软骨缺损修复体、 制备方法以及一体化软骨 - 骨修复材料 【技术领域】
本发明属于软骨缺损修复技术领域， 涉及一种软骨缺损修复体和一种一体化软 骨 - 骨修复材料， 具体涉及一种具有关节软骨基质结构的软骨缺损修复体及其制备方法以 及基于该软骨缺损修复体的一体化软骨 - 骨修复材料。背景技术
关节软骨损伤是临床上的常见病。 由于软骨本身代谢能力低， 修复能力有限， 即使 小到 4mm 的浅层软骨损伤也不能自行修复。而涉及软骨下骨的全层软骨损伤虽可引起自发 性修复反应 ； 但修复后组织多为纤维软骨和结缔组织， 其生物学性能和强度远远低于天然 关节软骨成分。 最终结果往往是关节软骨剥脱、 退变和骨性关节炎形成， 严重影响患者的生 活质量。即使采用临床上常用的自体软骨移植、 软骨下骨钻孔、 软骨膜移植等手术方法， 也 往往无法达到预期的修复效果。
组织工程的理念和技术为构建能够成功修复关节软骨损伤的人工软骨带来了希 望。 然而目前已报道的人工软骨或软骨修复支架尚存在很多缺陷， 其主要表现为 ： ①力学强 度不理想 ； ②新生软骨细胞数量太少， 取而代之的是大量胶原纤维。其主要原因在于 ： 现阶 段软骨组织工程产品缺乏对天然软骨基质排列结构的充分认识， 只关注天然软骨的基质成 分， 而忽视了天然软骨的基质结构。大多是采用按照制备多孔骨支架的方法制备多孔人工 软骨支架。而天然软骨与骨分处不同的生物学环境， 两者的代谢过程存在很大差异。当按 照人工骨的特点设计的人工软骨支架植入缺损后， 仅能在局部形成力学和功能较差的纤维 软骨， 而非天然的透明软骨从而引起远期的退变发生。
天然关节软骨由表层、 移行层、 辐射层和钙化层四部分组成。 研究发现软骨基质的 胶原纤维从辐射层到移行层呈一种特殊的辐射状排列方式， 即胶原纤维由软骨下骨部分开 始垂直向上走行， 直到软骨表层， 将软骨基质分成一个个纵向排列的小室， 室宽约 30-50 微 米， 室壁厚约 7-10 微米 ； 小室内是纵向排列的卵圆形或短柱状软骨细胞团， 每团约 2-8 细 胞， 每个细胞直径约 7-10 微米。这种纵向排列的小室犹如一根根支柱， 在使用尽可能少胶 原纤维的前提下， 发挥着最大的支撑功能。该结构的特点在于 ： 既能保护软骨细胞、 维持关 节软骨抗压强度， 又能提高软骨细胞与胶原纤维基质间的比例， 实现了关节的透明软骨化。 综上所述， 我们认为根据天然软骨基质的排列结构进行软骨支架设计具有重要意义。 发明内容 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点， 提供一种软骨缺损修复体及其制备 方法以及基于该修复体的一体化软骨 - 骨修复材料， 该种软骨缺损修复体在结构上可以模 拟天然软骨基质的纵向排列状态， 其不但力学强度稳定， 而且可容纳较多种子细胞， 能够通 过在保持强度的前提下结构诱导种子细胞按照支架的框架进行生长， 防止软骨纤维化的发 生， 最终在缺损部位形成天然的透明软骨 ； 并且该修复体可以与骨基质材料复合形成一体 化软骨 - 骨修复材料。
本发明的目的是通过以下技术方案来解决的 ：
这种具有关节软骨基质结构的软骨缺损修复体， 其特征在于 ： 由质量比是 1/3 ～ 3 的胶原和蛋白多糖组成， 其中所述胶原是 I 型或 II 型胶原， 所述蛋白多糖是糖胺聚糖、 壳聚 糖或硫酸软骨素 ； 所述修复体内部呈天然软骨基质的纵向排列方式。
本发明还提供一种上述软骨缺损修复体的制备方法， 具体按照以下步骤 ：
1) 将胶原和蛋白多糖粉末分别溶解于 0.2mol/l 的醋酸溶液中， 分别配置成浓度 为 20g/L 的胶原溶液和蛋白多糖溶液， 将两种溶液分别离心 5 ～ 15 分钟后， 静置脱除溶液 中的气泡 ；
2) 将上述胶原溶液和蛋白多糖溶液按质量比为 1/3 ～ 3 混合， 充分搅拌， 得到混合 溶液 ；
3) 将上述混合溶液注入模具， 迅速置于 -60℃～ -100℃环境中冷冻成型， 待完全 冻结后， 置于冷冻干燥机中冻干 8 ～ 14 小时， 制成多孔复合支架 ；
4) 将上述多孔复合支架置于通风橱内， 使残留醋酸完全挥发 ；
5) 在 2 ～ 6℃下， 将上述多孔复合支架置于京尼平溶液中进行交联反应 18 ～ 36 小时， 再置于甘氨酸溶液中， 待溶液颜色不再变化后取出， 并用 PBS 溶液冲洗 3 ～ 10 分钟 ； 6) 将 上 述 处 理 后 的 多 孔 复 合 支 架 依 次 经 -15 ～ -25 ℃ 冷 冻 18 ～ 36 小 时， 在 -60℃～ -100℃环境中冷冻 1 ～ 2 小时， 在冷冻干燥机中冻干 18 ～ 36 小时后， 即制得所 述的软骨缺损修复体。
进一步的， 上述步骤 5) 中， 所述京尼平溶液的浓度是 10g/L ； 所述甘氨酸溶液的浓 度为 0.2mol/L。
另外， 基于以上所述的软骨缺损修复体， 本发明还提供一种一体化软骨 - 骨修复 材料， 该修复材料由所述修复体与骨基质材料复合制成， 所述骨基质材料是脱抗原牛松质 骨或人工骨材料。
本发明具有以下有益效果 ：
本发明的软骨缺损修复体使用最少量的基质材料 ( 特别是胶原 )， 在结构上模拟 天然软骨基质的纵向排列状态， 其不仅力学强度稳定， 而且可容纳较多种子细胞 ( 如诱导 分化的骨髓基质细胞或软骨细胞 )， 能够在保持强度的前提下结构诱导种子细胞按照支架 的框架进行生长， 防止软骨纤维化的发生， 最终在缺损部位形成天然的透明软骨。另外， 该修复体生物相容性好， 可承载多种种子细胞， 并能与其他骨基质仿生材料复合， 形成软 骨 - 骨一体化的关节软骨修复体。
附图说明
图 1 为本发明的修复体结构示意图 ； 直径 4mm， 高 4mm ； 图 2 为本发明的修复体扫描电镜图， 其中 (a) 为单纯支架图 ； (b) 为细胞复合后图； 图 3-1 为本发明植入术后 12 周缺损修复情况 ( 由左至右以次为苏木精 - 伊红染 色， 甲苯胺蓝染色和番红花染色， 放大 100 倍 ) ；
图 3-2 为对照组术后 12 周缺损修复情况 ( 由左至右以次为苏木精 - 伊红染色， 甲 苯胺蓝染色和番红花染色， 放大 100 倍 ) ；
图 3-3 为本发明植入术后 24 周缺损修复情况 ( 由左至右以次为苏木精 - 伊红染 色， 甲苯胺蓝染色和番红花染色， 放大 100 倍 ) ；
图 3-4 为对照组术后 24 周缺损修复情况 ( 由左至右以次为苏木精 - 伊红染色， 甲 苯胺蓝染色和番红花染色， 放大 100 倍 ) ；
图 3-5 为本发明术后 48 周缺损修复情况 ( 由左至右以次为苏木精 - 伊红染色， 甲 苯胺蓝染色和番红花染色， 放大 100 倍 ) ；
图 3-6 为对照组术后 48 周缺损修复情况 ( 由左至右以次为苏木精 - 伊红染色， 甲 苯胺蓝染色和番红花染色， 放大 100 倍 )。 具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详细描述 ：
本发明的该种具有关节软骨基质结构的软骨缺损修复体， 由质量比是 1/3 ～ 3 的 胶原和蛋白多糖组成， 其中所述胶原是 I 型或 II 型胶原， 所述蛋白多糖是糖胺聚糖、 壳聚糖 或硫酸软骨素。如图 1 所示， 本发明所述的该种修复体内部呈天然软骨基质的纵向排列方 式。
以下结合实施例具体描述本发明的软骨缺损修复体的制备方法 ：
实施例 1 ：
在本实施例中， 按照以下步骤 ：
1) 将 I 型胶原和壳聚糖粉末分别溶解于 0.2mol/l 的醋酸溶液中， 分别配置成浓度 为 20g/L 的 I 型胶原溶液和壳聚糖溶液， 将两种溶液分别离心 5 分钟后， 静置脱除溶液中的 气泡 ；
2) 将上述 I 型胶原溶液和壳聚糖溶液按质量比为 1 ∶ 3 混合， 充分搅拌， 得到混合 溶液 ；
3) 将上述混合溶液注入模具， 迅速置于 -60℃环境中冷冻成型， 待完全冻结后， 置 于冷冻干燥机中冻干 14 小时， 制成多孔复合支架 ；
4) 将上述多孔复合支架置于通风橱内， 使残留醋酸完全挥发 ；
5) 在 2℃下， 将上述多孔复合支架置于浓度为 10g/L 的京尼平溶液中进行交联反 应 18 小时， 再置于浓度为 0.2mol/L 的甘氨酸溶液中， 待溶液颜色不再变化后取出， 并用 PBS 溶液冲洗 10 分钟 ；
6) 将上述处理后的多孔复合支架依次经 -15℃冷冻 36 小时， 在 -100℃环境中冷冻 1 小时， 在冷冻干燥机中冻干 18 小时后， 即制得所述的软骨缺损修复体。
实施例 2
在本实施例中， 按照以下步骤 ：
1) 将 II 型胶原和糖胺聚糖粉末分别溶解于 0.2mol/l 的醋酸溶液中， 分别配置成 浓度为 20g/L 的 II 型胶原溶液和糖胺聚糖溶液， 将两种溶液分别离心 15 分钟后， 静置脱除 溶液中的气泡 ；
2) 将上述 II 型胶原溶液和糖胺聚糖溶液按质量比为 1 ∶ 1 混合， 充分搅拌， 得到 混合溶液 ；
3) 将上述混合溶液注入模具， 迅速置于 -100℃环境中冷冻成型， 待完全冻结后，置于冷冻干燥机中冻干 8 小时， 制成多孔复合支架 ；
4) 将上述多孔复合支架置于通风橱内， 使残留醋酸完全挥发 ；
5) 在 6℃下， 将上述多孔复合支架置于浓度为 10g/L 的京尼平溶液中进行交联反 应 24 小时， 再置于浓度为 0.2mol/L 的甘氨酸溶液中， 待溶液颜色不再变化后取出， 并用 PBS 溶液冲洗 3 分钟 ；
6) 将上述处理后的多孔复合支架依次经 -25℃冷冻 18 小时， 在 -60℃环境中冷冻 2 小时， 在冷冻干燥机中冻干 36 小时后， 即制得所述的软骨缺损修复体。
实施例 3
在本实施例中， 按照以下步骤 ：
1) 将 II 型胶原和硫酸软骨素粉末分别溶解于 0.2mol/l 的醋酸溶液中， 分别配置 成浓度为 20g/L 的 II 型胶原溶液和硫酸软骨素溶液， 将两种溶液分别离心 10 分钟后， 静置 脱除溶液中的气泡 ；
2) 将上述 II 型胶原溶液和硫酸软骨素溶液按质量比为 2 ∶ 1 混合， 充分搅拌， 得 到混合溶液 ；
3) 将上述混合溶液注入模具， 迅速置于 -80℃环境中冷冻成型， 待完全冻结后， 置 于冷冻干燥机中冻干 10 小时， 制成多孔复合支架 ； 4) 将上述多孔复合支架置于通风橱内， 使残留醋酸完全挥发 ；
5) 在 4℃下， 将上述多孔复合支架置于浓度为 10g/L 的京尼平溶液中进行交联反 应 20 小时， 再置于浓度为 0.2mol/L 的甘氨酸溶液中， 待溶液颜色不再变化后取出， 并用 PBS 溶液冲洗 8 分钟 ；
6) 将上述处理后的多孔复合支架依次经 -20℃冷冻 24 小时， 在 -80℃环境中冷冻 1.5 小时， 在冷冻干燥机中冻干 24 小时后， 即制得所述的软骨缺损修复体。
实施例 4 ：
在本实施例中， 按照以下步骤 ：
1) 将 I 型胶原和壳聚糖粉末分别溶解于 0.2mol/l 的醋酸溶液中， 分别配置成浓度 为 20g/L 的 I 型胶原溶液和壳聚糖溶液， 将两种溶液分别离心 8 分钟后， 静置脱除溶液中的 气泡 ；
2) 将上述 I 型胶原溶液和壳聚糖溶液按质量比为 3 ∶ 1 混合 ( 质量比可以在 1/3 ～ 3 之间任意调节 )， 充分搅拌， 得到混合溶液 ；
3) 将上述混合溶液注入模具， 迅速置于 -90℃环境中冷冻成型， 待完全冻结后， 置 于冷冻干燥机中冻干 11 小时， 制成多孔复合支架 ；
4) 将上述多孔复合支架置于通风橱内， 使残留醋酸完全挥发 ；
5) 在 5℃下， 将上述多孔复合支架置于浓度为 10g/L 的京尼平溶液中进行交联反 应 30 小时， 再置于浓度为 0.2mol/L 的甘氨酸溶液中， 待溶液颜色不再变化后取出， 并用 PBS 溶液冲洗 7 分钟 ；
6) 将上述处理后的多孔复合支架依次经 -18℃冷冻 30 小时， 在 -90℃环境中冷冻 1 小时， 在冷冻干燥机中冻干 18 小时后， 即制得所述的软骨缺损修复体。
通过以上制备的具有关节软骨基质结构的软骨缺损修复体， 本发明还利用该修复 体与骨基质材料， 如脱抗原牛松质骨或人工骨材料， 复合制成一体化软骨 - 骨修复材料。
参见图 2， 其中 (a) 是本发明具有关节软骨基质结构的软骨缺损修复体的扫描电 镜图 ； (b) 是本发明的软骨缺损修复体在与细胞复合后的扫描电镜图。为了验证本发明的 应用效果， 本发明做了以下对比实验来证实 ：
本发明在实验中制备了兔股骨下端软骨面非负重区直径 4mm， 深达骨髓腔的软 骨 - 骨缺损。将体外扩增的种子细胞接种本发明后， 植入缺损处， 设立自体软骨移植组和空 白组作为对照。术后 12、 24、 48 周分别通过大体观察、 组织学切片、 软骨区特异性染色的方 法观察缺损修复效果 ：
如图 3-1， 本发明的支架术后 12 周软骨缺损已初步修复， 软骨关节面较平整， 四层 结构已形成。而图 3-2 中的自体软骨组 12 周缺损被大量软骨细胞填充， 但细胞排列结构较 紊乱。两者表现出了明显的差异。
如图 3-3 是本发明的支架术后经过 24 周， 软骨缺损完全修复， 软骨关节面平整光 滑， 与周围正常软骨无显著差异， 这种情况与图 3-4 同时期的空白组形成明显对比， 从图中 可以看出， 24 周缺损虽已修复， 但关节出现塌陷， 明显低于周围正常组织。
如图 3-5 是本发明的支架术后经过 48 周的缺损修复处， 软骨面保持平整， 软骨细 胞大而丰满， 无纤维增生细胞排列紊乱等退变表现。如图 3-6 所示的对照组术后 48 周， 其 新生软骨变薄， 代之以大量纤维结缔组织， 说明软骨已经退变。
综上所述， 空白对照组的术后 12、 24 和 48 周缺损部位始终被大量软组织填充， 无 软骨形成表现。 而本发明设计的具有关节软骨基质结构的软骨缺损修复体能够满足关节软 骨缺损的修复需要， 有效提高关节软骨损伤的修复率， 降低患者伤残的发生率。