1万亿活芽胞每克地衣芽胞杆菌原粉的制备方法
技术领域
本发明涉及污染水体净化、垃圾除臭等新领域，更具体涉及一种地衣芽胞杆菌原粉(10,000亿活芽胞/克)的制备方法，将在饲料工业和水产养殖方面上得到广泛应用。随着芽胞杆菌功能还在不断地被发现，应用范围也在不断扩大，在国内国际市场上有很强的竞争力。
背景技术
自20世纪50年代以来，抗生素作为疾病治疗剂和动物生长促进剂发挥了重大作用。然而，由于抗生素负面效果越来越严重，世界卫生组织已禁止在饲料中使用任何抗菌药物，一些发达国家对兽用抗生素的使用也有明确规定。饲料和养殖业以添加抗生素预防和促进动物生长的饲养方式已经受到了很大冲击，抗生素替代品的使用和推广成为养殖业发展的必然方向。芽胞杆菌益生菌具备抗生素预防疾病和促进生长的特点，成为抗生素的替代品，将取得理想的应用效果，在养殖业中具有很大的开发潜力。
益生菌又称微生态制剂，是指有益微生物经过特殊驯化和加工制成的活菌制剂，益生菌可以改善动物肠道中微生物的菌群平衡，防治某些细菌性疾病的发生，能提高动物的饲料利用率、提高机体免疫力，促进生长和改善生产性能，得到安全无药物残留的动物产品。现已开发成商品制剂的益生菌有：芽胞杆菌类、酵母、乳酸菌、双歧杆菌、链球菌、曲霉等。
目前，国内芽胞杆菌益生菌制品的生成工艺主要有两种，即固体发酵法和液体深层发酵法。固体发酵法是把益生菌接种到固体培养基上进行发酵培养，其优点是相对管理比较粗放，具有生产工艺简单，投资少的特点，但同时具易受杂菌污染，菌体含量不易控制、产品质量不稳定的缺点。目前我国大多数芽胞杆菌益生菌产品都是采用该生产方法。液体深层发酵法是采用现代发酵技术，将益生菌菌种接种到反应器中进行通风培养，对整个发酵过程都可以进行精细的过程控制，具有便于无菌操作，容易控制菌体含量，产品质量稳定的特点，但技术水平要求较高，相对固体发酵投资要高，但更适合工业化生产。其一般工艺流程为：菌种接种培养→种子罐培养→发酵罐发酵培养→排放培养液→收集菌体→加入适量载体和保护剂→干燥→粉碎→过筛→稀释混和→成品包装→质检→益生菌产品。
国内通常采用的固体发酵方式生产的地衣杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵生产的制剂(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。采用本工艺生产的地衣芽胞杆菌原粉(原药)具有生产清洁安全、回收率高、产品芽孢数稳定、产品活芽胞数达10,000亿活芽胞每克等优点。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种地衣芽胞杆菌原粉的制备方法，安全、高效优质，方法易行，由该工艺生产的地衣芽胞杆菌原粉(原药)中的活芽胞数达10,000亿活芽胞每克。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
发明内容包括：地衣芽孢杆菌培养基优化及液体高密度补料发酵技术；高效的芽胞提取回收工艺，产品活芽胞数高。
一种地衣芽胞杆菌原粉的制备方法，其步骤是：
1.高产BL KN-08的培养基优化：
采用Box-Behken设计的响应面实验，首先从众多因子中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑碳源、氮源、无机离子等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Steepestascent)，和用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过对回归方程的分析，设计优化B-52发酵培养基(大米粉15.26g/L，酵母粉27.05g/L，玉米浆16.58g/L，豆粕3.88g/L，玉米粉4.16g/L，玉米淀粉3.95g/L，磷酸二氢钾0.68g/L，氯化锰(MnCl2)0.2g/L，氯化钠2.5g/L)。
2.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量：
采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基B-52进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期迟缓期、对数生长期和稳定期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优化高密度补料发酵工艺，在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，采用糖浓度15g/ml，通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度为0.5-1.0％(质量比)，发酵过程共用葡萄糖7％(质量比)；，发酵过程补加氨水，使pH控制在6.8-7.2范围，发酵液活芽胞数达106亿/ml；
3.特殊、高效的芽胞提取与回收工艺：
芽胞提取与回收：发酵罐酸化，2N稀盐酸，pH4.2-4.5，升温35-37℃，80-85目过滤，加3.5‰(质量比)硫酸锌，搅拌3-8分钟，再加2.5‰(质量比)黄血盐，搅拌1-2分钟，静置15-30分钟，离心去上清，菌浆加3倍体积的水水洗后二次离心，得到菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200-201℃，出口风温85-87℃，原粉活芽胞数达10,000亿/克；
发明的目的在于对筛选的生长迅速、生物量高、产芽胞同步率高的地衣芽胞杆菌菌株(菌种专利保护)，采用培养基的优化和高密度发酵工艺、高效芽胞回收工艺，生产出活芽胞数达到10,000亿/克的地衣芽胞杆菌安全原药，远高于国内通常采用的固体发酵方式生产的地衣杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵产品(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。一种地衣芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌地衣亚种(Bacillus licheniformis subsp.licheniformis)，BL KN-08，(该菌种由武汉科诺公司自主开发筛选并通过形态、生理生化和16SrDNA序列鉴定，于2008年12月12日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO.M208251)。
一种10,000亿活芽胞每克地衣芽胞杆菌原粉的制备方法，其步骤是：
1.高产BLKN-08的培养基优化：
采用Box-Behken设计的响应面实验，首先从众多因子(玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉、水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵、氯化钴(CoCl2)、碳酸钙(CaCO3)、硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeSO4)、氯化锰(MnCl2)、硫酸铜(CuSO4)、硫酸锌(ZnSO4))中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑碳源、氮源、无机离子等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Steepestascent)，和用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)。来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析，设计优化发酵培养基B-52：大米粉15.26g/L，酵母粉27.05g/L，玉米浆16.58g/L，豆粕3.88g/L，玉米粉4.16g/L，玉米淀粉3.95g/L，磷酸二氢钾0.68g/L，氯化锰(MnCl2)0.2g/L，氯化钠2.5g/L。
2.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量：
采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期迟缓期、对数生长期和稳定期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优化高密度补料发酵工艺。
3.特殊、高效的芽胞提取与回收工艺：
芽胞提取与回收：发酵罐酸化，2N稀盐酸，pH4.2-4.5，升温35-37℃，80-85目过滤，加3.5‰(质量比)硫酸锌，搅拌3-8分钟，再加2.5‰(质量比)黄血盐，搅拌1-2分钟，静置15-30分钟，离心去上清，菌浆加3倍体积的水水洗后二次离心，得到菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200-201℃，出口风温85-87℃，地衣芽胞杆菌原粉(原药)活芽胞数达10,000亿/克。
本发明与现有技术相比，比国内通常采用的固体发酵方式生产的地衣芽胞杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵生产的制剂(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)要高很多。该工艺安全、高效优质，方法易行，由该工艺生产的地衣芽胞杆菌原药中的活芽胞数达10,000亿活芽胞每克，水份≤7％，pH：6.0-9.0，细度(150μm)≥95％，噬菌体含量≤40个/10,000活芽胞。
具体实施方式
一种10,000亿活芽胞每克地衣芽胞杆菌原粉的制备方法，其步骤是：
1.高产BLKN-08的培养基优化：
采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数(cfu)为筛选指标，利用单因子实验首先从10个碳源(玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉，)；13个氮源(水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵，)；9个微量元素：氯化钴(CoCl2)、碳酸钙(CaCO3)、硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeSO4)、氯化锰(MnCl2)、硫酸铜(CuSO4)、硫酸锌(ZnSO4)因子中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑重要碳源(玉米粉、大米粉和玉米淀粉)、氮源(酵母粉、豆粕和玉米浆)及无机离子(磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化锰(MnCl2)和氯化钠(NaCl))等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Steepest ascent)和用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过对回归方程的分析来设计优化培养基B-52，芽胞数为75亿cfu/ml。
(1)、碳源因子：通过单因子实验，从玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中筛选出玉米粉、大米粉和玉米淀粉为BL KN-08最佳碳源需求因子。
(2)、氮源因子：通过单因子实验，从水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸、硫酸铵中筛选出酵母粉、豆粕和玉米浆为BL KN-08最佳氮源需求因子。
(3)、微量元素因子：通过单因子实验，从氯化钴(CoCl2)、碳酸钙(CaCO3)、硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeSO4)、氯化锰(MnCl2)、硫酸铜(CuSO4)、硫酸锌(ZnSO4)中筛选出磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化锰(MnCl2)和氯化钠(NaCl)为BL KN-08最佳微量元素需求因子。
(4)、利用PB实验设计(Plackett-Burman Design)筛选影响BL KN-08芽胞形成的重要因子，试验表明葡萄糖、玉米浆和蛋白胨对BL KN-08芽胞形成有极显著的影响，因此增加它们的用量对促进BL KN-08芽胞形成具有积极的意义。通过最陡坡试验(Path of Steepest ascent)最终确定大米粉用量为15.26g/L，酵母粉用量为27.05g/L，玉米浆用量为16.58g/L时BL KN-08芽胞数达到65亿。利用本公司从SAS公司购买的SAS统计软件设计中心组合实验(Central CompositeDesign)，最终得到BL KN-08发酵最佳配方B-52：大米粉15.26g/L，酵母粉27.05g/L，玉米浆16.58g/L，豆粕3.88g/L，玉米粉4.16g/L，玉米淀粉3.95g/L，磷酸二氢钾0.68g/L，氯化锰(MnCl2)0.2g/L，氯化钠2.5g/L，采用该配方，发酵液活芽胞数达75亿/ml。
2.高密度液体补料发酵技术提高发酵生物量：以响应面法优化的培养基配方B-52进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞数关系。在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，分析出现反馈抑制因素及浓度，进行分批补料发酵动力学研究，确定补料工艺为：采用初始糖浓度15g/mL，通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度保持0.5-1.0％(质量比)水平，发酵工程共用葡萄糖7％(质量比)；发酵过程补加氨水，使pH控制在6.8-7.2范围；发酵过程通过调节转速控制溶氧水平不低于临界氧(3ppm)。较分批发酵相比，虽然菌数和总耗量明显增加，但采用补料工艺，不仅没有出现底物反馈抑制，也没有因对数期溶解氧不能维持在临界氧之上而影响芽胞的形成。采用此工艺，发酵液活芽胞数达106亿/ml。
3.高效的芽胞提取与回收工艺：
芽胞提取与回收工艺：发酵罐酸化，2N稀盐酸，pH4.2-4.5，升温35-37℃，80-85目过滤，加3.5‰质量比硫酸锌，搅拌3-8分钟，再加2.5‰质量比黄血盐，搅拌1-2分钟，静置15-30分钟，离心去上清，菌浆加3倍体积的水水洗后二次离心，得到菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200-201℃，出口风温85-87℃，原粉活芽胞数达10,000亿/克。