经鼻给药用药物组合物 技术领域 本发明涉及用于使亲水性生理活性物质以保持其活性的状态通过鼻腔进入血中 的药物组合物。
背景技术 近年来， 除了迄今为止占主流的低分子疏水性的药物以外， 肽和 / 或核酸等亲水 性生理活性物质也进入临床应用， 作为药品使用而显示显著的治疗效果。 然而， 现在亲水性 生理活性物质的给药方法大多数情况下仅限于注射剂。这是由于与现有药物不同， 亲水性 物质不能通过粘膜的上皮细胞层的缘故。为了不使体外的异物进入生物体内， 上皮细胞层 的细胞彼此紧密地连结， 因而具有亲水性物质基本不能通过。而采用作为一般使用的药物 给药方法的口服给药不能使亲水性生理活性物质在体内发挥作用。
通过药剂注射的给药， 特别是在治疗频繁、 长期的情况下， 对患者和医师造成较大 负担， 因此已经研究了可以将这样的亲水性生理活性物质采用除了注射以外的方法给药的 各种方法。
人们多次尝试了在作为一般的药物给药方法而广泛使用的口服给药中使亲水性 生理活性物质吸收的技术。 特别是为了提高作为口服给药时的主要吸收部位的肠道上皮细 胞层的透过性， 已经尝试了采用表面活性物质和 / 或上皮细胞附着物质、 细胞穿透肽等。
细胞穿透肽是具有在不破坏细胞膜的情况下从细胞外向细胞内移动的性质的 肽的总称。作为有名的细胞穿透肽， 已知精氨酸连接而成的寡聚精氨酸、 HIV-1 病毒的肽 Tat( 专利文献 1)、 具有本发明的序列号 1 的氨基酸序列的穿膜肽 (penetratin)( 专利文献 2、 3) 等各种细胞穿透肽。这些细胞穿透肽包括单纯以碱性为特征的肽、 具有疏水性结构域 的肽、 以肽的一级结构或二级结构的两亲性为特征的肽、 机制不明确的肽等各种细胞穿透 肽。对于这些肽除了进行其本身的细胞内移动性的研究以外， 还在大量进行涉及将以其本 身为媒介连接成的基因等送达细胞内部的用途的研究。
此外， 还以利用该特性促进上皮细胞层透过、 促进口服给药时的吸收为目标进行 了研究 ( 专利文献 4、 5)。然而， 这些研究中所使用的细胞穿透肽的吸收促进效果是基于通 过洗涤后的肠道进行的评价等， 实际口服给药时的效果不明确。此外， 由于胃中的消化分 解、 摄取食物造成的消化道内环境的变化， 因此难以实现稳定的吸收， 因而亲水性生理活性 物质的口服给药尚未实用化。
作为通过口服给药以外的方法来实现吸收的方法， 也考察了利用鼻腔的粘膜层的 给药方法。由于鼻腔粘膜与消化道粘膜之间存在构成粘膜层的细胞种类的差异， 和 / 或各 个细胞的特性的差异， 而且还存在管腔内所存在的分解酶的种类、 量等各种差异， 因此为了 促进经鼻吸收， 要求与促进消化道吸收不同的技术。
鼻腔粘膜具有给药容易， 而且在鼻腔粘膜之下血管、 淋巴管发达而适合药物吸收 的特性。 此外， 由于通过鼻腔吸收的药物在吸收后直接进入体循环， 因此认为可以避免肝脏 的首过效应， 并认为作为容易被消化道和 / 或肝脏代谢的药物的给药部位是有效的。然而，
由于亲水性生理活性物质的鼻腔粘膜透过性与其它吸收部位同样地较低， 而且吸收部位的 面积也较小， 因此需要用于实现从鼻腔的亲水性生理活性物质吸收的吸收促进技术。
迄今为止， 虽然已经有多个制药商对利用表面活性剂作为吸收促进剂的经鼻制剂 进行临床试验的例子， 但是均以对鼻粘膜的刺激性较强而放弃的结果告终。 此外， 作为不使 用表面活性剂的方法， 在研究阶段尝试了采用肽来促进吸收， 专利文献 6 中公开了通过使 药物直接与肽连接来促进经鼻吸收性的尝试。 然而， 该技术需要对药物进行化学修饰， 因此 必然存在药物的药理活性降低、 和 / 或体内动力学变化、 生产成本增加、 给药药物的抗原性 等大量待解决的问题。
此外， 关于穿膜肽或其变体促进经鼻吸收的可能性已经在专利文献 2 或 3 中提及， 但是由于这需要透过的药物与穿膜肽变体形成共价键， 因此是与亲水性生理活性物质和穿 膜肽或其变体不形成共价键的本发明不同的技术。此外， 已知为了利用细胞穿透肽实现促 进鼻腔吸收， 除了从细胞外部向细胞内部的移动以外， 还需要使从细胞的脱离有效地发生， 此外， 由于在鼻腔粘膜吸收中， 肽容易被存在于鼻腔粘膜组织的各种分解酶分解等不同于 细胞透过性的各种因素会影响吸收性， 因此关于细胞穿透肽是否具有鼻腔粘膜透过性， 需 要通过使用模型动物等的实验来证实， 这是本领域技术人员的技术常识， 但是由于专利文 献 2 或 3 中并未公开关于穿膜肽或其变体的鼻腔粘膜透过性的实验证明， 因此对本领域技 术人员而言由专利文献 2 或 3 不容易类推出穿膜肽或其变体具有鼻腔粘膜透过性。 此外， 还尝试了将未与形成药物共价键的寡聚精氨酸作为鼻腔吸收促进物质， 与 药物同时给药 ( 专利文献 7)， 但是需要高浓度的寡聚精氨酸， 而且仅仅采用荧光标记葡聚 糖这样的单一模型药物还不能证实其效果， 关于肽性的亲水性生理活性物质的透过性还不 清楚。
因此， 还未发现使亲水性生理活性物质以高效率经鼻吸收的实用性高的技术。
专利文献 1 ： 特开平 10-33186 号公报
专利文献 2 ： 特表 2002-530059 号公报
专利文献 3 ： 特表 2002-519392 号公报
专利文献 4 ： 特开 2006-257074 号公报
专利文献 5 ： 特开 2008-7448 号公报
专利文献 6 ： WO2004/037859 号
专利文献 7 ： 特开平 10-95738 号公报
发明内容
本发明的课题在于提供使经鼻给药的亲水性生理活性物质进入血中的药物组合物。 为了解决上述课题， 本发明者针对在通常条件下经粘膜向血中的移动性低的亲水 性生理活性物质， 研究了提高其吸收效率的方法， 结果发现， 含有亲水性生理活性物质和下 述肽的药物组合物是有效的， 可以实现在经鼻给药中高效地使亲水性生理活性物质进入血 中， 所述肽是 (a) 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽， (b) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列 中缺失、 替换或添加了 1 个或几个氨基酸而得的氨基酸序列， 且具有鼻腔粘膜透过性的肽， 或 (c) 包含 (a) 或 (b) 的反向序列所示氨基酸序列、 且具有鼻腔粘膜透过性的肽。即， 本发
明具有如下构成。
(1) 一种经鼻给药用药物组合物， 含有亲水性生理活性物质和下述 (a) ～ (c) 的任 一肽，
(a) 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽，
(b) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或几个氨基酸而得 的氨基酸序列， 且具有鼻腔粘膜透过性的肽，
(c) 包含 (a) 或 (b) 的反向序列所示氨基酸序列、 且具有鼻腔粘膜透过性的肽。
(2) 根据 (1) 所述的经鼻给药用药物组合物， 所述 (b) 的肽是包含在序列号 1 所示 氨基酸序列中 1 个或几个碱性氨基酸被替换成其它碱性氨基酸、 或者添加了 1 个或几个碱 性氨基酸的氨基酸序列， 且具有鼻腔粘膜透过性的肽。
(3) 根据权利要求 1 或 2 所述的经鼻给药用药物组合物， 所述 (b) 的肽是包含序列 号 3 ～ 6 的任一序列所示氨基酸序列的肽。
(4) 根据 (1) ～ (3) 的任一项所述的经鼻给药用药物组合物， 所述 (c) 的肽是包含 序列号 2 所示氨基酸序列的肽。
(5) 根据 (1) ～ (4) 的任一项所述的经鼻给药用药物组合物， 以 0.2 ～ 2.0mM 的浓 度含有所述 (a) ～ (c) 的任一肽。
(6) 根据 (1) ～ (5) 的任一项所述的经鼻给药用药物组合物， 亲水性生理活性物质 是肽。
(7) 根据 (1) ～ (6) 的任一项所述的经鼻给药用药物组合物， 亲水性生理活性物质 是胰岛素或 β 干扰素。
根据本发明， 可以使经鼻给药后的亲水性生理活性物质进入血中， 与现有的注射 给药法相比， 可以进行简便且对患者温和的药物治疗。 附图说明
图 1 是使用了序列号 1 或序列号 7 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 血中浓 图 2 是使用了序列号 1 或序列号 7 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 血糖值。 图 3 是使用了序列号 1 或序列号 7 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 生物利 图 4 是使用了序列号 1 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 浓度依赖性。 图 5 是使用了序列号 1 的肽的经鼻给药荧光标记葡聚糖吸收促进效果。 图 6 是使用了序列号 1 的肽的经鼻给药 β 干扰素吸收促进效果。 图 7 是使用了序列号 1 ～ 6 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 血糖值。 图 8 是使用了序列号 1 ～ 6 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 血中浓度。度。
用度。
具体实施方式
本发明涉及经鼻给药用药物组合物， 是使亲水性生理活性物质从鼻腔进入血中的 药物组合物， 是将作为药效成分的亲水性生理活性物质与具有鼻腔粘膜透过性的特定肽在 它们不通过共价键连接的情况下以彼此独立的状态配合而成的。此处， 本发明中的亲水性生理活性物质是指具有亲水性特征的生理活性物质。亲水性是指在水中的溶解度高， 此处 将在每 1ml 水中溶解 1μg 以上的物质定义为亲水性的物质。此外， 生理活性物质是指作 用于生物体使生物体发生变化的所有物质， 可例示与特定的细胞的受体结合的蛋白质、 和/ 或与生物体内的物质具有亲和性的酶， 还可以是不与生物体内物质直接发生反应的物质， 例如， 还包括代替血浆用于增加血液用途的葡聚糖等可作为医疗用途给药至生物体的物 质。
此外， 本发明中的肽是指具有氨基酸通过肽键连接而成的结构的物质。肽中分子 量大的一般被称为蛋白质， 但在本说明书中包括这些蛋白质不受分子量限制地都称为肽。 此外， 在蛋白质中结合有糖链的糖蛋白、 和 / 或进行了聚乙二醇 (PEG) 化等化学修饰的衍生 物也包括在本发明的肽中。
以下， 对本发明的经鼻给药用药物组合物进行详细说明。
在本发明中， 与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的、 包含序列号 1 所 示氨基酸序列的肽是一般被称为穿膜肽的肽。穿膜肽是从被称为果蝇的触角蛋白的肽的 DNA 结合部位发现的、 具有细胞穿透性的肽， 但本发明者最新发现， 在将穿膜肽与亲水性生 理活性物质合并进行经鼻给药时， 由于穿膜肽的优异的鼻腔粘膜透过性而使亲水性生理活 性物质在生物体内以高比率进入血中， 从而完成了本发明。 在本发明所使用的包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽中缺失、 替换或添加了 1 个 或几个氨基酸的情况下， 只要是作为肽整体的变化在具有本发明所需的鼻腔粘膜透过性的 范围内， 也是允许的。例如， 在肽内的碱性氨基酸被置换成其它 1 个或几个碱性氨基酸的情 况、 亲水性氨基酸被置换成其它 1 个或多个亲水性氨基酸情况、 疏水性氨基酸被置换成 1 个 或多个疏水性氨基酸的情况下， 由于肽整体的特性无变化， 因此毫无疑问是允许的。 特别优 选允许在序列号 1 所示氨基酸序列中替换或添加 1 个或几个碱性氨基酸的情况。此外， 优 选上述缺失、 替换或添加的氨基酸较少， 优选为 1 ～ 5 个氨基酸， 更优选为 1 ～ 3 个氨基酸， 进一步优选为 1 个氨基酸。此处， 在本发明中疏水性氨基酸是指选自亮氨酸、 异亮氨酸、 色 氨酸、 苯丙氨酸、 缬氨酸、 丙氨酸中的氨基酸， 亲水性氨基酸是指选自丝氨酸、 苏氨酸、 天冬 氨酸、 谷氨酸、 赖氨酸、 精氨酸、 组氨酸中的氨基酸。 此外， 碱性氨基酸是指选自赖氨酸、 精氨 酸、 组氨酸中的氨基酸。作为包含在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或 几个氨基酸而得的氨基酸序列， 且具有鼻腔粘膜透过性的肽的优选例， 可列举包含序列号 3 ～ 6 中的任一序列所示氨基酸序列的肽。
此外， 在本发明中， 与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的肽可以是显 示有效的经鼻粘膜透过性的、 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽或上述序列号 1 所示氨基 酸序列的一部分被缺失、 替换或添加而得的肽的反向序列所表示的肽， 只要是作为肽整体 的差异在具有本发明所需的鼻腔粘膜透过性的范围内， 就是允许的。 此处， 反向序列所表示 的肽是指构成肽的氨基酸的排列相反的肽， 举例来说， 当从 N 末端向 C 末端的氨基酸序列排 列为精氨酸、 谷氨酰胺、 异亮氨酸、 赖氨酸时， 其反向肽是指从 N 末端向 C 末端的氨基酸序列 排列为赖氨酸、 异亮氨酸、 谷氨酰胺、 精氨酸的肽。作为优选例， 可列举包含序列号 1 所示氨 基酸序列的肽的反向序列所表示的肽 ( 序列号 2)。
在本发明中， 构成与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的肽的氨基酸除 了作为天然存在的氨基酸的立体构型为 L 型的氨基酸之外， 也可以使用天然氨基酸的结构
部分发生了改变的衍生物等非天然氨基酸。例如， 由于立体构型为 D 型的氨基酸不易被蛋 白分解酶分解， 从而可以有效地使用， 因此在该肽的氨基酸序列中， 既可以一部分氨基酸为 D 型， 也可以全部氨基酸为 D 型， 可根据与该肽合并给药的亲水性生理活性物质来适当选 择。另外， 在亲水性生理活性物质整体带有负电荷的情况下， 优选全部氨基酸序列为 L 型， 例如在亲水性生理活性物质为胰岛素的情况下， 优选全部氨基酸序列为 L 型。在亲水性生 理活性物质不带有电荷的情况、 或带有正电荷的情况下， 优选全部氨基酸序列为 D 型， 例如 在亲水性生理活性物质为带有正电荷的 β 干扰素的情况下， 优选该肽的全部氨基酸序列 为 D 型。
在本发明中， 与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的肽可以使用通常的 肽合成的方法来制备， 也可以在例如大肠菌等微生物、 动物细胞、 昆虫细胞等中导入编码该 肽的氨基酸序列的基因并使其表达来制备。此外， 还可以将天然存在的具有该肽的氨基酸 序列的蛋白质进行分解处理来获得。例如， 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽是与果蝇的 触角蛋白的一部分序列相同的序列， 也可以由天然的该蛋白经分解酶处理来制备。
在本发明中， 与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的肽可以是 1 种， 也 可以包含多种， 优选是 1 种。此外， 作为其浓度没有特别的限制， 优选如实施例所示那样为 0.2 ～ 2mM， 由于在 0.5 ～ 2mM 浓度下可观察到亲水性生理活性物质的显著鼻腔透过， 因此 更优选。 另外， 在本发明中所谓的肽的浓度是指向鼻腔内给药时的浓度， 本发明的药物组合 物如果是溶液状， 则是指在该溶液中的肽的浓度， 如果是固体状， 则是指将 1 次给药量的组 合物复原为作为 1 次鼻腔内给药量标准的 40μl 溶液时的浓度。 作为本发明中使用的亲水性生理活性物质的具体例， 有肽、 糖链、 核酸， 优选为肽。 作为肽的具体例， 可列举抗体、 肽类激素或细胞因子， 优选为肽类激素或细胞因子。作为肽 类激素， 可例示胰岛素、 降钙素、 甲状旁腺素、 生长激素、 GLP-1 或 Exendin-4， 作为细胞因 子， 可列举干扰素类、 白介素类或 G-CSF， 优选为胰岛素或 β 干扰素。 另外， 这些亲水性生理 活性物质可以是天然物质， 也可以是改变其序列结构的一部分而得的衍生物。 此外， 也可以 是进行了聚乙二醇 (PEG) 化等化学修饰的衍生物。
本发明中所谓的亲水性生理活性物质的经鼻吸收， 是指给药到鼻腔内的亲水性生 理活性物质通过鼻腔进入血液中。 其结果可以通过确认该亲水性生理活性物质的血中浓度 上升或药理活性出现来证实。亲水性生理活性物质的血中浓度可以通过免疫学测定法等 本领域技术人员通常使用的方法来测定。对于药理活性， 例如如果亲水性生理活性物质是 酶， 则可以以其酶活性为指标进行测定， 如果亲水性生理活性物质是作用于细胞的受体的 物质， 则可以以改变靶细胞的功能或标记物质的产生量的能力等为指标进行测定。 例如， 对 于胰岛素的药理活性， 可以以给药后的动物的血中葡萄糖浓度为指标来进行测定。
是否发生吸收促进可以如下证实 ： 将在鼻腔中仅给药作为药效成分的亲水性生理 活性物质时药物向血中的移动量相对于给药药物量的比率、 与给药本发明的药物组合物时 药物向血中的移动量相对于给药药物量的比率进行比较， 后者较高。为了作为实际的药品 发挥充分的功能， 优选生物利用度的值显示 10％以上的药物组合物， 更优选为 20％以上， 所述生物利用度表示作为 AUC( 血中浓度 - 时间曲线下面积 ) 的值， 以注射给药相同量的亲 水性生理活性物质时的 AUC 为 100％时的比率。
本发明的经鼻给药用药物组合物可以同时包含可药用的载体和 / 或添加物。作为
这样的载体和添加物的实例， 可列举水、 可药用的有机溶剂、 胶原、 聚乙烯醇、 聚乙烯基吡咯 烷酮、 羧基乙烯基聚合物、 羧甲基纤维素钠、 聚丙烯酸钠、 藻酸钠、 水溶性葡聚糖、 羧甲基淀 粉钠、 果胶、 甲基纤维素、 乙基纤维素、 黄原酸胶、 阿拉伯树胶、 酪蛋白、 明胶、 琼脂、 双甘油、 丙二醇、 聚乙二醇、 凡士林、 石蜡、 硬脂醇、 硬脂酸、 人血清白蛋白 (HSA)、 甘露糖醇、 山梨糖 醇、 乳糖、 允许作为药物添加物的表面活性剂等。
本发明的经鼻给药用药物组合物可以以溶液、 固体、 粉末状等各种形态使用， 但从 稳定性和操作容易性出发， 优选通过例如冷冻干燥等方法制成固体状或粉末状的形态。
对将本发明的经鼻给药用药物组合物给药至动物 ( 包括人 ) 的方法， 特别是对其 具体形态没有特别的限制。 例如， 可以将干燥状态的组合物或溶液状的组合物直接给药， 或 者将其与赋形剂一起填充到胶囊中来给药， 还可以使干燥状态的组合物一次性溶解分散在 水中然后给药。
将本发明的经鼻给药用药物组合物给药至生物体时的给药量和 / 或给药次数可 以根据亲水性生理活性物质、 给药形态、 患者的年龄、 体重、 症状的严重度进行适当选择， 但 作为所含有的亲水性生理活性物质的重量， 可以在通常成人每天 0.0001 ～ 50mg、 优选为 0.001 ～ 20mg 的范围给药。 实施例
实施例 1 ： 胰岛素的经鼻给药
< 方法 >
在 1.5ml 管 ( エツペンドルフ社 ) 中称取一定量的胰岛素 (WAKO 社 ) 粉末， 溶解 在 0.1N HCl 中， 然后加入相同量的 0.1N NaOH 来制作胰岛素溶液。
将全部氨基酸序列为 L 型或 D 型的穿膜肽 ( 序列号 1， 委托シグマジエノシス社 合成 ) 或寡聚精氨酸 ( 序列号 7， 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中， 与上述胰 岛素溶液合并， 从而在各给药实验中配制胰岛素 (10IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶 液。
对禁食 24 小时的体重约为 200g 的 SD 系雄性大鼠， 在其腹腔内注射 50mg/kg 的戊 巴比妥使其麻醉， 然后切开颈部露出气管。将聚乙烯管 (INTRAMEDIC PE205， Clay Adams) 插入气管， 接着切开部分食道， 将相同直径的管从食道的切开部向后鼻孔小心地插入以免 损伤组织。 将向后鼻孔插入的管的前端预先用脱脂棉和粘结剂密封。 为了防止药液漏出， 将 在口腔开口的上腭部的鼻腭管用合成粘结剂 ( 第一三共株式会社制 “アロンアルフア A” ) 密封。 然后， 给药配制成的胰岛素、 肽混合液， 或仅给药胰岛素， 在给药之前和给药之后的第 5、 10、 15、 30、 60、 120、 180、 240 分钟后由颈静脉采血 0.25ml， 通过离心分离来分离出血浆， 通过 EIA 试剂盒 ( レビス社 ) 来测定血浆中胰岛素浓度。通过与胰岛素皮下给药时进行比 较来计算生物学利用能力 ( 生物利用度 )。
< 结果 >
给药后的血中胰岛素浓度变化示于图 1， 血中葡萄糖浓度变化示于图 2。在仅经鼻 给药胰岛素的大鼠中， 几乎观察不到血中的胰岛素浓度上升， 与此相对， 在与胰岛素一起给 药穿膜肽或寡聚精氨酸后的大鼠中， 观察到从刚给药之后开始胰岛素向血中移动， 至于最 大血中浓度， L- 穿膜肽最高， 接着是 D- 穿膜肽、 D- 寡聚精氨酸、 L- 寡聚精氨酸 ( 图 1)。此 外， 随着胰岛素向血中移动， 还观察到作为药理活性的血糖值降低， 从而证实了血糖值与血
中的胰岛素浓度对应地降低 ( 图 2)。
对于生物利用度， 仅给药胰岛素的大鼠为 0.8％， 与此相对， 在同时给药胰岛素和 L 型或 D 型的寡聚精氨酸的情况下， L 型的生物利用度 (BA) 为 1.1％， D 型为 2.0％， 在同时 给药胰岛素和穿膜肽的情况下， D 型的 BA 为 3.4％， L 型为 7.1％ ( 图 3)， 穿膜肽与寡聚精 氨酸相比， 显示高的胰岛素吸收促进效果。
实施例 2 ： 胰岛素的经鼻给药、 肽浓度依赖性
< 方法 >
采用与实施例 1 同样的方法， 对于在实施例 1 中发现了最有效的吸收促进效果的 L 型穿膜肽 ( 序列号 1)， 将给药溶液中所含的浓度变成 0.2mM、 0.5mM、 1mM、 2mM， 进行同样的 评价。
< 结果 >
在单独给药胰岛素的情况下， 生物利用度为 1.7％， 与此相对， 在以 0.2mM、 0.5mM、 1mM、 2mM 给药 L 型穿膜肽的情况下， 生物利用度分别为 15.1％、 17.9％、 28.4％、 50.7％， 胰 岛素的吸收效率依赖于穿膜肽的浓度而提高 ( 图 4)。
实施例 3 ： 荧光标记葡聚糖的经鼻给药
< 方法 >
将作为荧光标记葡聚糖的 FD-4( モルキユラ一プロ一ブ社 ) 用 PBS 稀释制成 4mg/ ml 溶液。使用 40μl 该溶液， 采用与实施例 1 相同方法进行评价。血液中的 FD 浓度通过荧 光光度法来定量。通过与静脉内给药相同量的 FD-4 的情况进行比较来计算生物利用度。
< 结果 >
单独给药 FD-4 的大鼠的生物利用度为 4.9％， 使用 L 型穿膜肽时为 17％， 使用 D 型 穿膜肽时为 36％。此外， 给药 L 型或 D 型寡聚精氨酸的大鼠的生物利用度分别为 12.4％、 12.4％， 与寡聚精氨酸相比， 穿膜肽显示高的吸收促进效果 ( 图 5)。
实施例 4 ： β 干扰素的经鼻给药
< 方法 >
在用冰冷却下， 在人天然型 β 干扰素 ( 東レ株式会社制 “フエロン” ) 中加入 1ml 添加了 Tween20 的 PBS， 制成 6,000,000IU/ml 的溶液， 取出 100μl 该溶液， 加入 566μl 添 加了 Tween20 的 PBS 制成 900,000IU/ml 溶液。称量 D 型和 L 型穿膜肽 ( 序列号 1)， 使各 自的终浓度分别为 0.5mM 或 2mM， 添加 40μl 的 β 干扰素溶液并溶解， 制成 β 干扰素与穿 膜肽的混合溶液， 采用与实施例 1 相同方法进行评价。通过株式会社镰仓テクノサイエン ス制 “人 β 干扰素 ELISA 试剂盒” 来测定 β 干扰素的浓度， 通过与静脉内给药相同量的 β 干扰素的情况进行血浆中浓度的比较来计算生物利用度。
< 结果 >
通过与 β 干扰素一起添加穿膜肽而观察到 β 干扰素向血中移动。对于生物利用 度， 0.5mM 的 L 型为 6.1％， 0.5mM 的 D 型为 11.0％， 2mM 的 D 型为 22.0％ ( 图 6)。
实施例 5 ： 胰岛素的经鼻给药
< 方法 >
在 1.5ml 管 ( エツペンドルフ社 ) 中称取一定量的胰岛素 (WAKO 社 ) 粉末， 使其 溶解在 0.1N HCl 中， 然后加入相同量的 0.1N NaOH， 从而制作胰岛素溶液。将全部氨基酸序列为 L 型的肽 ( 序列号 1 ～ 6， 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶 解在 PBS 中， 与上述胰岛素溶液合并， 从而在各给药实验中的配制胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液， 采用与实施例 1 同样的方法进行评价。
< 结果 >
给药后的血中葡萄糖浓度变化示于图 7， 血中胰岛素浓度变化示于图 8， 由评价结 果获得的各种参数示于表 1。 在仅经鼻给药胰岛素的大鼠中， 几乎不能观察到血中的胰岛素 浓度上升， 与此相对， 通过与胰岛素一起分别给药序列号 1 ～ 6 的肽， 而观察到从刚给药之 后开始胰岛素向血中移动， 与此同时， 观察到血中葡萄糖浓度降低。 对于由血中胰岛素浓度 变化计算出的生物利用度 (BA)， 仅给药胰岛素的大鼠为 2.3％， 与此相对， 在共同给药序列 号 1 ～ 6 的肽的情况下为 4.4 ～ 20.1％。此外， 对于由血中葡萄糖浓度变化计算出的药学 利用性 (PA)， 在仅给药胰岛素的情况下， 为 4.7％， 在共同给药序列号 1 ～ 6 的肽的情况下 为 15.7％～ 37.5％。
[ 表 1]
产业可利用性
根据本发明， 可以提供能够将迄今为止以注射剂形式给药的亲水性生理活性物质 进行经鼻给药， 从而大幅度改善患者的疼痛、 不便的药剂。 改善这些注射剂带给患者的疼痛 和 / 或去医院的不便不仅可在进行医疗时实现以患者为中心的医疗， 而且从根本上改变迄 今为止的制剂概念， 从而带来划时代的制剂创制。
背景技术 近年来， 除了迄今为止占主流的低分子疏水性的药物以外， 肽和 / 或核酸等亲水 性生理活性物质也进入临床应用， 作为药品使用而显示显著的治疗效果。 然而， 现在亲水性 生理活性物质的给药方法大多数情况下仅限于注射剂。这是由于与现有药物不同， 亲水性 物质不能通过粘膜的上皮细胞层的缘故。为了不使体外的异物进入生物体内， 上皮细胞层 的细胞彼此紧密地连结， 因而具有亲水性物质基本不能通过。而采用作为一般使用的药物 给药方法的口服给药不能使亲水性生理活性物质在体内发挥作用。
通过药剂注射的给药， 特别是在治疗频繁、 长期的情况下， 对患者和医师造成较大 负担， 因此已经研究了可以将这样的亲水性生理活性物质采用除了注射以外的方法给药的 各种方法。
人们多次尝试了在作为一般的药物给药方法而广泛使用的口服给药中使亲水性 生理活性物质吸收的技术。 特别是为了提高作为口服给药时的主要吸收部位的肠道上皮细 胞层的透过性， 已经尝试了采用表面活性物质和 / 或上皮细胞附着物质、 细胞穿透肽等。
细胞穿透肽是具有在不破坏细胞膜的情况下从细胞外向细胞内移动的性质的 肽的总称。作为有名的细胞穿透肽， 已知精氨酸连接而成的寡聚精氨酸、 HIV-1 病毒的肽 Tat( 专利文献 1)、 具有本发明的序列号 1 的氨基酸序列的穿膜肽 (penetratin)( 专利文献 2、 3) 等各种细胞穿透肽。这些细胞穿透肽包括单纯以碱性为特征的肽、 具有疏水性结构域 的肽、 以肽的一级结构或二级结构的两亲性为特征的肽、 机制不明确的肽等各种细胞穿透 肽。对于这些肽除了进行其本身的细胞内移动性的研究以外， 还在大量进行涉及将以其本 身为媒介连接成的基因等送达细胞内部的用途的研究。
此外， 还以利用该特性促进上皮细胞层透过、 促进口服给药时的吸收为目标进行 了研究 ( 专利文献 4、 5)。然而， 这些研究中所使用的细胞穿透肽的吸收促进效果是基于通 过洗涤后的肠道进行的评价等， 实际口服给药时的效果不明确。此外， 由于胃中的消化分 解、 摄取食物造成的消化道内环境的变化， 因此难以实现稳定的吸收， 因而亲水性生理活性 物质的口服给药尚未实用化。
作为通过口服给药以外的方法来实现吸收的方法， 也考察了利用鼻腔的粘膜层的 给药方法。由于鼻腔粘膜与消化道粘膜之间存在构成粘膜层的细胞种类的差异， 和 / 或各 个细胞的特性的差异， 而且还存在管腔内所存在的分解酶的种类、 量等各种差异， 因此为了 促进经鼻吸收， 要求与促进消化道吸收不同的技术。
鼻腔粘膜具有给药容易， 而且在鼻腔粘膜之下血管、 淋巴管发达而适合药物吸收 的特性。 此外， 由于通过鼻腔吸收的药物在吸收后直接进入体循环， 因此认为可以避免肝脏 的首过效应， 并认为作为容易被消化道和 / 或肝脏代谢的药物的给药部位是有效的。然而，
通过药剂注射的给药， 特别是在治疗频繁、 长期的情况下， 对患者和医师造成较大 负担， 因此已经研究了可以将这样的亲水性生理活性物质采用除了注射以外的方法给药的 各种方法。
人们多次尝试了在作为一般的药物给药方法而广泛使用的口服给药中使亲水性 生理活性物质吸收的技术。 特别是为了提高作为口服给药时的主要吸收部位的肠道上皮细 胞层的透过性， 已经尝试了采用表面活性物质和 / 或上皮细胞附着物质、 细胞穿透肽等。
细胞穿透肽是具有在不破坏细胞膜的情况下从细胞外向细胞内移动的性质的 肽的总称。作为有名的细胞穿透肽， 已知精氨酸连接而成的寡聚精氨酸、 HIV-1 病毒的肽 Tat( 专利文献 1)、 具有本发明的序列号 1 的氨基酸序列的穿膜肽 (penetratin)( 专利文献 2、 3) 等各种细胞穿透肽。这些细胞穿透肽包括单纯以碱性为特征的肽、 具有疏水性结构域 的肽、 以肽的一级结构或二级结构的两亲性为特征的肽、 机制不明确的肽等各种细胞穿透 肽。对于这些肽除了进行其本身的细胞内移动性的研究以外， 还在大量进行涉及将以其本 身为媒介连接成的基因等送达细胞内部的用途的研究。
此外， 还以利用该特性促进上皮细胞层透过、 促进口服给药时的吸收为目标进行 了研究 ( 专利文献 4、 5)。然而， 这些研究中所使用的细胞穿透肽的吸收促进效果是基于通 过洗涤后的肠道进行的评价等， 实际口服给药时的效果不明确。此外， 由于胃中的消化分 解、 摄取食物造成的消化道内环境的变化， 因此难以实现稳定的吸收， 因而亲水性生理活性 物质的口服给药尚未实用化。
作为通过口服给药以外的方法来实现吸收的方法， 也考察了利用鼻腔的粘膜层的 给药方法。由于鼻腔粘膜与消化道粘膜之间存在构成粘膜层的细胞种类的差异， 和 / 或各 个细胞的特性的差异， 而且还存在管腔内所存在的分解酶的种类、 量等各种差异， 因此为了 促进经鼻吸收， 要求与促进消化道吸收不同的技术。
鼻腔粘膜具有给药容易， 而且在鼻腔粘膜之下血管、 淋巴管发达而适合药物吸收 的特性。 此外， 由于通过鼻腔吸收的药物在吸收后直接进入体循环， 因此认为可以避免肝脏 的首过效应， 并认为作为容易被消化道和 / 或肝脏代谢的药物的给药部位是有效的。然而，
由于亲水性生理活性物质的鼻腔粘膜透过性与其它吸收部位同样地较低， 而且吸收部位的 面积也较小， 因此需要用于实现从鼻腔的亲水性生理活性物质吸收的吸收促进技术。
迄今为止， 虽然已经有多个制药商对利用表面活性剂作为吸收促进剂的经鼻制剂 进行临床试验的例子， 但是均以对鼻粘膜的刺激性较强而放弃的结果告终。 此外， 作为不使 用表面活性剂的方法， 在研究阶段尝试了采用肽来促进吸收， 专利文献 6 中公开了通过使 药物直接与肽连接来促进经鼻吸收性的尝试。 然而， 该技术需要对药物进行化学修饰， 因此 必然存在药物的药理活性降低、 和 / 或体内动力学变化、 生产成本增加、 给药药物的抗原性 等大量待解决的问题。
此外， 关于穿膜肽或其变体促进经鼻吸收的可能性已经在专利文献 2 或 3 中提及， 但是由于这需要透过的药物与穿膜肽变体形成共价键， 因此是与亲水性生理活性物质和穿 膜肽或其变体不形成共价键的本发明不同的技术。此外， 已知为了利用细胞穿透肽实现促 进鼻腔吸收， 除了从细胞外部向细胞内部的移动以外， 还需要使从细胞的脱离有效地发生， 此外， 由于在鼻腔粘膜吸收中， 肽容易被存在于鼻腔粘膜组织的各种分解酶分解等不同于 细胞透过性的各种因素会影响吸收性， 因此关于细胞穿透肽是否具有鼻腔粘膜透过性， 需 要通过使用模型动物等的实验来证实， 这是本领域技术人员的技术常识， 但是由于专利文 献 2 或 3 中并未公开关于穿膜肽或其变体的鼻腔粘膜透过性的实验证明， 因此对本领域技 术人员而言由专利文献 2 或 3 不容易类推出穿膜肽或其变体具有鼻腔粘膜透过性。 此外， 还尝试了将未与形成药物共价键的寡聚精氨酸作为鼻腔吸收促进物质， 与 药物同时给药 ( 专利文献 7)， 但是需要高浓度的寡聚精氨酸， 而且仅仅采用荧光标记葡聚 糖这样的单一模型药物还不能证实其效果， 关于肽性的亲水性生理活性物质的透过性还不 清楚。
因此， 还未发现使亲水性生理活性物质以高效率经鼻吸收的实用性高的技术。
专利文献 1 ： 特开平 10-33186 号公报
专利文献 2 ： 特表 2002-530059 号公报
专利文献 3 ： 特表 2002-519392 号公报
专利文献 4 ： 特开 2006-257074 号公报
专利文献 5 ： 特开 2008-7448 号公报
专利文献 6 ： WO2004/037859 号
专利文献 7 ： 特开平 10-95738 号公报
【发明内容】
本发明的课题在于提供使经鼻给药的亲水性生理活性物质进入血中的药物组合物。 为了解决上述课题， 本发明者针对在通常条件下经粘膜向血中的移动性低的亲水 性生理活性物质， 研究了提高其吸收效率的方法， 结果发现， 含有亲水性生理活性物质和下 述肽的药物组合物是有效的， 可以实现在经鼻给药中高效地使亲水性生理活性物质进入血 中， 所述肽是 (a) 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽， (b) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列 中缺失、 替换或添加了 1 个或几个氨基酸而得的氨基酸序列， 且具有鼻腔粘膜透过性的肽， 或 (c) 包含 (a) 或 (b) 的反向序列所示氨基酸序列、 且具有鼻腔粘膜透过性的肽。即， 本发
明具有如下构成。
(1) 一种经鼻给药用药物组合物， 含有亲水性生理活性物质和下述 (a) ～ (c) 的任 一肽，
(a) 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽，
(b) 包含在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或几个氨基酸而得 的氨基酸序列， 且具有鼻腔粘膜透过性的肽，
(c) 包含 (a) 或 (b) 的反向序列所示氨基酸序列、 且具有鼻腔粘膜透过性的肽。
(2) 根据 (1) 所述的经鼻给药用药物组合物， 所述 (b) 的肽是包含在序列号 1 所示 氨基酸序列中 1 个或几个碱性氨基酸被替换成其它碱性氨基酸、 或者添加了 1 个或几个碱 性氨基酸的氨基酸序列， 且具有鼻腔粘膜透过性的肽。
(3) 根据权利要求 1 或 2 所述的经鼻给药用药物组合物， 所述 (b) 的肽是包含序列 号 3 ～ 6 的任一序列所示氨基酸序列的肽。
(4) 根据 (1) ～ (3) 的任一项所述的经鼻给药用药物组合物， 所述 (c) 的肽是包含 序列号 2 所示氨基酸序列的肽。
(5) 根据 (1) ～ (4) 的任一项所述的经鼻给药用药物组合物， 以 0.2 ～ 2.0mM 的浓 度含有所述 (a) ～ (c) 的任一肽。
(6) 根据 (1) ～ (5) 的任一项所述的经鼻给药用药物组合物， 亲水性生理活性物质 是肽。
(7) 根据 (1) ～ (6) 的任一项所述的经鼻给药用药物组合物， 亲水性生理活性物质 是胰岛素或 β 干扰素。
根据本发明， 可以使经鼻给药后的亲水性生理活性物质进入血中， 与现有的注射 给药法相比， 可以进行简便且对患者温和的药物治疗。 附图说明
图 1 是使用了序列号 1 或序列号 7 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 血中浓 图 2 是使用了序列号 1 或序列号 7 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 血糖值。 图 3 是使用了序列号 1 或序列号 7 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 生物利 图 4 是使用了序列号 1 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 浓度依赖性。 图 5 是使用了序列号 1 的肽的经鼻给药荧光标记葡聚糖吸收促进效果。 图 6 是使用了序列号 1 的肽的经鼻给药 β 干扰素吸收促进效果。 图 7 是使用了序列号 1 ～ 6 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 血糖值。 图 8 是使用了序列号 1 ～ 6 的肽的经鼻给药胰岛素吸收促进效果 ： 血中浓度。度。
用度。
具体实施方式
本发明涉及经鼻给药用药物组合物， 是使亲水性生理活性物质从鼻腔进入血中的 药物组合物， 是将作为药效成分的亲水性生理活性物质与具有鼻腔粘膜透过性的特定肽在 它们不通过共价键连接的情况下以彼此独立的状态配合而成的。此处， 本发明中的亲水性生理活性物质是指具有亲水性特征的生理活性物质。亲水性是指在水中的溶解度高， 此处 将在每 1ml 水中溶解 1μg 以上的物质定义为亲水性的物质。此外， 生理活性物质是指作 用于生物体使生物体发生变化的所有物质， 可例示与特定的细胞的受体结合的蛋白质、 和/ 或与生物体内的物质具有亲和性的酶， 还可以是不与生物体内物质直接发生反应的物质， 例如， 还包括代替血浆用于增加血液用途的葡聚糖等可作为医疗用途给药至生物体的物 质。
此外， 本发明中的肽是指具有氨基酸通过肽键连接而成的结构的物质。肽中分子 量大的一般被称为蛋白质， 但在本说明书中包括这些蛋白质不受分子量限制地都称为肽。 此外， 在蛋白质中结合有糖链的糖蛋白、 和 / 或进行了聚乙二醇 (PEG) 化等化学修饰的衍生 物也包括在本发明的肽中。
以下， 对本发明的经鼻给药用药物组合物进行详细说明。
在本发明中， 与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的、 包含序列号 1 所 示氨基酸序列的肽是一般被称为穿膜肽的肽。穿膜肽是从被称为果蝇的触角蛋白的肽的 DNA 结合部位发现的、 具有细胞穿透性的肽， 但本发明者最新发现， 在将穿膜肽与亲水性生 理活性物质合并进行经鼻给药时， 由于穿膜肽的优异的鼻腔粘膜透过性而使亲水性生理活 性物质在生物体内以高比率进入血中， 从而完成了本发明。 在本发明所使用的包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽中缺失、 替换或添加了 1 个 或几个氨基酸的情况下， 只要是作为肽整体的变化在具有本发明所需的鼻腔粘膜透过性的 范围内， 也是允许的。例如， 在肽内的碱性氨基酸被置换成其它 1 个或几个碱性氨基酸的情 况、 亲水性氨基酸被置换成其它 1 个或多个亲水性氨基酸情况、 疏水性氨基酸被置换成 1 个 或多个疏水性氨基酸的情况下， 由于肽整体的特性无变化， 因此毫无疑问是允许的。 特别优 选允许在序列号 1 所示氨基酸序列中替换或添加 1 个或几个碱性氨基酸的情况。此外， 优 选上述缺失、 替换或添加的氨基酸较少， 优选为 1 ～ 5 个氨基酸， 更优选为 1 ～ 3 个氨基酸， 进一步优选为 1 个氨基酸。此处， 在本发明中疏水性氨基酸是指选自亮氨酸、 异亮氨酸、 色 氨酸、 苯丙氨酸、 缬氨酸、 丙氨酸中的氨基酸， 亲水性氨基酸是指选自丝氨酸、 苏氨酸、 天冬 氨酸、 谷氨酸、 赖氨酸、 精氨酸、 组氨酸中的氨基酸。 此外， 碱性氨基酸是指选自赖氨酸、 精氨 酸、 组氨酸中的氨基酸。作为包含在序列号 1 所示氨基酸序列中缺失、 替换或添加了 1 个或 几个氨基酸而得的氨基酸序列， 且具有鼻腔粘膜透过性的肽的优选例， 可列举包含序列号 3 ～ 6 中的任一序列所示氨基酸序列的肽。
此外， 在本发明中， 与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的肽可以是显 示有效的经鼻粘膜透过性的、 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽或上述序列号 1 所示氨基 酸序列的一部分被缺失、 替换或添加而得的肽的反向序列所表示的肽， 只要是作为肽整体 的差异在具有本发明所需的鼻腔粘膜透过性的范围内， 就是允许的。 此处， 反向序列所表示 的肽是指构成肽的氨基酸的排列相反的肽， 举例来说， 当从 N 末端向 C 末端的氨基酸序列排 列为精氨酸、 谷氨酰胺、 异亮氨酸、 赖氨酸时， 其反向肽是指从 N 末端向 C 末端的氨基酸序列 排列为赖氨酸、 异亮氨酸、 谷氨酰胺、 精氨酸的肽。作为优选例， 可列举包含序列号 1 所示氨 基酸序列的肽的反向序列所表示的肽 ( 序列号 2)。
在本发明中， 构成与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的肽的氨基酸除 了作为天然存在的氨基酸的立体构型为 L 型的氨基酸之外， 也可以使用天然氨基酸的结构
部分发生了改变的衍生物等非天然氨基酸。例如， 由于立体构型为 D 型的氨基酸不易被蛋 白分解酶分解， 从而可以有效地使用， 因此在该肽的氨基酸序列中， 既可以一部分氨基酸为 D 型， 也可以全部氨基酸为 D 型， 可根据与该肽合并给药的亲水性生理活性物质来适当选 择。另外， 在亲水性生理活性物质整体带有负电荷的情况下， 优选全部氨基酸序列为 L 型， 例如在亲水性生理活性物质为胰岛素的情况下， 优选全部氨基酸序列为 L 型。在亲水性生 理活性物质不带有电荷的情况、 或带有正电荷的情况下， 优选全部氨基酸序列为 D 型， 例如 在亲水性生理活性物质为带有正电荷的 β 干扰素的情况下， 优选该肽的全部氨基酸序列 为 D 型。
在本发明中， 与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的肽可以使用通常的 肽合成的方法来制备， 也可以在例如大肠菌等微生物、 动物细胞、 昆虫细胞等中导入编码该 肽的氨基酸序列的基因并使其表达来制备。此外， 还可以将天然存在的具有该肽的氨基酸 序列的蛋白质进行分解处理来获得。例如， 包含序列号 1 所示氨基酸序列的肽是与果蝇的 触角蛋白的一部分序列相同的序列， 也可以由天然的该蛋白经分解酶处理来制备。
在本发明中， 与亲水性生理活性物质一起被包含在组合物中的肽可以是 1 种， 也 可以包含多种， 优选是 1 种。此外， 作为其浓度没有特别的限制， 优选如实施例所示那样为 0.2 ～ 2mM， 由于在 0.5 ～ 2mM 浓度下可观察到亲水性生理活性物质的显著鼻腔透过， 因此 更优选。 另外， 在本发明中所谓的肽的浓度是指向鼻腔内给药时的浓度， 本发明的药物组合 物如果是溶液状， 则是指在该溶液中的肽的浓度， 如果是固体状， 则是指将 1 次给药量的组 合物复原为作为 1 次鼻腔内给药量标准的 40μl 溶液时的浓度。 作为本发明中使用的亲水性生理活性物质的具体例， 有肽、 糖链、 核酸， 优选为肽。 作为肽的具体例， 可列举抗体、 肽类激素或细胞因子， 优选为肽类激素或细胞因子。作为肽 类激素， 可例示胰岛素、 降钙素、 甲状旁腺素、 生长激素、 GLP-1 或 Exendin-4， 作为细胞因 子， 可列举干扰素类、 白介素类或 G-CSF， 优选为胰岛素或 β 干扰素。 另外， 这些亲水性生理 活性物质可以是天然物质， 也可以是改变其序列结构的一部分而得的衍生物。 此外， 也可以 是进行了聚乙二醇 (PEG) 化等化学修饰的衍生物。
本发明中所谓的亲水性生理活性物质的经鼻吸收， 是指给药到鼻腔内的亲水性生 理活性物质通过鼻腔进入血液中。 其结果可以通过确认该亲水性生理活性物质的血中浓度 上升或药理活性出现来证实。亲水性生理活性物质的血中浓度可以通过免疫学测定法等 本领域技术人员通常使用的方法来测定。对于药理活性， 例如如果亲水性生理活性物质是 酶， 则可以以其酶活性为指标进行测定， 如果亲水性生理活性物质是作用于细胞的受体的 物质， 则可以以改变靶细胞的功能或标记物质的产生量的能力等为指标进行测定。 例如， 对 于胰岛素的药理活性， 可以以给药后的动物的血中葡萄糖浓度为指标来进行测定。
是否发生吸收促进可以如下证实 ： 将在鼻腔中仅给药作为药效成分的亲水性生理 活性物质时药物向血中的移动量相对于给药药物量的比率、 与给药本发明的药物组合物时 药物向血中的移动量相对于给药药物量的比率进行比较， 后者较高。为了作为实际的药品 发挥充分的功能， 优选生物利用度的值显示 10％以上的药物组合物， 更优选为 20％以上， 所述生物利用度表示作为 AUC( 血中浓度 - 时间曲线下面积 ) 的值， 以注射给药相同量的亲 水性生理活性物质时的 AUC 为 100％时的比率。
本发明的经鼻给药用药物组合物可以同时包含可药用的载体和 / 或添加物。作为
这样的载体和添加物的实例， 可列举水、 可药用的有机溶剂、 胶原、 聚乙烯醇、 聚乙烯基吡咯 烷酮、 羧基乙烯基聚合物、 羧甲基纤维素钠、 聚丙烯酸钠、 藻酸钠、 水溶性葡聚糖、 羧甲基淀 粉钠、 果胶、 甲基纤维素、 乙基纤维素、 黄原酸胶、 阿拉伯树胶、 酪蛋白、 明胶、 琼脂、 双甘油、 丙二醇、 聚乙二醇、 凡士林、 石蜡、 硬脂醇、 硬脂酸、 人血清白蛋白 (HSA)、 甘露糖醇、 山梨糖 醇、 乳糖、 允许作为药物添加物的表面活性剂等。
本发明的经鼻给药用药物组合物可以以溶液、 固体、 粉末状等各种形态使用， 但从 稳定性和操作容易性出发， 优选通过例如冷冻干燥等方法制成固体状或粉末状的形态。
对将本发明的经鼻给药用药物组合物给药至动物 ( 包括人 ) 的方法， 特别是对其 具体形态没有特别的限制。 例如， 可以将干燥状态的组合物或溶液状的组合物直接给药， 或 者将其与赋形剂一起填充到胶囊中来给药， 还可以使干燥状态的组合物一次性溶解分散在 水中然后给药。
将本发明的经鼻给药用药物组合物给药至生物体时的给药量和 / 或给药次数可 以根据亲水性生理活性物质、 给药形态、 患者的年龄、 体重、 症状的严重度进行适当选择， 但 作为所含有的亲水性生理活性物质的重量， 可以在通常成人每天 0.0001 ～ 50mg、 优选为 0.001 ～ 20mg 的范围给药。 实施例
实施例 1 ： 胰岛素的经鼻给药
< 方法 >
在 1.5ml 管 ( エツペンドルフ社 ) 中称取一定量的胰岛素 (WAKO 社 ) 粉末， 溶解 在 0.1N HCl 中， 然后加入相同量的 0.1N NaOH 来制作胰岛素溶液。
将全部氨基酸序列为 L 型或 D 型的穿膜肽 ( 序列号 1， 委托シグマジエノシス社 合成 ) 或寡聚精氨酸 ( 序列号 7， 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶解在 PBS 中， 与上述胰 岛素溶液合并， 从而在各给药实验中配制胰岛素 (10IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶 液。
对禁食 24 小时的体重约为 200g 的 SD 系雄性大鼠， 在其腹腔内注射 50mg/kg 的戊 巴比妥使其麻醉， 然后切开颈部露出气管。将聚乙烯管 (INTRAMEDIC PE205， Clay Adams) 插入气管， 接着切开部分食道， 将相同直径的管从食道的切开部向后鼻孔小心地插入以免 损伤组织。 将向后鼻孔插入的管的前端预先用脱脂棉和粘结剂密封。 为了防止药液漏出， 将 在口腔开口的上腭部的鼻腭管用合成粘结剂 ( 第一三共株式会社制 “アロンアルフア A” ) 密封。 然后， 给药配制成的胰岛素、 肽混合液， 或仅给药胰岛素， 在给药之前和给药之后的第 5、 10、 15、 30、 60、 120、 180、 240 分钟后由颈静脉采血 0.25ml， 通过离心分离来分离出血浆， 通过 EIA 试剂盒 ( レビス社 ) 来测定血浆中胰岛素浓度。通过与胰岛素皮下给药时进行比 较来计算生物学利用能力 ( 生物利用度 )。
< 结果 >
给药后的血中胰岛素浓度变化示于图 1， 血中葡萄糖浓度变化示于图 2。在仅经鼻 给药胰岛素的大鼠中， 几乎观察不到血中的胰岛素浓度上升， 与此相对， 在与胰岛素一起给 药穿膜肽或寡聚精氨酸后的大鼠中， 观察到从刚给药之后开始胰岛素向血中移动， 至于最 大血中浓度， L- 穿膜肽最高， 接着是 D- 穿膜肽、 D- 寡聚精氨酸、 L- 寡聚精氨酸 ( 图 1)。此 外， 随着胰岛素向血中移动， 还观察到作为药理活性的血糖值降低， 从而证实了血糖值与血
中的胰岛素浓度对应地降低 ( 图 2)。
对于生物利用度， 仅给药胰岛素的大鼠为 0.8％， 与此相对， 在同时给药胰岛素和 L 型或 D 型的寡聚精氨酸的情况下， L 型的生物利用度 (BA) 为 1.1％， D 型为 2.0％， 在同时 给药胰岛素和穿膜肽的情况下， D 型的 BA 为 3.4％， L 型为 7.1％ ( 图 3)， 穿膜肽与寡聚精 氨酸相比， 显示高的胰岛素吸收促进效果。
实施例 2 ： 胰岛素的经鼻给药、 肽浓度依赖性
< 方法 >
采用与实施例 1 同样的方法， 对于在实施例 1 中发现了最有效的吸收促进效果的 L 型穿膜肽 ( 序列号 1)， 将给药溶液中所含的浓度变成 0.2mM、 0.5mM、 1mM、 2mM， 进行同样的 评价。
< 结果 >
在单独给药胰岛素的情况下， 生物利用度为 1.7％， 与此相对， 在以 0.2mM、 0.5mM、 1mM、 2mM 给药 L 型穿膜肽的情况下， 生物利用度分别为 15.1％、 17.9％、 28.4％、 50.7％， 胰 岛素的吸收效率依赖于穿膜肽的浓度而提高 ( 图 4)。
实施例 3 ： 荧光标记葡聚糖的经鼻给药
< 方法 >
将作为荧光标记葡聚糖的 FD-4( モルキユラ一プロ一ブ社 ) 用 PBS 稀释制成 4mg/ ml 溶液。使用 40μl 该溶液， 采用与实施例 1 相同方法进行评价。血液中的 FD 浓度通过荧 光光度法来定量。通过与静脉内给药相同量的 FD-4 的情况进行比较来计算生物利用度。
< 结果 >
单独给药 FD-4 的大鼠的生物利用度为 4.9％， 使用 L 型穿膜肽时为 17％， 使用 D 型 穿膜肽时为 36％。此外， 给药 L 型或 D 型寡聚精氨酸的大鼠的生物利用度分别为 12.4％、 12.4％， 与寡聚精氨酸相比， 穿膜肽显示高的吸收促进效果 ( 图 5)。
实施例 4 ： β 干扰素的经鼻给药
< 方法 >
在用冰冷却下， 在人天然型 β 干扰素 ( 東レ株式会社制 “フエロン” ) 中加入 1ml 添加了 Tween20 的 PBS， 制成 6,000,000IU/ml 的溶液， 取出 100μl 该溶液， 加入 566μl 添 加了 Tween20 的 PBS 制成 900,000IU/ml 溶液。称量 D 型和 L 型穿膜肽 ( 序列号 1)， 使各 自的终浓度分别为 0.5mM 或 2mM， 添加 40μl 的 β 干扰素溶液并溶解， 制成 β 干扰素与穿 膜肽的混合溶液， 采用与实施例 1 相同方法进行评价。通过株式会社镰仓テクノサイエン ス制 “人 β 干扰素 ELISA 试剂盒” 来测定 β 干扰素的浓度， 通过与静脉内给药相同量的 β 干扰素的情况进行血浆中浓度的比较来计算生物利用度。
< 结果 >
通过与 β 干扰素一起添加穿膜肽而观察到 β 干扰素向血中移动。对于生物利用 度， 0.5mM 的 L 型为 6.1％， 0.5mM 的 D 型为 11.0％， 2mM 的 D 型为 22.0％ ( 图 6)。
实施例 5 ： 胰岛素的经鼻给药
< 方法 >
在 1.5ml 管 ( エツペンドルフ社 ) 中称取一定量的胰岛素 (WAKO 社 ) 粉末， 使其 溶解在 0.1N HCl 中， 然后加入相同量的 0.1N NaOH， 从而制作胰岛素溶液。将全部氨基酸序列为 L 型的肽 ( 序列号 1 ～ 6， 委托シグマジエノシス社合成 ) 溶 解在 PBS 中， 与上述胰岛素溶液合并， 从而在各给药实验中的配制胰岛素 (1IU/kg)、 各个肽 0.5mM 的 40μl 混合溶液， 采用与实施例 1 同样的方法进行评价。
< 结果 >
给药后的血中葡萄糖浓度变化示于图 7， 血中胰岛素浓度变化示于图 8， 由评价结 果获得的各种参数示于表 1。 在仅经鼻给药胰岛素的大鼠中， 几乎不能观察到血中的胰岛素 浓度上升， 与此相对， 通过与胰岛素一起分别给药序列号 1 ～ 6 的肽， 而观察到从刚给药之 后开始胰岛素向血中移动， 与此同时， 观察到血中葡萄糖浓度降低。 对于由血中胰岛素浓度 变化计算出的生物利用度 (BA)， 仅给药胰岛素的大鼠为 2.3％， 与此相对， 在共同给药序列 号 1 ～ 6 的肽的情况下为 4.4 ～ 20.1％。此外， 对于由血中葡萄糖浓度变化计算出的药学 利用性 (PA)， 在仅给药胰岛素的情况下， 为 4.7％， 在共同给药序列号 1 ～ 6 的肽的情况下 为 15.7％～ 37.5％。
[ 表 1]
产业可利用性
根据本发明， 可以提供能够将迄今为止以注射剂形式给药的亲水性生理活性物质 进行经鼻给药， 从而大幅度改善患者的疼痛、 不便的药剂。 改善这些注射剂带给患者的疼痛 和 / 或去医院的不便不仅可在进行医疗时实现以患者为中心的医疗， 而且从根本上改变迄 今为止的制剂概念， 从而带来划时代的制剂创制。
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