乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗，还涉及该疫苗的制备方法。
背景技术
乙肝病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型肝炎是由HBV引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。大量研究证明，乙肝病毒表面抗原(HBsAg)所诱导产生的抗HBSAg抗体是一种保护性抗体，具有阻断HBV感染的能力。因此，运用HBsAg疫苗免疫机体，能有效防止HBV感染的风险，可以显著降低肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌等肝脏疾病的发生率。
B细胞激活因子(BAFF)是B细胞存活与成熟的必需因子，为肿瘤坏死因子(TNF)家族成员。其能够增强B细胞、CD4T细胞、NK细胞的活性，使机体的免疫应答增强；还可作为T细胞激活的共刺激因子，刺激T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)，上调CD25(IL-2受体α链)表达，并以IL-2依赖方式促进T细胞增生。
免疫刺激复合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发形成的一种直径为30～40nm的球形笼状颗粒，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可大幅度提高抗原的免疫原性。文献报道，以ISCOM为佐剂制得的DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经ISCOM包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而保证该DNA在机体内持续表达。另外，ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从而有利于抗原递呈细胞的吞噬。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HBsAg的免疫增强型基因疫苗；目的之二在于提供所述HBsAg的免疫增强型基因疫苗的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
1、HBsAg的免疫增强型基因疫苗，该疫苗是由HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的ISCOM型疫苗。
进一步，所述HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点(IRES)的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBsAg全长cDNA和BAFF全长cDNA；
进一步，所述HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶10∶1∶1。
2、所述HBsAg的免疫增强型基因疫苗的制备方法，包括以下步骤：
a、HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建：将HBsAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，即得HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体；
b、ISCOM的制备：将HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISCOM。
进一步，所述步骤a的具体方法为：
a1、HBsAg全长cDNA的克隆：提取HBV转基因小鼠的肝脏细胞总RNA，逆转录得到cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的HBsAg全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-HBsAg；
a2、BAFF全长cDNA的克隆：提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamH I和Sal I酶切位点的B细胞激活因子全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-BAFF；
a3、重组真核载体的构建：自步骤a1所得重组载体pT-HBsAg中用Pst I和EcoR I双酶切出HBsAg全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接，得重组载体pStar-HBsAg；再自步骤a2所得重组载体pT-BAFF中用BamH I和Sal I双酶切出BAFF全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-HBsAg连接，即得HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体pStar-HBsAg-IRES-BAFF。
本发明的有益效果在于：本发明的HBsAg的免疫增强型基因疫苗能够显著增强HBsAg的免疫原性，促进抗HBSAg抗体的生成，且制备方法简单、成本低廉，在抗HBV感染领域具有良好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为PCR扩增HBsAg全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为PCR扩增BAFF全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；
图3为透射电镜检测HBsAg的免疫增强型基因疫苗的结构；
图4为免疫组织化学检测HBsAg的表达；
图5为ELISA法测定血清抗体效价。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、HBsAg的免疫增强型基因疫苗的制备及鉴定
1、HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建
(1)HBsAg全长cDNA的克隆
根据GenBank登录号为NP_647605的HBsAg基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的HBsAg全长cDNA：F1：5’-aatcttgcagatgcaactttttcacctctgc-3’(SEQ ID No.3)，下划线部分为Pst I酶切位点；R1：5’tacgaattcctaacattgagattcccgagattg-3’(SEQ ID No.4)，下划线部分为EcoR I酶切位点；分离HBV转基因小鼠的肝脏细胞，用RPMI 1640培养基常规培养，调节细胞密度为2×107个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；将所得细胞总RNA逆转录为总cDNA，再以该总cDNA为模板、F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pGEM-TEasy载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将插入了HBcAg全长cDNA序列(SEQ ID No.1)的阳性克隆质粒命名为pT-HBcAg；
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约650bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。
(2)BAFF全长cDNA的克隆
根据GenBank登录号为NM_006573的BAFF基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的BAFF全长cDNA：上游引物F2：5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’(SEQ ID No.5)，下划线部分为BamH I酶切位点；下游引物R2：5’-acgctcgcgactcacagcagtttcaatgcac-3’(SEQ ID No.6)，下划线部分为Sal I酶切位点；按Trizol试剂盒说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，采用上下游引物F2和R2进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将插入了BAFF全长cDNA序列(SEQ ID No.2)的阳性克隆质粒命名为重组载体pT-BAFF。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约850bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。
(3)HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建
根据HBsAg和BAFF全长cDNA两端所设计的酶切位点，先将HBsAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体pStar的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方法为：先将重组载体pT-HBsAg用Pst I和EcoR I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Pst I和EcoR I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为重组载体pStar-HBsAg；再将重组载体pT-BAFF用BamH I和Sal I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-HBsAg连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定，阳性克隆质粒即为HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体，将其命名为pStar-HBsAg-IRES-BAFF。
2、ISCOM的制备
将HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体pStar-HBsAg-IRES-BAFF用PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISCOM，也即HBsAg的免疫增强型基因疫苗。
3、透射电镜分析
将新鲜制备的ISCOM滴于200目铜网上，吸附3分钟，吸水纸吸干，晾干30秒，以浓度为1％(w/v)的水溶性醋酸铀负染30秒，吸水纸吸干，晾干30秒，80kV透射电镜观察。结果如图3所示，所得ISCOM呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。
二、HBsAg的免疫增强型基因疫苗的体内免疫及检测
将雄性BALB/c小鼠随机分为实验组、对照组和空白对照组，每组10只；实验组以本发明的HBsAg的免疫增强型基因疫苗为免疫原，对照组以HBsAg基因疫苗(HBsAg单基因重组表达载体的ISCOM)为免疫原，空白对照组以PBS为免疫原；三组小鼠按100μL的剂量行双侧股四头肌免疫，每隔2周免疫1次，连续免疫3次；末次免疫后第14天取股四头肌组织，采用免疫组化检测HBsAg的表达；同时尾静脉采血，采用间接ELISA法测定血清抗体效价，P/N≥2判为阳性。
(1)免疫组化检测HBsAg的表达
取小鼠股四头肌组织(0.5cm×0.5cm×0.5cm)置中性福尔马林溶液中，4℃固定12小时，脱水后石蜡包埋、切片(5mm)，将蜡切片脱蜡至水，用体积分数为3％的过氧化氢溶液室温孵育5～10分钟，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，再用体积分数为5～10％的正常山羊血清的PBS稀释液封闭，室温孵育10分钟，倾去封闭液，滴加适当比例稀释的抗HBSAg抗体工作液，37℃孵育1～2小时，PBS冲洗，再滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10～30分钟，PBS冲洗，再滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育10～30分钟，PBS冲洗，DAB显色，自来水充分冲洗，复染，封片，置显微镜下观察，拍片。
结果如图4所示，A为实验组，B为对照组，C为空白对照组，可见HBsAg的免疫增强型基因疫苗能在肌肉组织中高效表达HBsAg，而空白对照组中无抗原表达。
(2)ELISA法测定血清抗体效价
在96孔板中，每孔加入用浓度为0.05mol/L、pH为9.0的碳酸盐缓冲液稀释至浓度为1μg/mL的HBsAg溶液0.1mL，4℃包被过夜，次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤后，再加入适当比例稀释的血清样品0.1mL，37℃孵育1小时，用洗涤缓冲液洗涤后，再加入新鲜稀释的酶标抗体0.1mL，37℃孵育0.5～1小时，用洗涤缓冲液洗涤后，加入TMB底物溶液0.1mL，37℃反应10～30分钟，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液0.05mL终止反应。
结果如图5所示，实验组的血清抗体平均效价为16∶1，而对照组的血清抗体平均效价为4∶1，说明本发明的HBsAg免疫增强型基因疫苗能够显著增强HBsAg的免疫原性，促进抗HBsAg抗体的产生。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
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