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一种哈茨木霉菌(Trichoderma?harzianum)HN-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年5月18日，保藏编号为CCTCC?NO.M2010119。该菌株对蔬菜病和烟草病害有较强的抑制作用，尤其是对辣椒白绢病、豇豆立枯病、姜瘟病、及烟草青枯病有较强的抑制效果。。
CN201010226129.6
2010.07.14
CN101928673A
2010.12.29
授权
有权
专利申请权的转移IPC(主分类):C12N 1/14变更事项:申请人变更前权利人:洪亚辉变更后权利人:湖南农业大学变更事项:地址变更前权利人:410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学生物科学技术学院变更后权利人:410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学变更事项:共同申请人变更前权利人:湖南农业大学登记生效日:20110609|||授权|||专利申请权的转移IPC(主分类):C12N 1/14变更事项:申请人变更前权利人:洪亚辉变更后权利人:洪亚辉变更事项:地址变更前权利人:410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学生物科学技术学院变更后权利人:410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学生物科学技术学院变更事项:共同申请人变更后权利人:湖南农业大学登记生效日:20110513|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/14申请日:20100714|||公开
C12N1/14; A01N63/04; A01P3/00; C12R1/885(2006.01)N
C12N1/14
洪亚辉
洪亚辉; 周双德; 程鹏
410128 湖南省长沙市芙蓉区东湖湖南农业大学生物科学技术学院
长沙正奇专利事务所有限责任公司 43113
何为
一种哈茨木霉菌(Trichoderma??harzianum)HN-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年5月18日，保藏编号为CCTCC??NO.M2010119。该菌株对蔬菜病和烟草病害有较强的抑制作用，尤其是对辣椒白绢病、豇豆立枯病、姜瘟病、及烟草青枯病有较强的抑制效果。
1.一种哈茨木霉菌株，其特征在于：该菌株为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)HN-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年5月18日，保藏编号为CCTCC NO.M2010119。2.如权利要求1所述的菌株在抑制辣椒白绢病中的作用。3.如权利要求1所述的菌株在抑制姜瘟病中的作用。4.如权利要求1所述的菌株在抑制豇豆立枯病中的作用。5.如权利要求1所述的菌株在抑制烟草青枯病中的作用。
哈茨木霉菌 技术领域：本发明涉及微生物领域，尤指一种哈茨木霉菌HN-2。 背景技术：随着化学杀菌剂对生态环境、有益生物及人体所引致负作用的加大，以及植物病原菌日益增加的抗药性，利用一些生物防治菌作为生物杀菌剂来防治植物病害，以减轻化学农药对环境污染的研究引起了世界各国科学家的广泛兴趣。 木霉菌自被发现对植物病原菌有抑制作用以来，一直作为一种重要的植物病害生物防治因子而倍受关注。从Weindling于1932年首次发现木素木霉菌对多种植物病原菌具有寄生作用以来，应用其进行植物病害的防治已有大量的报道。近几年随着多种商品化木霉制剂研制开发的成功，使得木霉菌应用于植物真菌病害生物防治的研究得到迅速发展，为植物病原真菌的生物防治在实际操作上的可行性利用提供了有效的探索途径，并展示出可喜的应用前景。 发明内容：本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种对蔬菜病抑制效果明显的哈茨木霉菌HN-2。 本发明所述的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)HN-2，已于2010年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.M2010119。 本发明的哈茨木霉菌HN-2在PDA培养基上生长，菌落开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色。菌落周围有白色菌丝的生长带。最后整个菌落全部变成绿色。菌丝白色，纤细，产生分生孢子。本发明菌株适应性很强，孢子在PDA培养基平板上28℃时萌发，菌落迅速扩展。培养2天，菌落直径为3.5～5.0厘米；培养3天，菌落直径为7.3～8.0厘米，即布满整个平板。菌丝生长pH值为5-7，在pH值为6时生 长最快最好。 通过普通光学显微镜观察，可以看到菌丝纵横交错，呈网络状；菌落在PDA平板上生长快，菌丝层较厚，菌丝密集如毡，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生分生孢子而呈绿色。电镜观察结果表明，分生孢子壁光滑，没有刺突。菌落老熟时暗绿色，反面同色孢子梗丛束疏松，环状排列。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团；主分枝呈树状，其上很多次级分枝，常常2～3个一组，直角伸出。整个分枝系统呈金字塔状瓶梗短，基部变细，中间膨大，大角度伸出终极瓶梗长而细，5个以内的瓶梗近似轮状排列。分生孢子球形，短的倒卵形，基部平截，孢子小。 本发明菌株产几丁质酶，纤维素酶，过氧化物酶，水解酶，能使明胶液化、能水解淀粉，能水解果胶和纤维素。 用CTAB法提取本发明菌株的DNA，然后采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，获得扩增片段，扩增片段测序。序列经GenBank中BLAST比对，结果表明本发明菌株属为哈茨木霉，与登陆号为FJ461563.1的Trichoderma harzianum核糖体DNAITS序列相似率达98.75％，通过ITS序列分析鉴定表明本发明菌株为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的一个新种，命名为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)HN-2。 本发明菌株对蔬菜病抑制作用明显，抑制率达70％以上，有较强的抑制效果，还对烟草病害有较强的抑制效果；且因本发明菌株属哈茨木霉，产几丁质酶，纤维素酶，在工农也上可以较好的运用，比如农作物的秸杆，可以通过它来降解，减少焚烧带来的大气，环境污染，有利于发展低碳，循环经济，解决能源问题，发展微生物工业，促进环境友好型社会良好发展。 具体实施方式：实施例1， 将从湖南省醴陵市采集到的重病区辣椒田土样碾碎，呈微细粉末状，盛于灭菌三角瓶中，每三角瓶装20克样土，加适量无菌水润湿，无菌水所加量视土壤干湿程度而定，一般2-5mL。然后将病原菌Sclerotium rolfsii Sacc.菌核置于样土中，每三角瓶15粒，用黑色塑料膜封口，置于阴暗处。每隔5d-6d，洒少许无菌水，混匀三角瓶中土样，使样土保持湿润状态。20d后，从土壤中挑出已腐烂的菌核，接种到PDA培养基平皿上(超净工作台上完成)，置于培养箱中28℃恒温培养。3d后，挑取单个菌落接种到PDA培养基的平皿上，多次纯化，即可得到本发明菌株。 实施例2，本发明菌株对辣椒白绢病的抑制作用： 在超净工作台上将辣椒白绢病致病菌用灭菌后的接种环接种到PDA培养基平板的一侧，同时用将本发明菌株接种到PDA培养基的另一侧，于28℃的恒温培养箱中倒置培养，并观察记录抑制效果，用十字交叉法测量病原菌菌落半径，以只接种致病菌的平板作对照，并按下列公式计算平板培养第7天本发明菌株对辣椒白绢病的抑菌率。 抑菌率(％)＝[(对照菌落半径-与本发明菌株对峙培养的菌落半径)/对照菌落半径]×100％。 结果表明，本发明菌株的抑菌率为80.5％，说明了本发明菌株对辣椒白绢病的生长有较强的抑制作用，对辣椒白绢病有较强的抑制效果。 实施例3，本发明菌株对姜瘟病的抑制作用： 将姜瘟病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基的平皿上，再在28℃活化3d的本发明菌株的PDA平板上，挑取直径4mm的菌块，将本发明菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块。每处理3次重复。以仅接种姜瘟病原菌的培养皿为对照。在28℃恒温培养箱中倒置培养5d，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。 抑菌率(％)＝(对照病原菌的菌落直径-处理病原菌的菌落直径)/对照病原菌的菌落直径×100％。 结果表明：本发明菌株的抑菌率为72.8％，说明了本发明菌株对姜瘟病的生长有较强的抑制作用，对姜瘟病有较强的抑制效果，能有效抑制致病菌生长，运用到实际生活中，有益姜的生长，减少姜瘟的发生，从而提高农民的经济收益。 实施例4，本发明菌株对豇豆立枯病的抑制作用： 将豇豆立枯病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基的平皿上，再在28℃活化3d的本发明菌块的PDA平板上，挑取直径4mm的菌块，将本发明菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块。每处理3次重复。以仅接种豇豆立枯病原菌的培养皿为对照。在28℃恒温培养箱中倒置培养5d，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。 结果表明，本发明菌株的抑菌率为80.5％，说明了本发明菌株对豇豆立枯病的生长有较强的抑制作用。 实施例5，本发明菌株对烟草青枯病的抑制作用： 将烟草青枯病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基的平皿上，再在28℃活化3d的本发明菌块的PDA平板上，挑取直径4mm的菌块，将本发明菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块。每处理3次重复。以仅接种烟草青枯病原菌的培养皿为对照。在28℃恒温培养箱中倒置培养5d，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。 观察结果显示：本发明菌株布满整个平板，而致病菌少量生长，抑菌率为95.6％。说明了本发明菌株对烟草青枯病的生长有很强的抑制作用。
技术领域：
本发明涉及微生物领域，尤指一种哈茨木霉菌HN-2。
背景技术：
随着化学杀菌剂对生态环境、有益生物及人体所引致负作用的加大，以及植物病原菌日益增加的抗药性，利用一些生物防治菌作为生物杀菌剂来防治植物病害，以减轻化学农药对环境污染的研究引起了世界各国科学家的广泛兴趣。
木霉菌自被发现对植物病原菌有抑制作用以来，一直作为一种重要的植物病害生物防治因子而倍受关注。从Weindling于1932年首次发现木素木霉菌对多种植物病原菌具有寄生作用以来，应用其进行植物病害的防治已有大量的报道。近几年随着多种商品化木霉制剂研制开发的成功，使得木霉菌应用于植物真菌病害生物防治的研究得到迅速发展，为植物病原真菌的生物防治在实际操作上的可行性利用提供了有效的探索途径，并展示出可喜的应用前景。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种对蔬菜病抑制效果明显的哈茨木霉菌HN-2。
本发明所述的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)HN-2，已于2010年5月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.M2010119。
本发明的哈茨木霉菌HN-2在PDA培养基上生长，菌落开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色。菌落周围有白色菌丝的生长带。最后整个菌落全部变成绿色。菌丝白色，纤细，产生分生孢子。本发明菌株适应性很强，孢子在PDA培养基平板上28℃时萌发，菌落迅速扩展。培养2天，菌落直径为3.5～5.0厘米；培养3天，菌落直径为7.3～8.0厘米，即布满整个平板。菌丝生长pH值为5-7，在pH值为6时生 长最快最好。
通过普通光学显微镜观察，可以看到菌丝纵横交错，呈网络状；菌落在PDA平板上生长快，菌丝层较厚，菌丝密集如毡，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生分生孢子而呈绿色。电镜观察结果表明，分生孢子壁光滑，没有刺突。菌落老熟时暗绿色，反面同色孢子梗丛束疏松，环状排列。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立，分枝，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团；主分枝呈树状，其上很多次级分枝，常常2～3个一组，直角伸出。整个分枝系统呈金字塔状瓶梗短，基部变细，中间膨大，大角度伸出终极瓶梗长而细，5个以内的瓶梗近似轮状排列。分生孢子球形，短的倒卵形，基部平截，孢子小。
本发明菌株产几丁质酶，纤维素酶，过氧化物酶，水解酶，能使明胶液化、能水解淀粉，能水解果胶和纤维素。
用CTAB法提取本发明菌株的DNA，然后采用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，获得扩增片段，扩增片段测序。序列经GenBank中BLAST比对，结果表明本发明菌株属为哈茨木霉，与登陆号为FJ461563.1的Trichoderma harzianum核糖体DNAITS序列相似率达98.75％，通过ITS序列分析鉴定表明本发明菌株为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的一个新种，命名为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)HN-2。
本发明菌株对蔬菜病抑制作用明显，抑制率达70％以上，有较强的抑制效果，还对烟草病害有较强的抑制效果；且因本发明菌株属哈茨木霉，产几丁质酶，纤维素酶，在工农也上可以较好的运用，比如农作物的秸杆，可以通过它来降解，减少焚烧带来的大气，环境污染，有利于发展低碳，循环经济，解决能源问题，发展微生物工业，促进环境友好型社会良好发展。
具体实施方式：
实施例1，
将从湖南省醴陵市采集到的重病区辣椒田土样碾碎，呈微细粉末状，盛于灭菌三角瓶中，每三角瓶装20克样土，加适量无菌水润湿，无菌水所加量视土壤干湿程度而定，一般2-5mL。然后将病原菌Sclerotium rolfsii Sacc.菌核置于样土中，每三角瓶15粒，用黑色塑料膜封口，置于阴暗处。每隔5d-6d，洒少许无菌水，混匀三角瓶中土样，使样土保持湿润状态。20d后，从土壤中挑出已腐烂的菌核，接种到PDA培养基平皿上(超净工作台上完成)，置于培养箱中28℃恒温培养。3d后，挑取单个菌落接种到PDA培养基的平皿上，多次纯化，即可得到本发明菌株。
实施例2，本发明菌株对辣椒白绢病的抑制作用：
在超净工作台上将辣椒白绢病致病菌用灭菌后的接种环接种到PDA培养基平板的一侧，同时用将本发明菌株接种到PDA培养基的另一侧，于28℃的恒温培养箱中倒置培养，并观察记录抑制效果，用十字交叉法测量病原菌菌落半径，以只接种致病菌的平板作对照，并按下列公式计算平板培养第7天本发明菌株对辣椒白绢病的抑菌率。
抑菌率(％)＝[(对照菌落半径-与本发明菌株对峙培养的菌落半径)/对照菌落半径]×100％。
结果表明，本发明菌株的抑菌率为80.5％，说明了本发明菌株对辣椒白绢病的生长有较强的抑制作用，对辣椒白绢病有较强的抑制效果。
实施例3，本发明菌株对姜瘟病的抑制作用：
将姜瘟病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基的平皿上，再在28℃活化3d的本发明菌株的PDA平板上，挑取直径4mm的菌块，将本发明菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块。每处理3次重复。以仅接种姜瘟病原菌的培养皿为对照。在28℃恒温培养箱中倒置培养5d，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。
抑菌率(％)＝(对照病原菌的菌落直径-处理病原菌的菌落直径)/对照病原菌的菌落直径×100％。
结果表明：本发明菌株的抑菌率为72.8％，说明了本发明菌株对姜瘟病的生长有较强的抑制作用，对姜瘟病有较强的抑制效果，能有效抑制致病菌生长，运用到实际生活中，有益姜的生长，减少姜瘟的发生，从而提高农民的经济收益。
实施例4，本发明菌株对豇豆立枯病的抑制作用：
将豇豆立枯病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基的平皿上，再在28℃活化3d的本发明菌块的PDA平板上，挑取直径4mm的菌块，将本发明菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块。每处理3次重复。以仅接种豇豆立枯病原菌的培养皿为对照。在28℃恒温培养箱中倒置培养5d，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。
结果表明，本发明菌株的抑菌率为80.5％，说明了本发明菌株对豇豆立枯病的生长有较强的抑制作用。
实施例5，本发明菌株对烟草青枯病的抑制作用：
将烟草青枯病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基的平皿上，再在28℃活化3d的本发明菌块的PDA平板上，挑取直径4mm的菌块，将本发明菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块。每处理3次重复。以仅接种烟草青枯病原菌的培养皿为对照。在28℃恒温培养箱中倒置培养5d，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。
观察结果显示：本发明菌株布满整个平板，而致病菌少量生长，抑菌率为95.6％。说明了本发明菌株对烟草青枯病的生长有很强的抑制作用。
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