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本发明涉及一种犬瘟热活疫苗及其制备方法。本发明是利用本发明人由野外分离到得一株拥有优良免疫原性的犬瘟热病毒自然减毒株CGMCC No.3201作为生产毒株，制备出安全、有效地、单一成份的犬瘟热活疫苗。本发明有效降低了在免疫犬瘟热疫苗时引入其他活毒的风险，为控制毛皮动物疾病的扩散提供了条件。

1.  一种犬瘟热活疫苗，其特征是本疫苗含有保藏号为CGMCCNo.3201的犬瘟热活病毒。

2.  一种用于犬瘟热活疫苗的制备方法，其特征是将保藏号为CGMCCNo.3201自然弱毒病毒株通过接种Vero细胞，37℃培养，当接毒细胞有80％出现病变时，收获病毒细胞培养液加入常用的冻干保护剂，经冷冻干燥制成冻干活疫苗。

3.  一种用于犬瘟热活疫苗的制备方法，其特征是将保藏号为CGMCCNo.3201作为活疫苗生产毒种同样可用于生产犬瘟热病毒抗原制备多联活疫苗。

一种犬瘟热活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种犬瘟热活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。
背景技术
犬瘟热(Canine Distemper，CD)，俗称狗瘟，是由犬瘟热病毒(Canine Distemper virus，CDV)感染引起的貂、貉、狐狸等毛皮动物和犬以及熊猫、虎等珍稀动物的一种急性、烈性传染病，是目前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。主要在冬春寒冷季节流行，呈散发、地方流行或暴发。由于犬瘟热的临床表现千变万化，在临床诊断时易与犬瘟热相互混淆，给临床诊断和实验研究带来了一定困难。
犬瘟热病毒，属副粘病毒科，麻疹病毒属，是螺旋状对称的负链单股不分节的RNA病毒。大小150～250nm，毒粒子多数呈球形，中心还有宽径为15～17nm螺旋形核衣壳，有杆状纤突，只含血凝素，而无神经氨酸。CDV对热和干燥敏感，50～60℃，30分钟即可灭活。由于CDV在炎热季节不能长期存活，故该病流行于冬春寒冷季节。CDV对紫外线和碱性溶液敏感，可见光容易将病毒灭活，临床上可用3％氢氧化钠(火碱)、漂白粉作为消毒剂。早在1905年，Carre就提出本病的病原是一种病毒(Carr，Y H.Sur la maladie desjeunes chiens.Compt.Rend.Acad.d.Sc.1905，140：689-690)。1951年，Dedie首次用组织培养的方法培养出了CDV。Rockborn发现，CDV在原代犬肾细胞上能形成合胞体、星状细胞与核内或胞浆内包涵体(夏咸柱.养犬大全.长春：吉林人民出版社.1993.9：549-553；殷震，刘景华.动物病毒学.第二版.北京：科学出版社，1997，10：789-801)。我国于70年代末，华国荫等先后从国外进口的CDV弱毒疫苗中分离到了多株疫苗株(华国荫，水貂犬瘟热免疫的研究I.复制鸡胚组织培养弱毒疫苗的研究.畜禽传染病，1980，4：30-35)。
由于犬瘟热有发病急、难以用药物治疗等特点，目前，主要依靠犬瘟热疫苗进行预防，国内外用于有多种预防犬瘟热的疫苗产品，但在疾病预防的实际应用中，由于存在毒株的免疫原性良莠不齐、抗原滴度不高等问题，使用的疫苗可能会存在不能产生有效免疫保护的问题而导致免疫失败的情况出现。同时，国内外的犬瘟热疫苗产品中大都为多联活疫苗，如果养殖场在未发生过犬瘟热以外疾病的情况下，冒然使用多联活疫苗进行预防，可能会存在引发犬瘟热以外疾病的风险，这种情况在使用一些制备不规范的产品时尤为严重。
本发明的目的是利用本发明人由野外分离的一株拥有优良免疫原性的犬瘟热病毒弱毒株，CDV-11株，制备出安全、有效地犬瘟热弱毒冻干疫苗。同时，上述疫苗是一种可以用于狐狸以及水貂、貉、犬等犬瘟热易感动物的单苗，解决了市场上没有用于狐狸等动物的有效犬瘟热单苗的问题，填补了市场上的空白，并为控制毛皮动物疾病的扩散提供了条件。
发明内容
本发明的目的是利用本发明人由野外分离到得一株拥有优良免疫原性的犬瘟热病毒自然减毒株作为生产疫苗的病毒株，接种到Vero细胞上，收获感染的细胞病毒液，加入冻干保护剂，用最适合此毒株的冻干曲线进行冻干，制备出安全、有效地、单一成份的犬瘟热活疫苗。
本发明的犬瘟热活疫苗的生产毒株是来自野外分离到得一株拥有优良免疫原性的犬瘟热病毒自然减毒株，因此，本领域的技术人员可以想到，本发明的犬瘟热病毒自然减毒株作为活疫苗生产毒种同样可用于生产犬瘟热病毒抗原制备多联活疫苗。
1疫苗生产用毒株
(1)病毒来源
本发明人由犬瘟热疑似病犬中，采集体温一过性升高的犬内脏和淋巴组织，用细胞传代方法分离到一株犬瘟热疑似病毒，对该病毒进行了病毒学鉴定，并将细胞培养物接种幼犬。病毒学鉴定结果表明，PCR检测CDV阳性，其它理化特性和生物学特性符合犬瘟热病毒的特点；病理解剖学检查结果表明，接种动物没有犬瘟热临床症状，解剖后也均未发现犬瘟热的病理变化，说明分离到的病毒是犬瘟热弱毒，命名为CDV-11株。本发明制备所用的生产病毒是一株犬瘟热自然减毒毒株CDV-11株(2009年07月15日该株病毒已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.3201)。
(2)病毒株特性
1)病毒培养将病毒样品按维持液量的5％接到Vero细胞(本发明人保存的Vero细胞，营养液为含10％新生牛血清的MEM生长液或含2％新生牛血清的MEM维持液，按常规方法培养)单层上，置37℃、5％CO₂培养箱中静置培养，每天观察CPE，连续观察96～120小时，当细胞出现肿胀、变圆、融合、脱落，细胞融合性病变达80％时收获，置-20℃保存。将CDV11株C1代毒液作毒价测定，共检测三次，结果分别为10^5.63TCID₅₀/ml、10^6.0TCID₅₀/ml和10^5.5TCID₅₀/ml。
2)病毒的形态观察把CDV-11株C1代的培养液作电镜磷钨酸负染色观察(见图1电镜照片，箭头处为病毒粒子)，图1中可见有以圆形或椭圆形为主、大小不等、形态各异的多形型病毒粒子，有的多个病毒粒子聚集成堆，还可见到成堆的或单条的病毒核衣壳丝，在较大的病毒粒子内部也可见到规律性排列的螺旋状核衣壳，也可见到杆状病毒粒子。
3)核酸型鉴定按常规法测定，CDV-11株的病毒生长代谢不被BUDR所抑制，证明CDV-11株C1代病毒的核酸为RNA型，与犬瘟热病毒的核酸类型一致。
4)血凝性按常规法进行，CDV-11株C1代病毒对1％的鸡、豚鼠、兔、猪红细胞均无凝集性。
5)理化特性按常规方法检测病毒对不同pH值、温度、时间和对乙醚、氯仿、甲醛等化学试剂的耐受性试验。理化特性鉴定结果表明，0℃以上保存病毒毒价下降很快，37℃，60min后，毒价降低了10^3.5TCID₅₀，56℃，30min后，毒价降低了10^4.0TCID₅₀；CDV弱毒株对乙醚、氯仿、甲醛化学试剂敏感；pH 7.0～9.0病毒活性稳定，pH7.0以下或9.0以上活性均受到很大影响。
5)分子病毒学鉴定根据Genbank发表CDV的F基因保守区序列，设计1对引物：P1：5’-GCTGGTTGGAGAATAAGG-3’，P2：5’-CCAACTCCCA TAGCATAA-3’。从CDV-11株C1代毒液中提取RNA，经反转录后用以上引物进行RT-PCR扩增，结果扩增出585bp的特异核酸带，如图。
6)血清学检查CDV-11株C1代病毒液与犬瘟热阳性血清(由山东农业大学朱瑞良教授赠送，SN效价为1:355)中和后接种Vero细胞，结果发现CDV-11株C1代对Vero细胞的病变作用能被犬瘟热阳性血清特异性抑制，表明CDV-11株为犬瘟热病毒。
7)安全性
①动物回归试验
病料接种试验将原始采集的病料接种2～3月龄健康易感犬(SN抗体≤1∶4)4只，分别编号，每只同时滴鼻2ml、腹腔8ml，接种后观察21天，每日检测体温，观察精神、饮食、粪便等。其中1只犬在第12日体温出现一次升高，第2日又恢复正常，另外3只未出现体温升高现象；4只犬饮食、粪便性状正常，精神未见异常。将4只试验犬经病理解剖学检验，均未发现犬瘟热的病理变化。
病毒细胞培养物接种试验将CDV-11株C1代病毒液接种2～3月龄健康易感犬(SN抗体≤1∶4)4只，分别编号，每只同时滴鼻2ml、腹腔8ml，接种后观察21天，每日检测体温，观察精神、饮食、粪便等。接种后，21日内接种犬均未出现体温升高，结果见表3；饮食、粪便性状正常，精神未见异常。将4只试验犬经病理解剖学检验，均未发现犬瘟热的病理变化。
通过对分离的病毒进行电镜观察、特异性、核酸型、血凝性、理化特性、分子病毒学、纯净性鉴定证实我们分离到的病毒符合犬瘟热副粘病毒特性，并且纯净。经动物回归试验，病料毒接种健康易感犬后仅有1只犬体温出现一次升高，其余均正常；病料毒在细胞上连传11代后，将病毒培养物接种犬，未引起犬体温升高。所有试验犬解剖后均未发现犬瘟热病理变化，说明分离的病毒对犬无致病力，是一株弱毒。
②稳定性
将CDV-11株在细胞中传15代，每毫升病毒含量均在10^5.5TCID₅₀以上，证明CDV-11株在15代以内是稳定的，可以作为疫苗生产用种毒。
通过CDV-11株对犬、狐、貉、水貂进行大剂量接种的试验，接种动物均未出现犬瘟热临床症状和病理变化，同居试验结果显示未免疫动物未被感染。
将CDV-11株C5代毒通过动物体连续传3代，在每代毒接种狐狸，扑杀后采集脏器进行检测，在第1、2代时，可检测到动物体内有CDV存在，再重复第2代和加大剂量接种4、5代试验，均未检测到CDV。试验结果表明CDV-11株对犬、狐、貉、水貂是安全的，并且不存在毒力反强现象，是用于制备犬瘟热弱毒苗的理想毒株。
8)免疫原性
为了CDV-11株的疫苗研究，对CDV-11株进行了免疫原性试验，免疫狐狸、犬等动物，检测中和抗体并进行攻毒，结果显示CDV-11株具有良好的免疫原性。比较CDV11株C5、C15、C20代免疫原性后，结果并无太大差异，因此选取C5～C15代作为基础种毒，生产用种子继代不超过3代，可以保证疫苗的免疫原性。
2犬瘟热活疫苗的生产制备
(1)将制备好的生产用种毒，采用异步接毒的方法接种到转瓶上的Vero细胞单层，然后将转瓶细胞置37℃培养，转速为8～10r/h。
(3)当细胞病变达80％左右时即可收获病毒液，冻融1次，置于-15℃冻结保存，此为半成品，待检备用。
(4)经过半成品合格检验合格后，用常规冻干保护剂(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典，二○○五年版三部.中国农业出版社，2006，以下称《中国兽药典》)与病毒液的体积比按照1∶1混合，进行冻干。冻干完成后，贴签，入库保存。
3犬瘟热活疫苗的检验方法
(1)无菌检验应无菌生长。按《中国兽药典》中的规定进行检验。
(2)支原体检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无支原体生长。
(3)鉴别检验将疫苗作10^-2稀释，与等量10^-1稀释的犬瘟热阳性血清混合，经37℃中和30分钟，接种Vero细胞4瓶，同时设病毒对照组2瓶，置37℃培养，连续观察CPE96～120小时。
(4)外源病毒检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无外源病毒。
(5)安全检验将每头份疫苗用1ml生理盐水溶化后，肌肉接种2～3月龄易感犬(SN抗体效价≤1∶4)5只，10头份/只，观察21日。
(6)效力检验用含2％新生牛血清的MEM将疫苗溶化，使每1ml疫苗含1头份，然后作10倍递进稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，分别接种已长成单层的Vero细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔100μl，同时设不接毒对照，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，观察96～120小时，记录细胞病变(CPE)孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀，每头份疫苗病毒含量≥10^4.5TCID₅₀。
(7)剩余水分测定每批冻干制品任抽4个样品，各样品剩余水分均不应超过4％。如果有超过时，可重检1次，重检后如有1个样品超过规定，该批制品应判为不合格(《中国兽药典》)。
(8)真空度测定包装前测定真空度，无真空的制品，应予剔除报废，不得重抽空出售(《中国兽药典》)。
附图说明
图11-1正常Vero细胞单层；1-2CDV-11株病毒感染的Vero细胞单层显示细胞病变，
图2病毒的电镜照片，箭头处为CDV-11株病毒粒子。
图3CDV11株病毒PCR扩增产物酶切图1道M，2道CDV-11株病毒，显示扩增产物的585bp的特异核酸带
本发明的优点
本发明是利用本发明人由野外分离到得一株拥有优良免疫原性的犬瘟热病毒自然减毒株作为生产毒株，制备出安全、有效地、单一成份的犬瘟热活疫苗。本发明有效降低了在免疫犬瘟热疫苗时，引入其他活毒的风险，为控制毛皮动物疾病的扩散提供了条件。
实施例
以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
病毒毒种的纯净性检验
1无菌检验将病毒培养物分别接种T.G、G.P小管和G.A斜面培养基各2支，每支0.2ml，一支置37℃培养；一支置25℃培养，观察3日，移植后的病毒培养物接种的T.G、G.P小管和G.A斜面培养基，观察5日均无细菌、霉菌生长。有无细菌、霉菌生长。
2支原体检验取病毒培养物5ml，接种到小瓶液体支原体培养基，再从小瓶混悬液中取0.8ml分别移植到2支小试管液体支原体培养基和2付琼脂固体平板。液体培养物放置37℃培养，固体培养物放在37℃含5％CO₂环境培养。培养5、10、15天，分别从小瓶中取0.6～0.8ml培养物移植于到2支小试管液体培养基(0.2ml/支)，2付固体培养基(0.1～0.2ml/付)，如此重复3次，所有的移植培养物均培养观察14天。在观察期内，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无“煎蛋”状支原体菌落。
3外源病毒检验
1)致细胞病变外源病毒检验将病毒培养物与CDV阳性血清完全中和后，分别接种3瓶F81、DK细胞单层(每瓶细胞瓶底面积为5cm×7cm)，每瓶接种1.0ml，连传2代，每代观察7日，均未出现CPE。
2)荧光抗体检查将病毒培养物用犬瘟热阳性血清完全中和，混合物接种Vero细胞单层(每瓶细胞瓶底面积为2cm×3cm)，培养4日，传代，将第2代培养物经丙酮固定，用荧光法检测镜检细胞表面均未发现RV、BVDV荧光颗粒。
3)红细胞吸附病毒检测将病毒培养物与CDV阳性血清完全中和后，接种Vero细胞单层(每瓶细胞瓶底面积为2cm×3cm)，37℃培养7日进行检验。用PBS缓冲液洗涤待检细胞单层，漂洗3次，加适量新配制的0.2％的豚鼠红细胞、人“O”型红细胞和鸡红细胞等量混合液，轻轻摇晃，使之均匀覆盖整个单层细胞表面，选2个细胞单层，一瓶置于4℃，另一瓶置于25℃培养30min，用PBS洗涤，用显微镜观察待检细胞单层均未吸附鸡、豚鼠、人“O”型红细胞，表明没有具有红细胞吸附特性的外源病毒污染。
实施例2
疫苗的制造
1细胞营养液的配制
采用常规细胞生长液(含10％的初生新生牛血清)和维持液(含2％的初生新生牛血清)作为细胞培养用。
2生产用种毒的制备
用分离到的犬瘟热自然弱毒株，接种转瓶上的Vero细胞单层，接毒量为维持液量的2％，当细胞病变达80％时即可收获，再传1代，制备生产用种毒。
3病毒液的繁殖
用生产用种毒，接种到转瓶上的Vero细胞单层，接毒量为细胞维持液的2％。然后将转瓶细胞置37℃培养，转速为8～10r/h。
接种后，每天观察细胞病变情况，当细胞病变达80％左右时即可收获，冻融1次，置-15℃冻结保存，此为半成品。
5冻干
经过半成品合格检验合格后，用常规冻干保护剂(《中国兽药典》)与病毒液的体积比按照1∶1混合，分装成2ml/瓶，按照设计好的冻干曲线进行冻干，即：-65℃，维持2小时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13.3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度为-20～-10℃，搁板温度为8℃，升华时间为10个小时；解析温度为30℃，2个小时，全部冻干时间约？小时。
6贴签后入库保存。
实施例3
疫苗的成品检验。
(1)无菌检验应无菌生长。按《中国兽药典》中的规定进行检验。
(2)支原体检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无支原体生长。
(3)鉴别检验将疫苗作10^-2稀释，与等量10^-1稀释的犬瘟热阳性血清混合，经37℃中和30分钟，接种Vero细胞4瓶，同时设病毒对照组2瓶，置37℃培养，连续观察CPE96～120小时。
(4)外源病毒检验按《中国兽药典》中的规定进行检验，应无外源病毒。
(5)安全检验将每头份疫苗用1ml生理盐水溶化后，肌肉接种2～3月龄易感犬(SN抗体效价≤1∶4)5只，10头份/只，观察21日。本发明人试生产的三批疫苗0303001批、0303002批和0303003批均安全检验合格。
(6)效力检验用含2％新生牛血清的MEM将疫苗溶化，使每1ml疫苗含1头份，然后作10倍递进稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，分别接种已长成单层的Vero细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8个孔，每孔100μl，同时设不接毒对照，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，观察96～120小时，记录细胞病变(CPE)孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。
本发明人试生产的三批疫苗的效价：0303001批为10^5.19TCID₅₀/头份、0303002批为10^5.0TCID₅₀/头份、0303003批为10^5.12TCID₅₀/头份。
(7)剩余水分测定每批冻干制品任抽4个样品，各样品剩余水分均不应超过4％。如果有超过时，可重检1次，重检后如有1个样品超过规定，该批制品应判为不合格(《中国兽药典》)。
(8)真空度测定包装前测定真空度，无真空的制品，应予剔除报废，不得重抽空出售(《中国兽药典》)。
实施例4
疫苗安全性试验
1最小使用日龄犬和狐狸一次单剂量接种的安全试验
将两种试验动物(SN抗体≤1∶4的50日龄左右幼犬和断奶后1周狐狸)各10只再分成2组，每组5只，第1组肌肉接种0302003批疫苗(本发明人制造)1头份/只，第2组不接种作为对照。隔离饲养，检测体温，观察精神状态、饮食及粪便性状。并在21日时每组抽取2只捕杀作病理检查。
犬将犬瘟热活疫苗接种幼犬后，经临床观察未见任何CDV症状，体温均在38.2℃～39.2℃的正常范围内，精神、饮食、粪便性状均正常，对照组也未见异常。第21日时每组捕杀2只，经病理检查，未见异常；犬瘟热活疫苗接种幼狐狸后，经临床观察未见任何CDV症状，体温均在38.7℃～39.9℃的正常范围内，精神、饮食、粪便性状均正常，对照组也未见异常。第21日时将每组捕杀2只，经病理检查，未见异常。
犬瘟热活疫苗(CDV-11株)冻干苗一次单剂量接种断奶后1周的犬和狐狸后，所有犬和狐狸都正常。说明该疫苗是安全的，在实际应用中动物断奶后2周开始免疫是安全可靠的。
2对犬和狐狸单剂量重复接种的安全试验
将两种试验动物(SN抗体≤1∶4的2～3月龄的犬和狐狸)各10只分成2组，每组5只，第1组肌肉接种0303003批疫苗(10^5.12TCID₅₀/头份)1头份/只，间隔2周后重复接种1次，第2组不接种作为对照。隔离饲养，检测体温，观察精神状态、饮食及粪便性状。并在最后一次接种后21天时每组抽取2只捕杀作病理解剖学检查。
犬瘟热活疫苗经2次连续接种，10只幼犬经临床观察未见任何CDV症状，体温均在38.2℃～39.4℃的正常范围内，精神、饮食、粪便性状均正常，对照组也未见异常。第21日时将犬捕杀，经病理检查，未见异常，说明单剂量连续接种疫苗对幼犬是安全的。
犬瘟热活疫苗经2次连续接种，10只幼狐经临床观察未见任何CDV症状，体温均在38.7℃～39.9℃的正常范围内。精神、饮食、粪便性状均正常，对照组也未见异常。第21日时将狐狸捕杀，经病理检查，未见异常。
通过以上试验证明犬瘟热活疫苗(CDV11株)冻干苗单剂量重复接种犬和狐狸是安全的。
3对犬和狐狸一次超剂量(10头份/只)接种的安全试验
将两种试验动物各20只(SN抗体≤1∶4的2～3月龄的犬和狐狸)，分为4组，每组5只。第1组肌肉接种0303001批疫苗(10^5.19TCID₅₀/头份)10头份/只，第2组肌肉接种0303002批疫苗(10^5.0TCID₅₀/头份)10头份/只，第3组肌肉接种0303003批疫苗(10^5.12TCID₅₀/头份)10头份/只，第4组不接种作为对照。4个组分别隔离饲养，检测体温，观察精神状态、饮食及粪便性状。并在21天时接种犬每组随机抽取2只捕杀作病理检查。
所有接种犬经21天的临床观察，精神、饮食、粪便均正常，未出现犬瘟热症状。体温均在38.2℃～39.4℃的正常范围内。第21日时将动物捕杀，经解剖未见任何犬瘟热病变。
所有接种狐狸经21天的临床观察，精神、饮食、粪便均正常，未出现犬瘟热症状。体温均在38.7℃～39.9℃的正常范围内。第21日时将动物捕杀，经解剖未见任何犬瘟热病变。
结果表明：犬瘟热活疫苗(CDV11株)一次超剂量(10头份/只)接种对犬和狐狸是安全的。
4对怀孕犬和狐狸的安全性试验
试验用怀孕40天左右的犬和狐狸各10只。第1组5只肌肉接种0303003批疫苗(10^5.12TCID₅₀/头份)10头份/只，第2组5只不接种作为对照，观察21日精神、饮食、粪便性状，跟踪调查产仔情况(由于怀孕动物在捕捉过程中可能会造成机械流产，因此未检测体温)。
经21日临床观察，接种犬精神、饮食、粪便均正常，产仔与对照组无明显区别；接种狐精神、饮食、粪便均正常，产仔与对照组无明显区别。结果说明犬瘟热活疫苗(CDV11株)大剂量(10头份)接种怀孕犬和狐狸是安全的。
通过犬瘟热活疫苗对犬和狐狸进行最小日龄单剂量、单剂量重复、超剂量接种和对怀孕母兽接种试验，结果表明犬瘟热活疫苗(CDV-11株)对犬和狐狸是安全的。对于怀孕动物由于捕捉过程中可能会造成机械流产，一般在实际生产中怀孕动物不推荐进行疫苗接种。
实施例5
犬瘟热活疫苗(CDV-11株)效力试验
试验用疫苗为本发明人制备的3批犬瘟热(冻干)活疫苗(CDV-11株)：0303001(10^5.19TCID₅₀/头份)、0303002(10^5.0TCID₅₀/头份)、0303003(10^5.12TCID₅₀/头份)进行试验。在免疫前将疫苗用生理盐水进行稀释，使每毫升疫苗含10^4.0TCID₅₀的犬瘟热病毒，稀释后立即进行免疫。
将犬瘟热SN抗体≤1∶4的45只幼狐，经过一周的健康观察，在体温、精神、饮食、粪便均正常的情况下，将这些幼狐随机分成3批，每批15只，每批再分为3个组，每组5只。第1批每只分别经肌肉注射2ml(含2×10^4.0TCID₅₀)的0303001、0303002、0303003批疫苗；第2批每只分别肌肉注射1ml(含10^4.0TCID₅₀)的0303001、0303002、0303003批疫苗；第3批每只分别肌肉注射0.5ml(0.5×含10^4.0TCID₅₀)的0303001、0303002、0303003批疫苗；第4批5只不免疫作为对照。隔离饲养，于接种后21日，分别采血，测定SN抗体效价。
对免疫1ml(含10^4.0TCID₅₀)剂量的狐狸和对照组狐狸在免疫后21日进行攻毒，每只攻100ID₅₀的由犬制备的CDV/Q3代强毒(对狐狸的ID₅₀为10^-1.70/ml)，攻毒后观察21日。
在免疫0.5ml(0.5×10^4.0TCID₅₀)犬瘟热活疫苗的狐狸中，至少有93.3％(总比例14/15)在免疫后21天SN抗体达到1∶50以上；免疫1ml(10^4.0TCID₅₀)和2ml(2×10^4.0TCID₅₀)的狐狸SN抗体100％均在1∶50以上，其中免疫1ml的狐狸攻毒后均获保护。说明免疫0.5×10^4.0TCID₅₀以上的疫苗能使90％以上的保护免疫狐狸抵御强毒的攻击。具体结果见表1。
表13批犬瘟热活疫苗(CDV-11株)对狐狸的效力试验

以上结果显示：当免疫0.5×10^4.0TCID₅₀/只以上的犬瘟热活疫苗(CDV-11株)，免疫后21日90％以上狐狸的SN抗体≥1∶50。本实验结果表明疫苗的最小免疫剂量为0.5×10^4.0TCID₅₀/只；免疫10^4.0TCID₅₀/只的犬瘟热活疫苗(CDV-11株)，攻毒保护率为100％。因此狐狸的免疫剂量为10^4.0TCID₅₀/只；疫苗的出厂标准定为：每头份病毒含量≥10^4.5TCID₅₀。
序列表
<110>齐鲁动物保健品有限公司
<120>一种犬瘟热活疫苗及其制备方法
<160>2
<170>
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：犬瘟热病毒PCR引物P1
<400>1
GCTGGTTGGA GAATAAGG  18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：犬瘟热病毒PCR引物P1
<400>2
CCAACTCCCA TAGCATAA  18