具体实施方式
现详细阐述本发明的示例性实施方案，其实施例在附图中得以说明。
本公开涉及使用包囊抗肿瘤药物的聚合胶束用于治疗肿瘤的药物组合物。所述聚合胶束包含嵌段共聚物，所述嵌段共聚物含有至少一种亲水性嵌段、至少一种疏水性嵌段和至少一种两性离子。所述嵌段共聚物可例如为两亲的(amphiphilic)。在一个实施方案中，所述疏水性嵌段具有例如约500至约30,000道尔顿的分子量。所述疏水性嵌段可包含例如至少一种实体，所述实体例如选自聚己内酯(PCL)、聚戊内酯(PVL)、聚(丙交酯共乙交酯)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚丁内酯(PBL)、聚乙交酯和聚丙内酯(PPL)。所述亲水性嵌段具有例如约500至约30,000道尔顿的分子量。所述亲水性嵌段可包含例如至少一种实体，所述实体选自聚乙二醇(PEG)、透明质酸(HA)和聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)。以及所述两性离子可包含例如至少一种实体，所述实体选自磷酰胆碱(PC)、磺基甜菜碱(NS)和氨基酸。
示例性的嵌段共聚物即PEG-PCL-PC具有以下结构：
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其中R为氢原子、C1-6烷基、苄基或酰基，所述C1-6烷基、苄基或酰基可以是未取代的或被官能团取代，所述氢原子、C1-6烷基、苄基或酰基可以是受保护的；m和n可以相同或不同，其各自为整数；优选地，m和n各自为1-200的整数，更优选地，m和n各自为10-100的整数，最优选地，m为30-85的整数，以及n为10-80的整数。本申请披露的嵌段共聚物可通过美国专利申请公开号2007/0104654中披露的方法制备。
本申请披露的嵌段共聚物在超过临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)时能够在含水介质中形成聚合胶束，其中疏水部分被包埋在核芯中。所述聚合胶束可以例如具有约20-1,000nm的直径。由于亲水性嵌段的链柔性(chain flexibility)和两性离子的存在，所述聚合胶束基本上是非免疫原性的(non-immunogenic)。疏水性嵌段能够通过酶或水解而被分解。所述聚合胶束为生物可降解的和/或生物相容的。因此，在疏水性嵌段被分解后，剩余的无害物质例如亲水性嵌段和两性离子可溶于血液中，然后从肾脏系统除去。
包囊在聚合胶束中的抗肿瘤药物可以是单一的药物或不同药物的组合。
本申请披露的聚合胶束可用作有效的药物载体，并且能够将至少一种疏水药物吸收到其疏水核芯中以形成药物组合物。因此，本公开还涉及增强抗肿瘤药物溶解度的方法、增加所述药物血液循环时间的方法和将所述药物递送至一种或多种实体瘤的方法。这些方法使用本申请披露的聚合胶束包囊至少一种抗肿瘤药物，以增加所述药物的溶解度、有效性或效能，并且将所述药物递送至一种或多种实体瘤。在一个实施方案中，本公开涉及递送抗肿瘤药物至实体瘤的方法，所述方法包括将所述抗肿瘤药物包囊在本申请披露的聚合胶束中以形成包囊复合物(encapsulation complex)，然后通过已知的药物递送方法(如通过口服给药、经皮给药、注射或吸入)将所述包囊复合物递送至人体。
本申请披露的包囊至少一种抗肿瘤药物的聚合胶束可以例如通过以下方法制备。对一定量的抗肿瘤药物和嵌段共聚物进行搅拌并溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中。通过冷冻干燥除去DMSO后，加入1ml10％蔗糖溶液，然后使冷冻干燥的固体溶解以形成混悬液。经受超声处理(ultra-sonication)十分钟后，使混悬液进一步通过0.45μm过滤器过滤，以除去未经包囊的药物晶体，然后可以得到包囊至少一种抗肿瘤药物的聚合胶束。药物包封率(drug encapsulation efficiency，E.E.)使用下式计算：
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表1显示了对各种抗肿瘤药物(CPT或SN38)、嵌段共聚物和它们在每种制剂中用量的选择。PEG、PCL、PVL和PC分别表示聚乙二醇、聚己内酯、聚戊内酯和磷酰胆碱，以及所附加的数字表示PEG、PCL和PVL的近似分子量。例如，PEG5000PCL1900PC表示嵌段共聚物包含分子量为约5000道尔顿的PEG，所述PEG与分子量为约1900道尔顿的PCL相连，所述PCL进一步与PC相连。
任意给出组合物代码以表示不同的组合物。CC201、CC301、CC701、CV201和SC201组合物不包含任何两性离子，由此用于对照目的。
粒度分布(particle size distribution)可通过例如激光粒度分析仪(Coulter N4plus)获得，每种制剂中包囊的CPT或SN38的量可通过HPLC确定。表1中的P.S.、P.I.和E.E.分别表示粒度、多分散指数(polydispersity index)和包封率。这些参数可按照本领域已知的技术测量和/或计算。
表1
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基于以下实施例更详细地解释本发明，这些实施例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实施例1：使用透析袋进行释放试验
将根据上文所述方法制备的药物组合物的50μL溶液加到截留分子量(molecular weight cutoff)为约3,500道尔顿的透析袋中，然后在37℃用50ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)进行透析。在透析0.5、1、1.5、2、4和8小时后，分别取出250μL袋外缓冲液(out-of-bag buffer)，然后各自与750μL甲醇(于0.6N HCl中的溶液)混合。经HPLC确定从聚合胶束中释放然后透析进入袋外缓冲液中的各药物的量。使用50μL含有CPT的DMSO溶液(CPT-DMSO)作为对照。
图1显示了使用透析袋就各种组合物而言CPT(或SN38)随孵育时间的释放分布，表2显示了原始数据。
表2
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a％表示释放的CPN/SN38的百分数。
bS.D.表示标准偏差。
如图1和表2所示，透析8小时后，CPT-DMSO中包含的超过90％的CPT透析进入袋外缓冲液中，但是药物组合物中包含的仅30％或更少百分数的药物透析进入袋外缓冲液中。图1和表2还显示，一般而言，与不含两性离子的聚合胶束相比，含有两性离子的聚合胶束如CCP201和SCP201组合物能够更有效地使药物保持包囊。
实施例2：直接稀释试验
将根据上文所述方法制备的本公开的药物组合物的150μL溶液与1350μL PBS(pH 7.4)混合，然后在37℃孵育。在孵育0.5、1、2、4和8小时后，分别取出10μL孵育溶液，然后各自与990μL甲醇混合。经HPLC确定混合物中内酯形式CPT或SN38的量。使用150μL含有CPT的DMSO溶液(CPT-DMSO)作为对照。
图2显示了使用直接稀释法就各种组合物而言剩余的内酯形式CPT(或SN38)随孵育时间的比例，表3显示了原始数据。
表3
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a％表示剩余的内酯形式CPT和SN38的百分数
bS.D.表示标准偏差。
如图2和表3所示，孵育8小时后，CPT-DMSO中仅约20％的CPT保持内酯形式，但是最初包含在药物组合物中的超过50％的CPT和SN38保持内酯形式。图2和表3还显示，一般而言，与不含两性离子的聚合胶束相比，含有两性离子的聚合胶束如CCP201和SCP201组合物能够更有效地保持CPT和SN38为内酯形式。
实施例3：CPT的体内动力学试验
分别将在DMSO、CC201、CCP201和CV201中的剂量为1mg/kg的CPT通过静脉注射引入到SD小鼠中。然后经HPLC确定内酯形式CPT在血液中随时间的浓度。
图3显示了在体内动力学试验中注射后内酯形式CPT在血浆中的定量分布，表4显示了原始数据。
表4
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aS.D.表示标准偏差
bN.D表示不可检测
其中ng表示10-9克
表5显示了动力学数据。表5中的T1/2(hr)、AUCINF(hr*ng/ml)、CL(mL/hr/kg)和Vss(mL/kg)分别表示半衰期、直到无限的曲线下面积(area under the curve to infinity)、清除率和稳态分布容积以及它们的单位。n表示样本数目。这些参数可根据本领域已知的技术测量和/或计算。
表5
CPT-DMSO
CC201
CV201
CCP201
|
T1/2(hr)
0.25±0.1
1.19±0.32
0.24±0.00
2.39±1.6
AUCINF(hr*ng/ml)
16±6
77±12
62±4
63±24
CL(mL/hr/kg)
69403±24178
16181±938
13127±2001
18045±8008
Vss(mL/kg)
23936±6196
21409±7459
5689±5146
68772±39936
根据表5，4小时后，就使用CPT-DMSO而言，在血液中仅检测到痕量的内酯形式CPT，但相反的是，就使用CC201、CV201和CCP201组合物而言，检测到显著较高的血浆内酯形式CPT浓度。表5显示CCP201提供了在血液中对内酯形式CPT的最好保护，这是因为就CCP201而言血浆内酯形式CPT的T1/2(hr)和AUCINF(hr*ng/ml)值比就CPT-DMSO而言血浆内酯形式CPT的T1/2(hr)和AUCINF(hr*ng/ml)值高约4倍和9.5倍，并且与不含两性离子的聚合胶束相比，含有两性离子的聚合胶束如CCP201能够更有效地在血液中保持CPT为内酯形式。此外，表5表明本发明的示范性实施方案能够在HSA的存在下基本上改善内酯形式CPT的稳定性，并且在HSA的存在下降低可转化为羧酸盐形式的CPT的量。
实施例4：SN38的体内动力学试验
分别将在DMSO、SC201和SCP201中的剂量为4mg/kg的SN38通过静脉注射引入到SD小鼠中。然后经HPLC确定内酯形式SN38在血液中随时间的浓度。
图4显示了在体内动力学试验中注射后内酯形式SN38在血浆中的定量分布，表6显示了原始数据。
表6
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aS.D.表示标准偏差
表7显示了动力学数据。表7中的T1/2(hr)、AUCINF(hr*ng/ml)、CL(mL/hr/kg)和Vss(mL/kg)分别表示半衰期、直到无限的曲线下面积、清除率和稳态分布容积以及它们的单位。n表示样本数目。这些参数可根据本领域已知的技术测量和/或计算。
表7
SN38-DMSO
SC201
SCP201
|
T1/2(hr)
6.2
14.8
12.7
AUCINF(hr*ng/ml)
417
2370
20030
CL(mL/hr/kg)
2490
834
960
SN38-DMSO
SC201
SCP201
|
Vss(mL/kg)
34300
34900
62300
根据表7，4小时后，就使用SN38-DMSO而言，在血液中仅检测到有限量的SN38，但相反的是，就使用SC201和SCP201而言，检测到显著较高的血浆SN38浓度。表7显示SCP201在血液中提供了对SN38的最好保护，这是因为就SCP201而言血浆SN38的T1/2(hr)和AUCINF(hr*ng/ml)值分别比就SN38-DMSO而言血浆SN38的T1/2(hr)和AUCINF(hr*ng/ml)值高约2倍和50倍。
实施例5：CCP201与游离CPT11的体内药物效力比较
将人结肠癌HT29细胞皮下植入在免疫缺陷小鼠的背肌(dorsal muscle)中。肿瘤大小达到约300-500mm3后，将小鼠随机分为4组，然后通过静脉注射分别将盐水、CPT11和CCP201引入到小鼠中。给药频率为每周两次，共给药五次。监测每只小鼠的肿瘤大小和重量。测量肿瘤大小并根据式V＝1/2ab2计算，其中V为肿瘤体积，a为肿瘤的最长直径，以及b为肿瘤的最短直径。
图5显示了经过CCP201和游离CPT11治疗后HT29肿瘤的大小。表8显示了原始数据，表9显示了概括的数据。结果表明，一般而言，与游离CPT11相比，CCP201能够提供更高的药物效力或效能。具体地，18mg/kgCCP201剂量的肿瘤抑制率超过60％，这显著高于游离CPT11的肿瘤抑制率。
表8
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aS.D.表示标准偏差
表9
组
剂量(mg/kg)
总剂量(mg/kg)
TIR％a(第21天)
最大重量损失％(天)b
对照组
-
-
-
14.8(13)
CPT11
10
50
35
17.3(27)
CCP201
9
45
59
20.0(15)
CCP201
18
90
66
32.6(15)
aTIR(％)：肿瘤抑制率＝(1-V治疗组/V对照组)*100
b第一次治疗后测量的最大体重
实施例6：SN38与游离CPT11的体内药物效力比较
将人结肠癌HT29细胞皮下植入到免疫缺陷小鼠的背肌中。肿瘤大小达到约100-200mm3后，将小鼠随机分为5组，然后通过静脉注射分别将盐水、CPT11和SCP201引入到小鼠中。给药频率为每周两次，共给药五次。监测每只小鼠的肿瘤大小和重量。测量肿瘤大小并根据式V＝1/2ab2计算，其中V为肿瘤体积，a为肿瘤的最长直径，以及b为肿瘤的最短直径。人结肠癌Colo205细胞也通过与上文描述相同的方法进行试验，不同的是将小鼠分为6组。
图6显示了经过SCP201和游离CPT11治疗后HT29肿瘤的大小。表10显示了原始数据，表11显示了概括的数据。
表10
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aS.D.表示标准偏差
表11
组
剂量(mg/kg)
总剂量(mg/kg)
TIR％a(第21天)
最大重量损失％(天)b
对照组
-
-
-
5.3(21)
CPT11
10
50
23
9.4(27)
SCP201
4
20
29
11.8(18)
SCP201
10
50
75
8.8(15)
SCP201
20
100
94
15.0(12)
aTIR(％)：肿瘤抑制率＝(1-V治疗组/V对照组)*100
b第一次治疗后测量的最大体重
图7显示了经过SCP201和游离CPT11治疗后Colo205肿瘤的大小。表12显示了原始数据，表13显示了概括的数据。
表12
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aS.D.表示标准偏差
表13
组
剂量(mg/kg)
总剂量(mg/kg)
TIR％a(第20天)
最大重量损失％(天)b
对照组
-
-
-
3.0(18)
CPT11
10
50
61
4.2(18)
CPT11
40
200
95
3.7(8)
SCP201
4
20
48
3.2(3)
SCP201
10
50
86
8.8(6)
SCP201
20
100
98
16.1(15)
aTIR(％)：肿瘤抑制率＝(1-V治疗组/V对照组)*100
b第一次治疗后测量的最大体重
图7、表12和表13显示，一般而言，与游离CPT11相比，SCP201能够提供更高的药物效力。具体地，表11和13都显示，当使用20mg/kg的SCP201时，对HT29和Colo205的肿瘤抑制率可高于90％。
实施例7：使用MTT测定进行SCP201的体内药物效力试验
将各种人癌细胞系如A549、AS2和H460植入到多孔板上，然后将含有10％胎牛血清和1％P/S的Dulbecco改进的Eagle培养基(Dulbecco’sModified Eagle Media)(高葡萄糖)加到每个孔中。在37℃和CO2下孵育24小时后，分别将各种量的CPT11、SN38和SCP201加到每个孔中，然后将混合物在37℃和CO2下再孵育72小时。然后将20μL 0.5mg/ml的MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑![]()
)溶液加到每个孔中以开始反应。2小时后，除去每个孔中的混悬液，然后将DMSO加到孔中以溶解反应过程中形成的甲![]()
(formazan)。然后通过分析每个孔的OD570和OD600数据，获得活细胞浓度。
表14显示了对癌细胞系的选择以及CPT11、SN38和SCP201分别对各肿瘤细胞系的半数最大抑制浓度(IC50)。CPT11和SN38的药物活性差异与出版物中披露的数据一致。表14显示本申请所披露的包含SN38的药物组合物的体外药物活性没有降低。
表14
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aN.D表示没有进行
本申请中所使用的人肺癌细胞系(A549和AS2)由Prof.Wu-Chou Su(National Cheng Kung University Hospital College of Medicine，Taiwan)提供。人结肠直肠癌(Colo 205和HT29)由Dr.Ming-Jium Shieh(National Taiwan University College of Medicine and College of Engineering，Taiwan)提供。人肝癌细胞系SK-HEP-1获自American Type Culture Collection(ATCC，Rockville，MD)。在本申请中所有其余的被测试的细胞系获自Bioresource Collection and Research Center(BCRC，Food Industry Research and Development Institute，Hsinchu，Taiwan)。
鉴于本申请披露的本发明说明书和实践，本发明的其它实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。应该理解，说明书和实施例仅视为示例性的，而本发明的真正范围由权利要求书所指明。