口服真菌多糖硫酸酯前体脂质体及其制备方法 技术领域 本发明涉及一类用于防治血管栓塞、 弥漫性血管内凝血、 病毒感染等疾 病的多糖硫酸酯口服前体脂质体制剂， 具体涉及将真菌 ( 如 ： 茯苓、 香菇、 云芝、 树舌、 猪苓、 裂褶菌等 ) 多糖进行硫酸酯化半人工合成、 再以其为活性成分制备前体脂质体的方法和用 途。
背景技术 脂质体 (Liposome) 具有缓释、 靶向、 提高药物稳定性及改善药物动力 学特性等优点， 是近 20 年国内外新型给药系统研究领域的热点之一。脂质体具有类细胞结 构， 即由磷脂为膜材及附加剂组成， 亲水性和疏水性药物可直接包裹或附着于双分子层中。 口服脂质体由于其极小的粒径而易于粘附于肠壁上， 增加了药物与肠壁的接触面积和接触 时间。 脂质体还可与胃肠粘膜细胞作用发生融合、 胞饮和吞噬作用， 使药物进人胃肠道粘膜 进而被吸收。脂质体进入体内后缓慢释放药物， 降低体内消除速率。同时药物由于脂质体 的包裹保护， 免于胃肠道酶的降解或减少胃肠道刺激等副作用， 从而提高药物的治疗指数， 减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。所以口服脂质体具有药物促吸收、 药物缓释和减 少毒副作用三重功能。
但无论如何， 脂质体混悬液在贮存期间易发生聚集、 融合及药物渗漏， 尤其水溶 性药物的渗漏更显著。同时天然磷脂易氧化、 水解， 难以满足药物制剂稳定性的要求。 为解决脂质体实际应用中存在的问题， 1986 年， 英国学者 Payne 等提出了前体脂质体 (Proliposome) 这一概念， 系将脂质体膜材和药物的混合溶液在减压搅拌下逐步分布到一 种可溶性固体载体表面， 形成可自由流动的粉体状制剂。 由于尚未形成脂质双分子层结构， 因此称之为前体脂质体， 使用前水化即形成脂质体混悬液。
多糖硫酸酯是多糖衍生物， 由多糖链单糖分子上的某些羟基被硫酸根取代而形 成。多糖硫酸酯大致可分成两类， 一类是天然的硫酸化多糖， 如动物糖胺聚糖、 褐藻多糖硫 酸酯、 卡拉胶等。 此类药物需通过分离、 纯化获得， 来源有限， 提纯工艺复杂， 价格昂贵， 产品 质量不易控制。 另一类是人工半合成产物， 通过简单分离获得丰富的天然多糖， 经硫酸酯化 结构修饰获得多糖硫酸酯， 制备工艺简单， 产物成本低， 易通过控制反应条件按目标产物的 结构进行化学合成。我国是食用菌、 药用菌生产大国， 年产量 1000 多万吨， 占世界总产量的 60％以上。以茯苓为例， 茯苓国内年产量高达 1 万多吨。茯苓多糖含量占干菌核的 90％以 上， 提取、 纯化相对容易， 开发成本低。开发利用真菌多糖这一廉价的雄厚资源具有巨大的 工业价值。
多糖硫酸酯药学活性十分广泛， 具有抗凝血、 抗血栓形成、 抗病毒 (HIV、 单纯疱疹 病毒、 巨细胞病毒、 流感病毒等 )、 降血脂和抗肿瘤等活性， 尤其是其抗艾滋病的功能已引起 国内外许多研究者的极大兴趣， 且硫酸根取代度越高， 抗病毒活性越强。 1987 年原联邦德国 人工合成硫酸化木聚糖用于艾滋病的治疗。硫酸化右旋糖 的 Beyer 与 Hoechst 公司合作， 酐钠盐 (Dextran sulfate sodium) 已是临床治疗 IIa 及 IIb 型高血脂症和保护血管内皮 的药物。
众多研究表明真菌 ( 如 ： 茯苓、 香菇、 云芝、 灵芝、 猪苓等 ) 来源多糖多为带少量 1， 6 分支的 β-1， 3 葡聚糖。 申请人所在实验室一直从事多糖的硫酸酯化人工半合成及药效学
实验研究。目前， 已通过中试确定茯苓多糖硫酸酯生产的最佳工艺路线和质量分析监控体 系， 产品产量、 性质稳定， 成本较低 ； 药效学实验揭示本茯苓多糖硫酸酯属于低毒或无毒物 质， 具有抗凝血、 抗血栓和抗肾衰作用 ( 参见 ： 中国专利 200410013931.1、 200410064766.2、 生物学杂志， 2004， 21(1) ： 36、 中国药学杂志， 2005， 40(12) ： 908)。
但是， 不论是天然硫酸化多糖还是人工半合成多糖硫酸酯， 由于分子量大， 含有大 量硫酸基、 羧基阴离子基团而呈强极性， 口服吸收比较困难。如 ： 肝素广泛用于血栓栓塞性 疾病、 弥漫性血管内凝血等疾病的治疗， 给药方式基本为静脉注射和皮下注射， 并需要住院 观察。为了方便多糖硫酸酯类药物给药， 减轻病人和医院的住院负担， 开发缓释 ( 降低粘膜 出血的副作用 )、 高效的口服制剂迫在眉睫。采用脂质体制剂技术， 将这类药物和易被胃肠 道吸收的物质有机结合， 可以实现该类药物口服吸收。
脂质体成膜材料卵磷脂原本是一种具有降血脂、 抗动脉硬化、 抗血栓等多种保健 功能的天然物质， 因带有胆碱基团而带正电荷， 易与多糖硫酸酯发生静电吸引而结合， 所 以多糖硫酸酯即使不被脂质体包封， 也可能结合在脂质体表面而增加其脂溶性从而易被吸 收。近年来， 我国人口老龄化程度日益加剧， 血栓性疾病的发生率不断上升， 抗血栓药物市 场迅速扩容。根据中国数字医药网的检测数据， 2006 年， 全国使用抗血栓药物总金额在 22 亿元左右， 年增长率为 15％ -20％。而肝素类产品是目前主要的抗血栓产品， 市场份额占抗 血栓药物的 50％以上。因此开发多糖硫酸酯类药物新剂型， 方便病人使用， 降低用药成本， 提高疗效， 减轻副作用， 必将有广阔的市场前景。 发明内容 本发明目的是解决硫酸化多糖的口服不吸收问题， 开发缓释、 高效的口 服制剂， 降低这类药物注射给药的粘膜出血副作用， 方便用药， 减轻病人和医院的住院负 担。
以真菌多糖硫酸酯取代肝素作为脂质体的活性成分， 有益于降低药物成本。人工 半合成真菌多糖硫酸酯及前体脂质体制备的生产工艺简单， 工艺条件温和， 对设备无特殊 要求， 生产过程无固体废料， 溶剂可回收套用。真菌多糖原材料来源丰富。人工半合成真菌 多糖硫酸酯， 通过控制反应条件， 可以得到高硫酸根取代度、 低分子量的产物， 有利于口服 吸收和增大药效。
本发明公开的是提高脂质体稳定性的一类真菌多糖硫酸酯前体脂质体粉末或凝 胶的制备方法。本发明将真菌多糖硫酸酯和其它脂质成分通过加入支撑剂配制成颗粒状、 冻干状的前体脂质体， 加水水化即可成脂质体。本发明公开的前体脂质体除了具有普通脂 质体优点外， 可以进一步延长药物作用时间， 增加产品稳定性， 有利于产品长期存放 ； 还可 以进一步制作成缓释 ( 控释 ) 制剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 栓剂、 片剂等， 即可直接服用， 也可以水 化后服用。 本发明公开的前体脂质体可以防治血管栓塞、 弥漫性血管内凝血、 病毒感染和高 血脂等疾病。
本发明通过下述制备方法和步骤完成 ：
(1) 逆相蒸发法
取成膜脂质、 胆固醇和维生素 E 按 10-2 ∶ 1 ∶ 0.1-0.5 的质量比溶于有机溶剂 (W/V 为 2-5％ )， 混匀后加入 0.5％ -5％的多糖硫酸酯 PBS(pH7.0) 溶液， 有机相、 无机相的 体积比为 10-5 ∶ 1， 磁力搅拌制成稳定的 W/O 型乳剂， 超声 5-30 分钟， Φ0.8-1.2 微孔滤膜 过滤， 分次加入预热 (35℃ ) 的载体中， 液相、 固相重量比为 10-5 ∶ 1， 搅拌混匀后置真空干
燥器或冷冻干燥器去除有机溶剂既制备成多糖硫酸酯前体脂质体。
(2) 薄膜蒸发法
取成膜脂质、 胆固醇和维生素 E 按 10-2 ∶ 1 ∶ 0.1-0.5 的质量比溶于有机溶剂 (W/V 为 2-5％ )， 混匀后置旋转蒸发仪中 35℃减压蒸发成膜， 加入 0.5％ -5％的多糖硫酸酯 PBS(pH7.0) 溶液， 有机相、 无机相的体积比为 10-5 ∶ 1， 洗膜， 超声 5-30 分钟， Φ0.8-1.2 微 孔滤膜过滤， 分次加入预热 (35℃ ) 的载体中， 液相、 固相重量比为 10-5 ∶ 1， 搅拌混匀后置 真空干燥器或冷冻干燥器去除有机溶剂既制备成多糖硫酸酯前体脂质体。
上述 2 种前体脂质体制备方法中， 有机溶剂选自乙醇、 甲醇、 氯仿、 乙醚， 或 2 种以 上溶剂的组合。
本 发 明 公 开 的 真 菌 来 源 多 糖 硫 酸 酯 前 体 脂 质 体， 其中多糖硫酸酯含量为 0.1-10％， 加水回复成脂质体后， 多糖硫酸酯在脂质体中含量不少于 0.05-5％。
本发明所述的前体脂质体， 真菌来源的多糖可以是均多糖， 也可以是杂多糖， 优选 带少量 1， 6 分支的 β-1， 3 葡聚糖。真菌优选产量较大的食用菌或药用菌。
本发明所述的前体脂质体， 其中真菌多糖硫酸酯分子量在 0.2 万 -50.0 万之间， 优 选 0.3 万 -20.0 万， 最优 0.5 万 -10.0 万 ； 单糖硫酸根的取代度为 0.5-2.5， 优选 1-1.5。
本发明公开的多糖硫酸酯前体脂质体中成膜脂质含量为 10-90％， 支撑剂的含量 为 9.9-80％。
本发明所述的前体脂质体， 其成膜脂质成分选自蛋黄卵磷脂、 大豆卵磷脂、 二棕榈 酰磷脂酰胆碱、 二硬脂酰磷脂酰胆碱、 二油酰磷脂酰胆碱、 二油酰磷脂酰乙醇胺中筛选， 优 选卵磷脂。支撑剂选自壳聚糖、 山梨醇、 甘露醇、 海藻糖、 蔗糖、 乳糖、 聚乙烯吡咯烷酮， 优选 低分子壳聚糖。 具体实施方式
实施例 1 ： 茯苓多糖硫酸酯的制备
(1) 采用常规碱溶解 - 酸沉淀的方法从中药茯苓中提取茯苓多糖， 苯酚 - 硫酸法检 测多糖含量为 99.2％。 索氏抽提和元素分析结果显示， 所得茯苓多糖中检测不出蛋白、 核酸 5 和脂类物质。粘度法测定粘均分子量为 2.15×10 Da
(2)1000ml 平底烧瓶中加入吡啶 240ml， 冷却至 4℃并搅拌， 用分液漏斗慢慢滴加 氯磺酸 40ml， 制备磺化试剂 ；
(3) 向磺化试剂中加入 12g 茯苓多糖， 于 75-80℃下剧烈搅拌反应 1 小时 ；
(4)4NNaOH 调 pH6， 减压蒸馏去除水和吡啶， 一直到蒸干为止 ；
(5) 反应瓶中加 500ml 热水溶解， 流水透析 1 天， 收集溶液用活性碳脱色 ；
(6)3 倍量的 95％乙醇沉淀茯苓多糖硫酸酯， 无水乙醇洗涤， 真空干燥， 得浅黄色 粉末 38.5g ；
(7) 改良的 BaSO4 浊度法检测所得产品硫酸根含量， 结果为 48.6％； 硝酸银法检测 NaCI 含量小于 0.15％ ；
(8) 经醋酸纤维素薄膜电泳， 甲苯胺蓝染色， 以已知分子量的肝素、 硫酸软骨素、 透 明质酸为对照品， 检测所得产品分子量分布范围为 0.6 万 -20.0 万。
实施例 2 ： 逆相蒸发法制备茯苓多糖硫酸酯前体脂质体(1) 取卵磷脂 1g、 胆固醇 0.2g 和维生素 E 0.01g 溶于 30ml 乙醇中， 磁力搅拌混 (2) 加入 5％的 PBS(pH7.0) 茯苓多糖硫酸酯溶液 3ml， 磁力搅拌制成稳定的 W/O 型匀；
乳剂 ； (3) 功率 120W 的超声波仪超声 10 分钟 ( 每超声 5 分钟， 间歇 1 分钟 )， Φ0.8 微 孔滤膜过滤 ；
(4) 边搅拌边分 3 次加入到预热 (35℃ ) 的 4g 载体中， 混匀后置真空干燥器 35℃ 减压干燥既制备成多糖硫酸酯前体脂质体。
实施例 3 ： 薄膜蒸发法制备茯苓多糖硫酸酯前体脂质体
(1) 取卵磷脂 1g、 胆固醇 0.1g 和维生素 E0.01g 溶于 30ml 氯仿 - 乙醚混合液中 (V ∶ V ＝ 1 ∶ 1)， 磁力搅拌混匀 ；
(2) 置旋转蒸发仪中 35℃减压蒸发成膜 ；
(3) 加入 3％的 PBS(pH7.0) 茯苓多糖硫酸酯溶液 5ml， 洗膜 ；
(4) 功率 120W 的超声波仪超声 20 分钟 ( 每超声 5 分钟， 间歇 1 分钟 )， Φ1.2 微 孔滤膜过滤 ；
(5) 边搅拌边分 3 次加入到预热 (35℃ ) 的 6g 载体中， 混匀后置冷冻真空干燥器 中干燥既制备成多糖硫酸酯前体脂质体。6