分离肝祖细胞的基质和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年6月28日提交的美国临时申请第60/816,862号的优先权，其公开内容通过引用整体结合入本文。
技术领域
本发明涉及肝祖细胞的体外富集和/或分离和增殖。具体来说，本发明涉及细胞外基质组分的识别和选择，所述细胞外基质组分能够在体外增殖和/或分离肝祖细胞(包括肝干细胞)。
背景技术
过去十年间，已经在临床研究中试验了原代肝细胞移植作为整体器官移植替代的安全性和有效性，证明了其潜力。鉴于绝大部分从未使用过的供体肝分离的肝细胞不具有增殖能力，植入有能力原位形成肝组织的“干”细胞群的能力将是现有的基于细胞的疗法中的重要进步。肝干细胞及其子代(例如，肝胚细胞和定向祖细胞)具有相当的扩增潜力。为此，这些细胞群是细胞疗法(包括生物人工肝或细胞移植)的理想候选物，并为患者提供了有吸引力的可选治疗选择。
但是尽管有此希望，但肝细胞疗法的全部潜力依然有待实现。首先，肝干细胞的分离可能是费力费时的。这些细胞经常包括少于5％的总肝细胞群，并且在许多情况下少于1％。目前方法通常包括使用可识别标志物(例如，细胞表面蛋白抗体)正向选择靶细胞。这些方法是昂贵且有时无效的。
其次，肝干细胞及其子代的体外增殖已证明是有挑战性的。当肝干细胞及其子代成功在体外增殖时，培养条件对于从实验台转向临床不是最佳的。例如，一些培养条件极大阻碍细胞分裂或随意促进细胞分化，从而降低增殖有效性。而且，一些培养条件需要添加因子(例如，血浆或培养细胞)，这可能引入污染物并从而限制它们在治疗人中的应用。
因此，需要选取并分离肝祖细胞的可选方法。而且，需要能够提供增强的肝干细胞及其子代体外增殖的培养条件，也需要能够使限制干细胞谱系成其适当命运的条件。最后，需要避免需求培养细胞的培养条件。
发明内容
发明概述
本发明的一个实施方案提供了体外分离和/或选择肝祖细胞的方法，该方法包括：(a)提供干细胞的单细胞混悬液；(b)在包含聚合形式胶原的细胞外基质上培养所述肝细胞混悬液以获得分离的肝祖细胞群。所述胶原可以是I型胶原，优选超过约75％重量的I型胶原，更优选超过约90％重量的I型胶原，甚至更优选超过约95％重量的I型胶原。在本发明具体实施方案中，所述基质包括超过约97％重量的I型胶原和/或是商业可获得的PURECOL基质。在一些实施方案中，所述基质可进一步包含聚合形式的III型胶原。而且，肝祖细胞可以是肝干细胞。本发明方法可以进一步包括在无血清培养基中培养肝细胞混悬液。
在本发明另一个实施方案中，提供包含肝祖细胞细胞培养物、无血清培养基和细胞外基质(其包含聚合形式的胶原)的组合物。所述胶原可以是I型胶原，优选超过约75％重量的I型胶原，更优选超过约90％重量的I型胶原，甚至更优选超过约95％重量的I型胶原。在本发明具体实施方案中，所述基质包括超过约97％重量的I型胶原和/或是商业可获得的PURECOL基质。在一些实施方案中，所述基质可进一步包含聚合形式的III型胶原。而且，肝祖细胞可以是肝干细胞。
在本发明另一实施方案中，提供了体外增殖肝祖细胞的方法，该方法包括：(a)提供干细胞的单细胞混悬液；(b)在包含聚合形式胶原和无血清培养基的细胞外基质上培养所述肝细胞混悬液。肝祖细胞可以是肝干细胞、分离的肝胚细胞、定向肝祖细胞或其组合。进一步地，所述胶原可以是I型胶原，优选超过约75％重量的I型胶原，更优选超过约90％重量的I型胶原，甚至更优选超过约95％重量的I型胶原。在本发明具体实施方案中，所述基质包括超过约97％重量的I型胶原和/或是商业可获得的PURECOL基质。在一些实施方案中，所述基质可进一步包含聚合形式的III型胶原。
在本发明另一实施方案中，提供了用于增殖肝祖细胞的容器，该容器包括容器和不溶性物质，所述不溶性物质包括至少一种聚合形式的胶原，其中不溶性物质大体上包裹容器的至少一个表面。容器可以是组织培养板、生物反应器、实验室单元或实验室芯片。
附图说明
图1显示衍生自新生肝的干细胞集落在本发明创造性基质上分离后两周的形态。
图2显示图1集落是EpCAM阳性(肝干细胞标志物)。
图3显示衍生自胎儿肝的干细胞集落在本发明创造性基质上分离后两周的形态。
图4显示在根据本发明的PureColTM基质上生长的细胞的选择标志物的RNA表达。cDNA产生自细胞溶解产物，然后为下述标志物经受PCR：泳道：1，EpCAM；2，白蛋白；3，A胎儿蛋白；4，CK19；5，CYP3A4；6，运铁蛋白；7，α-1-抗胰蛋白酶；8，二肽基肽酶4(Dipeptylpeptidase 4)；9，水通道蛋白4；10，GAPDH。
具体实施方式
发明实施方案详述
在本发明的一个实施方案中，已经识别了细胞外基质组分，其促进肝干细胞及其子代的附着、存活和体外增殖。本文使用的术语“肝祖细胞”被广泛定义为包括肝干细胞及其子代。“子代”可以包括自我复制的肝干细胞、肝胚细胞、其多潜能祖细胞，以及定向分化为特定细胞类型(例如，肝细胞或胆细胞)的祖细胞。“多潜能”表明细胞能够形成超过一种命运的子细胞；“单潜能”或“定向祖细胞”是具有单一成体命运的细胞。
“无性系扩增”指能够从单细胞扩增并保留母细胞表型地重复次培养和扩增的细胞生长性质。“集落形成”指能够在一周或两周内经历有限次数的细胞分裂(通常5-7次细胞分裂)的二倍体实质细胞的性质，并包括具有有限的经历次培养或传代的能力的细胞。
肝干细胞是在胎儿肝和新生肝的导管板(也称为限制板)中和小儿肝和成体肝的赫林管中发现的多潜能细胞，证明了具有端区酶表达的自我复制并能够在移植时形成成熟肝细胞。这些细胞是EpCAM+、NCAM+、ALB+、CK8/18+、CK19+、CD133/1+，并且对所有试验造血标志物(例如，CD34，CD38，CD45，CD14)、间质细胞标志物(CD146，VEGFr，CD31)和P450或α胎儿蛋白表达呈阴性。已经发现肝干细胞产生肝胚细胞和定向(单潜能)胆祖细胞。
肝胚细胞(HB)也是胎儿和新生肝实质各处存在的多潜能细胞，并且作为单细胞或小的细胞聚集体而集中在赫林管末端。HB衍生自肝干细胞。HB分享存在于HSC上存在的许多抗原，但是具有重要差别。例如，HB不表达NCAM而是ICAM1，并且它们表达显著量的α胎儿蛋白和胎儿形式的P450。这些HB产生单潜能祖细胞、定向造血和胆祖细胞。
肝定向祖细胞是肝细胞和胆谱系之一。它们的抗原特征与HB重叠；但是，胆定向祖细胞表达CK19而非AFP或ALB，而肝细胞定向祖细胞表达AFP和ALB而非CK19。定向胆祖细胞直接衍生自肝干细胞，也衍生自肝胚细胞。
间质细胞(MC)包括许多不同间质细胞类型(列为成熟细胞和括号中它们的祖细胞)的不同谱系阶段的细胞：包括间质(间质干细胞)、内皮(成血管细胞)、星状细胞(星状细胞前体)和各种造血细胞(造血干细胞)。
虽然本文讨论和示例的肝祖细胞的大部分(如果非全部)指人类衍生的细胞群，但是本文教导不限于人类。事实上，本领域普通技术人员预期应用本文教导普遍从哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、狗等)扩增肝祖细胞。因此，本发明范围预期包括任何和所有哺乳动物的肝祖细胞。
而且，虽然本发明在很大程度上描述从肝组织分离肝祖细胞。本文描述的方法扩展至从其他组织(包括胰腺、肠、肺或骨髓细胞)分离祖细胞细胞，不限于肝祖细胞。
还要注意，根据本发明适合体外增殖的肝祖细胞不限于通过任何特定方法分离或识别的那些。参见例如美国专利第5,702,881；5,660,976；5,752,929；5,863,296；5,855,617；5,843,024；5,827,222；5,723,282；5,514,536；和4,723,939号等，其通过引用整体结合入本文。
作为具体实例，用于分离和识别肝祖细胞的方法描述于例如美国专利第6,069,005号和美国专利申请第09/487,318；10/135,700；和10/387,547号，其公开内容也通过引用整体结合入本文。例如，肝干细胞和肝胚细胞分享多种抗原(例如，细胞角蛋白8、18和19，白蛋白CD133/1，和上皮细胞粘附分子(“EpCAM”))，并且对造血标志物(例如，血型糖蛋白A，CD34，CD38，CD45，CD14)和间质细胞标志物(例如，CD146，CD31，VEGFr或KDR)呈阴性。肝干细胞和肝胚细胞能够通过这些标志物分离。
可选地，肝干细胞和肝胚细胞能够通过尺寸(干细胞是7-9μm；而肝胚细胞是10-12μm)、通过培养物形态(干细胞形成密集的、形态学一致的集落，而肝胚细胞形成由清晰通道、假定小管分散的带状结构)、通过某些抗原表达模式差异(EpCAM在肝干细胞各处表达，但限制在肝胚细胞的细胞表面)或通过不同抗原特征(N-CAM存在于肝干细胞，而α胎儿蛋白(AFP)和ICAM1由肝胚细胞表达)而彼此区分。
在胎儿和新生肝中，肝干细胞在导管板(还称为“限制板”)中，而肝胚细胞是主要的实质细胞群(＞80％)。在小儿和成体组织中，肝干细胞存在于赫林管中，而肝胚细胞是聚集在赫林管末端的细胞。肝胚细胞由小量正常组织细胞组成，但大量(例如，小瘤)发现于患病肝(例如，肝硬化)中。
来自胎儿肝的肝细胞混悬液充满造血细胞，特别是类红细胞。事实上，人类胎儿肝的原始细胞混悬液平均由仅6-9％实质细胞组成，其余是各种非实质细胞，特别是类红细胞。作为清除类红细胞的常规方法，例如使用裂解缓冲液，可能对肝祖细胞是毒性的，其他方法可能是优选的。例如，类红细胞可以通过使用之前公开的方法反复慢速离心从实质细胞分离(Lilja等，1997；Lilja等，1998)。
一种可选且更有效的方法，补体介导的细胞毒性，可以被用于使候选干细胞的损失最小化。胶原酶消化之后，抗人红细胞(RBC)抗体可以用细胞混悬液(1∶5000稀释)在37℃孵育15分钟。为了穿刺和裂解抗体标记的红细胞，添加(1∶3000稀释)补体(例如，LowToxGuinea猪补体)，在37℃孵育10分钟。细胞上清液由于从红细胞释放的红色素变成粉红色。清除了造血细胞的混悬液由至少80-90％实质细胞组成。
然后，得到的、已经清除了造血细胞的混悬液在新鲜胶原酶溶液中经受第二轮酶消化30分钟，以最小化细胞成簇，随后通过75μm尼龙筛筛分。通过台盼蓝排除估计的细胞成活力常规高于95％。过滤后，大部分肝胚细胞是每聚集体含有4至8个细胞的成簇细胞。这些技术共同帮助产生基本不含PBC而富含实质肝细胞的细胞混悬液。
作为另一个实例，如美国专利申请第10/620,433号所描述，整个肝可以被加工以去除死亡细胞和造血细胞。简言之，来自新生、小儿、青年、成年或尸体供体的整个人类肝或其部分在37℃用螯合缓冲液灌注约15分钟，然后用包含胶原酶和弹性酶的酶制剂在37℃消化至少约30分钟，以提供消化的肝。然后，将消化的肝冷冻在收集缓冲液中并机械离解以提供细胞混悬液。然后，将细胞混悬液又通过过滤筒过滤以去除碎屑和细胞聚集体。然后收集单细胞混悬液，并任选测定其成活力和浓度。细胞浓度被调节至约25百万细胞/mL，以提供起始细胞混悬液。为了从该混悬液去除死亡细胞，小份(250mL)起始细胞混悬液与等体积25％碘克沙醇(OPTIPREP)在缺少酚磺酞的RPMI 1640培养基中的溶液混合。该混合物(500mL)用预定体积(60mL)的缺少酚磺酞的RPMI 1640培养基覆盖，并在COBE2991 Cell Processor(15min，2000rpm，约500xg)上经受离心，以获得至少一个富集活力细胞的条带。该条带在冰上收集入第三个袋。任选地，可以测定细胞存活力和浓度。
细胞外基质组分
单干细胞混悬液一经获得，本发明通过将混悬液铺板于凝胶样细胞外基质上分离或选择肝祖细胞细胞(优选肝干细胞)。事实上，不限于理论或不受理论束缚，本发明人已经发现，本文描述的细胞外基质组分优选以纤维(即，聚合)形式使用。如本文所定义，“聚合”或“聚合物”胶原与纤维形式的胶原同义。注意，定义以及本发明不受聚合程度的限制。换言之，包含大部分非单体胶原的任何组合物是纤维状的。确信的是，当聚合时，基质蛋白形成凝胶样层，其有益于肝祖细胞分离和增殖。细胞可以直接铺板于基质上或者“夹在”在两层之间，产生三维基质。
确信，本发明范围不限于任何一种基质组分或其组合。与本文教导相一致，本发明描述并教导了任何和所有细胞外基质组分及其组合产生基质的用途，所述基质可用于体外维持待扩增或分化的细胞。虽然这些组分中许多将在下文讨论，为清楚起见，术语例如I、III和IV型胶原和/或层粘连蛋白应该解释为仅代表其各自类别的细胞外基质组分。
在本发明的具体实施方案中，描述了I和III型胶原的基质。虽然这些胶原的许多比例适合本发明，但优选实施方案包括97∶3的I∶III胶原。97％I型胶原和3％III型胶原的溶液可以标志PURECOL商业获自INAMED Corp.(Fremont，USA)。
PURECOL通常以大约3mg/mL和pH 2提供。“溶液”含有高含量单体；然而，单体可根据下述生产商建议的方案聚合：
1.将8份冷的PURECOL胶原与1份10X细胞培养基的10X磷酸盐缓冲生理盐水溶液混合。细胞在该步骤被添加至培养基。
2.通过添加0.1M NaOH或0.01N HCl调节溶液pH至7.4±0.2。溶液pH可由pH计或pH试纸监测。
3.保持4-6℃的温度以防止胶凝化。
4.为了成凝胶，加热被中和的PURECOL胶原溶液至37℃。为了最好的结果，允许发生至少45分钟至1小时的胶凝化。
5.凝胶可以在层流通风橱中干燥。
为了本文描述的实验，用10x PBS制备PURECOL基质为所提供的PURECOL溶液。例如，在图1A中，由8份1.5mg/ml PURECOL和1份10X PBS，pH 7.4(使用0.1M NaOH或0.1M HCl)组成的1.0mlPURECOL被合并，并在4℃温和混合以产生均质溶液。此过程中，需要避免在新形成的胶原悬液中引入气泡，因为气隙能够使胶原不稳定。优选地，制备表1所示不同比例的I型和III型人类胶原为上述凝胶，然后应用至组织培养塑料(TCP)。胶凝化后，准备好板/孔以接收细胞悬液。
如上所述，这些胶原的许多比例适合本发明。除了上文特别指出的那些外，其他比例包括但不限于下表1所列：
表1.
No. ％I型胶原 ％III型胶原 ％其他胶原1 ％非胶原2
1 97 3 0 0
2 98 2
3 99 1
4 100 0
5 95 5
6 90 10
7 80 20
8 70 30
9 60 40
10 50 50
11 97 0 3
12 97 0 3
13 97 1 2 0
14 97 1 1 1
15 97 0 3 0
16 95 1 3 1
17 95 0 0 5
18 95 0 5 O
1：其他胶原包括例如IV型胶原
2：非胶原包括例如纤维结合素
不受理论束缚，认为胶原I与胶原III的比例越大，促进祖细胞富集，而且，与膜(即，单体的)形式相反的胶原的凝胶(即，纤维的)形式可以驱使祖细胞富集。
可选的富集步骤
虽然本发明不要求，但在将全部肝细胞涂布至本文所述基质之前或随后的进一步富集方案包括菲可分级分离以分离肝母细胞。简言之，细胞悬浮于10ml无酚红的基础培养基中，并层叠在50ml离心管中等体积菲可帕克(Amersham Pharmacia)上。细胞随后以1000xg离心25分钟。收集界面和沉淀的细胞。菲可粉剂分离产生超过80％实质细胞的沉淀，其基本上全部是肝母细胞，具有多种抗原全貌的原始细胞群的13-14％的界面表明实质、造血和内皮细胞。菲可界面细胞以0.1％产生管板细胞集落，是来自原始细胞悬液的10倍。虽然菲可分级分离的结果可能与肝母细胞分离一致，但它们在分离干细胞时制备与制备间更容易变化。
免疫选择是富集和/或分离肝干细胞(管板细胞)或其他亚群的另一种技术。优选的免疫选择方案是采用在细胞上高表达的抗原(例如，在所有肝祖细胞上发现的EpCAM)和在肝祖细胞的一个亚群上的其他抗原(例如，管板细胞上的NCAM)的那些方案。免疫选择可以是这些程序的多种方法的任何一种，并且可以是细胞计数器、淘选或磁珠。
磁性免疫选择包括从人肝细胞悬液分离表达例如EpCAM的细胞，使用与磁性小珠偶联的单克隆抗体HEA125，和Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach，Germany)的autoMACSTM或![]()
磁性柱分离系统，按照生产商推荐的方案。使用类似的方法来免疫选择NCAM、CD146、KDR(VEGFr)和CD133/1细胞。
培养基&缓冲液
多种细胞培养基可适合本发明。通过添加或从培养基去除生长和/或分化因子，可以影响细胞增殖和/或分化的速率。例如，添加血清可以减缓肝祖细胞的生长并导致对肝细胞命运的谱系限制，平行地，导致间充质细胞群的快速扩增(间质和内皮)。添加表皮生长因子导致对肝细胞命运的谱系限制。
优选地，在一些实施方案中，本文描述的基质组分与无血清培养基结合使用。无血清培养基先前为肝母细胞而开发并描述于第09/678,953美国专利申请，其公开内容通过引用整体结合入本文。不受理论束缚，目前认为本发明基质组分提供了许多一般由培养细胞提供的生存、生长和/或增殖细胞。因此，本发明可以显著部分地替代对胚胎间质培养细胞的需求以保持肝祖细胞的存活力和扩增潜力。
除非另有说明，在肝组织处理和细胞培养物维持过程中使用了无血清培养基。该培养基包含500ml RPMI 1640，添加了0.1％牛血清白蛋白组分V、10μg/ml牛全运铁蛋白(离子饱和的)、5μg/ml胰岛素、500μl硒(5×10-5M原液)、5ml L-谷氨酰胺、270mg烟酰胺、5ml AAS抗生素、500μl氢化可的松(10-4M原液)、1.75μl2-巯基乙醇和38μl游离酸混合物，其如第09/678,953号美国专利申请所公布的制备。该培养基进一步添加了0.2至1单位/mL LIF(ES-GRO；Chemicon，Inc.，Temecula，CA)、0-10ng/ml BMP4(R& D Systems)和0-20μM PD098059(Mek inhibitor，Upstate，Lake Placid，NY)。最终，培养基被灭菌并在使用前调节其pH至7.4。
“细胞洗涤缓冲液”包含500ml RPMI 1640，添加1％牛血清白蛋白、500μl硒和5ml AAS抗生素。“酶消化缓冲液”包含100ml细胞洗涤缓冲液，其添加60mgIV型胶原酶和30mg在37℃溶解的DNA酶。
增殖
使用4x、10x和20x放大镜的相位显微镜检查法，通过集落生长的成像尺寸变化目视评价肝祖细胞增殖的识别和记录；低放大物镜允许完整集落的观察。祖细胞集落包括直径约7-10μm的紧紧粘附的细胞。通过重复集落成像获得生长曲线，根据MetaMorph图像软件预先校准的已知尺度标准化显微照片，以进行统计学对比分析。或者，肝祖细胞的增殖使用生产商推荐的CellTiter 96非放射性细胞增殖分析(MTT)或单溶液细胞增殖分析(MTS)(Promega，Madison，WI)。
通常，富集根据本发明的肝祖细胞所需的生长期范围是，对于胎儿实质细胞群为6天，对于新生细胞实质群为10天，对于成体实质细胞群为60天。
组织获得&制备
来自16-22周妊娠年龄的人胎儿的肝组织获自公认的代理商Advanced Biosciences Resources of Alameda，CA。优选地，组织在分离18小时内接收并作为肝组织多切片或者有时作为适当完整的肝到达。一般而言，整个肝体积范围为约4ml至约12ml，并含有大量红细胞(RBC)。
肝被机械离解，组织用酶消化缓冲液部分消化，产生实质细胞簇。这些簇经受洗涤和低速离心以基本上去除游离的悬浮造血细胞而保留肝实质。然后，将离解的肝分成3ml小份，向其中添加25ml酶解消化缓冲液。32℃下30分钟适度搅拌后，移出上清液并贮存于4℃。任何残留的未成碎片的沉淀用新鲜酶消化缓冲液再次消化额外30分钟。组织碎片的酶消化完成后，细胞悬液以250革命性离心力(RCF)离心；除去上清液；沉淀重悬于等量细胞洗涤缓冲液。
免疫染色
使用丙酮和甲醇的50/50混合物固定细胞2分钟后进行细胞的免疫染色，再次用1x PBS洗涤，用10％山羊血清封闭45分钟。然后，在室温下添加与荧光探针偶合的初级人类抗体1至8小时。当使用未偶合的初级抗体时，细胞用与荧光探针偶合的次级抗体染色。
现在通过非限制实施例描述本发明实施方案。
实施例
使用几种细胞外基质作为涂布全肝(例如“UMIX”)或EpCAM+磁性分选细胞(即，肝干细胞)的单细胞悬液的基底。基质诱导的(a)未处理的；(b)PureColTM；(c和d)胶原III[分别来自Sigma-Aldrich或Becton-Dickinson(BD)]；(e)胶原IV(BD)，(f)胶原I(Biocoat；Becton-Dickinson)；或(g)纤维结合素(Sigma)。PureColTM(Inamed)包含凝胶形式(纤维形式)的97％胶原I和~3％胶原III。来自Sigma-Aldrich和Becton-Dickinson的胶原III都主要包含胶原III，含有小百分比的膜形式的胶原I。胶原IV是膜形式，来自Becton-Di ckinson的胶原I也以膜形式(单体形式)提供。纤维结合素(Sigma-Aldrich，Inc，St.Louis，MO)板以5μg/cm2制备并调节至pH 7.5。胶原III和IV板以1.0mg/ml浓度制备。
实施例I
新生-37周胶凝化。十亿细胞用于免疫选择EpCAM+肝祖细胞。新生EpCAM-分选细胞涂布于(a)未处理的组织培养塑料(TCP)；(b)PURECOL；和(c-d)胶原III(分别地，Sigma和BD)，在6孔皿中以每孔100,000或300,000个细胞。涂布后两周，干细胞集落在PureCol板中获得，而没有干细胞集落在任何其他条件下获得。
实施例II
新生-38周胶凝化。73亿细胞被回收，接近全部被免疫选择EpCAM+肝祖细胞。新生EpCAM-分选细胞涂布于(a)未处理的组织培养塑料(TCP)；(b)PURECOL；和(c-d)胶原III(分别Sigma和BD)，6孔皿中每孔800,000细胞。此外，非免疫选择的全细胞群(包括实质细胞和非实质细胞)也以每孔800,000个细胞(6孔皿)涂布于(a)未处理的TCP；(b)PURECOL；和(c-d)胶原III(分别为Sigma和BD)，对UMIX以融合涂布，对EpCAM分选细胞以6孔皿中每孔800,000个细胞涂布。
体外增殖两周内，观察到肝细胞样集落(图1)。图1中所示的显微照片在以相等细胞密度涂布的UMIX细胞培养两周后获得。PURECOL增殖的培养物以更低放大倍数照相以更好说明推定肝干细胞的广泛生长。肝干细胞形成致密的直径7-10μM的细胞聚集物。在未处理和胶原III处理的涂布中，UMIX细胞培养物没有产生任何干细胞集落，但观察到了成纤维细胞样细胞。使用EpCAM-分选细胞获得了类似结果。有趣的是，涂布在PURECOL上的EpCAM分选细胞也产生了干细胞集落；但是，非免疫选自群产生了更高的干细胞富集。其他涂布条件没有一个产生任何干细胞集落。
涂布两周后，培养物经固定并对EpCAM染色。所有细胞对EpCAM染色呈阳性。对于阴性对照，平行培养物不用二级抗体染色而可视；没有观察到信号。因此，PURECOL基质单独可以用以从全肝细胞选择肝干细胞(参见图2)。
实施例III
胎儿肝细胞在6孔皿中以每孔800,000个细胞涂布于(a)未处理的TCP；(b)PURECOL；和(f)Biocoat胶原I。涂布5周后，通过形态学确定与图1和3-PURECOL板)所示相同，条件(a)和(f)产生了不小于1％的肝干细胞。条件(a)产生了＞50％的肝干细胞，但是，细胞在35天后停止增殖。
实施例IV
胎儿肝细胞在6孔皿中以每孔800,000个细胞涂布于(a)未处理的TCP，4.6×106个细胞于10cm皿中；和(b)PURECOL。涂布4周后，条件(a)产生小于2％的肝干细胞，而条件(b)产生＞40％肝干细胞。
实施例V
胎儿肝细胞在6孔皿中以每孔800,000细胞涂布于(a)未处理的TCP；(b)PURECOL；(c，d)胶原III(分别Sigma-Aldrich和BD)；(e)胶原IV，(f)胶原I(Biocoat；Becton-Dickinson)；和(g)纤维结合素。涂布1周后，条件(a)和(c-g)产生了小于2％的肝干细胞，而条件(b)产生了＞40％的肝干细胞(参见图3)。
综合而言，这些实验说明，全肝的单细胞悬液在凝胶样细胞外基质(优选含有纤维胶原、更优选纤维胶原I)上培养时可以基本上富集肝祖细胞，优选肝干细胞。在本发明的一些实施方案中，基本上富集被定义为对全肝细胞群富集超过约40％、50％或60％。在优选实施方案中，对全肝细胞群富集超过约70％、80％或甚至90％富集。
如上所记录的，在本发明的其他实施方案中，全肝单细胞悬液在凝胶样细胞外基质(优选含有纤维胶原、更优选纤维胶原I)上培养时可以基本上被分离或选择肝祖细胞。在这些实施方案中，分离产生超过约90％、优选超过约95％、最优选超过约99％“纯”肝祖细胞群、优选肝干细胞的群。
干细胞集落培养物通常在肝处理后两周内获得。对于胎儿制品，高富集的干细胞样集落在肝处理后1周是可视的。成体肝细胞群可发现类似的结果。
再次，数据显示，干细胞更好地扩增并保持在主要由纤维形式的胶原I组成的基质上，该基质提供了简单的选择性培养基以从新生和胎儿全肝细胞制品获得高富集的肝干细胞群(接近或达到100％富集)。换言之，本发明方法允许选择肝干细胞而无任何其他标准。例如，本方法不需要分选EpCAM+细胞。
来自这些培养物的RNA可用以对许多生物标志物(例如，EpCAM(表达于干细胞)、ALB(表达于干细胞)、AFP(表达于肝母细胞而非干细胞)、CYP3A4(表达于成熟肝细胞)、CK19(表达于干细胞和胆细胞)和GAPDH(输入RNA质量的对照和RNA量的内标)进行RT-PCR分析(图4)。确信，肝干细胞已知是EpCAM+AFP-ALB+。这样，细胞能够被识别为“干细胞”、“肝母细胞”或“成熟肝细胞”。
这里的新发现能够实现细胞或细胞群的移植，并可以不需要全器官一起替代。实际上，本发明的发明性组合物能够用于对患病肝进行种群恢复。来自胎儿、新生、小儿或成体供体器官的全肝细胞制品或者已经从这些来源富集的干细胞可以以800至850细胞/cm2(3.5-4.0×106细胞/150mm皿)的密度涂布于本文描述的新基质上(例如，胶原I和III凝胶(33∶1比例))。在干细胞富集后，可以获得超过3×107细胞/150mm皿。产生可安全移植入患者的3×109细胞或1％肝块将需要约100个150mm皿(利用总计3.5-4.0×108个肝细胞；成体肝含有超过50×109个细胞)。
在这一点上，细胞可用于细胞移植，冷冻保存以将来扩增，或者通过胰岛素或胶原酶消化从150mm皿去除细胞而进一步扩增并以1∶10稀释涂布(即，使1皿扩增至10皿)。支持强壮干细胞增殖的、添加了因子例如LIF、EPO、PD98059、BMP4和胆碱的无血清培养基将用以培养干细胞。
对于预期用于人类的产品，所有处理步骤应优选根据具有适当SOP的cGMP标准进行。人类干细胞应该通过胰岛素或胶原酶消化而分离。细胞应该立即使用或在使用前冷冻保存。冷冻保存的人类干细胞可以被融化并悬浮于适合以不小于0.1百万且不超过10百万细胞/ml的优选浓度输注的无血清等渗介质中。细胞存活力可以通过台盼蓝排除或等同分析来评估。细胞可以保存在室温或在湿冰上，并通过显微镜检查评估成簇迹象。如果观察到成簇，则细胞将接受在尼龙网(40微米)过滤器上分散，并再次测定细胞的最终浓度。
细胞可以以1百万至10百万细胞/kg体重的优选剂量通过肝门静脉或脾内输注入由于接触急性毒性而遭受肝损伤的受体。作为细胞输注的替代，干细胞可以植入多种支架(模子)的任何一种，所述支架用于直接移植入肝，使用上述相同的剂量参数。应该监测受体的任何急性反应迹象，例如发热、寒战或精神状态变化，并且如果观察到这些症状的任何一种，应该通过标准医疗实践对症治疗。然后通过每周血清化学在接下来的2个月时段内监测患者，以评价肝功能恢复。
在其他实施方案中，体外装置例如生物反应器可以用在适当细胞外基质和适当信号传递环境中包封的肝祖细胞接种，以便它们居住在具有活力组织结构的装置小室。这样，生物人工肝被开发为体外肝辅助装置以支持器官衰竭的患者。它们还可以用作佐剂以移植干细胞以使患者具有肝功能，即使移植的供体细胞是重建的正常肝组织。临床实验已经使用细胞系(例如，猪肝细胞和人肝细胞)完成或者正在进行。
本发明的发明性组合物能够用于如下用干细胞接种肝辅助装置：来自胎儿、新生、小儿或成体供体器官的全肝细胞制品，或来自这些来源的富集干细胞以850细胞/cm2的密度(细胞数将取决于肝辅助装置的容积容量)涂布在根据本发明的基质上，优选地，胶原I和III凝胶(33∶1比例)。细胞培养将导致高富集的肝干细胞在肝辅助装置内产生。支持强壮干细胞增殖的、添加了因子(包括LIF、EPO、PD98059、BMP4和胆碱的组合)的无血清培养基将用以培养干细胞。
生物人工肝还可以用于药理学研究、疫苗开发和作为器官衰竭和器官移植之间的桥梁。每年合成数百个候选药物化合物，需要降低动物实验的花费(其可能超过几百万元以试验一种物质的安全性评估)。因此，评价化学物质和药物毒性的体外模型系统的开发已变得日益重要。这些体外系统也可以提高对药物和化学诱导的毒性机制的理解。体外模型通过生化途径的结构和功能异质性的存在而复杂化，并不允许被清楚确定或重复检验的机制。目前用于试验药物候选物的技术是基于四十年前开发的二维(2-D)夹层细胞培养技术。
大鼠肝细胞在多同轴生物反应器(MCB)中维持升高水平的代谢功能持续至少14天的最近发现已经说明了MCB的证实原理。本发明的发明性组合物可以用于接种MCB，供体外药物和化学品诱导的毒性研究。该含有肝干细胞的新产品具有通过识别特异体质药物反应而节省制药工业显著时间和金钱资源的潜力，所述特异体质药物反应一直不能使用现有的2-D技术解释。
实际上，从这些考察获得的结果表明，利用这些细胞可以是改善目前限制细胞疗法和生物反应器装置医疗选择的细胞来源局限性的途径。根据本文的教导，来自胎儿、新生、小儿或成体供体器官的全肝细胞制品，或者来自这些来源的富集干细胞以2×106细胞/ml体积(细胞数将取决于生物反应器的容积容量)涂布于根据本发明的基质上，优选地，胶原I和III凝胶(33∶1比例)。细胞培养将导致高富集的肝干细胞在肝辅助装置内产生。支持强壮干细胞增殖的、添加了因子(包括LIF、EPO、PD98059、BMP4和胆碱的组合)的无血清培养基将用以培养干细胞。
虽然已经结合其具体实施方案描述了本发明，但应理解，其能够有进一步调整，并且该申请预期包括下述本发明的任何变化、用途或改变。一般而言，本发明原理包括如下从本公开内容的偏差：落入本发明所属领域内的已知或惯常实践，和可以应用至前文提出的必要特征，和落入所附权利要求的范围。