一种胸腺生成素 -II 突变体 一 . 技术领域
本发明涉及基因工程重组蛋白领域， 其中该基因工程蛋白是一种胸腺生成素 -II 突变体。通过对天然蛋白的分子设计与基因工程改造， 得到了具有更高稳定性的胸腺生成 素 -II 突变体。 二 . 背景技术
免疫系统是人体的防御系统。 参与免疫反应的主要细胞有 T 淋巴细胞、 B 淋巴细胞 和巨噬细胞。而胸腺是 T 淋巴细胞发育、 分化的免疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子 ( 或 胸腺激素 ) 是 T 淋巴细胞发育分化所需的一系列必需物质， 其中最为重要的两种免疫增强 因子是胸腺素 α1(Tα1) 和胸腺生成素 -II。
胸腺素 α1 的结构和功能目前已经研究得非常清楚， 并且已经作为药品 ( 如日达 仙 ) 在市场上进行销售。相对来说， 对胸腺生成素 -I I 的研究较少。从机体免疫系统的复 杂性和协同性来讲， 胸腺生成素 -II 作为另一种重要的免疫增强因子， 值得进行深入的研 究。
胸腺生成素 -II 是最早 Goldstein 等从小牛胸腺分离出的一种多肽， 是一种 49 个 氨基酸的多肽， 由 13 种氨基酸组成的。相对分子质量为 4818Da。胸腺生成素 -II 具有调 节神经肌肉传导的作用和免疫激活作用， 能够促进胸腺细胞和外周 T 细胞及 B 细胞分化发 育， 并且能够双向调节机体失衡的免疫功能， 具有独特的生物学作用， 是一种重要的免疫调 节剂， 其 32-36 位氨基酸称为胸腺五肽， 是胸腺生成素 -I I 重要的功能活性部分。
通过研究发现了胸腺生成素 -I I 在体外酸性状态下 (pH5) 不够稳定， 容易水解， 水解的位置发生在序列中 6-7 位的 Asp-Pro 肽键处， 并且文献表明， 蛋白中的 Asp-Pro 序列 在酸性条件下易发生水解 (Acid-catalyzed peptide bond hydrolysis of recombinant human interleukin 11.Pharmaceutical Res.1994.Vol.11.NO1， 72-74)， 影响其分子稳定 性。所以本发明通过对胸腺生成素 -II 6 位的氨基酸位点改造， 从原来的 Asp 同源替换为 Glu， 解决了分子在体外不稳定的问题， 为其作为免疫增强药物的开发研究打下了基础。 三 . 发明内容
本发明的一个方面， 涉及一种胸腺生成素 -II 突变体， 其为 SEQ ID NO ： 2 所示的氨 基酸序列。
本领域普通技术人员知晓， 所述胸腺生成素 -II 突变体可以通过基因重组表达的 方法或者化学合成的方法制备。在本发明中， 所述胸腺生成素 -II 突变体是通过基因工程 重组表达的方法获得的。
在本发明的一个实施方案中， 通过如下方法获得胸腺生成素 -II 和胸腺生成 素 -II 突变体， 包括如下步骤 ：
1) 表达载体的构建
依据已知胸腺生成素 -II 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1)， 选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体 (SEQ ID NO ： 2)DNA 序列， 同时在相应 于所编码的氨基酸序列之 5’ 端和 3’ 端加上限制性酶切位点， 加入 EK 酶酶切位点， 得到编 码胸腺生成素 -II 突变体的核酸序列。
再分别将如上述制备的胸腺生成素 -II 序列和胸腺生成素 -II 突变体以及筛选质 粒 pBSK 用限制性内切酶处理好， 经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入 T4 连接体系。
用限制性酶切下融合蛋白基因， 再将该基因与用限制性酶处理好的 Pharmacia 公 司质粒 pGEX 连接， 经筛选得到正确的重组子 pGEX-T2.
2) 胸腺生成素 -II 和重组胸腺生成素 -II 突变体的表达及分离纯化
将如上述所得重组子转化到表达宿主菌 BL21， 经表达筛选出高表达基因工程菌 pGEX-T2/BL21， 然后经发酵， 离心收集目的蛋白高表达的菌体。 高压均质机破碎菌体并离心 得到含目的前体蛋白上清液， 将上清液上样到 GST 亲和柱上， 洗脱目的前体蛋白并用 EK 酶 酶切后， 再将样品通过阴离子柱进一步纯化， 使得最终目的蛋白纯度大于 95％。
3) 重组胸腺生成素 -II 突变体的体外生物活性测定
用 E 玫瑰花结实验对样品进行生物活力测试 ： 首先分离健康人外周血单核细胞， 6 使用小牛血清调整细胞数至 2×10 /ml。各取 200μl 细胞液加入 EP 管中， 再分别加入测试 样品胸腺生成素 -II 突变体 (100ug/mL) 与胸腺生成素 -II(100ug/mL)， 37℃水浴 90 分钟， 6 每支 EP 管中加入 200μl 绵羊红细胞 (2×10 /ml)， 4℃放置 3 小时， 涂片、 染色后放于高倍镜 下计数 200 个， 淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数 ( 结合 3 个或以上的为一个玫瑰花结 )。 计算玫瑰药形成细胞的百分数。按以下公式计算增殖率。
增殖率＝样品管药结百分比 - 对照药结百分比
经测试， 本发明生产的胸腺生成素 -II 突变体的体外生物活性优于胸腺生成 素 -II。
4) 重组胸腺生成素 -II 突变体的体外稳定性测定
经过测试， 经过改造后分子的体外稳定性大大提高。
5) 重组胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体的体内生物活性测定
7 周大的雌性 Balb/C 小鼠 ( 每组 6 只 ) 连续 10d 腹膜内分别注射 0.2mL 生理盐 水， 以及 30μg/kg 的胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体， 10d 后取血做流式细胞仪分 析。
经测试， 本发明生产的胸腺生成素 -II 突变体体内生物活性大于胸腺生成素 -II。
从上述结果可以看出， 本发明的胸腺生成素 -II 突变体提高了分子稳定性， 从而 提高了其体内生物活性。 四 . 具体实施方式
1. 胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体前体蛋白表达质粒的构建与工程菌的 获得
表达载体的构建
依据已知胸腺生成素 -I I 氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1)， 选用大肠杆菌偏好密码子 全基因合成胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体 (SEQ ID NO ： 2) 的 DNA 序列， 同时在 相应于所编码的氨基酸序列之 5’ 端和 3’ 端加上限制性酶切位点， 加入 EK 酶酶切位点， 得到编码胸腺生成素 -II 突变体的核酸序列。
GGA TCCTCT CAA TTT CTT GAA GAG CCT TCC GTT CTT ACTBanHI EK 酶切位点
AAA GAA AAG TTA AAA TCT GAA TTG GTC GCT AAT AAC GTC ACC TTACCT GCC GGT GAA CAA CGT AAA GAT GTT TAT GTC CAG TTG TAC TTA CAAACT TTG ACT GCT GTT A 从 CGT TAA TGA GAA TTC
EcoRI
目的片段经 BamH I、 EcoR I 双酶切后分别回收小片段， 质粒 PGEX 经 BamH I、 EcoR I 双酶切后回收大片段， 14℃在 T4 连接酶体系中两段目的基因片段进行连接， 经筛选得到 的重组质粒命名为 PGEX-T2。然后用 CaCl2 法转化大肠杆菌 BL21， 涂布在含有 100ug/ml 氨 苄青霉素的 LB 平板， 挑选阳性菌落在 LA 中培养至 OD600 为 0.6-0.8 时加入 IPTG 0.1mM 诱 导 3-4 小时离心收集菌体， 8M 尿素破菌后 15 ％ SDS-PAGE 电泳时出现一条 30KD 左右的蛋 白带， 表达量为菌体可溶性蛋白的 35％。所获得的高效表达前体蛋白的工程菌分别命名为 PGEX-T2/BL21.
2. 胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体的发酵
1). 摇瓶表达 ： 含胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体前体蛋白基因的 PGEX-T2/BL21， 在含 100ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中摇瓶过夜 (37 ℃， 200rpm)， 再按 1 ∶ 30 接种含有 100ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37℃培养 3 小时后， 加入 0.1mM IPTG 诱导 4 小时。收集菌体经 SDS-PAGE 电泳分析， 发现含胸腺生成素 -I I 和胸腺生成素 -II 突变体的前体蛋白 (30KD) 以可溶性表达为主， 表达量占菌体可溶性蛋白的 40％。
2) 发酵工艺 ：
a. 培养基 ：
a) 种子液培养基 (LA) ：
胰蛋白胨 ： 10 克 / 升、 酵母粉 ： 5 克 / 升、 氯化钠 ： 10 克 / 升、 氨苄青霉素 ： 100 微克 / 毫升。
b) 培养基 (15 升 ) ：
磷酸氢二钠 ： 375 克、 磷酸二氢钾 ： 80 克、 氯化钠 ： 10. 克、
氯化铵 ： 45 克、 胰蛋白胨 ： 50 克。
以上成分一起在罐中灭菌 ； 下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁 ： 15 克、 葡萄糖 ： 150 克、
补料 (500 克 / 升 ) ： 葡萄糖
b. 发酵过程 ：
(a) 种子培养 ：
从已鉴定的平皿上划取菌种， 接种到 50 毫升 (250 毫升的三角瓶 )LA 中， 37 度、 200 转 / 分、 8 小时后将这 50 毫升种子液转接到 700 毫升 LA 中， 36 度、 200 转 / 分， 过夜。
(b) 发酵过程 ：
将 培 养 好 的 种 子 液 (OD600 ＝ 3-4) 加 入 罐 中， 调 好 各 参 数， 37 度、 150 转、 溶氧 100％， 开始发酵 ； 5 小时后开始以 2.5 速流加 2 小时， 加入终浓度 0.3mM 的 IPTG 诱导 ( 五 小时 )。3. 胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体的纯化 ：
(1) 亲和层析
采用 GST Fast Flow 层析介质 (GE 公司 )， 平衡液采用 25mM Tris-HCl， pH8， 菌体 经过破碎并离心取上清， 上样平衡后， 裂菌的离心上清上 Glutathione Sepharose 层析柱， 平衡后用含 10mM 还原型谷胱甘肽 (GSH) 的洗脱液洗下融合蛋白。
(2) 酶解
上一步的洗脱液加入 EK 酶 (5NIHU/mL)37℃酶切 20 小时。
(3) 阴离子交换层析
采用 Source30Q 层析介质， 平衡液为 20mM PB， pH7， 上一步得到的样品用水稀释 1 倍进行上样， 平衡后采用 20mM PB， pH7， 0-1M NaCl， 20 个柱体积的梯度洗脱， 收集目的蛋白 洗脱峰。
4. 检测
得到的胸腺生成素 -II 和胸腺生成素 -II 突变体通过 SDS-PAGE 纯度检测和反相 HPLC 检测， 纯度均大于 95％。
5. 体外活性检测 E 玫瑰药结实验对样品进行生物活力测试 ：
基础细胞培养液 ： 1640 基 础 培 养 基 10.0g， NaHCO3 2.2g， Hepes5.9g， 丙酸钠 0.11g， 0.05M 巯基乙醇 2.0ml， ddH2O 1000ml ； 细胞培养基 ： 基础细胞培养基 90ml， 小牛血清 10ml， 双抗 ( 青霉素 + 链霉素 )100U/ml， 谷胱甘肽 0.03g/ml ；
测活培养基 ： 基础培养基 95ml 小牛血清 5.0ml， 双抗及谷胱甘肽浓度与上相同。 过 滤灭菌 ； 裂解液 ： SDS 10g， ， DMSO 25ml， ddH2O 19ml， 调 PH ＝ 4.7。
方法 ： 首先分离健康人外周血单核细胞， 使用小牛血清调整细胞数至 2×106/ml。 各取 200μl 细胞液加入 EP 管中， 再分别加入测试样品胸腺生成素 -I I 突变体 (100ug/ mL) 与胸腺生成素 -II(100ug/mL)， 37℃水浴 90 分钟， 每支 EP 管中加入 200μl， 绵羊红细胞 6 (2×10 /ml)， 4℃放置 3 小时， 涂片、 染色后放于高倍镜下计数 200 个， 淋巴细胞中形成玫瑰 花结的细胞数 ( 结合 3 个或以上的为一个玫瑰花结 )。计算玫瑰药形成细胞的百分数。
按以下公式计算激活率。
激活率＝样品管药结百分比 - 对照药结百分比
样品对 E 玫瑰花结形成率的影响
E 玫瑰花结形成数 阴性对照 胸腺生成素 -II(100ug/ml) 胸腺生成素 -II 突变体 (100ug/ml)
增殖率 0 14.1％ 21.5％26.2％ 40.3％ 47.7％由上表可知， 本发明生产的胸腺生成素 -II 突变体的体外生物活性优于胸腺生成素 -II。
6. 重组胸腺生成素 -II 和重组胸腺生成素 -II 突变体的体外稳定性测定通过上表可以看到， 重组胸腺生成素 -I I 突变体分子的体外稳定性与重组胸腺生 成素 -II 相比大大提高。
7. 体内活性检测
动物模型的建立 ：
7 周大的雌性 Balb/C 小鼠 ( 每组 6 只 ) 连续 10d 腹膜内分别注射 0.2mL 生理盐 水， 以及 30μg/kg 的胸腺生成素 -II 以及胸腺生成素 -II 突变体， 10 天后分离胸腺细胞做 + + 流式细胞仪分析 CD4 、 CD8 细胞数。
流式细胞仪分析
新分离的胸腺细胞中加入抗 CD4、 CD8 抗体， 阴性选择获得的 CD4-CD8- 细胞中加入 羊抗鼠抗体， 用 FACScan 流式细胞仪分析， Cell Quest 软件。
结果 ：
CD4+CD8+ 细胞群比例 生理盐水组 胸腺生成素 -II 组 胸腺生成素 -II 突变体组
1.5％ ±0.42 30.2％ ±1.10 52.3％ ±0.63从上表可以看出， 本发明的胸腺生成素 -II 突变体体内生物活性大于胸腺生成 素 -II， 推测是由于分子改造后其稳定性增强所造成的体内活性提高。
序列表
<110> 汪晓东
<120> 一种胸腺生成素 -II 突变体
<160>2
<210>1
<211>49
<212>PRT
<213>SEQ ID NO ： 1<400>1 Ser Gln Phe Leu Glu Asp 1 5 Thr Lys Glu Lys Leu Lys 15 Ala Asn Asn Val Thr Leu 25 Gln Arg Lys Asp Val Tyr 35 Leu Gln Thr Leu Thr Ala 45 <210>2 <211>49 <212>PRT <213>SEQ ID NO ： 2 <400>2 Ser Gln Phe Leu Glu Glu 1 5 Thr Lys Glu Lys Leu Lys 15 Ala Asn Asn Val Thr Leu 25 Gln Arg Lys Asp Val Tyr 35 Leu Gln Thr Leu Thr Ala 45Pro Ser Val Leu 10 Ser Glu Leu Val 20 Pro Ala Gly Glu 30 Val Gln Leu Tyr 40 Val Lys Arg 49Pro Ser Val Leu 10 Ser Glu Leu Val 20 Pro Ala Gly Glu 30 Val Gln Leu Tyr 40 Val Lys Arg 498