可以由本领域技术人员根据其总体的知识按需要来改变，有可能在常规的校准实验之后。培养基是适于培养乳酸菌菌株特别是乳球菌属的某些种的菌株的介质。
根据一种最佳的实现方式，乳酸菌菌株从乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)中选择。它特别是从乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、葡聚糖明串珠菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、丙酸杆菌的种。
优选地，如下文所述，在根据本发明的方法中，要实现一个从含有杆菌肽或氧化剂如过氧化物的培养基中选择的选择性介质。
如此实现的选择性介质可以诱发细胞内氧化还原状态的变化。有利的是，这一变化和从表1列出的1～27号基因中选择的至少一种基因的表达在所述变种中相对于衍生它的乳酸菌菌株中的变化相关联：
表I

  基  因  号  基因  名   对应蛋白质功能  NCBI存取  号  1  cysD  O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶  (O-acetylhomoserine sulfhydrylase)  llmg_0091  2  gpo  Gpo蛋白(谷胱甘肽过氧化物酶)  (gpo protein(glutathione peroxidase))  llmg_1088   3   metE  5-甲基四氢化蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶  (5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine  methyltransferase)   llmg_1225  4  推测的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶  (putative NADH dehydrogenase)  llmg_0195  5  metF  MetF蛋白质亚甲基四氢叶酸还原酶  (MetF Protein methylene tetrahydrofolate reductase)  llmg_1226  6  trxH  H型硫氧还蛋白  (H-type thioredoxin)  llmg_0406  7  fur  铁摄取调节蛋白  (Ferric uptake regulating protein)  llmg_1023  8  qor  醌氧化还原酶  (quinone oxidoreductase)  llmg_1850  9  frdc  延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基  (fumarate reductase flavoprotein subunit)  llmg_1441  10  adhE  醇-醛脱氢酶  (alcohol-acetaldehyde dehydrogenase)  llmg_2432   11   purC  磷酸核糖氨基咪唑-琥珀羧酰胺合成酶  (phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide  synthase)   llmg_0973
表I，
  12  cydB  细胞色素d泛醇氧化酶，亚基II  (cytochrome d ubiquinol oxidase，subunit II)  llmg_1863  13  purE  磷酸核糖氨基咪唑羧化酶催化亚基  (phosphoribosylaminoimidazole carboxylase catalytic subuint)  llmg_0999  14  purQ  磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶I  (phosphoribosylformylglycinamidine synthase I)  llmg_0975  15  trxA  硫氧还蛋白(thioredoxin)  llmg_0779  16  noxB  烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶  (NADH dehydrogenase)  lmg_1734  17  cpo  非血红素过氧化物酶氯化物  (non-heme peroxidase chloride)  llmg_1737  18  metK  MetK蛋白质S-腺苷甲硫氨酸合成酶  (Met K protein S-adenosylmethionine synthase)  llmg_2160  19  trxB1  TrxB1蛋白质硫氧还蛋白还原酶  (TrxB1 protein thioredoxin reductase)  llmg_1588  20  cysK  O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶  (O-acetylserine sulfhydrylase)  llmg_1775  21  metC  胱硫醚β裂解酶  (cystathionine beta-lyase)  llmg_1776  22  metS  MetS蛋白甲硫胺酰tRNA合成酶  (MetS protein methionyl-tRNA synthetase)  llmg_1764  23  feoB  铁离子转运蛋白B的同系物  (Ferric iron transport protein B homolog)  llmg_0199  24  citB  钨头酸水合酶  (aconitate hydratase)  llmg_0636  25  icd  异柠檬酸脱氢酶  (isocitrate dehydrogenase)  llmg_0637
表I，
  26  fhuD 铁色素ABC转运蛋白底物结合蛋白 (ferrichrome ABC transporter substrate binding protein)  llmg_0349  27  ldh L-乳酸脱氢酶 (L-lactete dehydrogenase)  llmg_1120
优选地，1～27号基因的表达在所述变种中相对于衍生它的乳酸菌菌株被改变。
通过“改变某基因的表达”，这里的意思是所考虑的基因表达相对于初始乳酸菌菌株中观测的表达被定量地改变：
-或者表达被增加，这种情况优选1～15号基因中的至少一个基因；
-或者表达被减少，这种情况优选16～27号基因的至少一个基因。
优选地，变种在b)阶段被选择，如果它在标准发酵条件下生产的维生素K2是：
-CHN-12发酵生产的维生素K2的至少约1.5倍、优选至少约2倍、更优选至少约3倍；和/或
-自然菌株样品MG1363生产的维生素K2的至少约1.5倍、优选至少约2倍、更优选至少约3倍、尤其优选直到至少约10倍。
有利地，变种在b)阶段被选择，如果它在标准发酵条件下为100克发酵乳生产至少约5.5微克维生素K2。
如果该变种在标准发酵条件下为100克发酵乳产生的维生素K2含量至少约5.5微克，则可以称这一变种为维生素K2的“过剩生产者”。特别的是，在本发明意义下的变种在标准发酵条件下更好的是能为100克发酵乳生产至少约5.7微克、优选至少约5.9微克、更优选至少约6.1微克、特别优选至少约6.3微克维生素K2。更优选地，根据本发明的变种在标准发酵条件下更好的是能为100克发酵乳生产至少约6.5微克、优选至少约7微克、更优选至少约7.5微克、更优选至少约8微克、更优选至少约8.5微克、更优选至少约9微克、更优选至少约9.5微克，尤其优选至少约10微克维生素K2。
在另一方面，本发明涉及乳酸菌菌株的自然变种，所述变种可以通过上文描述的方法获得，以及所述变种的生物学纯培养物和培养级分，所述变种在标准发酵条件下生产比相同条件下培养的初始乳酸菌菌株更多的维生素K2，倍数至少约等于1.2。
特别的是，本发明的变种在实验室条件下(或标准发酵条件)生产维生素K2是：
-CHR.Hansen A/S(霍尔索尔姆，丹麦)出售的CHN-12发酵生产的维生素K2的至少约1.5倍，优选至少约2倍，更优选至少约3倍；和/或
-是提交到CBS(巴恩，荷兰)的CBS364.89号自然菌株样品乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363生产的维生素K2的至少约1.5倍，或优选至少约2倍，甚至优选至少约3倍，有利地直到至少约10倍的维生素K2。这一菌株样品乳酸乳球菌乳脂亚种被本领域技术人员们所熟知。它在1983年被Gasson第一次描述(Gasson M.，1983)。
和前文对“自然变种”的定义一致，根据本发明的变种是在合适的培养基上靠选择压力获得的自然变种。
在本专利中提供了几个这种靠选择压力获得的自然变种的例子。简要的说(为得到更多细节，参见下文“实例”部分)，以下是自然变种的优选实施例以及获得方法。
根据第一种实施方式，一种本发明的变种在含有杆菌肽的介质上靠选择压力被获得。根据初始菌株的不同，介质中杆菌肽的浓度可以是，如，至少约0.4毫克/升，优选是至少约1毫克/升，更优选是至少约2毫克/升，更优选是至少约3毫克/升，更优选是至少约4毫克/升。然而，所属领域技术人员清楚地知道为获得根据本发明的自然变种的杆菌肽的浓度是由初始乳酸菌菌株抵抗杆菌肽的能力决定的。如有必要，所属领域技术人员根据初始菌株的特性选择不同的浓度。有利的是，所属领域技术人员能够研究一系列浓度的杆菌肽。
一种尤其有益的自然变种基本上具有和1-3557变种相同的生物特性，保藏在法国微生物保藏中心(CNCM，巴斯德研究院，25，胡博士大街(rue duDocteur Roux)，75724巴黎cedex 15，法国)。
“一种变种A基本上具有和1-3557变种相同生物特性”，该表达方式的意思是变种A是在含有杆菌肽的介质上通过选择压力获得的。然而，为获得变种A而在介质中实现的杆菌肽并不是为满足本定义而限定的。相反，限定的条件是变种A能够在实验室条件下生产和变种I-3557生产近似等量、或优选至少等量的维生素K2。本发明意义下的自然变种优选自然变种I-3557。
在第二种实施方式中，根据本发明的自然变种在含有至少一种氧化剂的介质上通过选择压力被获得。例如，氧化剂可以从过氧化物、高氯酸根离子(perchloric ion)、亚铁离子、甲萘醌、对草快(paraquat)、氧气或其它任何一种合适的氧化物。氧化剂优选过氧化物。和杆菌肽一样，过氧化物的浓度由初始乳酸菌菌株决定。例如，如下系列的一种或多种浓度的过氧化物：至少约20、25、27、28.5毫克/升。同样地，所属领域技术人员来决定一种或多种浓度，甚至一种或多种浓度系列的合适的过氧化物，他们像通常一样对它们进行实验性测试。
有利的是，根据本发明的自然变种基本上具有和1-3558变种(2006年1月20日保藏在CNCM)相同生物特性。前文给出的表达方式“一种变种A基本上具有和1-3557变种相同生物特性”的定义做必要的更改后应用在这里(过氧化物代替杆菌肽；变种I-3558代替变种I-3557)。这样的变种优选自然变种I-3558。
本发明的第三个方面涉及特别为了获得乳酸菌菌株自然变种的选择性条件的用途，和前文的描述一致，所述变种在标准发酵条件下比相同条件下培养的初始菌株多生产至少约20％的维生素K2。
所述用途特别是：
-对杆菌肽抵抗力的用途；和/或
-对某种氧化剂如过氧化物的抵抗力的用途。
如前文所述，所述自然菌株能在标准发酵条件下有利地为100克发酵乳生产至少约5.5微克的维生素K2
本发明的第四个方面涉及含有至少一种上文描述的变种的乳酸酵素。
根据第五个方面，本发明涉及某种富含维生素K2食品的制造方法，至少包括：
a)在所述产品制备的中间阶段，使用至少一种前文描述的变种和/或至少一种酵素；以及
b)所述富含维生素K2产品的获得。
可选地，增加食品中维生素K2含量的方法至少包括：
a)在所述产品制备的中间阶段，使用至少一种前文描述的变种和/或至少一种酵素；以及
b)所述富含维生素K2产品的获得。
所述变种和/或乳酸酵素可以特别地立即利用预培养的细菌浓缩物实现(在食品生产场所)，或利用发酵供应者预培养的细菌，然后包装并发送到食品生产场所。供应者可以包装新鲜的或冷冻的细菌；可选地，细菌可以是风干的或冻干的。细菌在各种情况下都以传统方式添加到乳质中(如同其他所知的任意一种乳酸酵素)。
本发明的第六个方面涉及富含维生素K2的食品，可以通过如前文透露的方法获得。本发明涉及给人类和/或动物食用的食品，优选用来作人类食品的产品。有利地，这种富含维生素K2的食品是食用者的骨骼更强壮。所述食用者优选儿童。
更好的是，本发明意义下的食品选自发酵制品、新鲜的发酵乳制品或非发酵乳制品，基于植物(水果、蔬菜、谷物、大豆等等)汁液的发酵产品或非发酵产品，以及它们的结合。特别优选的是，本发明意义下的食品是发酵制品和/或鲜乳制品。
在本发明的情况下，“鲜乳制品”特指人类即食的鲜乳发酵制品，也就是说鲜乳发酵食品。在本申请中，特别针对发酵乳和酸奶。所述鲜乳发酵食品可以换成白奶酪或小瑞士奶酪。
赋予术语“发酵乳”和“酸奶”在乳品工业常用的意义，也就是说用于人类食用的产品和源自乳基质的酸化乳酸酵素。这些产品可以含有附加成分，如水果、蔬菜、糖等等。可以参考1988年12月30日关于发酵乳和酸奶的法国法令No.88-1203，它发表于1988年12月31日的法兰西共和国官方日报上。
还可以参考《食品法典》(由食品法委员会制订受联合国粮食及农业组织及世界卫生组织的保护，由联合国粮食及农业组织情报分局发表，可以在线访问http://www.codexalimentarius.net；特别参考食品法第12卷《针对乳和乳制品的法典标准》，以及标准《法典STANA-1 1(a)-1975》)。
因此用语“发酵乳”在本申请中指由乳基质制备的乳制品，所述乳基质经过至少等价于巴斯德灭菌的处理，用属于每种产品特征种的微生物来接种。“发酵乳”未经任何使得乳基质组成成分减少的处理并且特别未经凝固脱水处理。“发酵乳”的凝固只能用由所用微生物活动引起的方法。
术语“酸奶”指获得的发酵乳，根据当地的持久的惯例，其中生长有嗜热乳酸菌特别是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，它们应该活着存在于完成的产品中，按照每克至少1千万细菌的标准添加到乳体部分。
在某些国家，法令规定其他的乳酸菌被加入酸奶的生产，特别是追加使用双歧杆菌和/或嗜酸性乳杆菌和/或干酪乳杆菌。这些附加的乳酸菌株用来赋予完成的产品不同的特性，如促进肠内菌丛的平衡或调节免疫系统。
在实践中，用语“发酵乳”通常用来指发酵乳而不是酸奶。它可以根据不同国家有不同的名字，例如，“Kefir”、“Kumiss”、“Lassi”、“Dahi”、“Leben”、“Villi”、“Acidophilus milk”。
关于发酵乳，每100克发酵乳基质内的游离态乳酸的含量在卖给消费者时不得低于0.6克，添加到乳体部分的蛋白质含量不得低于普通乳品的含量。
最后，名称“白奶酪”或“小瑞士奶酪”在本要求书中指未经精制的、不含盐的芝士，并且只经过乳酸菌发酵(没有乳酸酵素以外的任何发酵)。每100克白奶酪的干重可降低到15克或10克，根据是否每100克白奶酪在经干燥处理后的脂质含量大于等于20克。白奶酪干质含量在13％至20％之间。每100克小瑞士奶酪的干重不低于23克。其干质含量通常在25％至30％之间。白奶酪和小瑞士奶酪通常归类到名称“清爽干酪”中，在本发明技术领域中传统地使用。
在第七个方面，本发明涉及前文描述的至少一种变种和/或至少一种酵素的用途，用来制备富含维生素K2的食品。
有利的是，这种富含维生素K2的食品使食用者的骨骼更加强壮。所述食用者优选儿童。
显然本发明不局限于前文的描述。本发明其他的实现方式和优势可以通过阅读下面的实例而得出，提供的例子都完全能说明问题。
实施例
如开篇注意事项，应该注意以下描述的获得自然变种的方案适用于任何类型的初始乳酸菌菌株。所属领域技术人员根据使用的初始菌株的不同，可能由于重要的实践原因而被迫修改发明者已校准的实验条件。不管怎样，所属领域技术人员可能引入到以下过程中的改变微不足道并且只需简单的常规操作而不蕴含任何创造性活动。
I-抵抗杆菌肽的自然变种的获得和利用
虽然一系列熟知的试剂如杆菌肽或过氧化物可以选择对所述试剂具有强大抵抗力的细菌的菌株，但是从未在文献中确定对杆菌肽或对过氧化物的抵抗力与细菌生产维生素K2水平的关系。
在研究的范围内，发明者意外地发现细菌可以形成一种原本的机制来抵抗某些试剂如杆菌肽或过氧化物，这蕴含着维生素K2产量的增加。发明者打算靠这一发现在获取大量生产维生素K2的乳酸菌菌株自然变种(特别是乳球菌属)的末期使用如杆菌肽或过氧化物作为选择试剂来获得利润。
I-1-获得抵抗杆菌肽的自然变种的方案
在2ml的培养基中从乳球菌属自然菌株的晶体实现预培养，所述培养基是传统商用M17(介质M17，DifcoTM)，其中添加了浓度为5克/升的乳糖(后文称为乳糖介质M17)和氯高铁血红素(20微升/毫升)(后文称为乳糖+氯高铁血红素介质M17)。在30℃的温度搅动下进行培养。
预培养用来接种2毫升添加杆菌肽(4微克/毫升)的乳糖+氯高铁血红素介质M17。接种率为1％。然后，培养物在30℃的温度搅动下培养48小时。
接下来，将100微升这种悬浮液滴在含乳糖介质M17的琼脂上。将浸润了2.5毫克杆菌肽的纸片放置在盒子中央。琼脂在30℃的温度下培养48小时。靠近纸片的菌落在含有杆菌肽(4微克/毫升)的2毫升乳糖+氯高铁血红素介质M17中被培养。在30℃的温度搅动下持续培养24小时。
在30℃下培养了48小时后，细胞在含有杆菌肽(2微克/毫升)乳糖介质M17琼脂上被分离。将分离的菌群在乳糖+氯高铁血红素介质M17上培养，然后在30℃的温度搅动下培养24小时。这一悬浮液用来转化成冷冻的储用培养物(frozen stock)。
这些实验允许发明者选择2006年1月20日保藏在CNCM的乳酸乳球菌乳脂亚种的自然变种I-3557。
I-2-用“杆菌肽”变种制造乳制品实例的方案
在2ml的乳糖介质M17中从乳球菌属自然菌株的晶体实现预培养。
预培养用来接种50毫升经高温消毒的全乳，接种率为1％，所述全乳在30°下培养了24小时。
如下表II给出维生素K2含量的结果，以微克等价于MK-4/100克产品来表示，分别给出抗杆菌肽变种和对应的野生菌株的结果。
表II
  菌株I-3557  野生  维生素K(微克/100克)8.90  3.32
抗杆菌肽变种比对应的初始野生菌株多生产3倍的维生素K。
II-抵抗过氧化物的自然变种的获得和利用
乳球菌的呼吸最近得到证明(Duwat等人，2001)。乳球菌(IL1403)菌株染色体组的顺序排列确定了编码所需有氧呼吸功能的基因的存在(Bolotin等人，2001)。乳球菌属实际上拥有men和cytABCD操纵子，编码用于合成甲基萘醌以及衍生细胞色素D所需蛋白质。这一菌种还拥有参与亚铁原卟啉(hemH、hemK和hemN，它们在为亚铁原卟啉结合铁离子的卟啉氧化中获得)合成最后几个步骤的三个基因，但它不具有参与这一过程前几步的基因。然而，乳球菌在拥有卟啉基因时能够实现氧化磷酸化。
人们还指出乳球菌可以在含有氧气和亚铁原卟啉的培养基中呼吸。这一呼吸能使细胞达到更大的生物量，并且最终观测的pH比通常获得的值高。有氧气和/或亚铁原卟啉存在时的培养可以在前6或7个小时的发酵期获得可比较的增长曲线。然后，葡萄糖的消耗在有氧气和亚铁原卟啉存在时减少，并且乳酸盐的生产也减少。这意味着一个新陈代谢的“转变”，它在培养过程中发生得很迟缓。乳球菌的呼吸在指数增长的最后阶段出现(Duwat等人，2001)。
乳球菌呼吸的作用目前还不知道，也不知道维生素K2在这一菌种发酵型新陈代谢中的作用。发明者注意到维生素K2被乳球菌属生产而呼吸未被引入测试条件中(介质中无亚铁原卟啉并且也没有搅动确保介质中充足的氧气)。
在细胞质中，和细胞外不同的是，蛋白质只有少数二硫键。存在一个普遍的酶化系统，它能够限制二硫键的数量。化学键S-S通过一种酶，硫氧还蛋白的参被还原为SH。这种酶是由硫氧还蛋白还原酶催化的。Vido等人(2005)靠基因工程技术制造了乳球菌属突变体trxB1。trxB1基因编码硫氧还蛋白还原酶。利用由此突变体合成的蛋白的二维电泳的研究表明它大量合成某些用于合成维生素K2的酶，就是MenB和MenD。
已知这些数据以及根据个人的观测，发明者提出改善乳球菌生产维生素K2的可行方法之一可以是引入呼吸。另一种途径可以是试图调动维生素K2来对氧化性应激产生反应。
因此发明者试图获得抵抗氧化性应激的自然变种。需要注意的是获得的自然变种不表示操纵子Men的过表达。
II-1-获得抵抗氧化性应激变种的方案
过氧化物被选为可用的氧化剂。当然，其他的氧化剂，如高氯酸根离子、亚铁离子、甲萘醌、对草快、氧气或其他任何合适的氧化物，可以用在类似的条件下。
在介质M17上进行预培养后，初始自然菌株被移植到含浓度增加的过氧化物的相同介质(例如，从至少约20毫克/升到至少约25、27、28.5毫克/升的范围)。培养物在30℃进行培养。24小时后，第一批试管的浓度未增加，再额外培养24小时。之后菌落被用浸滤法在琼脂介质上分离。一个菌落被浓度为27毫克/升的过氧化物选择。发明者以注意到过氧化物浓度超过28.5毫克/升以后就不再增加。
因此这些实验使发明者可以选择2006年1月20日保藏在CNCM的乳酸乳球菌乳脂亚种I-3558。
II-2-用“过氧化物”变种制造乳制品实例的方案
被选择的菌落被加入全乳中繁殖24小时。之后样本被提取出来并在-80°温度下冷冻以备以后为维生素K配量使用。
如下的表III示出由抵抗过氧化物的变种生产的维生素K2的含量，与初始菌株产量相比较(含量表示为微克等价MK-4/100克发酵乳)。
表III
  菌株 维生素K(微克/100克)  野生  2.92±0.45  I-3558  5.94±0.76
如表III所示，变种比对应的野生菌株多生产约1倍的维生素K2。
III-I-3557和I-3558自然变种的遗传型表征
III-1-材料和方法
菌株在30℃的温度在乳糖介质M17上被培养了一夜。市售的全乳以每一个菌株1％预培养物被接种。将被接种的乳品放入12毫升试管中。为了使发酵在所需的生理状态下停止，指数增长期或减速期，将试管浸入液氮中。之后试管在-80℃温度下冷藏直至使用。前面的实验表明维生素K主要在减速期大量生产(未示出数据)。
总核糖核酸的提取
所有的样本以相同方式处理。这些样本在有保护RNA的保护下被解冻(Qiagen-ref 76506)以免核糖核酸被破坏。这些样品的细胞通过离心法被恢复。
之后，每个样品中细胞的核糖核酸在存在(Invitrogen-ref15596-026)时借助滚珠(Biospec Products-ref 11079101z，Zirconia/Silica Beads直径0.1毫米)式细胞研磨机Mixer Mill MM300(Qiagen)被分离。之后核糖核酸的浓度和纯度(230/260和260/280纳米)被用分光光度计ND-1000(Nanodrop科技)的分光光度测定法来控制。核糖核酸的含量(RIN，比率16/23S)也借助2100Bioanalyzer-专业软件，B.02.05版(Agilent科技)和Kits RNA 6000纳米II系列(Agilent科技-ref5067-1511)来控制。
标记mRNA和DNA芯片杂交
目标靶由mRNA的反转录使用与散布在DAN芯片上的合成聚合酶链式反应产物相同的特别逆转菌种合成。这些直接的标记由Eurogentec公司借助CyScribe first strand cDNA标记系统dCTP/净化CyScribe GFX试剂盒(Amersham-refRPN6202X)和耦合到核苷酸的荧光分子Cy3-dCTP/Cy5-dCTP(Perkin Elmer-ref NEL576/NEL577)。
标记目标靶在乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363(在NCBI可查到其序列)菌株的聚合酶链式反应产物DNA芯片的杂交由Eurogentec公司实现，该公司独立生产了这些DNA芯片并将其商品化。该公司使用一个杂交方案和传统洗选方法(杂交缓冲剂Eurogentec-ref QR-HYB-01，在杂交站42℃温度下培养一夜Advalytix Slidebooster SB800-Implen，在环境温度下在缓冲液0.2X SSC/0.1％SDS中搅动洗选杂交DNA芯片5分钟之后在环境温度下在缓冲液0.2X SSC中偶尔搅动地冲洗5分钟，之后用离心法1000rpm干燥5分钟)。
杂交数据的获得由Eurogentec公司借助一种扫描仪Axon 4100A和软件GenePix Pro 5.1(Axon仪器)。之后杂交DNA芯片的扫描由Eurogentec公司发送给发明者。
数据的处理
来自杂交DNA芯片的扫描数字结果由发明者借助软件GenePix Pro 6.0获得。
这些最初的数字结果跟随使用软件MANGO的统计学处理，所述软件由法国国家科学研究中心Yvette图像交互格式Transcriptomique GODMAP平台开发，它可以获得显性表达的比率；每个点对应一个基因在DNA芯片上被复制并且每个生物实验重复三次包含一个标记倒置(DyeSwap)以便限制耦合到核苷酸上的荧光分子的混合偏差每次比较表示六个薄板。
微分表达的比率根据再现性准则被选择比如校准的p-值(＜0.01)，相对于平均背景噪声并在表达比率值上(r＞＝2.00和r＜＝2.00)。
III-2-结果
对于某些基因的表达来说两个变种呈现出相似的结果。涉及到的大部分基因影响细胞氧化还原的状态并且特别是和Fe-S簇相关。在这个范围内，甲硫氨酸和半胱氨酸的新陈代谢被改变以及铁的运输也被改变。几个参与抵抗氧化性应激机制的酶的表达被修改：硫氧还蛋白H、硫氧还蛋白B1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等。
在指数增长阶段，某些参与乳球菌属呼吸的酶被过表达：延胡索酸还原酶(frdC)和细胞色素氧化酶(cydD)。同样，嘌呤基的新陈代谢似乎也被更改。
如下表IV提供了某些基因表达比率的信息并确定变种和野生菌株之间在减速阶段的比较。
表IV
 蛋白质  基因  本申请中  的基因号  NCBI存取  号  变种  I-3557  变种  I-3558 O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶  cysD  1  llmg_0091  4.04  3.70 Gpo蛋白(谷胱甘肽过氧化物 酶)  gpo  2  llmg_1088  3.16  3.73 5-甲基四氢化蝶酰三谷氨酸-高 半胱氨酸甲基转移酶  metE  3  llmg_1225  2.94  3.12 推测的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)脱氢酶  4  llmg_0195  2.66  3.77 MetF蛋白质亚甲基四氢叶酸还 原酶  metF  5  llmg_1226  2.44  2.64 H型硫氧还蛋白  trxH  6  llmg_0406  2.37  2.63 铁摄取调节蛋白  fur  7  llmg_1023  2.16  4.91 醌氧化还原酶  qor  8  llmg_1850  2.13  2.35 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)脱氢酶  noxB  16  llmg_1734  -2.01  -2.42
表IV，
  非血红素过氧化物酶氯化物  cpo  17  llmg_1737  -2.39  -2.52  metK蛋白质S-腺苷甲硫氨酸合成酶  metK  18  llmg_2160  -3.51  -2.07  TrxB1蛋白质硫氧还蛋白还原酶  trxB1  19  llmg_1588  -3.62  -2.94  O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶  cysK  20  llmg_1775  -3.86  -3.54  胱硫醚β裂解酶  metC  21  llmg_1776  -5.02  -5.27  L-乳酸脱氢酶  ldh  27  llmg_1120  -10.98  -4.31
如下表V给出了变种基因表达比率和野生菌株在指数增长阶段的比较。
表V
  蛋白质  基因  本申请中  的基因号  NCBI存取  号  变种  I-3557  变种  I-3558  延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基  frdC  9  llmg_1441  6.28  6.52  醇醛脱氢酶  adhE  10  llmg_1916  4.36  3.14  磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酰胺  合成酶  purC  11  llmg_0973  3.61  3.13  细胞色素d泛醇氧化酶，亚基  II  cydB  12  llmg_1863  3.15  2.95  磷酸核糖氨基咪唑羧化酶催化  亚基  purE  13  llmg_0999  2.12  2.58  磷酸核糖甲酰甘氨酸脒合成酶  I  purQ  14  llmg_0975  2.29  2.42  硫氧还蛋白  trxA  15  llmg_0779  3.07  2.19  推测的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸  (NADH)脱氢酶  4  llmg_0195  2.41  2.02  MetS蛋白甲硫胺酰tRNA合  成酶  metS  22  llmg_1764  -2.49  -2.08  铁离子转运蛋白B的同系物  feoB  23  llmg_0199  -3.42  -2.21
表V，
 TrxB1蛋白质硫氧还蛋白还原酶 trxB1  19  llmg_1588  -2.74  -2.58 钨头酸水合酶 citB  24  llmg_0636  -3.1  -2.88 异柠檬酸脱氢酶 icd  25  llmg_0637  -7.32  -7.16 铁色素ABC转运蛋白底物结合蛋白 fhuD  26  llmg_0349  -15.1  -16.80
参考文献
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