一种增加 CD4+CD25+Foxp3+ 调节性 T 细胞的抗原及其应用 技术领域 本 发 明 属 于 免 疫 学 领 域， 具 体 涉 及 一 种 增 加 CD4+CD25+Foxp3+ 调 节 性 T 细 胞 (Tregs) 的 血 吸 虫 来 源 的 抗 原 分 子 - 日 本 血 吸 虫 热 休 克 蛋 白 60KDa(Schistosoma japonicum heatshock protein 60KDa， SjHSP60) 及其应用。
背景技术
上个世纪九十年代前后， 西方发达国家提出来 “卫生假说” ， 认为在卫生环境大大 改善的发达国家， 一些过敏性疾病和自身免疫病的发病率大为增加， 这是与发达国家卫生 条件改善， 人群发生病原体感染的机会减少有关 (Wills-Karp， et al， Nat Rev Immunol， 2001， 1： 69-75)。 其后的若干年， 科学家们通过一些过敏性疾病和自身免疫病的动物模型研 究证明， 一些病原体的慢性感染确实可以预防这些免疫性疾病的发生或者减轻免疫病理损 伤 (Dunne， Nat Rev Immunol， 2005， 5： 420-426) ： 如曼氏血吸虫感染可以预防或减轻 I 型糖 尿病， 实验性脑炎， 甲状腺炎 ； 绦虫感染会减少实验性结肠炎的发病 ； 链球菌感染可以抑制 胶原诱导型关节炎的发生发展， 等等。 从进化史的角度看， 慢性感染是病原体和宿主在长期 共同进化彼此选择后， 最终所形成的对双方都有利的一种平衡状态。 在这种状态下， 病原体 不会被宿主完全清除， 可长期存在于宿主 ； 宿主既可维持对病原体有一定抵抗力， 也不会因 为过强的免疫反应而产生免疫病理损伤， 而且还预防了自身免疫病的发生。
随着免疫学的发展， 在免疫系统中发现了一群天然存在的 CD4+CD25+ 调节性 T 细 胞 (Tregs)(Sakaguchi， et al.， J Immunol， 1995， 155 ： 1151-64)， 这群细胞主要由胸腺产 生， 参与维持外周自身免疫耐受和免疫内环境稳定 ； 后来进一步发现， 一些病原体的感染 + ( 病毒， 细菌， 寄生虫 ) 也可以在外周从 CD4+T 细胞中诱导产生 CD4 CD25+Tregs(Bluestone and Abbas， Nat Rev Immunol， 2003， 3： 253-7)。如丙型肝炎病毒 (HCV) 感染人体后， 可以 + + 诱导特异性的 CD4 CD25 Tregs(Bolacchi， et al.， Clin Exp Immunol， 2006， 144 ： 188-96) ； + + 小鼠百日咳杆菌感染模型中研究发现， CD4 CD25 Tregs 发生增多 (McGuirk， et al.， J Exp Med， 2002， 195 ： 221-31) ； 寄生虫类感染中， 曼氏血吸虫感染后 4 周， 发现肠系膜淋巴结中 + + CD4 CD25 Tregs 发生了扩增， 然后聚集到肝脏和脾脏中发挥免疫抑制效应 (Wilson et al， . unpublished observaton)。进一步探究导致慢性感染的病原体是如何诱导调节性 T 细 胞， 从而抑制免疫攻击， 对于提高宿主抗感染力和治疗免疫病意义都非常重大。寄生虫中 的蠕虫类， 是一类具有复杂生物学功能的多细胞真核生物， 能够很好的逃避宿主免疫攻击， 长期存在于宿主机体中 (Maizels， et al.， J ExpMed， 2009， 206 ： 2059-66)。蠕虫类中血 吸虫感染是一种非常典型的慢性感染， 在其感染模型中研究发现， 其虫卵抗原是刺激诱导 + + et al.， JImmunol， 2006， 176 ： 5374-87) ； 此外， CD4 CD25 Tregs 产生的关键因素 (Baumgart， + + 本课题组也已发现， 日本血吸虫虫卵抗原也可以刺激诱导 CD4 CD25 Tregs 从而减轻哮喘所 导致的气道炎症反应 (Yang， et al.， Immunology， 2006， 120 ： 8-18)。
关于特异性抗原在外周诱导免疫负调控的研究， 在自身免疫研究领域已有一些报 道， 有些自身抗原的自身反应性在逃避了胸腺中枢的阴性选择后， 它们还可以在外周诱导自身反应性调节性 T 细胞， 从而参与免疫调控。这些自身抗原包括 ： 一些组织抗原 ( 谷氨酸 脱羧酶 GAD， 少突胶质细胞蛋白 MOG， 肌球蛋白等 ) ； 免疫调控分子 ( 泛素， 白介素， 肌动蛋白 等)； 应激蛋白 (HSP40， HSP60， HSP70)(Merbl， et al.， J Clin Invest， 2007， 117 ： 712-8)。 实际上， 免疫系统天然就存在这些抗原的抗体或反应性 T 细胞， 或其特定的受体 ( 配体 )， 它们会时刻监视着机体免疫系统， 维持免疫内环境稳定 (Cohen， Nat Rev Immunol， 2007， 7： 569-74)。早些年就有研究发现， 人自身 HSP60 或其多肽可预防或减轻 I 型糖尿病 (Elias and Cohen， Diabetes， 1996， 45 ： 1168-72)， 且于两年前已经开始应用于临床 III 期实验 (Eldor， et al.， DiabetesMetab Res Rev， 2009， 25 ： 316-20) ； 通过大鼠佐剂性关节炎模型 研究发现， 鼠自身 HSP60 也可减轻关节炎症病理反应 (Durai， et al.， J Autoimmun， 2009， 33 ： 208-13)。而且非常特别的是， HSP60 属于进化上最为保守的分子家族 - 热休克蛋白家 族， 在所有真核和原核生物中高度同源。因此， 病原体很可能会利用这个分子去模拟宿主 HSP60 的作用， 诱导免疫调控， 抑制宿主免疫攻击， 维持慢性感染。 如果能够鉴定和验证出这 些病原体来源的 “模拟分子” ， 不仅可以找到打破慢性感染的靶标， 还可应用于预防或治疗 免疫性疾病。
对于过敏性疾病和自身免疫病的治疗， 临床上很长时间以来一直在用一些直接抑 制免疫应答行为的化学药物， 如激素类， 或者联合应用硫唑嘌呤 ( 抗胸腺球蛋白类药物 )， 环孢素 A 等 (Bougneres， et al.， Diabetes， 1990， 39 ： 1264-72)。但是其中有些药物不仅 价格比较贵， 会让患者产生难以忍受的副作用， 而且一旦停止用药， 自身免疫反应会立即反 弹， 疾病会卷土重来。 而廉价的纯化蛋白分子， 不仅安全没有毒副作用， 更重要的是， 它是通 过免疫学途径去启动其自身的调控机制， 从根本上解决了问题 ； 相比较于同类的短肽疫苗， 氨基酸序列较长而不易被降解， 且具有多个表位， 可以联合发挥作用， 更易被机体免疫系统 所识别 ； 此外， 蛋白分子的制备， 一般都是通过生物表达系统 ( 原核或真核表达系统 )， 而不 是生物合成， 这有助于形成蛋白质的高级空间结构， 能更有效地形成免疫学表位。
已公开的日本血吸虫热休克蛋白 60KDa(Schistosoma japonicum heat shock protein60KDa， SjHSP60) 基因在 Genebank 中序列号为 AY813151。
总之， 利用慢性感染中病原体来源的抗原， 寻找诱导调节性 T 细胞的特异分子， 不 仅有利于鉴定出导致慢性感染主要因素， 从而可以针对性地提高宿主抗感染力， 而且在进 一步研究应用于治疗过敏性疾病或自身免疫病方面具有更广阔的前景。 发明内容
本发明旨在提供一种增加 CD4+CD25+Foxp3+ 调节性 T 细胞的蛋白。
本发明所说的增加 CD4+CD25+Foxp3+ 调节性 T 细胞的蛋白， 是日本血吸虫热休克蛋 白 60KDa(SjHSP60)， 其全长氨基酸序列 SEQ.ID.NO.1 所示， 由 572 个氨基酸构成。 + + +
本发明所说的增加 CD4 CD25 Foxp3 调节性 T 细胞的蛋白， 还包括缺失了一段多肽 的 SjHSP60， 即 SjHSP60(D)， SjHSP60(D) 的序列如 SEQ.ID.NO.3 所示， 由 548 个氨基酸组成。
本 发 明 SEQ.ID.NO.1 所 示 的 蛋 白 与 Genebank 中 SjHSP60 基 因 ( 序 列 号 为 ： AY813151) 的 蛋 白 质 序 列 并 不 完 全 相 同 ( 一 致 性 为 87 ％ )。 但 是 SEQ.ID.NO.1 分 别 与 其 它 种 属 同 源 蛋 白 中 曼 氏 血 吸 虫 HSP60(SmHSP60， Genebank 号 ： AF310263) 和 人 类 HSP60(HomoHSP60， Genebank 号 ： BC003030) 的 一 致 性 更 高， 分 别 为 92 ％ 和 72 ％， 而AY813151 的蛋白质序列与 SmHSP60 和 HomoHSP60 的一致性分别为 81％和 65％。这是单克 隆测序与大规模测序的差异所在， 本发明是经过 “Primer walking” 测序拼接后翻译出来的 序列， 所以更精确。
本发明所说的蛋白 SjHSP60， 主要通过以下两个途径增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs， 从而增强机体免疫抑制力 ：
1. 上述所说蛋白诱导 CD4+CD25-T 细胞转化为 CD4+CD25+Foxp3+Tregs ；
2. 上述所说蛋白直接使 CD4+CD25+Tregs 发生扩增 ；
本发明公开了 SjHSP60 和 SjHSP60(D) 作为增强 CD4+CD25+Foxp3+ 调节性 T 细胞抑 制效应的免疫抑制剂的应用。
本发明公开了 SjHSP60 和 SjHSP60(D) 在制备治疗免疫反应引起的炎症性疾病药 物中的应用。特别是在制备防治关节炎所致的炎性症状和免疫病理药物中的应用。
本发明所说的 SjHSP60 和 SjHSP60(D) 蛋白使扩增后的 CD4+CD25+Tregs 的免疫抑 制力增强。
本发明所说的蛋白应用于实验性炎症动物模型中有抑制炎性症状和免疫病理反 应的作用， 在治疗免疫性疾病方面具有比较广阔的应用前景。 附图说明
图 1SjHSP60 序列同源性比对分析， 天然表达分析。 A SjHSP60 的全长氨基酸序列， 与宿主 ( 人， 小鼠 ) 的 HSP60 进行序列比对 ； B SjHSP60 在虫体中的天然表达情况 ； 表 1SjHSP60 与宿主 ( 人， 小鼠 ) 自身 HSP60 的交叉性 T 细胞表位分析。 + 图 2SjHSP60 增加 CD4 CD25+Foxp3+Tregs。 A 用 SjHSP60 体内免疫小鼠， 小鼠脾和淋巴结中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例显著增加； B 用 SjHSP60 体内免疫小鼠， 检测小鼠脾和淋巴结中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例的 流式细胞术检测图 ；
C 用 SjHSP60 体外处理小鼠脾和淋巴结细胞， CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例均发生增 加；
D 用 SjHSP60 体外处理小鼠脾和淋巴结细胞， 检测 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例的流 式细胞术检测图 ；
图 3SjHSP60 减轻 CIA( 胶原性关节炎 ) 小鼠炎性症状和病理损伤。
A SjHSP60 体内免疫可减轻 CIA 小鼠关节炎性症状 ；
B SjHSP60 体内免疫可减轻 CIA 小鼠踝关节肿胀度 ；
C SjHSP60 体内免疫可减轻 CIA 小鼠关节周围软组织肿胀和骨关节损害 ；
D SjHSP60 体内免疫可减轻 CIA 小鼠关节及其周围软组织的炎症病理反应 ；
图 4SjHSP60 增 加 CIA 小 鼠 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比 例，抑 制 炎 症 抗 原 (CollagenII， CII) 的特异性体液和细胞免疫应答。
A SjHSP60 体内免疫 CIA 小鼠， 小鼠脾和淋巴结中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例显著 增加 ；
B SjHSP60 体内免疫 CIA 小鼠， 检测小鼠脾和淋巴结中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例 的流式细胞术检测图 ；
C SjHSP60 体内免疫后， CIA 小鼠体内针对炎症抗原 C II 的特异性体液免疫应答 水平明显降低 ；
D SjHSP60 体内免疫后， CIA 小鼠体内针对炎症抗原 CII 的特异性细胞免疫应答水 平明显降低 ：
图 5HSP60 增 加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可 通 过 诱 导 CD4+CD25-T 转 化 为 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。
A 用 SjHSP60 处理小鼠 CD4+T， CD4+CD25-T 细胞， SjHSP60 诱导 CD4+CD25-T 转化为 CD4+CD25+Foxp3+Tregs ；
B 用 SjHSP60 处理小鼠 CD4+T， CD4+CD25-T 细胞， SjHSP60 诱导 CD4+CD25-T 转化为 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的流式细胞术检测图 ；
图 6SjHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通过直接扩增 CD4+CD25+Tregs， 且扩增 + + 后的 CD4 CD25 Tregs 免疫抑制力更强。
A SjHSP60 直接扩增 CD4+CD25+Tregs ； B 扩增后的 CD4+CD25+Tregs 具有更强的免疫抑制力 ；
图7： SjHSP60(D) 仍可显著增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。
A SjHSP60 的蛋白质空间结构和表面功能残基 ( 蛋白质 - 蛋白质作用位点 ) 的预 测和分析 ；
B 通过两次 PCR 得到了接头部分重叠且缺失了 SJMHE1 的两个 PCR 产物 ；
C 通过第三次 PCR 得到了缺失 SJMHE1 的 SjHSP60(D) ；
D 用 SjHSP60(D) 体内免疫小鼠， 小鼠脾和淋巴结中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例显 著增加 ；
E 用 SjHSP60(D) 体内免疫小鼠， 检测小鼠脾和淋巴结中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比 例的流式细胞术检测图 ；
F 用 SjHSP60(D) 体外处理小鼠脾和淋巴结细胞， CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例显著 增加 ；
G 用 SjHSP60(D) 体外处理小鼠脾和淋巴结细胞， 检测 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例 的流式细胞术检测图 ；
图8： 去除 SjHSP60 全长序列中一段多肽 ( 第 435 到第 458 个氨基酸， SJMHE1) 的 引物设计法和三步 PCR 示意图。
具体实施方式 ：
在本发明中所使用的术语， 除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例， 并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解为 ： 这些实施例只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、 商品名以及有必要列出其组成成分者， 均在首次出现时标明， 其后所用相同试剂如无特殊说明， 均与首次标明的内容相同。
本发明实施例中所提及的表达载体 pGEX-6p-1 可从 GE Healthcare 公司购买 ( 货 号： 28-9546-48)。
日本血吸虫总 cDNA 的获取 ： 日本血吸虫感染性钉螺 ( 阳性钉螺 ) 购自江苏省血吸 虫病防治研究所。感染性钉螺可以释放出具有感染性的尾蚴 ( 日本血吸虫发育阶段之一， 此阶段具有感染性 ) 从而用来攻击感染实验性小鼠。然后尾蚴在小鼠体内可以继续发育为 童虫， 最终发育为日本血吸虫成虫， 寄居在小鼠的门静脉系统。剖杀小鼠后， 可以通过灌注 小鼠门静脉系统取出成虫， 从而可以用来抽提日本血吸虫总 RNA， 最后再逆转录成日本血吸 虫总 cDNA。
实施例一 ： SjHSP60 同源性的序列比对分析， 交叉性表位分析， 及其天然表达的检 测。
1、 根据 Genebank 中 SjHSP60 基因 ( 序列号为 ： AY813151) 全长 cDNA 序列， 先行 设计引物 ： 上游引物为 5’ -cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgag-3’ ( 含 BamHI 酶切位点及 起始密码字 ATG)， 下游引物为 5’ -ccgctcgagattaagagcaggcagtgtttac-3’ ( 含 XholI 酶 切位点及终止密码子 TAA)， 由上海英潍捷基贸易有限公司 (Invitrogen) 合成 ； 通过 PCR 方法从日本血吸虫总 cDNA 中扩增 SjHSP60ORF 全长序列， 送生物技术公司 ( 上海英潍捷基 贸易有限公司， Invitrogen) 测序， 并回收 PCR 产物 ； 测序结果如 SEQ.ID.NO.2 所示， 再通 过在线生物学工具 Biology WorkBench(http://workbench.sdsc.edu/) 将其翻译成氨基 酸序列 ； 并与人和小鼠的 HSP60(Genebank 中基因序列号分别为 ： 人 HSP60-BC003030， 小鼠 HSP60-NM010477) 进行序列比对。 SjHSP60 开放阅读框 ORF 的全长序列， 如 SEQ.ID.NO.2 所示， 共 1719bp。
SjHSP60 开放阅读框 ORF 的全长序列翻译后的氨基酸序列为如 SEQ.ID.NO.1 所示， 共 572 个氨基酸。
2、 综合应用在线表位预测软件 ： IEDB(http://tools.immuneepitope.org/main/ index.html)， SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/home.htm) 分 析 SjHSP60 分 别 与 人 HSP60， 小鼠 HSP60 的交叉性 T 细胞表位。
3、 用 BamHI(NEB， #R3136V) 和 XholI(NEB， #R0146V) 将质粒 pGEX-6P-1 和此上 (1) 中回收的 PCR 产物进行双酶切 ； 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定后， 再分别割胶 回收质粒和 PCR 片断的双酶切产物 ； 通过 T4DNA 连接酶 (NEB， #M0202S) 进行载体和 PCR 产 物的连接， 构建重组表达载体 pGEX-SjHSP60 ； 转化 E.coli BL21 感受态细胞， 37 ℃培养过 夜后， 挑取单克隆菌落， 接种于含 Amp 的 LB 培养液中， 37℃振摇培养过夜后， 抽提质粒后行 双酶切鉴定， 进一步送测序公司鉴定。鉴定成功后， 将菌液进行 1 ∶ 100 扩大培养， 至 OD 值达 0.6-0.8 时， 加入 IPTG 使其终浓度为 0.05mmol/L， 37 ℃诱导表达 5h ； 收集菌液， 4℃ 高速离心 20min， 用 1×PBS 重悬细菌沉淀 ； 通过超声破碎仪和反复冻融法裂菌 ； 再次 4 ℃ 高速离心 20min， 分别取上清和沉淀， 以及未裂解的总蛋白进行 SDS-PAGE 电泳分析蛋白的 表达量及分布情况 ； 鉴定为可溶性表达后， 通过融合蛋白 GST 亲和层析法， 用 Glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare， 17-0751-01) 进行融合蛋白 GST-SjHSP60 的纯化 ； 并用蛋白 TM 酶 PreScission Protease(GE Healthcare， 270843) 对融合蛋白进行酶切， 最后得到纯化的 SjHSP60 ； 经过 SDS-PAGE 电泳分析纯化结果， 纯度＞ 95％。纯化的 SjHSP60 交由上海中科
院英沐生物科技有限公司制备抗 SjHSP60 的单克隆抗体 (anti-SjHSP60mAb)。制备可溶性 的成虫 (SWA) 和虫卵抗原 (SEA)， 通过 Weatern Blot 实验检测 anti-SjHSP60mAb 的特异性 和抗体效价 ； 验证成功后， 再用 anti-SjHSP60mAb， 通过免疫组织化学方法， 检测日本血吸 虫成虫 ( 雌虫和雄虫 ) 和虫卵中 SjHSP60 的天然表达和分布情况。
结果如图 1 和表 1 所示， SjHSP60 与人、 小鼠 HSP60 序列上具有高度的同源性， 序 列的一致性分别达到 72％和 70％； 通过 T 细胞表位预测后， 发现 SjHSP60， 与人 HSP60， 与小 鼠 HSP60， 均具有一系列相同或高度相似的 MHCI 和 MHCII 类交叉性 T 细胞表位。
表1
实施例二 ： SjHSP60 体内免疫小鼠或体外刺激小鼠淋巴细胞， 观察 SjHSP60 对 + CD4 CD25 Foxp3 Tregs 的影响。
1. 将实施例一 (3) 中纯化的 SjHSP60， 滤菌并通过 Polymyxin B-Agarose(Sigma， P1411) 去除其中的类毒素及其相关分子， 然后再通过 Limulus amebocyte lysate(LAL) 检 测试剂盒 E-TOXATE Kits(Sigma， ET0200)， 验证纯化蛋白的内毒素去除效果， ＜ 0.001FU/ ml(0.1pg/ml)， 最后用 DC Protein Assay(BIA-RAD， 500-0111) 进行蛋白定量。将 SjHSP60 与不完全弗氏佐剂 IFA(Sigma， F5501) 等体积混合， 使 SjHSP60 浓度为 250ug/ml， 反复涡悬 振荡混匀。对 BALB/c 小鼠 (SPF 级， 6-8 周龄， 雌性， 购自上海斯莱克实验动物有限责任公 司 ) 进行腹股沟皮下免疫， 剂量为 25ug/100ul/ 只， 首次免疫后， 隔两周再同样免疫一次， 设 PBS 免疫组为对照组。整个过程小鼠饲养于 SPF 级动物房 ( 南京医科大学实验动物中 心 )。末次免疫结束后一周， 剖杀小鼠， 分离各组小鼠的脾和淋巴结， 研磨过滤后， 制备成单 细胞悬液 ； 再经红细胞裂解液去除红细胞， 制备成单淋巴细胞悬液 ； 进行细胞计数后， 对各 6 组每只小鼠取 1×10 个细胞， 按 MouseRegulatory T Cell Staining Kit(eBioscience， 88-8111-40) 操作说明书进行淋巴细胞的染色标记， 再经流式细胞仪 FACSCalibur 检测 + + + CD4 CD25 Foxp3 Tregs 比例。
2. 分离正常 BALB/c 小鼠的脾和淋巴结， 按此上 (1) 中方法， 制备成单淋巴细胞悬
+ +液； 细胞计数后， 分别转移至 96 孔圆底培养板， 5×105 个细胞 / 孔 ； 再分三组进行刺激， 分 别是 SjHSP60 组 (0.1ug/ml)/PBS 组 / 无刺激 (Medium) 组， 每组设 4 孔 ； 在 37℃， 5％ CO2 细 6 胞孵箱培养 3 天后， 收集各组细胞并进行计数， 每组取 1×10 个细胞， 同此上 (1) 中方法检 + + + 测 CD4 CD25 Foxp3 Tregs 比例。
结果如图 2 所示， 体内外实验均证明， SjHSP60 可以增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比 例。
实施例三 ： 探究 SjHSP60 能否在炎症模型中发挥抑制炎症及免疫病理反应的作 用。
1. 按 实 施 例 二 (1) 中 方 法， 分两组： SjHSP60 组 /PBS 组， 体 内 免 疫 DBA1 小 鼠 ( 南 京 大 学 国 家 遗 传 工 程 小 鼠 资 源 库， 6-8 周 龄， 雌 性 )。 建 立 胶 原 诱 导 型 关 节 炎 (CIA) 小 鼠 模 型 ： 混 合 牛 源 II 型 胶 原 (CII)Bovine Collagen Type II(BD， 354257) 和 Mycobacteriumtuberculosis H37RA(Difco， 3114)， 用 1×PBS 稀 释， 使两者浓度分别为 2mg/ml， 3mg/ml ； 在混合体系中再加入等体积的不完全弗氏佐剂 CFA， 涡悬振荡仪上混匀 2min， 反复 6-8 次， 每隔 30min 一次 ； 于首次免疫 SjHSP60/PBS 后一周， 在两组小鼠尾部皮 下免疫混合抗原诱导 CIA， 100ul/ 只。诱导后一周， 对两组小鼠再分别免疫 SjHSP60/PBS 一 次。诱导后 4 周， 开始动态观察两组小鼠关节炎症表现， 隔天一次 ； 按如下标准进行炎性症 状严重程度评分 ：
0分： 正常， 无症状 ；
1分： 红斑， 只有踝关节轻微肿胀 ；
2分： 红斑， 从踝关节到跖骨、 掌指关节轻微肿胀 ；
3分： 红斑， 从踝关节到掌指关节中度肿胀 ；
4分： 红斑， 从踝关节到指尖严重肿胀 ；
每侧肢体最高分为 4 分， 最低分为 0 分 ； 每只小鼠总得分最高为 16 分， 最低为 0 分。
2. 与此上 (1) 中观察时间点同步， 使用电子数显游标卡尺 ( 购自温州三和量具仪 器有限公司 ) 测量各组小鼠左后肢踝关节直径。
3. 诱导后 7 周剖杀各组小鼠， 取各组小鼠前爪固定于含 10％福尔马林的 1×PBS 中， 送标本至上海瑞金医院伤骨科研究所进行 X 光检测。
4.X 光检测后， 将标本继续固定于含 10％福尔马林的 1×PBS 中， 交由江苏省人民 医院病理科进行标本脱钙、 石蜡包埋、 切片及病理 HE 染色 ； 显微镜下观察 HE 病理结果。
结果如图 3 所示， SjHSP60 免疫组的 CIA 小鼠， 其关节的炎性症状， 关节肿胀度， 关 节损害程度以及病理炎症反应都显著减轻。
实验例四 ： 观察 SjHSP60 能否增加 CIA 小鼠 CD4+CD25+Foxp3+Tregs， 从而发挥免疫 抑制作用。
1. 分离 CIA 诱导后 3W 和 7W 各组 (HSP60 组 /PBS 组 ) 小鼠脾和淋巴结， 按实施例 + + + 二 (1) 中方法， 检测各组小鼠 CD4 CD25 Foxp3 Tregs 比例。
2. 在剖杀此上 (1) 中各组小鼠前， 对各组小鼠采血， 并分离出血清 ； 再经 ELISA 检测各组血清中 CII 特异性抗体 (IgG， IgG2a， IgG1)， 具体操作是 ： 用高亲和力酶标板预 包被 CII， 5ug/ml， 4 ℃包被过夜 ； 弃去包被液， PBS-T 洗板 2-3 遍 ； 5 ％脱脂牛奶进行封闭， 200ul/ 孔， 37℃孵育 2 小时 ； 弃去封闭液， PBS-T 洗板 2-3 遍 ； 1 ∶ 20 稀释各组血清后， 加入酶标板， 100ul/ 孔， 4℃孵育过夜 ； 弃去血清， PBS-T 洗板 3-4 遍 ； 加入稀释后的二抗 ： HRP anti-mouse IgG(Boster， BA1050)1 ∶ 10000 稀 释， HRP anti-mouse IgG2a(BD， 553391) 和 HRP anti-mouse IgG1(BD， 559626) 均 1 ∶ 1000 稀释， 100ul/ 孔， 37 ℃孵育 1 小时 ； 弃 去二抗， PBS-T 洗板 4-5 遍 ； 加入 TMB 显色液 (eBioscience， 00-4201-56)， 室温避光放置 10-15min 后， 加入 2N H2SO4 终止反应， 100ul/ 孔 ； 最后在酶标仪上进行读值。
3. 取此上 (1) 中分离后得到的各组每只小鼠的淋巴细胞， 分别转移至 96 孔圆底 5 细胞培养板， 4×10 个 / 孔， 每只小鼠设 9 个孔， 再各分为三组处理 ： Medium 组 ( 不刺激 )/ ConA 刺激组 (2ug/ml)/CII 刺激组 (5ug/ml)， 3孔/组 ； 按实施例四 (5) 中方法， 通过 3H 掺入 3 法检测各组淋巴细胞增殖情况 ： 培养至 56 小时， 加入氚胸腺嘧啶 (3H-thymidine， H-TDR)， 0.5μCi/ 孔 ； 继续培养 16 小时 ( 总计培养 3 天 ) 后， 经 Beckman 液体闪烁计数仪检测细胞 3 的 H-TDR 掺入情况， 从而反映出 CII 特异性的细胞免疫应答水平。
结果如图 4 所示， SjHSP60 使 CIA 模型小鼠体内 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例显著增 加； 进一步的实验也证明， 针对 C II 特异性的体液和细胞免疫应答都有明显的抑制。
实施例五 ： SjHSP60 体外分别刺激小鼠 CD4+T 细胞， CD4+CD25-T 细胞， 进一步观察 + + + SjHSP60 如何增加 CD4 CD25 Foxp3 Tregs。 分 离 正 常 BALB/c 小 鼠 脾 和 淋 巴 结， 制备成单淋巴细胞悬液 ； 用 试 剂 盒 CD4+T cellIsolation Kit(MACS， 130-090-860) 分选出 CD4+T 细胞 ； 剩余的 CD4- 淋巴细胞经 50ug/ ml 丝裂霉素， 37℃， 5％ CO2 处理 30min 后， 作为抗原递呈细胞 (APC) 使用。再取部分 CD4+T 细胞， 进一步再用 CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit(MACS， 130-091-041) 去除 + + + CD4 CD25 Tregs， 从而分离出 CD4 CD25 T 细胞。具体分选步骤均参照产品说明书。通过流 式细胞术检测 CD4+T 细胞和 CD4+CD25-T 细胞纯度， 纯度分别＞ 90％和＞ 95％。将两种细胞 5 分别转移 96 孔圆底培养板， 2×10 个细胞 / 孔， 再加入 APC， 2×105 个 / 孔 ； CD4+T 细胞和 CD4+CD25-T 细胞再各自分两组处理， 刺激组 (SjHSP60， 0.1ug/ml)/ 不处理组 (Medium) ； 在 6 37℃， 5％ CO2 细胞孵箱培养 3 天后， 收集各组细胞并计数 ； 每组取 1×10 个细胞， 流式细胞 + + + 术检测 CD4 CD25 Foxp3 Tregs 比例。此实例中相关具体方法可参考实施例二 (1)。
结果如图 5 所示， SjHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通过诱导 CD4+CD25-T 细 胞转化而来。
实施例六： 观 察 SjHSP60 增 加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 是 否 可 通 过 直 接 扩 增 CD4+CD25+Tregs， 扩增后的 CD4+CD25+Tregs 免疫抑制力如何。
1. 按 实 施 例 二 (2) 中 方 法 分 离 正 常 BALB/c 小 鼠 的 脾 和 淋 巴 结， 制备成单淋 + + 巴细胞悬液 ； 用 CD4 CD25 Regulatory T Cell Isolation Kit 按照说明书步骤分选出 + + CD4 CD25 Tregs。参照实施例五中方法， 流式细胞术检测 CD4+CD25+Tregs 的细胞纯度， 纯度 + + 5 ＞ 95 ％。转移 CD4 CD25 Tregs 至 96 孔圆底细胞培养板， 2×10 个细胞 / 孔 ； 再分三组处 理： anti-CD3(BD， 553057) 刺激组 (1ug/ml)/SjHSP60 刺激组 (0.5ug/ml)/SjHSP60(0.5ug/ ml)+anti-CD3(1ug/ml) 刺激组， 均为 5 孔 / 组。按实施例四 (3) 中方法， 通过 3H 掺入法检 测各组 CD4+CD25+Tregs 的增殖情况。
2. 按此上 (1) 中具体方法分选并刺激处理 CD4+CD25+Tregs， 培养 3 天后， 收集并计 5 数； 转移至 96 孔圆底细胞培养板， 1×10 个 / 孔， 4 孔 / 组。再按实施例五中方法分选正常 + BALB/C 小鼠 CD4 细胞 ( 作为 APC 使用 ) 和 CD4 CD25-T 细胞， 分别加入每孔 CD4+CD25+Tregs，
1×105 个 / 孔。 共 培 养 3 天 后， 同 样 按 实 施 例 四 (3) 中 方 法， 通 过 3H 掺 入 法 检 测 各 组 CD4+CD25-T 细胞的增殖情况， 进而反映各组 CD4+CD25+Tregs 的抑制力。
结 果 如 图 6 所 示， SjHSP60 还 可 通 过 直 接 扩 增 CD4+CD25+Tregs，增 加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs ； 且扩增后的 CD4+CD25+Tregs 具有更强的免疫抑制力。
实施例七 ： 去除 SjHSP60 全长序列中第 435 到第 458 氨基酸的多肽 (SJMHE1) 后， 得到 SjHSP60(D)， 观察 SjHSP60(D) 是否还能增加小鼠 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。
1. 应用在线蛋白质结构和功能预测软件 Phyre server(http://www.sbg.bio. ic.ac.uk/phyre/)， 预测 SjHSP60 蛋白分子的空间结构以及表面功能残基 ( 蛋白 - 蛋白作 用位点 )。
2. 按附图中图 8 所示设计引物 ：
P1(5’ -3’ )： cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgag
P2(5’ -3’ )： cacacctgttcgctgtatgccttcctcaattgct
P3(5’ -3’ )： attgaggaaggcatacagcgaacaggtgtgcg
P4(5’ -3’ )： ccgctcgagattaagagcaggcagtgttta
以实施例一 (3) 中构建的重组表达载体 pGEX-SjHSP60 为模板 ： 以 P1/P2 为上下游 引物进行 PCR I ； 以 P3/P4 为上下游引物进行 PCRII ； 两次 PCR 后， 得到了缺失 SJMHE1 且有 部分重叠的两个 PCR 产物。 3. 等摩尔混合此上 (2) 中 PCR I 和 PCRII 产物 ( 质量比大约为 3.5 ∶ 1)， 以此为 模板， 以 P1/P4 为上下游引物， 进行 PCRIII， 得到了缺失 SJMHE1 的 SjHSP60(D)， 共 1816bp。 其全长 cDNA 序列和经过翻译出来的氨基酸序列分别为 SEQ.ID.NO.4 和 SEQ.ID.NO.3 所示。
4. 回收此上 (3) 中 PCR III 产物 ； 按实施例一 (3) 中方法， 用回收的 PCR III 产物和 pGEX-6P-1 构建重组表达载体 pGEX-SjHSP60(D) ； 诱导表达和纯化 SjHSP60(D) ； 再进行内毒素的去除和定量验证， 最后进行蛋白定量。按实施例二 (1) 中具体方法， 用 SjHSP60(D) 以及多肽 SJMHE1( 由上海生工公司合成， 纯度＞ 99 ％， 序列如 SEQ.ID.NO.5 所示 ) 体内免疫正常 BALB/c 小鼠， 设 PBS 免疫组为对照组， 检测各组小鼠脾和淋巴结中 + + + CD4 CD25 Foxp3 Tregs 比例。
5. 按实施例二 (2) 中方法， 用 SjHSP60(D)/ 多肽 SJMHE1/PBS 体外刺激正常 BALB/ c 小鼠的脾和淋巴结细胞， 检测各组小鼠脾和淋巴结中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。
结果如图 7 所示， 经过软件预测发现， SjHSP60 的三维空间结构表面， 除了 SJMHE1， 还存在其它一些功能性残基 ( 蛋白 - 蛋白作用位点 ) ； 进一步体内外实验证明， 缺失 SJMHE1 + + + 的 SjHSP60(D) 仍 可 增 加 小 鼠 脾 和 淋 巴 结 中 CD4 CD25 Foxp3 Tregs 比 例。 结 合 图 2 分 析， 可以发现 ： 与 SJMHE1 相比较， SjHSP60 和 SjHSP60(D) 体内免疫小鼠 (in vivo) 增加 + + + CD4 CD25 Foxp3 Tregs 比例的能力更强一些 ； 而体外刺激淋巴细胞 (in vitro)， SJMHE1， + + + SjHSP60 和 SjHSP60(D) 三者增加 CD4 CD25 Foxp3 Tregs 比例的能力无明显差异。
本发明不限于这些公开的实例方案， 本发明将覆盖在专利书中所描述的范围， 以 及权利要求范围的各种变型和等效变化。
11101921325 A CN 101921326序列表1/7 页SEQUENCE LISTING<110> 南京医科大学 <120> 一种增加 CD4+CD25+Foxp3+ 调节性 T 细胞的抗原及其应用 <130> <160>5 <170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>572 <212>PRT <213>Schistosoma japonicum <400>1 Met Leu Arg Ala Leu Ser Ser Leu Arg Gly Ser Leu Val Pro 1 5 10 Gln Lys Val Val Gln Arg Phe Tyr Ala Lys Glu Val Lys Phe 20 25 30 Asp Ala Arg Ser Ala Met Leu Ile Gly Val Asp Val Leu Ala 35 40 45 Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Ile Ile 50 55 60 Ser Trp Lys Ser Pro Lys Ile Thr Lys Asp Gly Val Thr Val 65 70 75 Gly Ile Glu Leu Lys Asp Lys Phe Gln Asn Ile Gly Ala Lys 85 90 Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly 100 105 110 Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe 115 120 125 Ile Ser Lys Gly Ala Asn Pro Ile Glu Phe Arg Arg Gly Val 130 135 140 Ala Val Asp Ala Val Val Lys Glu Leu Lys Ser Phe Ser Lys 145 150 15512Ala Arg 15 Gly Ala Asp Ala Glu Ser Ala Lys 80 Leu Val 95 Thr Thr Glu Lys Met Leu Gln Ile 160101921325 A CN 101921326序列表2/7 页Ser Thr Pro Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Gly 165 170 175 Asp Lys Ala Ile Gly Asp Leu Ile Ala Ser Ala Met Lys Arg Val Gly 180 185 190 Asn Asp Gly Thr Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu His Asp Glu 195 200 205 Leu Glu Phe Ile Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr Ile Ser Pro 210 215 220 Tyr Phe Ile Asn Thr Glu Lys Gly Ala Arg Cys Glu Phe Gln Asp Ala 225 230 235 240 PheIle Leu Phe Ser Glu Lys Lys Ile Asn Ser Ile Gln Thr Leu Leu 245 250 255 Pro Ala Leu Glu Leu Cys His Gln Gln Lys Arg Pro Leu Leu Ile Ile 260 265 270 Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Thr Ala Leu Val Leu Asn Arg 275 280 285 Leu Lys Leu Gly Leu Gln Val Cys Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly 290 295 300 Asp Asn Arg Lys Asn Thr Leu Lys Asp Met Ala Val Ala Thr Gly Gly 305 310 315 320 Ile Val Phe Gly Asp Glu Ala Asp Met Tyr Lys Leu Glu Asp Val Gln 325 330 335 Leu Gln Asp Leu Gly Arg Val Ser Glu Ala Val Ile Thr Lys Asp Asp 340 345 350 Cys Leu Leu Met Arg Gly Arg Gly Asn Lys Met Asp Ile Asp Lys Arg 355 360 365 Ile Ala Gln Ile Lys Asp Glu Met Glu Ala Ser Asn Ser Glu Tyr Glu 370 375 380 Lys Glu Lys Met His Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Asn Gly Val Ala 385 390 395 400 Val Ile Lys Val Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Ser Glu Lys Lys 405 410 415 Asp Arg Tyr Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Ile Glu Glu 420 425 430 Gly Ile Val Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Val 435 440 445 Leu Asp Thr Leu Ser Thr Lys Asn Glu Asp Gln Arg Thr Gly Val Arg 450 455 460 Ile Val Leu Arg Ala Leu Ser Thr Pro Cys Tyr Thr Ile Ala His Asn13101921325 A CN 101921326序列表475 Lys Val Lys Gly Met 495 Val Tyr Val Asp Met 510 Val Arg Thr Ala Leu 525 Thr Ala Glu Thr Val 540 Asn Ala Ala Gly Met 555 Met Met 480 Ser Ile Val Val Gly 5603/7 页465 Ala Gly Val Asn Ala 485 Gln Asn Met Gly Tyr 500 Glu Ala Gly Ile Ile 515 Asp Ala Ala Gly Val 530 Thr Asp Leu Pro Lys 545 Gly Met Gly Gly Met 565470 Ser Val Val Val Glu 490 Asp Ala Gln Asn Asp 505 Asp Pro Thr Lys Val 520 Ala Ser Leu Leu Thr 535 Glu Glu Thr Gly Gly 550 Gly Gly Met Gly Gly 570<210>2 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101921326序列表175 Arg Val Gly 190 His Asp Glu Ile Ser Pro Gln Asp Ala 240 Thr Leu Leu 255 Leu Ile Ile 270 Leu Asn Arg Gly Phe Gly Thr Gly Gly 320 Asp Val Gln 335 Lys Asp Asp 350 Asp Lys Arg Glu Tyr Glu Gly Val Ala 400 Glu Lys Lys 415 Ile Glu Glu 430 Leu Ser Thr Ser Val Val Asp Ala Gln 4805/7 页Asp Asn Leu Tyr 225 Phe Pro Ala Leu Asp 305 Ile Leu Cys Ile Lys 385 Val Asp Gly Pro Val 465165 Lys Ala Ile Gly Asp Leu Ile 180 Asp Gly Thr Ile Thr Val Lys 195 200 Glu Phe Ile Glu Gly Met Lys 210 215 Phe Ile Asn Thr Glu Lys Gly 230 Ile Leu Phe Ser Glu Lys Lys 245 Ala Leu Glu Leu Cys His Gln 260 Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala 275 280 Lys Leu Gly Leu Gln Val Cys 290 295 Asn Arg Lys Asn Thr Leu Lys 310 Val Phe Gly Asp Glu Ala Asp 325 Gln Asp Leu Gly Arg Val Ser 340 Leu Leu Met Arg Gly Arg Gly 355 360 Ala Gln Ile Lys Asp Glu Met 370 375 Glu Lys Met His Glu Arg Leu 390 Ile Lys Val Gly Gly Ser Ser 405 Arg Tyr Thr Asp Ala Leu Asn 420 Ile Gln Arg Thr Gly Val Arg 435 440 Cys Tyr Thr Ile Ala His Asn 450 455 Glu 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Glu Asp 20