详细说明
将外源核酸或多肽输送穿过植物细胞的细胞进入屏障是困难的。可以通过用细胞透化剂诸如甲苯处理植物组织来提高成功的机会(Mahalakshmi et al，2000)；但是，转化率仍然较低。
本发明提供将载荷输送到植物细胞的新方法。所述载荷可以是将在靶细胞中表达的核酸分子或其可以是多肽。所述载荷可以包括标记物以追踪进入植物细胞的输送。
在本发明的方法中，载荷与细胞穿透肽(CPP)连接，在本文中CPP还被称为“载体”或“载体部分”。所述载体与载荷复合，然后将载荷输入细胞。
简单来说，制备包括载体部分和载荷部分的复合物。载体部分是可以横穿植物细胞膜和/或细胞壁的试剂。
用于本发明优选的载体是细胞穿透肽(CPP)。可用于本发明方法和复合物的CPPs包括，但不限于HIV tat，pVEC，运送子，穿透子，Pep-1及其片段。
载荷部分可以是核酸或多肽。可以与载体偶联的核酸实例包括mRNA，tm RNA，tRNA，rRNA，siRNA，shRNA，PNA，ssRNA，dsRNA，ssDNA，dsDNA，DNA：RNA杂合体；质粒，人工染色体，基因治疗构建体，cDNA，PCR产物，限制性片段，核酶，反义构建体或其组合。在一优选的实施方案中，核酸是DNA。在另一优选的实施方案中，核酸是RNA。可以与载体复合的多肽实例包括任意蛋白或其多肽片段。例如，所述蛋白可以是改变植物或植物细胞表型的试剂。还可以是提供对某些害虫或除草剂的抗性的蛋白。所述多肽还可以编码改变细胞代谢的蛋白，诸如胚胎发生相关蛋白或参与定点整合的蛋白。
本发明的载体-载荷复合物可以通过共价和/或静电连接以多种方式形成。此外，可以通过CPPs与载荷的结合制备复合物，例如，用与Pep-1复合的RecA包被的DNA。
在本发明优选的方法中，首先用透化剂处理细胞。借助于CPPs，通过结合透化技术可以实现出人意料的高转移率。透化处理导致在质膜中短暂的孔形成，通过克服细胞壁和膜设置的大小限制，这可有助于单独的CPP或载体-载荷复合物的转运。但是，显然应当理解，利用透化剂的预处理不是所有类型的植物细胞都需要的。例如，不需要任何预透化步骤就可以利用载体-载荷复合物有效地转化小孢子。
可以使用多种类型的透化剂增强载体-载荷复合物的转运。包括甲苯和乙醇的透化液已经被证明是特别有效的。
在附图中显示数个示例性实验的结果，以证明本发明方法和组合物的功效。
现在参照图1，显示的是证明透化效果的一系列显微照片。通过荧光显微镜检查显示黑小麦(Triticale)cv AC Alta的未成熟胚胎中荧光标记的TAT-PTD的转运。结果显示只在透化缓冲液中温育的对照胚胎(A)和用甲苯透化缓冲液处理的胚胎(B)不发射荧光。只用FITC标记的硫酸葡聚糖处理的胚胎(C)未显示标记硫酸葡聚糖的任何显著摄取。另一方面，在细胞透化剂存在条件下用FITC标记的硫酸葡聚糖处理的胚胎(D)的确显示与只用荧光标记的TAT-PTD处理的胚胎(E)所显示的荧光相同的某些荧光。但是，在细胞透化剂存在下，用荧光标记的TAT-PTD处理的胚胎中观察到最显著的摄取。这显示了当细胞透化处理与细胞穿透肽诸如TAT-PTD联用时输送的高效率。图1所示结果证明了未成熟胚胎的透化处理促进了细胞穿透肽的有效转运。
但是，透化不是所有细胞类型必需的。图2显示分离的小孢子对荧光标记Tat的摄取。这些结果表明Tat CPP可以穿透入细胞。
多种不同类型的细胞穿透肽可用于本发明的方法。表1列出被研究的一些CPPs。
表1
肽
序列
肽长度
参考文献
运送子*1
FI-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAK
KIL-酰胺
27
Pooga et
al，2001
|
pVEC*2
FI-LLIILRRRIRKQAHAHSK-酰胺
18
Elmquist
et al，2003
TAT-PTD*3
FI-RKKRRQRRR-酰胺
9
Futaki et
al，2001
|
对于这些肽中的每一个，将N端基团用荧光标记，用“FI”表示。运送子肽是一种嵌合肽，包括借助Lys13与C端的、来自黄蜂毒液肥大脱粒肽的14个氨基酸连接的N端的、来自神经肽甘丙肽(galanin)的12个氨基酸。pVEC肽来源于鼠血管内皮钙粘蛋白(氨基酸615-632)。TAT-PTD肽包括HIV-1 TAT蛋白转导结构域。
表2
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表2显示当对未成熟和成熟的胚胎使用多种细胞穿透肽时，观察到的相对荧光。
类似结果在图3中用图表显示。所述结果表明成熟和未成熟的胚胎中均存在多种肽的转运。当细胞暴露于透化剂诸如甲苯时，转运的效率被提高。尽管甲苯被用作显示透化效果的示例性试剂，但很明显也可以使用其他透化剂达到相同的效果。使用3种不同CPPs的表2和图3的结果表明可以合理预测在本发明的方法中还可以使用其他CPPs。
所述结果表明，用甲苯透化处理组织可以克服合子胚设置的细胞屏障，导致所有被研究的3种肽的转运显著增加。FITC标记的硫酸葡聚糖被用做阴性对照，因为它不具有细胞穿透能力。另一阴性对照，M-tat也显示明显更弱的荧光，表明CPP的穿透是具有高度序列依赖性的。
GUS报告系统(GUS：β-葡糖醛酸酶)是植物分子生物学领域的技术人员公知的报告系统。该报告系统用于显示细胞透化效果以及CPPs增强蛋白转导和基因转染效率的用途。
图4显示透化胚胎中Tat-GUS酶复合物的摄取。该显微照片清楚显示了高效的蛋白转导方法。为了进一步增强摄取，将Tat2 CPP定制合成，Tat 2是HIV Tat的PTD的18氨基酸二聚体。使用Tat2作为CPP的结果显示于图5。为了再次证明其他CPPs可用于本发明的方法，制备Pep-1-GUS酶复合物。图6所示显微照片表明，在透化的未成熟胚胎中使用该复合物的有效的蛋白转导。图6A是对照胚胎，图6B显示由Pep-1介导的GUS酶输送。为了进一步证明Pep-1作为CPP输送蛋白载荷的功效，用相同复合物处理小孢子，结果显示于图7。
正如以上的讨论，在透化的成熟和未成熟胚胎中检测的CPPs的转运更高。TAT-PTD显示在未成熟胚胎的胚芽区域的独特积聚，在对未成熟的胚胎进行透化处理后，TAT-PTD的摄取增加到最高水平(4.7倍)。此外，TAT-PTD是富含精氨酸的，其具有结合DNA的潜力，使其成为用于植物细胞/组织的基因输送的合适载体。
在进一步的研究中，评价了TAT-PTD-质粒DNA复合物在透化胚胎中诱导由所述质粒编码的gus基因表达的能力。结果显示于图8，其清楚的表明CPP-质粒DNA复合物可用于输送将在植物细胞中表达的基因。透化胚胎中GUS转基因的表达显著高于非透化胚胎中的表达。这明确表明细胞透化在CPP介导的载荷复合物的转运中起着重要作用。所述结果还表明复合物形成和透化不损害转移的载荷组分的生物活性。
使用Tat/Tat2-DNA复合物进一步证明本发明基因转染方法的效率。所述DNA载有除草剂抗性基因。转染小孢子，然后产生植物。图9显示可以利用本发明的方法产生转基因植物。
通过包括其他已知的转染促进剂(诸如lipofectamine)可以进一步增强植物基因转染的效率。当向用CPP-DNA复合物处理的透化细胞中添加lipofectamine时，效率被提高的更多。图10所示结果表明，通过形成Tat：DNA复合物，转染率要高于只使用lipofectamine作为转染剂时。但是，lipofectamine与CPP-DNA复合物的组合是最有效的。
尽管gus基因和蛋白报告系统已经用于证明系统的功效，但很清楚如果可以使用本发明的方法输送大分子诸如GUS并且表达复合基因产物，则也可以转导其他蛋白和转染其他基因。
本发明的方法还可用于向植物细胞转导胚胎发生相关蛋白。这引发胚胎发生，并且可以作为标记物。这还提供了向植物细胞输送蛋白的新的和通用的方法。胚胎发生相关蛋白和感兴趣基因的共输送(co-delivery)提供用于植物遗传工程的新方法。
还包括详细描述方法的变化。例如，可以将具有核或其他细胞器定位结构域的肽整合入CPP-载荷复合物。
一个或多个当前优选的实施方案已通过举例进行描述。对本领域技术人员显而易见的是：在不脱离权利要求书限定的本发明范围的情况下，可以进行大量修改和改变。
上面公开的内容泛泛的描述了本发明。我们相信本领域普通技术人员可以通过前述说明，制备和使用本发明的组合物以及实施本发明的方法。通过参照下列具体实施例可以获得更全面的理解。描述这些实施例只是为了显示本发明的优选实施方案，而不是为了限定本发明的范围。在环境可提示或提出有利下，可以预期形式的变化和等同物的取代。其他一般设置对本领域技术人员来说是显而易见的。本文涉及的文件诸如专利或专利申请通过引用并入本文。
实施例
尽管在这些实施例中使用具体术语，但这类术语只是为了描述而不是为了限制。在公开的内容和这些实施例中涉及但未明确描述的微生物学和医学方法记载于科学文献，并且是本领域技术人员公知的。
实施例1.植物细胞制备
成熟的胚胎
按照Mahalakshmi等人的描述(2000)，分离成熟胚胎(小麦(T.aestivumcv AC Superb)并进行表面灭菌。使用前将灭菌胚胎于层式通风橱中风干1小时。
未成熟的胚胎
从开花后两周(盾片(scutellum)直径1-2mm)的穗分离胚胎。用70％乙醇处理30秒，然后用10％次氯酸盐(Chlorex)和一滴Tween 20处理3分钟，对未成熟的种子进行表面灭菌。用无菌水进行4次清洗，每次1分钟。在无菌条件下人工解离胚胎。在CPP转运研究前，将分离的胚胎在室温黑暗条件下置于GEM培养基(Eudes et al，2003)上24小时。
按照Amundsen和Eudes(2005)的描述制备分离的小孢子。
实施例2.使用细胞透化剂在合子胚中转运荧光标记的细胞穿透肽
定制合成肽并在N端氨基进行荧光标记(Alberta Peptide Institute，Canada)(表1)。使用FITC-硫酸葡聚糖(4,000kDa，Sigma Aldrich)和突变的Tat作为阴性对照。
将分离并灭菌的胚胎(20-25)在总体积420μl的包含细胞透化剂甲苯/乙醇(1∶4)的透化缓冲液(15mM氯化钠，1.5mM柠檬酸钠，pH 7.1)中浸润，所述细胞透化剂与透化缓冲液的比例为1∶20。为此，向其中添加2.1μl 1mM荧光标记CPP得到5μM的终浓度。在阴性对照中，胚胎用FITC-硫酸葡聚糖或M-Tat处理。将胚胎在室温黑暗条件下于透化混合液中温育1小时，然后用透化缓冲液清洗两次。然后在室温下将胚胎用胰蛋白酶：EDTA(0.25％溶液，Sigma-Aldrich)(与透化缓冲液成1∶2比例)处理5分钟，以去除游离的肽分子。胚胎用透化缓冲液清洗两次，然后接受荧光显微镜检查或者荧光分光光度分析。
荧光显微镜检查
在经细胞穿透肽处理和酶促降解游离的胞外肽后，在荧光显微镜下观察胚胎的可见荧光(GFP滤波器；激发470nm/发射 525nm；Leica Inc.，Germany)。
在荧光显微镜下观察到，在存在透化剂(甲苯)的条件下，成熟和未成熟的胚胎中荧光标记肽的转运均显著增加(图1和表2)。包括用FITC-硫酸葡聚糖和M-Tat处理的阴性对照不显示荧光或显示非常弱的荧光(图1A-图1D)。通常，在透化和未透化条件下，未成熟胚胎的荧光强度均大于成熟胚胎(表2；图3)。在研究的3种肽中间，甚至在用细胞透化剂处理的胚胎中pVEC也显示最低的摄取。有趣地是，用TAT-PTD处理的透化未成熟胚胎在盾片中显示独特的积聚层，并且积聚集中于胚胎的胚芽区域(图1F)，而利用其他两种肽处理的透化胚胎显示荧光的均匀分布。
荧光测定分析
为了进行荧光分析，在4℃下将胚胎用500μl 1％Triton X-100(在透化缓冲液中制备)处理30分钟。在新管中收集上清，然后通过荧光计(Biorad，Versafluor，USA激发490/发射520)估算用不同CPPs处理的胚胎的相对荧光摄取。
所述荧光分析还显示，用细胞透化剂甲苯处理的胚胎中细胞穿透肽转运明显增强(图3A，图3B)。在透化和未透化的未成熟胚胎中，对于所有肽，未成熟的胚胎都显示更高水平的相对荧光摄取。特别地，未成熟胚胎中的TAT-PTD在透化胚胎中显示比未透化胚胎高4.7倍的相对荧光。运送子和pVEC转运在透化的未成熟胚胎中也增加1.8倍和1.7倍(图3B)。但是，在透化和未透化的胚胎中，所述荧光分析显示运送子比TAT-PTD的目视观察相对更高的转运。
实施例3.透化未成熟胚胎的CPP-质粒DNA复合物摄取
为了进行CPP-DNA复合物研究，使用未荧光标记的TAT-PTD制备与DNA的复合物(pAct-1GUS)。按1∶10比例混合质粒DNA和TAT-PTD(5μg DNA：50μg TAT-PTD，在优质水(optima water)中制备两者的储液)，然后利用透化缓冲液将总体积补足100μl。将所述混合物在室温下温育1小时，然后添加到浸润于透化缓冲液的胚胎中。在将复合物添加到胚胎之前，立刻添加与缓冲液成1∶20比例的透化剂(甲苯)。在存在透化剂的条件下，将胚胎与TAT-PTD和DNA复合物温育1小时，然后用透化缓冲液清洗两次。将胚胎种于包含250μg/ml头孢噻肟的GEM上，置于25℃黑暗条件下三天。
GUS组化分析
将未成熟胚胎在GUS组化缓冲液(Jefferson，1987)中于37℃温育过夜，并且添加20％甲醇以避免任何内源GUS表达。计算GUS表达的百分比：表达GUS的经处理胚胎数目/经处理胚胎的总数×100。
在细胞透化剂存在条件下，与TAT-PTD-质粒DNA复合物温育的未成熟胚胎显示瞬时GUS表达(12％；图8)，而未处理的阴性对照不显示任何GUS表达。只用TAT-PTD-DNA复合物处理但未添加透化剂的胚胎也未能显示任何GUS表达，表明透化剂在未成熟胚胎中促进TAT-PTD-DNA复合物摄取的作用。
实施例4.多种植物组织的CPP摄取
黑小麦种子用去污剂清洗，然后在湿棉花中生长一周。切除根尖、叶尖、叶基和胚芽鞘，将其与5μM荧光标记的pVEC、错配的(scrambled)pVEC和运送子温育。摄取在根尖和叶基中最高，其次是胚芽鞘和叶尖。运送子显示最强的荧光，其次是pVEC，错配的pVEC和对照(其中没有添加CPP)。
实施例5.未成熟胚胎中CPP介导的GUS酶输送
在透化缓冲液中用CPP(Tat或Tat2或R9)-GUS酶复合物(4∶1w/w)处理经甲苯透化的黑小麦未成熟胚胎1小时。对于Pep-1来说，说明书遵循Active Motif设计的用于哺乳动物细胞系中蛋白转导的Chariot试剂盒。分别按照4∶1的比例制备CPP-GUS酶复合物，然后在室温温育1小时。将处理的胚胎在室温下胰蛋白酶消化(1∶1胰蛋白酶∶透化缓冲液)五分钟，以降解过量和未内化的CPP-GUS酶复合物。用透化缓冲液清洗三次后，将胚胎在含20％甲醇的GUS组化缓冲液(Kosugi et al，1990)中于37℃温育三小时至过夜，以显示处理的未成熟胚胎中的蓝色。
实施例6.小孢子中CPP介导的GUS酶输送
在NPB-99培养基中用CPPs(Pep-1，Tat，Tat2，R9)和GUS酶复合物(4∶1)处理黑小麦小孢子1小时。按照之前实施例的描述制备CPP-GUS酶复合物。清洗两次后，室温下进行胰酶消化(与NPB-99培养基1∶1)五分钟。将小孢子在含20％甲醇的GUS组化缓冲液(Kosugi et al，1990)中于37℃温育三小时至过夜，以显示小孢子中的蓝色。阳性小孢子显示GUS主要积聚在它们的液胞中。
实施例7.洋葱表皮细胞中CPP介导的GUS酶输送
还在洋葱表皮细胞中研究了CPP R9输送功能活性GUS酶的能力。根据之前实施例的描述，按照1-4∶1的比例范围制备R9和GUS的复合物。将洋葱表皮细胞与复合物温育1小时，然后用磷酸盐缓冲液pH 7.2清洗三次。当在37℃与GUS组化缓冲液温育三小时后，用复合物处理的细胞显示蓝色的出现。4∶1比例显示最深的蓝色。
实施例8.胚胎发生小孢子中CPP介导的bar基因输送
在室温下，用CPP(Tat/Tat2)和除草剂(bar)基因编码片段(由′tap′启动子和nos终止子驱动)的复合物处理黑小麦小孢子1至2小时。按照4∶1比例的tat/tat2与DNA(w/w)制备复合物，温育1小时，然后添加5-10μglipofectamine 2000试剂。细胞用NPB-99清洗两次，然后在子房存在条件下，在含10％ Ficoll的NPB-99培养基中进一步培养以便胚胎发生(Eudesand Amundsen，2005)。
如下面表3所示，获得利用Tat/tat2 DNA复合物+Lipofectamine处理的PCR阳性愈伤组织。
表3
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实施例9.黑小麦中的PHB基因
将用于分离小孢子的黑小麦分蘖于冰箱(4℃)中保存3周，其基底位于蒸馏水中，而头部用铝箔包裹。在3周±3天后，在提取前使用醋酸胭脂红染色，来检查中位小花(median floret)的中到晚单核小孢子阶段。分离的小孢子由黑小麦携带，如Eudes和Amundsen(2005)公布的，用于获得调节至2.5×105细胞每ml NPB99培养基的纯化小孢子悬浮液。
将叶绿体或线粒体的两个转运肽与编码PHB代谢途径的酶的3个基因同框克隆。使用等摩尔量的3基因盒与相同转运肽进行共转染。将1μg总DNA(稀释于100μl无菌水)添加到稀释为100μl的4μg Tat2中，轻轻混合，导致混合物中DNA与细胞穿透肽(CPP)的比例为1∶4。复合物在室温温育30分钟后，在室温下添加5μg Lipofectamine 5分钟。然后将所述混合物添加到2ml微量离心管中不含上清的小孢子中。将小孢子与载体-载荷复合物温育15分钟，添加100μl NPB-99，然后在室温再温育45分钟。用NPB-99清洗转染的小孢子，然后离心并去除上清。向2ml微量离心管中添加1000μl NPB-99，轻轻混合，然后吸取500ml到包含3mlNPB-99+10％ Ficoll(Sigma F4375)(NPB-99-10F)和头孢噻肟的35mm培养皿中。
将直接取自植物的相似灭菌穗的4或5个子房添加到包含小孢子的各个皿中。所述皿用Parafilm密封，然后置于150mm培养皿中，围绕一个打开的包含无菌蒸馏水的50mm培养皿。然后再用Parafilm密封150mm皿，在28℃黑暗条件下温育20到30天。在小孢子、胚胎和小植株培养期间不进行选择。
针对所述3种转基因的存在，通过PCR筛选再生植株。从对所述3种感兴趣的基因PCR阳性的植株提取RNA。根据植株的这种选择产生cDNA，进行PCR以证实所述3种转基因的表达。结果显示于表4。
表4 3种PHB基因的共转染和同时表达
细胞器
转运信号
#转染实验
#绿色植物
#对3种基因PCR阳性
#对3种cDNAs PCR阳性
叶绿体
2
325
38
7
线粒体
1
21
9
1
实施例10.黑小麦小孢子中DNA-蛋白的共输送
将用于分离小孢子的黑小麦分蘖于冰箱(4℃)中保存3周，其基底位于蒸馏水中，而头部用铝箔包裹。在3周±3天后，在提取前使用醋酸胭脂红染色检查中位小花的中到晚单核小孢子阶段。分离的小孢子由黑小麦携带，如Eudes和Amundsen(2005)公布的，用于获得调节至2.5×105细胞每ml NPB99培养基的纯化小孢子悬浮液。
用PstI限制性内切酶将质粒(pAct-1GUS，～7.2kb)线性化，然后用PCR产物纯化试剂盒(QIAquick，Qiagen，USA)纯化DNA。按照7种不同的处理(T)输送GUS DNA。这些实验被重复5次。
T1)对照：对照处理是200μl无菌水。
T2)仅GUS DNA：1μg GUS DNA(Sigma Aldrich)，稀释于200μl无菌水。
T3)GUS DNA-RecA：将稀释于100μl无菌水的1μg DNA添加到稀释为100μl的4μg RecA中，轻轻混合，导致混合物中蛋白与DNA的比例为1∶4。
T4)DNA-Tat2：将稀释于100μl无菌水的1μg DNA添加到稀释为100μl的4μg Tat2中，轻轻混合，导致混合物中DNA与细胞穿透肽(CPP)的比例为1∶4。
T5)DNA-Chariot试剂盒：按照制造商的方案(Active Motif，USA)，利用chariot蛋白转导试剂盒将GUS DNA转化。将1μg GUSDNA稀释于100μl无菌水，6μl chariot稀释于100μl无菌水。向2ml微量离心管的Chariot溶液中添加GUS DNA溶液，终体积为200μl。
T6)DNA-RecA-Chariot试剂盒：按照制造商的方案，使用Chariot蛋白转导试剂盒将GUS DNA-RecA输送入小孢子。将4μg RecA稀释于50μl无菌水，1μg GUS DNA稀释于50μl无菌水。将RecA溶液添加到DNA溶液中，并温育15分钟。将6μl chariot稀释于100μl无菌水。吸取chariot溶液到2ml微量离心管的DNA-RecA溶液中，终体积为200μl。
T7)DNA-RecA-Tat2：通过Tat2将GUS DNA-RecA输送入小孢子。将4μg RecA稀释于50μl无菌水，1μg GUS DNA稀释于50μl无菌水。将RecA溶液添加到DNA溶液中，并温育15分钟。将4μg Tat2稀释于100μl无菌水。吸取Tat2溶液到2ml微量离心管的DNA-RecA溶液中，终体积为200μl。
复合物在室温温育15分钟后，在室温添加5μl Lipofectamine 5分钟。将混合物添加到只有小孢子而无上清的2ml微量离心管中。将小孢子与载体-载荷复合物温育15分钟，添加100μl NPB-99，然后在室温再温育45分钟。用NPB-99清洗转染的小孢子，然后离心并去除上清。向2ml微量离心中添加1000μl NPB-99，轻轻混合。吸取500ml到包含3ml NPB-99+10％ Ficoll(Sigma F4375)(NPB-99-10F)和头孢噻肟的35mm培养皿中。
将直接取自植物的相似灭菌穗的4或5个子房添加到包含小孢子的各个皿中。所述皿用Parafilm密封，然后置于150mm培养皿中，围绕一个打开的包含无菌蒸馏水的50mm培养皿。然后再用Parafilm密封150mm皿，在28℃黑暗条件下温育20到30天。
从培养皿中挑出大于0.5mm的胚胎，将其种于GEM培养基中(20ml于10cm培养皿；Eudes et al.2003)。用Parafilm密封培养皿，将其置于16℃室温，在输送80μMm-2s-1(16小时光照期)的Sylvania Gro-lux宽光谱灯泡(40瓦)下30cm。一旦胚胎变绿，将它们无菌转移到Magenta Vessels的50ml根培养基上，置于相同条件。一旦植物达到2-3叶期并具有足够的根生长，将植物移植到4×8 Spencer-Lemaire roottrainer(Spencer-LemaireIndustries Lte.，Edmonton)并置于与母本植物具有相同条件的生长室中。开花两周后，通过检查种子组估算倍数性。
在4～5周，对胚胎进行GUS组化分析。通过向小孢子添加200mlGUS组化缓冲液(500mM NaH2PO4，100mM EDTA，0.3M甘露醇，2mMX-gluc，pH 7.0)，然后在37℃黑暗条件下温育过夜，来进行分析。去除染色液，然后用PBS清洗胚胎。显示蓝色的小孢子表明通过CPPs外源导入的GUS酶的活性。使用立体显微镜计算每次处理中的蓝色胚胎百分比。
在转染后2个月，观察胚胎中Tat2和Chariot的独特转运(表5)。在阴性对照和未经处理的小孢子中观察不到GUS。用Tat2和Chariot处理时显示GUS的胚胎的最高数目分别是25.8％和26.4％(表5)。蓝色胚胎的第二最高频率是用DNA-RecA-Chariot和DNA-RecA-Tat2处理时观察到的。利用lipofectamine，DNA和DNA-RecA处理能够以较低频率转染入小孢子。这些研究证明，不同的DNA和蛋白复合物在黑小麦小孢子中内化。
表5.转染后2个月，通过7种不同的基因转化处理产生的GUS表达胚胎的总数。T1)对照，未经处理的胚胎；T2)DNA；T3)DNA-RecA；T4)DNA-Tat2；T5)DNA-Chariot；T6)DNA-RecA-Chariot；T7)DNA-RecA-Tat2。
实验1
实验2
实验3
实验4
实验5
平均值±SD
|
T1
0
1
1
0
1
0.6±0.5
T2
16
16
17
9
17
15±3.4
T3
21
11
15
17
6
14±5.7
T4
31
23
29
26
20
25.8±4.4
T5
32
25
26
27
22
26.4±3.6
T6
14
16
15
17
23
17±3.5
T7
18
15
18
12
22
17±3.7
实施例11：DNaseI保护分析和阻滞分析
按照实施例10关于DNA(T2)和DNA-RecA(T3)将DNA和CPP复合物输送入黑小麦小孢子的描述，制备CPPs-GUS DNA复合物。按照关于DNA(T2)和DNA-RecA(T3)将DNA和CPP复合物输送入黑小麦小孢子(但不用Lipofectamine)的描述，进行DNaseI保护分析。在温育肽-DNA 20分钟后，立即将4μl DNaseI(RNase-Free DNase set，Qiagen，USA)添加至混合物体积(200μl)，在室温温育15分钟，然后在冰上温育5分钟。利用DNA纯化试剂盒(QIAquick PCR纯化试剂盒)进行肽-质粒解离和质粒纯化。
DNaseI保护分析显示，含Lipofectamine的DNA，DNA-RecA，DNA-Tat2，DNA-Chariot，DNA-RecA-Chariot，和DNA-RecA-Tat2可观地得到保护，因为对应于DNA的条带(7.2kb)是清晰可见的，而不含Lipofectamine的DNA和DNA-RecA复合物在用核酸酶处理时导致DNA的降解(图11A)。
按照关于将DNA和CPP复合物输送入黑小麦小孢子的描述，制备RecA-GUS DNA复合物。将1μl GUS DNA与不同浓度的RecA蛋白混合，得到1∶0，1∶4，1∶8，1∶12，1∶16，1∶20和1∶24的比例。在不含Lipofectamine的条件下温育20分钟后，将20μl复合物应用于1％琼脂糖凝胶。
DNA-RecA复合物的凝胶阻滞分析显示，在GUS DNA的1∶8以及更高比例观察到模糊的荧光，表明高浓度RecA对线性质粒DNA迁移率降低的影响(图11B)。RecA以1∶8以及更高比例结合dsDNA。
图11A显示CPP-DNA复合物形成。(A)对CPPs和DNA组合的不同处理进行DNaseI保护分析。T1)对照，T2)DNA，和T3)DNA-RecA不含Lipofectamine；T4)DNA，T5)DNA-RecA，T6)DNA-Tat2，T7)DNA-Chariot，T8)DNA-RecA-Chariot，和T9)DNA-RecA-Tat2含Lipofectamine。图11B显示各种浓度的DNA和RecA的影响。
实施例12.转染小麦小孢子的发夹环基因构建体
使用发夹环技术，将TaAOS基因(AY196004)用于沉默小麦中的茉莉酸(JA)途径。选择27mer序列ggccatccgcgaccgcctcgacttcta作为正义链。在肌动蛋白启动子和NOS终止子之间克隆的完整基因序列是
TCTCGGCCATCCGCGACCGCCTCGACTTCTACTTCCTGTCATAGAAGTCGAGGCGGTCGCGGATGGCCCT。
将稀释于100μl无菌水的1μg总DNA添加到稀释为100μl的4μg Tat2中，轻轻混合，导致混合物中DNA与细胞穿透肽(CPP)的比例为1∶4。复合物在室温温育30分钟后，在室温添加5μl Lipofectamine 5分钟。将混合物添加到只有小孢子而不含上清的2ml微量离心管中。
按照之前实施例的描述，收集来自小麦栽培种Fielder的小孢子，将其与载体-载荷复合物温育15分钟。添加100μl NPB-99，然后将混合物在室温再温育45分钟。用NPB-99清洗转染的小孢子，离心并去除上清。将1000μl NPB-99添加到2ml微量离心管中，轻轻混合。吸取500ml到包含3mlNPB-99+10％ Ficoll(Sigma F4375)(NPB-99-10F)和头孢噻肟的35mm培养皿中。按照之前实施例的描述培养小孢子和胚胎。
通过培养小孢子的两种提取物，产生总共90棵小植株。在适应土壤的第一天，55棵植株死亡。暴露于土壤和空气污染物即出现的、小植株的这种不正常的高死亡率与JA表达沉默有关。针对所述转基因的存在，通过PCR筛选再生植株(35)。这些植株中的3棵对所述转基因是PCR阳性的。