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丁香苷在制备治疗急性痛风药物中的应用
    一、 技术领域 ： 本发明涉及中药提取物丁香苷在医学中的新用途， 具体地说是涉及 丁香苷在制备治疗急性痛风药物中的应用。
     二、 背景技术 ：
     痛风 (gouty)， 又称痛风性关节炎 (gouty arthritis)， 是体内嘌呤代谢紊乱所致 的疾病， 表现为血中尿酸过多， 易于使尿酸盐 (MSU) 在关节等组织析出结晶。痛风的急性发 作是由于沉积在关节的 MSU 引起中性粒细胞局部浸润和炎性反应。
     西药在痛风急性发作期选用三种药 ： 秋水仙碱、 非甾体抗炎药和肾上腺皮质激素。 秋水仙碱的作用机制是与中性粒细胞的微管蛋白结合， 从而妨碍粒细胞的活动， 抑制粒细 胞浸润。非甾体抗炎药如吲哚美辛， 抑制环氧酶 (COX) 活性而发挥抗炎作用， 以及选择性 COX2 抑制药。 它们虽然消炎止痛作用快， 但毒副作用也相当明显， 如秋水仙碱的有效剂量与 产生腹泻等胃肠道症状的剂量相近， 非甾体抗炎药在有活动性消化性溃疡、 胃肠道出血情 况下绝对禁用， 而保泰松用药短至 3 周也可致严重的粒细胞减少症或再生障碍性贫血。
     丁香苷 (Syringin) 主要来源于木犀科欧丁香 Syringa vulgaris L. 树皮、 五加 科刺五加 Acanthopanax Senticosus(Puper.et Maxim)Harms 等植物。药理作用研究显 示， 丁香苷有降血脂作用 (Ho-Shan Niu， Feng-Lin Hsu， I-Min Liuc.Role of sympathetic tone in the loss of syringin-induced plasma glucose lowering action in conscious Wistar rats[J].Neuroscience Letters， 445(2008) ： 113 ； Juei-Tang Cheng， I-Min Liu， Tzong-Cherng Chi， et al.Plasma Glucose-Lowering Effect of Tramadol in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats[J].DIABETES， 2001， 50(12) ： 2815.)、对 心 肌缺血的保护作用 ( 张迪 .《刺五加皂苷单体 B 对大鼠急性心肌缺血的保护作用》 ， 2006 年东北师范大学硕士学位论文 .)、 免疫增强作用 ( 张勇 .《紫丁香苷的测定及其降血脂 增强免疫力的研究》 .2004 年吉林大学硕士学位论文 .)、 抗氧化 (Nour-Eddine Es-Safi， Albert Kollmann， Samira Khlifi， et al.Antioxidative effect of compounds isolated from Globularia alypum L.structure-activity relationship[J].2007， 40 ： 1246.)、 抗 抑 郁 (Takahiro Nakazawa， Takaaki Yasuda and Keisuke Ohsawa.Metabolites of orally administered Magnolia officinalis extract in rats and man and its antidepressant-like effects in mice[J].Journal of Pharmacy and Pharmacology， 2003， 55 ： 1583.)， 对人宫颈癌 Hela 细胞、 乳腺癌 MCF-7 细胞、 肺癌 A549 细胞、 前列腺癌 PC-3 细胞及小鼠 S180 实体瘤有明显的抗肿瘤活性 ( 汪琢， 姜守刚， 祖元刚， 等 . 刺五加中紫丁香 苷的提取分离及抗肿瘤作用研究， 时珍国医国药， 2010， 21(3))。目前丁香苷用于制备药物 用途的国家发明专利是在抗疲劳、 镇静安神、 扩张血管、 降低血液粘度、 止血、 抗忧郁、 抗抑 郁方面 ( 苑立超 . 注射用紫丁香苷、 制备方法及应用， CN 101554370.)。
     三、 发明内容
     本 发 明 是 从 刺 五 加 等 植 物 中 分 离 出 丁 香 苷 成 分， 用 MSU 致 人 血 管 内 皮 细 胞 (HUVEC) 损伤的急性痛风模型评价显示， 对 MSU 致 HUVEC 损伤具有保护作用， 并抑制 ICAM-1表达， 可用于制备治疗急性痛风炎症药物。本发明的目的在于提供丁香苷在医学中的新用 途， 具体的说是涉及丁香苷在制备治疗急性痛风药物中的应用。
     本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的 ：
     现代医学病理研究表明， 痛风性关节炎是 MSU 引起中性粒细胞局部浸润和炎 性 反 应， 急 性 痛 风 产 生 的 本 质 是 中 性 粒 细 胞 (PMN)- 血 管 内 皮 细 胞 (HUVEC) 黏 连 增 强 (Terkeltaub R， et al.The murine homolog of the interleukin-8 receptorcxcr-2 is essential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis Rheum， 1998， 41(5) ： 900-909.)， HUVEC 损伤， 其分子生物学基础在于 PMN 与 HUVEC 表面黏附分子的相 互 作 用 (FujiwaraY， et al.Interleukin-8 stimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF-α， IL-1β， IL-8， and IL-l rain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis.LabInvest， 1998， 78(5) ： 559-569.)， 其中细胞间黏 附分子 -1(ICAM-1) 与粘附功能关系最密切， 是急性痛风炎症的重要指标之一 ( 张春， 唐怡， 刘军， 等 . 痛风灵方对尿酸钠致大鼠模型关节软组织 ICAM-1 表达的影响， 重庆医学， 2002， 31(12) ： 1211-1213.)。 因此， 针对急性痛风 MSU 致 HUVEC 损伤， ICAM-1 表达增多的病理特征， 本发明用 MSU 致 HUVEC 损伤的体外急性痛风模型 ( 杨妍华， 尹莲， 王明艳， 等 . 尿酸钠诱导 HUVEC 损伤 的急性痛风模型研究， 中华中医药学刊， 2010， 28(3) ： 592-594.)， 从刺五加中分离出丁香苷 成分， 评价其抗急性痛风炎症活性。
     1 丁香苷的制备
     称取刺五加干粉 4kg， 用 60％～ 90％乙醇回流提取 3 次， 固液比分别为 (1 ∶ 8 ～ 1 ∶ 10 ； 1∶6～1∶8； 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 7)， 0.5 ～ 1.5h/ 次， 滤液合并， 回收乙醇， 浓缩液加 5 ～ 10 倍量水搅拌成混悬液， 用等量石油醚萃取 3 ～ 5 次， 水层再用醋酸乙酯等体积萃取 3 ～ 5 次， 合并醋酸乙酯层， 减压浓缩干燥， 得浸膏， 取浸膏上硅胶柱分离， 依次用氯仿 - 甲醇 极性递增梯度洗脱， 当氯仿 - 甲醇为 100 ∶ 4 时， 洗脱得粗结晶， 再经甲醇重结晶得该化合 物丁香苷晶体。
     该化合物丁香苷晶体经 TLC 薄层鉴别， 与丁香苷对照品斑点位置、 显色颜色一 致。核磁共振氢谱分析， 吸收峰有 ： δ6.72(2H， S)， 6.44(1H， d， 15Hz)， 6.35(1H， d， 15Hz)， 4.10(2H， m)， 4.80(1H， d， 8.9Hz)， 3.77(6H， s)， 3.03(1H， m)， 3.13(1H， m)， 3.18(1H， m)， 3.20(1H， m)， 3.57(2H， m) ； 核磁共振碳谱分析， 吸收峰有 ： δ152.8， 134.0， 132.7， 130.3， 128.5， 104.5， 102.7， 81.6， 77.3， 76.7， 74.3， 70.1， 61.0， 56.5， 与文献基本一致 ( 郑璐， 吴 立军， 沈燕， 等 . 丁香苷的核磁共振研究 [J]. 波谱学杂志， 1999， 16(5) ： 465.)， 确定该化合 物为丁香苷 (Syringin)， 分子式 (C 17H24O9)， 分子量 (372.37)。
     2 丁香苷抗急性痛风炎症实验
     2.1 溶液配制
     5g 尿酸加 1000mL 蒸馏水煮沸， 加 5％ NaOH 溶液调 PH 7.4， 搅拌， 冷却析晶制成尿 酸钠结晶 (MSU)。将制好的 MSU 10mg 高压灭菌， 加不含血清的 DMEM 培养液 10mL， 研磨配成 1mg/mL 的 DMEM 溶液。实验时， 此溶液再加 DMEM 培养液配成不同浓度 DMEM 的 MSU 溶液。
     丁香苷 2.5mg， 用二甲基亚砜 (DMSO) 溶解， DMSO 终浓度＜ 0.02％， 再加无血清的
     DMEM 培养液， 配制成浓度 2.5μg/mL、 25μg/mL、 250μg/mL。
     阳性药吲哚美辛 2.0mg， 方法同丁香苷， 配制浓度 20μg/mL。
     2.2 血管内皮细胞的体外培养
     人脐静脉血管内皮细胞 HUVEC 株由南京中医药大学基础医学院提供， 细胞经支原 体检测， 无支原体污染， 细胞经 0.25％胰蛋白酶消化， 含 10％小牛血清的 DMEM 培养液中和， 离心 (1000r/min×6min)， 去上清液， 加含 10 ％小牛血清的 DMEM 培养液， 移入细胞培养瓶 中， 放 37℃、 5％ CO2 培养箱中传代培养。
     2.3 对 MSU 刺激 HUVEC 活力的影响
     HUVEC 在培养瓶中培养， 待生长至 70 ％～ 80 ％融合时， 以 0.25 ％胰蛋白酶消化、 离心， 10 ％小牛血清 DMEM 培养液洗涤 3 次， 用 10 ％小牛血清 DMEM 培养液调成 4×104/mL 细胞悬液， 植入 96 孔板 ( 每孔 200μL)， 培养 24 小时后轻吸出原培养液， 进行以下实验， 每 组各 8 孔， 具体分组及加液如下 ： 对照组 (200μLDMEM 培养液 )、 模型组 (100μg/mLMSU 溶 液 )、 干预 A 组 (100μg/mL MSU 溶液 +2.5μg/ml 丁香苷 )、 干预 B 组 (100μg/mL MSU 溶液 +25μg/ml 丁香苷 )、 干预 C 组 (100μg/mL MSU 溶液 +250μg/ml 丁香苷 )， 加液后继续放 37℃、 5％ CO2 培养箱中培养 24 小时， 收集上清液， 剩余的 HUVEC 用于测定细胞活性， 每孔再 加 5mg/mLMTT 液 20μL， 继续放 37℃、 5％ CO2 培养箱中培养 4 小时后， 弃 MTT 液， 加入二甲 基亚砜 200μL 溶解， 震荡， 于酶标仪读取吸光度值， 波长 490nm。
     阳性药组加液 (100μg/mL MSU 溶液 +20μg/mL 吲哚美辛 )， 其它方法同上。
     数据统计学处理， 细胞活力 (％ ) ＝实验组吸光度值 / 对照组吸光度值 ×100％， 结果见表 1。
     与对照组对比， 模型组细胞活力显著减小 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)， 阳性药吲哚美辛 及丁香苷干预后细胞活力显著提高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)， 并强于对照组， 其中， 丁香苷各 浓度组的细胞活力强于阳性药吲哚美辛。
     表 1 丁香苷对 MSU 刺激的血管内皮细胞活力的影响
     ** △△ △ 注： 与模型组相比， P ＜ 0.01 ； 与对照组相比， P ＜ 0.01， P ＜ 0.05
     2.4 对 ICAM-1 表达影响
     将处于对数生长期的 HUVEC 用 0.25％的胰蛋白酶消化， 轻轻吹打， 制成细胞悬液， 9 调整细胞密度为 5×10 /L， 接种于细胞培养瓶中。待细胞长满后 ( 约 24h)， 弃去上清液， 分
     为下列组 ： 对照组、 模型组 (100μg/mLMSU 溶液 )、 丁香苷组 (100μg/mLMSU 溶液 +25μg/mL 丁香苷 )， 继续培养 24 小时， PBS 收集细胞， 离心去上清， 加入 CD54 单克隆抗体， 30min 后， PBS 洗涤， 重悬细胞， 应用流式细胞仪检测其阳性细胞百分率 (n ＝ 10000)， 重复 3 次， 结果 见图 1。
     结果显示， 空白组 HUVEC 几乎无 ICAM-1 表达， 模型组 ICAM-1 的表达最高， 与模型 组相比， 丁香苷对 ICAM-1 的表达有较强的抑制作用。
     2.5 对 MSU 刺激 HUVEC 细胞形态的影响
     六孔板中各放入一张无菌的盖玻片， 将处于对数生长期的 HUVEC 用 0.25％的胰蛋 5 白酶消化， 轻轻吹打， 制成细胞悬液， 1×10 / 孔接种于六孔板中， 待细胞长满后 ( 约 24h)， 弃去上清液， 分为 3 组 ： 对照组 (200μL DMEM 培养液 )、 模型组 (100μg/mLMSU 溶液 )、 丁香 苷组 (100μg/mLMSU 溶液 +25μg/mL 丁香苷 )， 继续培养 24 小时， 分别加 10μl AO/EB 溶液 (100μg/ml AO ； 100μg/ml EB)， 1 分钟后在显微镜下观察， 见图 2(A-C)。
     正常组细胞核完全完整， 无皱缩现象 ； 模型组橘色凋亡细胞明显， 细胞损伤严重 ； 丁香苷干预后凋亡细胞明显减少。结果表明， 丁香苷可显著保护 MSU 致 HUVEC 的损伤， 减少 细胞凋亡。 有益效果
     研究结果表明， 用 MSU 致 HUVEC 损伤的急性痛风模型评价显示， 丁香苷可保护 MSU 致 HUVEC 损伤， 减少细胞凋亡， 提高细胞活性， 抑制 ICAM-1 表达， 具有抗急性痛风炎症的活 性， 丁香苷可用于制备治疗急性痛风炎症药物。
     四、 图面说明
     图 1 丁香苷对 MSU 致 HUVEC 损伤 ICAM-1 表达的抑制作用
     图 2 丁香苷对 MSU 诱导的 HUVEC 细胞核的影响
     A- 对照组、 B- 模型组、 C- 丁香苷组。
     五、 具体实施方式
     实施例 1 丁香苷制备
     称 取 刺 五 加 干 粉 2kg， 70 ％ 乙 醇 回 流 提 取 3 次， 固 液 比 分 别 为 (1 ∶ 8 ； 1∶6； 1 ∶ 5)， 1h/ 次， 滤液合并， 回收乙醇， 浓缩液加 8 倍量水搅拌成混悬液， 用等量石油醚萃取 3 次， 水层再用醋酸乙酯等体积萃取 4 次， 合并醋酸乙酯层， 减压浓缩干燥， 得浸膏。取浸膏上 硅胶柱分离， 依次用氯仿 - 甲醇极性递增梯度洗脱， 当氯仿 - 甲醇为 100 ∶ 4 时， 洗脱得粗 结晶， 再经甲醇重结晶得丁香苷晶体。
     实施例 2 丁香苷保护 HUVEC 活性
     丁香苷 0.20mg， 用二甲基亚砜 (DMSO) 溶解， DMSO 终浓度＜ 0.02％， 再加无血清的 DMEM 培养液， 配制成浓度 20μg/mL。
     HUVEC 在培养瓶中培养， 待生长至 70％～ 80％融合时， 以 0.25％胰蛋白酶消化、 离 4 心， 10％小牛血清 DMEM 培养液洗涤 3 次， 用 10％小牛血清 DMEM 培养液调成 4×10 /mL 细胞 悬液， 植入 96 孔板 ( 每孔 200μL)， 培养 24 小时后轻吸出原培养液， 进行以下实验。每组 各 8 孔， 具体分组及加液如下 ： 对照组 (200μL DMEM 培养液 )、 模型组 (100μg/mL MSU 溶 液 )、 丁香苷组 (100μg/mL MSU 溶液 +20μg/ml 丁香苷 )， 加液后继续放 37℃、 5％ CO2 培养箱中培养 24 小时， 收集上清液， 剩余的内皮细胞用于测定细胞活性， 每孔再加 5mg/mL MTT 液 20μL， 继续放 37℃、 5％ CO2 培养箱中培养 4 小时后， 弃 MTT 液， 加入二甲基亚砜 200μL 溶解， 震荡， 于酶标仪读取吸光度值， 波长 490nm。
     实施例 3 丁香苷抑制 ICAM-1 表达
     将处于对数生长期的 HUVEC 用 0.25％的胰蛋白酶消化， 轻轻吹打， 制成细胞悬液， 9 调整细胞密度为 5×10 /L， 接种于细胞培养瓶中。待细胞长满后 ( 约 24h)， 弃去上清液， 分 为下列组 ： 对照组、 模型组 (100μg/mLMSU 溶液 )、 丁香苷组 (100μg/mLMSU 溶液 +20μg/mL 丁香苷 )， 继续培养 24 小时， PBS 收集细胞， 离心去上清， 加入 CD54 单克隆抗体， 30min 后， PBS 洗涤， 重悬细胞， 应用流式细胞仪检测其阳性细胞百分率 (n ＝ 10000)。