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1、10申请公布号CN102078613A43申请公布日20110601CN102078613ACN102078613A21申请号201010551237022申请日20020809DSMACC252720010904DSMACC25172001072401119260620010809EP02815615320020809A61K45/00200601A61K39/395200601A61K49/00200601A61P35/00200601G01N33/50200601C12N5/18200601C07K16/2820060171申请人马普科技促进协会地址德国慕尼黑72发明人A乌尔里克E赫顿范。
2、德霍斯特74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人罗菊华54发明名称HER3活性抑制剂57摘要本发明涉及包含HER3活性抑制剂、特别是抗HER3抗体为活性剂的药物组合物。本发明进一步公开了该组合物在诊断、预防或治疗过度增殖性疾病、特别是肿瘤疾病中的用途。30优先权数据62分案原申请数据83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书9页附图43页CN102078616A1/2页21药物组合物，其包含HER3活性抑制剂为活性剂以及药物可接受的载体、稀释剂和/或助剂，其中所述抑制剂与HER3的结合可降低HER3介导的信号转。
3、导。2权利要求1的组合物，其中通过下调HER3导致所述信号转导降低。3权利要求1的组合物，其中通过使HER3稳定于基本失活的形式而导致所述信号转导降低。4权利要求13中任一项的组合物，其中该抑制剂并不竞争HEREGULIN与HER3的结合。5权利要求14中任一项的组合物，其中所述抑制剂是抗HER3抗体。6权利要求5的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段。7权利要求5的组合物，其中所述抗体是重组抗体或抗体片段。8权利要求7的组合物，其中所述重组抗体或抗体片段选自嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体及其片段。9权利要求58的组合物，其中所述抗体偶联标记基团或效应基团。10权利要求59的组合物，其中该。
4、抗体选自杂交瘤细胞系DSMACC2527或DSMACC2517产生的抗体1B4C3和2D1D12、其片段或其重组衍生物。11权利要求110中任一项的组合物，其包含另一活性剂。12权利要求111中任一项的组合物，其用于诊断性应用。13权利要求111中任一项的组合物，其用于治疗性应用。14权利要求110中任一项定义的HER3活性抑制剂的用途，用于制备供诊断、预防或治疗过度增殖性疾病、特别是肿瘤疾病的药剂。15权利要求14的用途，其中所述抑制剂是抗HER3抗体。16权利要求15的用途，其中该抗体选自杂交瘤细胞系DSMACC2527或DSMACC2517产生的抗体1B4C3和2D1D12、其片段或其重。
5、组衍生物。17权利要求1416中任一项的用途，用于诊断、预防或治疗乳癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤或肿瘤转移形成。18权利要求1417中任一项的用途，其中所述疾病与HER3的磷酸化提高有关。19权利要求1418中任一项的用途，其中所述疾病与HER2/HER3的异二聚体化提高有关。20权利要求1419中任一项的用途，其中所述疾病与PI3激酶、CJUN末端激酶、AKT、ERK2和/或PYK2的活性提高有关。21诊断、预防或治疗过度增殖性疾病、特别是肿瘤疾病的方法，其包含给予有此需要的受试者有效量的权利要求110中任一项定义的HER3活性抑制剂。22权利要求21的方法，其中所述抑。
6、制剂是抗HER3抗体。23权利要求22的方法，其中该抗体选自杂交瘤细胞系DSMACC2527或DSMACC2517产生的抗体1B4C3和2D1D12、其片段或其重组衍生物。24权利要求2123中任一项的方法，其中所述受试者是人。25用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病、特别是肿瘤疾病的新型药剂的鉴定方法，其包含分析候选化合物是否能够抑制HER3活性，其中所述抑制剂与HER3的结合可降低HER3介导的信号转导。权利要求书CN102078613ACN102078616A2/2页326权利要求25的方法，其中将HER3抑制剂或其衍生化合物配制成药物组合物。27杂交瘤细胞系DSMACC2517以及其衍生。
7、的细胞系。28杂交瘤细胞系DSMACC2527以及其衍生的细胞系。29权利要求27或28的细胞系产生的抗体。权利要求书CN102078613ACN102078616A1/9页4HER3活性抑制剂0001发明描述0002本发明涉及包含HER3活性抑制剂、特别是抗HER3抗体为活性剂的药物组合物。本发明进一步公开了该组合物在诊断、预防或治疗过度增殖性疾病、特别是肿瘤疾病中的用途。0003已知蛋白质酪氨酸激酶是介导可调节细胞生长和分化的信号转导过程的酶。受体蛋白质酪氨酸激酶通过配体刺激的底物酪氨酸磷酸化而起作用。HER3也称为ERBB3是受体蛋白质酪氨酸激酶表皮生长因子受体EGFR亚家族的成员PLO。
8、WMAN等人，PROCNATLACADSCIUSA871990，49054909；KRAUS等人，PROCNATLACADSCIUSA861989，91939197以及KRAUS等人，PROCNATLACADSCIUSA901993，29002904。0004已经发现HER3在若干癌症类型、例如乳腺、胃肠道和胰腺癌中过表达。若HER3与受体蛋白质酪氨酸激酶EGFR亚家族的另一成员HER2共表达，则形成活性异二聚体信号复合物。0005针对HER3的单克隆抗体RAJKUMAR等人，BRJCANCER701994，459456对表达HER3的细胞系的无贴壁依赖性生长具有激动效应。另一方面，据报道美国。
9、专利5,968,511对应于WO97/35885所述抗HER3抗体可降低HEREGULIN诱导的HER2/HER3异二聚体形成。然而，只是对提高HEREGULIN与HER3结合的抗体证明了这种活性。因此，尚不清楚哪种类型的抗HER3抗体如果存在的话具有供治疗性应用的潜能。0006VADLAMUDI等人ONCOGENES181999，305314描述了通过HER2受体调节环加氧酶COX2途径。发现COX2的特异性抑制剂能够抑制结肠直肠癌细胞的促有丝分裂及侵袭作用。进一步发现，与单克隆抗HER3抗体温育可致HER2/HER3异二聚体水平下降，但是只部分降低COX2表达。0007WO00/31048。
10、公开了可用作受体酪氨酸激酶例如EGFR、HER2和HER4抑制剂的喹唑啉QUINAZOLINE衍生物。但未公开HER3的抑制。0008WO00/78347公开了阻止或抑制细胞生长的方法，其中包含防止或降低ERBB2/ERBB3异二聚体形成。例如，该药剂可以是抗HER2胞外域抗体与抗HER3抗体例如购自NEOMARKERS的HER3抗体H31055的组合。然而尚不清楚需要何种类型的抗HER3抗体，以获得所需治疗效果。0009美国专利5,804,396描述了用于治疗增殖性疾病的药剂的鉴定方法，其中包含对一种潜在的药剂通过HER2/HER3或HER2/HER4或HER3/HER4异二聚体抑制信号转导。
11、的活性进行分析的步骤。并未公开特异性的HER3抑制剂。0010在表达不同HER2HER3比例的侵袭性乳癌细胞系MCR7DKFZHEIDELBERG、MDAMB468ATCCHTB132和MDAMB231ATCCHTB26中，我们比较了一种激动性的抗HER2单克隆抗体HERCEPTIN与抗HER3抗体的生物学特性，即I小鼠单克隆抗体IGG1，HER3ECD，UPSTATEBIOTECHNOLOGY，目录号05471，针对HER3的HEREGULIN结合位点，II我们实验室的抗体1B4C3以及III同样来自我们实验室的抗体2D102。我们提供了说明书CN102078613ACN102078616A。
12、2/9页5证据，证明利用抗HER3抗体在/HEREGULIN/HRG刺激之前预处理乳癌细胞系，与HERCEPTIN相比，可减少HER2/HER3酪氨酸磷酸化程度。此外，抗HER3抗体取消了HER2/HER3的异二聚体化，还降低了PI3激酶的P85亚基和连接ADAPTOR蛋白质SHC与HER3的复合物形成，分别导致PI3激酶和CJUN末端激酶活性JNK下降。与HERCEPTIN相比，抗HER3抗体也能够在/HRG刺激之后下调细胞外信号调节的激酶2ERK2。此外我们证明，在利用抗HER3抗体预处理之后，乳癌细胞系的迁移和增殖特性显著下降。我们的数据清楚表明，在HRG刺激之后，抗HER3抗体比HER。
13、CEPTIN更有效降低信号转导过程。此外，在特定癌症类型例如黑色素瘤中，抗HER3抗体可有效降低迁移和增殖特性，而抗HER2抗体根本没有任何显著作用。这些数据证明，抗HER3抗体或其它HER3抑制剂具有治疗乳癌及其它以通过HER3及其异二聚体化配偶体的超级信号为特征的恶性肿瘤的巨大潜能。0011因此，本发明涉及包含HER3活性的特定类型抑制剂为活性剂以及药物可接受的载体、稀释剂和/或助剂的药物组合物。本发明的HER3抑制剂的特征在于，该抑制剂与HER3的结合可降低HER3介导的信号转导。在一个实施方案中，通过下调HER3引起HER3分子至少部分从细胞表面消失，从而导致HER3介导的信号转导下降。
14、。在本发明另一实施方案中，通过使细胞表面的HER3分子稳定于基本失活的形式，即比非稳定形式显示较低的信号转导的形式，从而导致HER3介导的信号转导下降。0012本发明的抑制剂可能影响HEREGULIN与HER3的结合，特别是降低HEREGULIN与HER3的结合。但在另一实施方案中，该抑制剂可能并不竞争HEREGULIN与HER3的结合。0013在优选实施方案中，该抑制剂是抗HER3抗体。优选地，该抗体针对HER3的胞外域。然而应当注意，也可能使用其它HER3抑制剂，特别是低分子量抑制剂，例如肽或有机化合物。0014根据本发明，术语”抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种抗体形成的多特异。
15、性抗体例如双特异性抗体以及抗体片段，只要其具有所需活性即可。0015该抗体可以是利用等人NATURE2561975，495所述杂交瘤方法或重组DNA方法例如参见美国专利4,816,567获得的单克隆抗体。也可以利用CLACKSON等人NATURE3521991，624628以及MARKS等人JMOLBIOL2221991，581597所述技术，从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。该抗体可以是IGM、IGG，例如IGG1、IGG2、IGG3或IGG4。0016抗体片段包含抗体的一部分，一般是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括FAB、FAB、FAB2和FV片段、双功能抗体DIABODY。
16、、单链抗体分子以及多特异性抗体片段。0017特别而言，该抗体可以是重组抗体或抗体片段，更特别而言，选自嵌合抗体或其片段MORRISON等人，PROCNATLACADSCIUSA811984，68516855、人源化抗体JONES等人，NATURE3211986，522525；RIECHMANN等人，NATURE3321988，323329以及PRESTA，CURROPSTRUCTBIOL21992，593596、单链FV抗体PLCKTUHN在THEPHARMACOLOGYOFMONOCLONALANTIBODIES113，ROSENBURG和MOORE，EDS，SPRINGERVERLAG，N。
17、Y1994，PP269315以及双功能抗体HOLLINGER等人，PROCNATLACADSCIUSA901993，64446448。0018在特别优选的实施方案中，该抗体选自杂交瘤细胞系DSMACC2527或DSMACC说明书CN102078613ACN102078616A3/9页62517产生的抗体1B4C3IGG2A和2D1D12IGG1、其片段或其重组衍生物。1B4C3是导致HER3内在化的抗体，2D1D12是导致HER3稳定化的抗体。进一步优选与保藏的杂交瘤细胞系所产生的抗体具有基本相同的生物学活性例如实施例所述、例如结合到HER3的相同表位的抗体，例如嵌合或人源化抗体或其片段。按照。
18、BUDAPESTTREATYFORTHEDEPOSITOFMICROORGANISMS，杂交瘤细胞系DSMACC2517于2001年7月24日保藏在DEUTSCHESAMMLUNGVONMIKROORGANISMENUNDZELLKULTURENGMBHDSMZ，MASCHERODERWEG1B，38124BRAUNSCHWEIG，GERMANY。产生抗体1B4C3的杂交瘤细胞系DSMACC2527于2001年9月4日保藏在DSMZ。0019本发明的抗体可以偶联标记基团，特别用于诊断性应用。合适的标记基团的例子，例如放射性基团、荧光基团或其它标记基团为本领域已知。此外，特别对治疗性应用而言，该。
19、抗体可能偶联效应基团，例如细胞毒性基团，如放射性基团、毒素或本领域已知的其它效应基团。0020在进一步优选的实施方案中，该抑制剂可能选自非抗体来源的结合蛋白质，例如纤连蛋白III型结构域或ANTICALINSSKERRA，ENGINEEREDPROTEINSCAFFOLDSFORMOLECULARRECOGNITION，JMOLRECOG132000，167187以及在此引用的文献0021此外，本申请涉及HER3活性抑制剂的用途，用于制备药剂，供诊断、预防和/或治疗过度增殖性疾病，特别是肿瘤疾病，例如乳癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤或其它HER3表达或过表达的癌症或肿瘤转移。
20、形成，其中所述抑制剂结合到HER3可降低HER3介导的信号转导。该疾病可能与增强的HER3信号转导有关，并可能与相伴的HER2表达或缺少HER2表达有关。特别而言，该疾病与增强的HER3磷酸化、和/或增强的HER2/HER3异二聚体化、和/或增强的PI3激酶活性、和/或增强的CJUN末端激酶活性和/或AKT活性、和/或增强的ERK2活性和/或PYK2活性有关。0022令人吃惊的是，发现本发明的HER3抑制剂，特别是抗HER3抗体，在降低信号转导过程方面比HER2抑制剂、例如HERCEPTIN更为显著高效。特别而言，在黑色素瘤细胞中，抗HER3抗体有效，虽然黑色素瘤细胞表达HER2，但HERCE。
21、PTIN没有显著效果。0023优选地，本发明的HER3抑制剂具有至少一种下列特征0024降低HEREGULINP85与反式激活的HER3的结合，优选基本上完全抑制P85与HER3的结合，0025抑制GRB2结合到HER2、HER2结合到HER3和/或GRB2结合SHC，0026抑制受体酪氨酸磷酸化，0027抑制AKT磷酸化，0028降低肿瘤侵袭性，特别是乳癌和黑色素瘤，0029抑制PYK2酪氨酸磷酸化以及0030抑制ERK2磷酸化。0031本发明进一步涉及诊断、预防或治疗过度增殖性疾病、特别是肿瘤疾病的方法，其包含给予所需受试者例如人有效剂量的HER3活性抑制剂，其中所述抑制剂结合到HER3可。
22、降低HER3介导的信号转导。0032通过活性剂与生理上可接受的载体、稀释剂和/或助剂混合，将该HER3抑制剂、特别是抗HER3抗体配制成例如冻干剂型、含水溶液、悬浮液或固体制剂，例如片剂、糖锭剂或说明书CN102078613ACN102078616A4/9页7胶囊剂，如REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCES所述。0033该剂型可能包含多于一种的活性化合物，例如其它受体蛋白质酪氨酸激酶、例如EGFR、HER2、HER4或血管内皮生长因子VEGF的抑制剂。或者或另外，该组合物可能包含细胞毒性剂例如阿霉素DOXORUBICIN、顺铂CISPLATIN或卡铂CARBOPLAT。
23、IN、或细胞因子。0034本发明的抑制剂还适于诊断性应用，例如以便确定HER3的表达和/或对靶细胞的活性。这种诊断性应用可按照已知方法实现。0035根据待治疗疾病的类型及严重性，可给予人类患者约1G/KG15MG/KG的抗体，例如通过一次或多次分别给予或连续输注。典型的每日剂量可根据上述因素为约1G/KG至约100MG/KG或更多。对于几天或更长时间的重复给药而言，根据所治疗的疾病持续进行治疗，直至对疾病症状产生所需要的抑制为止。0036本发明进一步由以下附图及实施例进行说明。0037实施例00381单克隆抗体HER3ECD降低HER3和HER2的受体酪氨酸磷酸化0039根据其不同的HER2H。
24、ER3比值及其固有的迁移特性选择乳癌细胞系MCF7DKFZHEIDELBERG、MDAMB468ATCCHTB132和MDAMB231ATCCHTB26，MDAMB231是最具侵袭性的细胞系。为了与TRASTUZUMABHERCEPTIN比较HER3ECDUPSTATEBIOTECHNOLOGY，CAT05471的功能性作用，我们在HEREGULINHRG刺激之前，分别利用HERECD和HC预处理细胞，进行受体免疫沉淀实验，并利用抗磷酸酪氨酸抗体PY进行探测图1。我们的数据表明，利用HER3ECD预处理基本上降低HRG刺激后MCF7图1A和MDAMB231图1C中HER3和HER2的酪氨酸磷酸。
25、化程度，但反而提高MDAMB468中HER3的酪氨酸磷酸化图1B。HER3ECD甚至增强了HER2与HER3的结合，尽管酪氨酰磷酸化受体的含量显著下降图1A、B中上图泳道4和8。相比之下，所有细胞系在HRG存在与否的情况下，HC上调受体酪氨酰磷酸化并促进HER3与HER2的结合图1A、B、C上图泳道3、7、11和15。至于对HRG不敏感的MDAMB486细胞，使用HRG作为刺激物。00402HER3ECD取消SHC和PI3K与HER3以及GRB2与HER2的结合0041我们随后探询HER3ECD是否作用于HER3的已知底物，即分别引起MAPK级联活化以及脂质信号的效应蛋白质SHC和磷脂酰3OH。
26、激酶PI3K。因此，我们在上述实验条件下免疫沉淀SHC和PI3K，评估这些效应物的酪氨酸磷酸化。如图2所示，HER3ECD显著降低MCF7和MDAMB486细胞系中SHC的酪氨酸磷酸化图2A、B泳道13和16比较。引人注意的是，在MCF7细胞中SHC的结合衰减，而在MDAMB486中，HER3ECD引起HER3与SHC的结合提高。PI3K调节亚基的免疫沉淀产生基本相似的结果。酪氨酸磷酸化的HER3与PI3K的结合在MCF7中消失，在MDAMB486中则观察到提高图1B、2B。然而，利用HER3ECD预处理MDAMB486细胞，导致SHC和PI3K与HER3的结合提高，而HC再次在所有细胞系中显。
27、示交联特性。由于SHC在HRG刺激之后与连接分子GRB2结合，我们通过测定GRB2结合研究了SHC降低的酪氨酸磷酸化的作用图2C。为此我们按前述相同的实验设计，使用GSTGRB2融合子在MCF7细胞中进行GST下拉GSTPULLDOWN分析。降低的SHC酪氨酰磷酸化确实导致GRB2与SHC的结合剧烈下降图2C下图，比较泳道5和8，并完全说明书CN102078613ACN102078616A5/9页8抑制其结合HER2图2C中图，比较泳道5和8。这些数据清楚表明，HER3ECD在MCF7中抑制SHC和PI3K结合HER3，在MDAMB486中则不然，两种蛋白质都结合HER3，而与HER3的磷酸化。
28、状态无关。00423HER3ECD下调JNK1和PI3K活性0043连接蛋白质SHC介导生长因子受体下游的MAPK信号途径，分别活化ERK2和JNK。为研究HER3ECD对ERK2和JNK的作用，我们在MCF7和MB468中于相同实验条件下进行MAPK激酶分析图3。我们在所有细胞系中观察到JNK活性剧烈下降，但只在MCF7中检测到HC对JNK的等效作用图3A。ERK2活性通过HER3ECD仅仅略微但显著下降，而HC对ERK2活性没有作用数据略。由于最近证明PI3K与癌侵袭有关，我们研究了HER3ECD对PI3K活性的抑制特性，并进行了PI3K分析图3。在MCF7和MDAMB486中，与HRG处。
29、理的细胞相比，PI3K活性剧烈下降图3A、B。在MDAMB486中，HC对PI3K活性的作用甚至强于HER3ECD。这些数据提示，HER3ECD在MCF7和MDAMB486细胞中分别下调JNK和PI3K活性。00444HER3ECD增强HER3的内吞下调0045在HRG刺激之后，HER2和HER3被内吞并再循环。我们感兴趣确定HER3ECD介导的抑制HER3酪氨酸磷酸化是否起源于加速的内吞作用。为进一步理解，我们利用MCF7细胞，分别在HER3ECD或HRG存在与否的情况下，继之以HRG刺激，进行时间过程分析图4。然后在膜蛋白质生物素化之后，对HER3进行免疫沉淀。我们观察到利用HER3ECD。
30、预处理之后，HER3被快速内吞图4B上图。给予细胞HRG具有相同作用，差别在于，HER3于2小时以后回输到膜，3小时以后再次被内吞。利用PY探测全细胞裂解物WCL，作为对照图4B下图。与3小时后酪氨酰磷酸化蛋白质含量降低的HRG处理的细胞相比，利用HER3ECD预处理1小时后发生HER3的加速内吞作用。为比较HER3ECD和HC，我们利用HC和免疫沉淀的HER2进行相同实验图4A上图。惊人的是，利用HC预处理之后，HER2在任何时间点均未被内吞，而HRG则引起快速内吞作用。比较利用抗磷酸化酪氨酸PY探测的内吞受体及全细胞裂解物，清楚显示利用HER3ECD则磷酸化酪氨酸含量下降，利用HC则不然图。
31、4B下图。我们的数据表明，HER3ECD通过加速的内吞作用快速下调HER3，从而致使细胞对HRG刺激不敏感。00465AHER3ECD抑制乳癌细胞系的迁移和增殖特性0047为评价HER3ECD对乳癌细胞系迁移及增殖特性的生物学功能，我们在HER3ECD存在与否的情况下继之以HRG刺激，进行BRDU掺入分析。利用HER3ECD预处理使MCF7和MDAMB486的增殖分别降低287618和211762。观察到的增殖抑制与ERK2分析有关，而HC在这些细胞系中没有作用数据略。此外，为研究HER3ECD对乳癌细胞迁移特性的作用，我们在HER3ECD存在与否的情况下，利用MCF7和MDAMB486进行趋。
32、化CHEMOTAXIS实验。我们观察到MCF7和MDAMB486的迁移率分别剧烈下降591P0018和554P000005。另外，MDAMB231的迁移也被抑制35，但显著性略低P006。我们的数据清楚表明HER3ECD对MCF7和MDA468增殖和迁移的抑制作用。00486产生抗HER3的单克隆抗体0049我们然后利用HER3胞外部分和HISTAGC末端的重组人融合蛋白质说明书CN102078613ACN102078616A6/9页9HER36XHISCT免疫BALB/C小鼠，产生抗HER3胞外域的小鼠单克隆抗体。通过在HEK293细胞中转染、G418选择以及稳定表达构建体，获得免疫原，收集。
33、最高表达水平克隆的细胞培养上清，于硫酸铵沉淀、透析以及随后的金属离子亲和层析NINTA之后纯化蛋白质。利用WESTERN印迹进行质量保证数据略。按照厂家规程QIAGENIMMUNEASYMOUSEADJUVANT腹膜内注射22GHER36XHISCT进行免疫。使用标准方法得到产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系。00507抗HER3的单克隆抗体优先结合其蛋白质主链，并对HER3的内吞过程具有不同作用0051我们利用FACS分析鉴定了可特异性识别MCF7细胞表面的天然HER3的3株单克隆抗体数据略。1B4C2和1B4C3是IGG2A同型抗体，而2D1D12是IGG1同型抗体。未检测到与EGFR家族其它成。
34、员有交叉反应性数据略。然后我们试图确定该抗体结合HER3的糖基化结构还是结合HER3的蛋白质主链，及其对受体内吞调节的影响。为此，我们利用已知可防止细胞表面蛋白质N连接糖基化的抗生素TUNICAMYCIN，在其存在与否的情况下预处理MCF7细胞16小时。裂解细胞之后，我们利用单克隆抗体2F12针对HER3的胞内部分、HER3ECDHER3的胞外部分、1B4C2、1B4C3和2D1D12免疫沉淀HER3。我们的数据表明，HER3ECD、1B4C3和2D1D12均优先结合HER3的蛋白质主链，而1B4C3对HER3的糖基化形式也具有亲和性图6A。0052为研究1B4C3和2D1D12对HER3内吞。
35、过程的作用，我们分别利用1B4C3或2D1D12温育MCF7细胞不同时间，进行时间过程实验。将细胞表面蛋白质生物素化，利用抗HER3胞内域的抗体沉淀，利用链亲和素检测。我们观察到1B4C3类似于HER3ECD加速HER3的内吞作用，2D1D12则有稳定作用，从而在细胞表面积聚HER3图6B。00538单克隆抗体1B4C3和2D1D12抑制HER3和HER2的下游信号0054然后我们探询1B4C3和2D1D12是否可以抑制HER2和HER3底物SHC的酪氨酸磷酸化。由于GRB2与HRG刺激的HER2结合，并按与SHC相同的方式传递促分裂信号到MAPK途径，我们在未处理或经抗体预处理并随后经HRG。
36、刺激的MCF7细胞中免疫沉淀SHC，同时进行GSTGRB2下拉分析图6C。该实验表明，两种抗体均抑制SHC的酪氨酸磷酸化以及GRB2与SHC的结合。此外，该抗体抑制SHC和HER3的结合以及HER2和HER3的异二聚体化。这些数据表明，下游信号受1B4C3和2D1D12抑制，虽然2D1D12比1B4C3的抑制作用更强。00559单克隆抗体2D1D12抑制乳癌细胞系MDAMB435S、ZR751和黑色素瘤细胞系MELGERLACH的增殖0056我们然后着手研究1B4C3和2D1D12在两株乳癌细胞系MDAMB435SATCCHTB129、ZR751ATCCCRL1500以及黑色素瘤细胞系MELG。
37、ERLACHKLINIKUMGROHADERN，MUNICH中的生物学活性。我们因其在裸鼠中的致瘤性及其HER3高表达水平而选择这些细胞系。应当注意，黑色素瘤细胞过表达HER3，因为HER3在黑色素细胞MELANOCYTES以及少突胶质细胞OLIGODENDROCYTES的发育过程中是非常关键的。为了检验我们有关1B4C3和2D1D12取消促细胞分裂信号、因而取消癌细胞的增殖特性的假说，我们在抗体存在与否的情况下进行BRDU掺入分析图7。2D1D12极大降低所有细胞系的增殖，而1B4C3只在MELGERLACH中具有抑制作用。总之，我们的数据构成了第一个说明书CN102078613ACN102。
38、078616A7/9页10证据，证明抗HER3单克隆抗体可潜在视作抗癌的新治疗武器。0057产生抗体1B4C3和2D1D12的杂交瘤细胞系分别于2001年9月4日和2001年7月24日保藏在DSMZ。005810HER3抗体对信号转导的作用0059101方法0060MDAMB435S得自ATCCHTB129，MELJUSO得自CELLLINESSERVIVECLS0282HU。GSTP85AA333430得自SANTACRUZ。GSTGRB2如前所述纯化。PHOSPHOAKTPSER473来自NEWENGLANDBIOLABSNEB。HER2抗体按所述纯化自杂交瘤培养上清ATCCCRL1046。
39、3。GST下拉分析中使用125G诱饵BAIT蛋白质。如前所述进行BRDU掺入及侵袭分析。所有实验至少进行两次。0061102结果与讨论0062为了检测HER2和HER3受体在MDAMB435S和MELJUSO中的表面表达，我们另外利用FACS分析测定其表达水平图8A、B。我们观察了HER2和HER3在这些细胞系中的表达，继而仔细分析HER3抗体作用于HEREGULINHRG介导的信号转导的分子机制。为此，我们在人乳癌细胞系MDAMB435S和黑色素瘤细胞系MELJUSO中进行GST下拉分析图8。休眠细胞经HER3抗体1B4C3，2D1D12、对照抗HER2抗体以及PI3K抑制剂LY294002。
40、预处理，然后经HRG刺激。细胞裂解以后，归一化蛋白质水平，由于HER3具有6个潜在的P85结合位点，利用GSTP85AA333430为诱饵进行GST下拉分析。针对磷酸酪氨酸PY的WESTERN印迹表明，抗HER2和1B4C3同样降低P85与反式活化的HER3的结合，而LY294002阴性对照对MDAMB435S中P85的结合没有抑制作用图8C。然而，2D1D12几乎完全取消MDAMB435S中P85与HER3的结合图8C0063在人黑色素瘤细胞系MELJUSO中，1B4C3和2D1D12同样降低P85与HER3的结合，而抗HER2显示更显著降低P85的受体结合图8D。LY294002再次显示对。
41、P85的结合没有抑制作用图8D。此外，我们在磷酸酪氨酸印迹中观察到某些显著的酪氨酸磷酸化条带，在MDAMD435S中为125KDA和66KDA，而在MELJUSO中只有125KDA的一条主带。已知PI3K物理上结合粘着斑激酶FAK，因而我们利用FAK抗体重新探测该印迹图8C、D下图。我们的数据表明，在两株细胞系中，只有2D1D12和PI3K抑制剂LY294002可取消FAK与P85的结合。利用HER2和HER3抗体重新探测该印迹，确认捕获的HER3的量减少，其与HER2的异二聚体化降低图8C、D中图。总之，我们的数据表明，虽然HER3和HER2抗体降低受体酪氨酸磷酸化水平，但它们能够在受体结合。
42、效应蛋白质的次级水平调节不同的应答。0064由于GRB2只直接结合HER2，并通过SHC间接结合HER3，我们在相同的实验条件下利用GSTGRB2为诱饵以及上述人肿瘤细胞系进行另外的GST下拉实验图9A，B。我们观察到1B4C3和2D1D12减少160和185KDA之间的受体酪氨酸磷酸化，而LY294002没有抑制作用图9A、B上图。然而，利用抗HER2抗体预处理细胞导致受体酪氨酸磷酸化提高，这可由HRG进一步加强。利用HER2、HER3和SHC抗体重新探测表明，1B4C3和2D1D12基本上抑制GRB2结合HER2及其间接结合HER3图9A、B中图，及其在两株细胞系中与SHC的结合图9A、B。
43、下图。另一方面，抗HER2抗体提高GRB2与HER2和SHC的结合。0065为更加了解抗体介导的下游信号，我们还分析了上述实验的全细胞裂解物WCL说明书CN102078613ACN102078616A8/9页11图10。当我们关注总细胞蛋白质的磷酸蛋白质含量时，我们观察到在两株细胞系中，抗HER2组成型活化受体，而1B4C3和2D1D12抑制受体酪氨酸磷酸化图10A上图。LY294002仍没有作用。0066已经非常确定，HRG可活化促细胞分裂剂活化的蛋白质激酶MAPK途径，引起细胞增殖、细胞存活并增强各种基因的转录。为检测HER2和HER3抗体对HRG诱导的MAPK活化的作用，利用PHOSPH。
44、OERKT202/Y204抗体探测MDAMB435S和MELJUSO全细胞提取物的免疫印迹图10。MAPKERK1/2P44/P42的磷酸化表明，虽然活化受体，但抗HER2轻微降低ERK1磷酸化，而1B4C3和2D1D12对ERK1磷酸化没有抑制作用图10A中图。进一步重新探测该印迹，确认上样了等量蛋白质图10A下图。0067另外，我们研究了AKT的活化状态，AKT是PI3K的下游靶分子，在细胞存活中具有重要作用。我们观察到抗HER2、1B4C3和2D1D12显著抑制MELJUSO黑色素瘤细胞中AKT的磷酸化图10B上图。在MDAMB435S乳癌细胞中，HER2和HER3抗体均显著降低AKT磷。
45、酸化图10C。LY294002作为阳性对照。此观察结果极为重要，因为活化的AKT表达显著提高的乳癌患者更易复发远端转移，而致临床结果较差PEREZTENORIOG等人BRITISHJOURNALOFCANCER，86，5405452002。0068单克隆抗体1B4C3和2D1D12抑制乳癌细胞系MDAMB435S和黑色素瘤细胞系MELJUSO的增殖和迁移0069为评价1B4C3和2D1D12对细胞周期进程及肿瘤侵袭的抑制功能，我们进行了BRDU掺入及侵袭分析图11。0070我们发现在2D1D12预处理的MDAMB435S和MELJUSO细胞中，HRG刺激的BRDU掺入剧烈下降图11A。侵袭分析。
46、显示，抗HER3抗体2D1D12和1B4C3基本降低MDAMB435S乳癌和MELJUSO黑色素瘤细胞的侵袭力。令人惊讶的是，HER2抗体4D5只在MDAMB435S中显示抑制作用，在黑色素瘤细胞系MELJUSO中则不然，尽管在细胞表面表达受体图11B、C及图8A、B。我们的结果提示，可以使用抗HER3抗体治疗乳癌和黑色素瘤。0071单克隆抗体2D1D12抑制HEREGULIN刺激的PYK2磷酸化0072我们先前证明，胞内酪氨酸激酶PYK2可结合HER3并由HER3磷酸化，提示PYK2具有HER3活性介导剂的功能。与此相一致，显性失活的DOMINANTNEGATIVEPYK2可抑制HRG介导的。
47、神经胶质瘤细胞侵袭。为此，我们试图研究抗HER3抗体对HRG诱导的PYK2酪氨酸磷酸化的作用。我们利用抗HER2、1B4C3和2D1D12预处理休眠的SF767人神经胶质瘤细胞，然后利用HRG刺激细胞。裂解后按相同蛋白质数量归一化，我们免疫沉淀了PYK2，并针对磷酸酪氨酸PY进行印迹。我们观察到抗HER2和1B4C3对PYK2的酪氨酸磷酸化没有抑制作用，而2D1D12显著降低PYK2的酪氨酸磷酸化图12A。因此，抗HER3抗体可有效抑制HRG诱导的PYK2酪氨酸磷酸化。0073通过利用PHOSPHOERK抗体探测WCL的免疫印迹，我们观察到利用抗HER2、1B4C3和2D1D12预处理细胞可抑。
48、制HRG活化的ERK2磷酸化图12B中图。利用ERK抗体重新探测，确认上样了等量蛋白质图12B下图。我们的数据再次显示，HER3抗体可下调MDAMB435S、MELJUSO和SF767中HRG介导的信号事件。另外，我们的分析提示，针对HER2和HER3胞外域的抗体可调节不同的信号，引起下游效应蛋白质的不同响应。说明书CN102078613ACN102078616A9/9页12附图说明图1受体免疫沉淀实验，其表明单克隆抗体HER3ECD降低HER3和HER2的受体酪氨酸磷酸化。图2HER3ECD取消SHC和PI3K与HER3以及GRB2与HER2的结合。图3HER3ECD下调JNK1和PI3K活。
49、性。图4/5HER3ECD增强HER3的内吞下调。图6A针对HER3的单克隆抗体优选结合蛋白质主链，并对HER3的内吞过程具有不同作用。图6B1B4C3加速HER3的内吞作用，而2D1D12具有稳定作用且且在细胞表面上积聚HER3。图6C单克隆抗体1B4C3和2D1D12抑制HER3和HER2的下游信号。图7单克隆抗体2D1D12抑制乳腺癌细胞系MDAMB435S、ZR751和黑色素瘤细胞系MELGERLACH的增殖。图8A/B通过FACS分析的HER2和HER3受体在MDAMB435S和MELJUSO中的表达。图8C抗HER2和1B4C3同样降低P85与反式活化的HER3的结合，而LY294002阴性对照对MDAMB435S中P85的结合没有抑制作用；2D1D12几乎完全取消MDAMB435S中P85与HER3的结合图8D在人黑色素瘤细胞系MELJUSO中，1B4C3和2D1D12同样降低P85与HER3的结合，而抗HER2显示更显著降低P85的受体结合；LY294002对P85的结合没有抑制作用。图9A/B1B4C3和2D1D12基本上抑制GRB2结合HER2及其间接结合HER3。图10A1B4C3和2D1D12抑制受体酪氨。