miRNA-195/497 化合物共同作为乳腺癌标志物的应用 【技术领域】
本发明涉及一种小分子 RNA， 即 miRNA-195/497 的用途， 属于生物医学材料技术领域。 背景技术
微小 RNA(miR) 是一类高度保守的， 非编码小 RNA， 通常由 19-25 核苷酸组成。 微小 RNA 在多种真核生物体中调控基因表达， 从而调控多种生物过程， 如发育、 分化、 代谢、 免疫、 细胞增生和调亡。通常， 单链的微小 RNA 通过反向互补碱基结合到靶基因的 3- 非翻译区而 导致翻译抑制， mRNA 切割及降解。在某些条件下， 微小 RNA 也可以上调靶基因的的翻。越 来越多的证据显示在正常组织和肿瘤组织之间， 或者不同肿瘤类型之间， 微小 RNA 和它们 的靶基因的表达是不同的， 提示了微小 RNA 可能在肿瘤生成中起原癌基因或抑癌基因的作 用。
乳腺癌是妇女常见的死亡原因。近年来， 研究证实微小 RNA 和乳腺癌相关， 它们可 能参与肿瘤生成， 将来也可能对治疗有作用。在乳腺癌中有的微小 RNA 表达上调， 有的下 调， 如 mir-21, mir-155, mir-10b, mir-125b 和 mir-145， 提示它们可能在起原癌基因或 抑癌基因的作用。实验室研究证实 mir-27a 和 mir-17-5b 的原癌作用， 以及 mir-9-1 的抑 癌作用。最近发现 mir-497 在乳腺癌中表达下调。既然 mir-195 和 mir-497 都位于染色 体 17p13.1， 位置相近， 更有文献显示两者的表达在某些肿瘤中可同时被抑制， 因而在乳腺 癌中同时研究 mir-195 和 mir-497 的作用会很有义意。
近来研究人员力图寻找导致微小 RNA 在肿瘤中表达不平衡的原因。遗传改变及表 观遗传改变都可以使微小 RNA 表达失调。启动子高甲基化是导致特定微小 RNA 表达静默的 常见原因。哺乳类的 DNA 常在 CpG 的 C-5 位点在 DNA 甲基转移酶的作用下被甲基化。这种 表观遗传修饰对哺乳类发育至关重要， 其异常引发很多疾病， 包括癌症。对于微小 RNA， CpG 岛的甲基化常常出现在有抑癌基因功能的微小 RNA 上， 比如 mir-127, mir-124a, mir-1, mir-148a 和 mir-34b。所以， 在抑癌的微小 RNA 的启动子 DNA 甲基化可能参与肿瘤生成。
用 Deep sequencing、 qPCR 和 northern blot 发现 mir-195 和 mir-497 在乳腺癌 中显著下调。最早人们发现 Mir-195 在心肌肥大时表达上调， 而它的过度表达在转基因鼠 中导致心脏病理性生长和心衰。近来， mir-195 被发现在多种癌症中表达下调， 比如胃癌， 肝癌， 膀胱癌等， 提示 mir-195 可能是一个抑癌基因 . 研究显示引入 mir-195 可以显著抑制 体外癌细胞形成集落以及裸鼠成瘤。同样地， mir-497 在很多癌症中也是显著下调， 比如胃 癌和乳腺癌。
关于 mir-195/497 作为乳腺癌的共同标志物的研究和 mir-195/497 作为乳腺癌一 种抑癌基因的用途未见文献报道。 发明内容
本发明旨在提供 miR-195/497 共同作为乳腺癌临床诊断标志物的应用。本发明旨在提供 miR-195/497 共同作为制备治疗乳腺癌药物的应用。
首先， 检测了 mir-195/497 在乳腺癌组织和细胞系中的表达情况。图 1A 所示临床 样品的生理学组织切片结果。RNA 印迹杂交技术表明 mir-195/497 在乳腺癌组织表达下调 （图 1B） 。此外， mir-195/497 在乳腺癌细胞系 MCF7， ZR-75-30， MDA-453， MDA-435， MDA-231 下调表达， 表明其扮演着抑癌基因的角色 （图 1B-C） 。
为了探讨引起 miR-195/497 在乳腺癌中低表达的机制， 我们采用 COBRA 的方法检 测人乳腺癌组织和癌旁组织中 CpG 岛的甲基化情况。 甲基化酶 TaqI 消化提示基因组 DNA 的 甲基化状态。 5 对人乳腺癌组织的分析结果表明其 Taq I 位点被显著甲基化 （图 2A） 。 在乳腺 癌细胞系 MCF7 和 ZR-75-30 中也可以观察到同样的情况。 相反， 对照组中 CpG18 却未被甲基 化。因此， mir-195/497 基因的启动子区在乳腺癌中发生了甲基化。为了确定 mir-195/497 的甲基化状态， 我们采用亚硫酸氢盐转化测序的方法检测了相应癌组织和细胞系中的 CpG 岛。结果表明乳腺癌组织 T2， T3 及细胞系 ZR-75-30 确切发生了甲基化， 而在正常的乳腺 DNA 中只散布着一些孤立的甲基化 CpG 岛 （图 2B） 。此外， 去甲基化试剂 AZA 处理的乳腺癌 细胞系介导了 miR-195/497 的表达。因此， 因此我们推测 mir-195/497 基因的启动子区甲 基化可能是其在乳腺癌癌中沉默的主要原因。 为了进一步研究 miR-195/497 在乳腺癌的分子机制， 我们对二者的功能进行了分 析。与对照相比， 乳腺癌细胞分别转染 mir-195/497 前体后均能显著的降低细胞克隆数 （图 3A） 。 此外， 转染 mir-195/497 会降低 ZR-75-30 和 MCF7 细胞的胶侵袭能力 （图 3B） 。 同时， 过 表达 mir-195/497 会引起细胞周期 G1 延滞和细胞凋亡 （图 3D） 。 这些结果提示， mir-195/497 可以显著抑制乳腺癌细胞的肿瘤形成。
miRNAs 主 要 是 通 过 调 控 靶 基 因 的 表 达 发 挥 其 生 物 学 特 性。 因 此 我 们 对 mir-195/497 靶 基 因 进 行 预 测。 结 果 表 明 RAF1 可 能 是 mir195/497 的 靶 基 因 （图 4B） 。 mir-195/497 对 Raf1 位点的保守性甚至比之前验证的 CCND1 作用位点更保守。荧光素酶 报告实验表明 mir-195/497 可以显著抑制 RAF-1 报告质粒荧光的表达， 而突变体则不然 （图 4C） 。图 4B 红色标示突变位点。miR-195/497 转染乳腺癌细胞系 ZR-75-30 和 MCF7, 蛋白免 疫印迹技术分析提示 RAF1 和磷酸化 Erk1/2 被显著抑制 （图 4D-E） 。
最后， 本发明探讨了 mir-195/497 在脑胶质瘤早期诊断中的意义。如图 5A 所示， 与正常对照组和乳腺纤维瘤组相比较 , mir-195/497 在恶性肿瘤组织中表达显著降低 （p<0.0001） ， 提示 mir-195/497 可以作为恶性乳腺癌肿瘤早期诊断的共同标志 （图 5A） 。此 外， 在恶性乳腺癌组织 Raf1（6/6） ， Erk1/2（6/6） ， 磷酸化 -Erk1/2（3/6） 具有明显表达 （图 5B） 。因此， Raf1 与 mir-195/497 的表达呈负相关。这进一步证实了 mir-195/497 与其靶 标 Raf1 之间的相互关系。研究结果表明， 对 mir-195/497 表达水平同人乳腺癌恶性程度呈 负相关， 系乳腺癌的共同标志物， 对乳腺癌临床早期诊断具有重要的应用价值。
本发明首次证明表明 miR-195/497 在乳腺癌中表达均显著下调， 原因是其启动子 上游 CpG 岛的甲基化所致。结合靶基因的预测方法我们发现 miR-195/497 在 RAF1 gene 中 有作用位点， 荧光素酶报告实验及免疫印迹证实了 RAF1 是 miR-195/497 的可能靶标。为进 一步研究 miR-195/497 在乳腺癌发生过程中的分子机制， 构建了能分别稳定表达 miR-195 和 miR-497 的乳腺癌细胞株。在此基础上， 进一步证实了 RAF1 是 miR-195/497 的直接靶 标。为探讨 miR-195/497 在乳腺癌早期诊断中的意义， 对乳腺癌临床各期标本进行了定量
研究。首次证明发现 mir-195/497 的表达水平和乳腺肿瘤的良恶性负相关， 故可作为乳腺 癌临床诊断共同标志物。 附图说明 图 1， Mir-195/497 在人乳腺癌组织和细胞系中下调表达。
A)H&E 染色对乳腺癌组织的病理检测。正常的乳腺癌组织包含高度分化的腺细胞 和乳管， 而在乳腺癌中， 未完全分化的细胞呈过度生长并且侵入到乳导管中。
B)Northern 印迹杂交分析 miR-195/497 的表达。miR-195/497 在正常的乳腺组 织高表达而在乳腺癌中则明显下调。C1-C5 代表 MCF7, ZR-75-30, MDA-453, MDA-435, MDA-231。
C) 实时定量 PCR 检测 mir-195， mir-497 和 mir-21 成熟体的表达， U6 作为标准化 对照。每个数据重复 3 次， 平均值 ± 方差， *, P<0.01 t 检验。
图 2， miR-195/497 在人乳腺癌组织及细胞系中的 DNA 甲基化分析。
A) 人乳腺癌组织及细胞系的 COBRA 分析。基因组 DNA 用亚硫酸氢盐处理， PCR 扩 增， 然后以 TaqI 酶消化。+ 代表 TagI 酶消化 ； - 代表不用 TaqI 酶消化。N， 癌旁组织 ； T， 肿 瘤组织。
B） 亚硫酸氢盐转化测序分析 17 号染色体 miR-195/497 上游 18 个 CpG 岛在脑胶质 瘤及细胞系中的甲基化状态。■甲基化 CpG 岛 ； □未甲基化 CpG 岛。
C) 实时定量 PCR 分析 miR-34c 在 DNA 甲基转移酶抑制剂 （AZA， 5- 氮杂 -2'- 脱氧 胞嘧啶核） 处理前后的乳腺癌细胞系中的表达差异。
图 3， miR-195/497 抑制乳腺癌细胞的生长和浸润。
A) 软琼脂克隆实验分析 MCF7 和 ZR-75-30 细胞系转染 mir-195/497 与对照组的差 异。
直径大于 50um 的克隆将被计数 （10X） , 实验重复 3 次。
B) 脑胶质瘤细胞系 MCF7 和 ZR-75-30 转染 miR-195 及 miR-C 的基质胶侵袭实验分 析 （×200） 。Mir-195 转染的乳腺癌细胞系呈显著下降 *, P<0.05。
C) 流式细胞计数分析 ZR-75-30 的细胞周期分布。Mir-195/497 过表达的乳腺癌 细胞呈显著的 G1 期延滞 （P<0.01 t 检验） 。
D） 蛋白免疫印迹检测激活型 Casp3 和 PARP 在 mir195/497 过表达乳腺癌细胞系中 的表达情况。Caspase 3 和 PARP 在转染 mir-195/497 的乳腺癌细胞系 ZR-75-30 中被剪切 激活， 暗示 mir-195/497 介导了细胞凋亡。
图 4， RAF1 是 mir-195/497 的直接靶标。
mir-195/497 在染色体上的分布。
B) 图示 miR-195/497 对 RAF1 的预测位点及其在不同物种中的保守情况。首先通 过 MiRanda v1.0b（Enright et al.2003） 预测软件针对 miR-195/497 可能作用靶基因的 3’ UTR 和 CDS 区域进行搜索， 然后在 UCSC 的基因组窗口浏览器中分析预测位点的保守型情 况 （NCBI36/hg18,http://genome.ucsc.edu/, 红色框标示相应预测位点） 。Raf1 位点的保 守性要好于之前发表的 mir-195/497 的靶标 CCND1。
C） RAF-1 在 mir-195/497 过表达乳腺癌细胞中的荧光素酶报告实验。过表达
miR-195/497 显著抑制了 RAF-1 载体的荧光表达。 （n=3, *p < 0.05） 。
D）蛋 白 免 疫 印 迹 分 析 RAF1 在 mir-195/497 转 染 的 乳 腺 癌 细 胞 株 中 的 表 达。 Mir-195/497 转染后 RAF1 的表达显著下调。Raf1 的表达模式同 CCND1 呈一致性。
E） RAF-1 及其下游基因在 mir-195/497 过表达的 MCF7 细胞株中的蛋白印迹结果。
miR- 195/497 可以显著抑制 RAF-1， ERK1/2， 磷酸化的 ERK1/2 的表达。
F） 慢病毒 miR-195/497 转染 MDM231 后的表达情况。半定量 RT-PCR 表明转染后的 细胞显著表达 miR-195/497， 2%DNA 琼脂糖电泳结果见图。同时 mir-195/497 转染后细胞生 长缓慢且生存期变短。
G) 蛋白免疫印迹分析 Raf1 在 MDM231 中的表达。同另一癌基因 CCND1 相似， Raf1 在 mir-195/497 转染 48 小时后被显著抑制， Beta-actin 作为参照。
图 5， mir-195/497 在人乳腺癌中的表达同恶性程度负相关。
A) 实时定量 PCR 分析 mir-195/497 在原发性乳腺癌中的表达。 正常组织来源于无 病个体 （n=9） ； 纤维乳腺瘤 （n=9） ； 侵袭性导管瘤 （n=23） 。U6 rRNA 作为标准化对照。相对 于正常组织 mir-195/497 在恶性瘤 （p=0.0306） 和早期瘤 （p《0.0001》 中呈显著下调。
B） 蛋白免疫印迹分析 Raf1 及其下游基因在乳腺癌组织中的表达。横线代表中位 值。恶性乳腺癌具明显表达的蛋白有 Raf1 （6./6） ， Erk1//2 （6/6） 和磷酸化 Erk1/2 （3//6） 。 具体实施方式 1. 乳腺癌临床样品采集 正常乳腺组织样品及脑胶质瘤组织样品由复旦大学附属华山医院和北京协和医院乳 腺外科组织样品库提供。组织样品经手术取出后， 以 PBS 或生理盐水清洗三次后迅速切成 小块， 大部分样品于 2ml 冻存管中置液氮中保存备用。小部分用多聚甲醛固定后用于组织 切片分析。用于分子分析的样本在液氮中研磨为粉末后分别提取 RNA 或蛋白质。
2. RNA 抽提 ： 每 100 mg 组织加入 1 mL Trizol， 用液氮研磨充分研碎组织块。加 入约 1/5 体积的氯仿， 上下颠倒充分混匀 1 分钟左右， 室温下静置 5 分钟。4℃， 12,000 rpm 离心 15 分钟后小心转移上清液入新的 1.5ml 离心管， 加入等体积的异丙醇， 轻轻颠倒混匀， 室温静置 10 分钟。4℃， 12000 rpm 离心 10 分钟后， 去上清， 向沉淀中加入 2/5 体积的 70% 乙醇， 4℃， 12000 rpm 离心洗涤沉淀 5 分钟。去上清， 将沉淀室温晾干后加入适量无 RNA 酶 的水充分溶解， 测定 OD260 和 OD280 值。采用无 RNA 酶的 DNA 酶 I 处理， QIAGEN RNeasy 试 剂盒纯化总 RNA， 详细操作原理和方法见试剂盒说明书。琼脂糖胶电泳评价总 RNA 质量， 在 凝胶成像仪上观测、 拍照， 保存图像， 一般认为 28S:18S ≥ 2 可以初步判定总 RNA 质量较好。
3. QR-PCR 检测方法 ： miRNA 的 qPCR 检测使用 invitrogen 的 Trizol 抽提总 RNA， 定量并质检。取 50-100ng 总 RNA 为模板， 使用针对特定 miRNA 的逆转录引物及 invitrogen 的 SuperScript III First-Strand Synthesis System 试剂盒合成 cDNA 。以 cDNA 为模 板， 使用针对目标 miRNA 的 PCR 引物及 Takara 的 SYBR(R) Premix Ex TaqTM 荧光定量 PCR 体系， 在 stratagen MX3000P 定量 PCR 仪上进行扩增， 并测得样品的 Ct 值。将所得 Ct 值通 过代入测定标准曲线得出的公式， 采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标 miRNA 的含 量。U6 基因作为内照对 miRNA qPCR 检测结果进行标准化校正。对于预测中的目标基因的 qPCR 检测使用 invitrogen 的 Trizol 抽提总 RNA， 定量并质检。取 3μg 总 RNA 为模板， 以
随机寡核苷酸为引物， 使用 invitrogen 的 SuperScript?? III First-Strand Synthesis System 试剂盒合成 cDNA。以 cDNA 为模板， 使用针对目标基因的特异引物及 Takara 的 SYBR(R) Premix Ex TaqTM 荧光定量 PCR 体系， 在 stratagen MX3000P 定量 PCR 仪上进行 扩增， 并测得样品的 Ct 值。同时测定待测样品中的看家基因 （如 ： β- 肌动蛋白、 GAPDH） 的 Ct 值， 以此来校正各组样品之间上样量差别， 将所得数据标准化后进行比较各组之间目的 基因的变化 （即相对定量法） 。
4. 细 胞 培 养 ： 人 乳 腺 癌 细 胞 株 DA-MB-231, MDA-MB-435s, MDA-MB-453, ZR-75-30, SK-BR-3, T47D 和 MCF 7 在 MEM 培养基 （Gibco, CA） 中细胞培养。培养基含有 10% 的 FBS （PAA Laboratories, Linz, Austria） 、 青霉素 （100 单位 /mL） 和链霉素 （100 ng/ mL） 。细胞 293A 培养在含有 10% FBS、 2 mM L- 谷氨酰胺、 MEM 非必需氨基酸溶液 （Gibco） 。 所有细胞置 37℃培养箱、 5%CO2 培养。
5. 细胞转染 ： microRNA 前体购自美国 Ambion 公司， 转染另设正常对照组， miRNA 前 体 组 和 miRNA 前 体 通用阴性对 照 组。细 胞于 铺板 18-24h 后 至 70%-80% 融合 开始 转 染， 所用试剂为 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)。转染按本室常规方法并参照说明 书进行。细胞于铺板 18-24h 后约有 70%-80% 融合开始转染， 所用试剂为 Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 具体转染方法参照说明书进行， 寡核苷酸及 siRNA 的工作浓度均为 100nmol/L。 6. 体外侵润实验 ： MCF 7 和 ZR-75-30 细胞分别用 miRNA-195/497 转染。 ， 转染 48 h 后的细胞（5×104 个） 悬浮于含 5% BSA 的 MEM 培养基中， 接种于铺有胶原膜的 24 孔培养 板中， 置于培养箱上层培养 24 h， 未吸附的细胞用棉签小心移除。 侵入胶原膜下表面的细胞 用细胞染色剂染色， 继而计数， 最终用微孔板读取器于 560 nm 处定量测定。
7. 流式细胞周期分析 ： MCF 7 和 ZR-75-30 细胞以 30% 密度接种于 12 孔培养板 中培养 24 h。分别转染 miR-195 和 miR-497 前体 （100 nM） 。转染 24 h 后， 用诺考达唑 （nocodazole） 处理 18 h。接着收集细胞并用 70% 的乙醇于 4℃下固定 24 h。固定后的细胞 用 PBS 洗涤后再分散于含有 10 mg/mL 碘化丙锭和 50 mg/mL RNase 的 PBS 溶液中 （500 mL） ， 室温下培养 30 min。 所得细胞用流式细胞仪进行分析测定 （BD FACSaria cell sorter, BD Bioscences, San Jose, CA, USA） 。
8. 蛋白印迹实验 ： 将分别转染 miR-195 和 miR-497 前体 （100 nM） MCF 7 和 ZR-75-30 细胞于 12 孔培养板中培养 48 h。 收集细胞， 抽取蛋白液进行 PAGE 电泳、 转膜。 多 克隆抗体 RAF1 (Santa Cruz, CA, USA) 和 CCND1（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA） 按照使用说明书稀释并于 4° C 下孵育过夜。随后与 AP- 标记的兔抗山羊 IgG 二 级抗体室温下孵育 2 h。最后采用 BCIP/NBT（Ameresco） 显色并用 Labworks Instrument software（UVP LLC, Upland, CA） 进行定量分析。β- 肌动蛋白表达水平作为内参照。
9. 荧光素酶报告实验 ： 人源 Raf1 和 CCND1 基因 3’ UTR 用下列引物进行 PCR 扩增 ： RAF1-3UTR-F: 5’ -GAATTCGCAATGAAGAGGCTGGTA-3’ , RAF1-3UTR-R: 5’ - CTCGAGGCCCAAAGGG ATAGAAA-3’ , CCND1-3UTR-F: 5’ -GGTACCGTTTGGCGTTTCCCAGAGT-3’ CCND1-3UTR-R: 5’ -CGTCTAGATGGCTAAGTGAAGCATGAGG-3’ 。
PCR 扩增产物克隆到 pmd-19t 载体 (TaKaRa)， 继而克隆到 pGL3-Control vector
（Promega）荧 光 素 下 游。 核 苷 酸 替 换 突 变 基 于 PCR 的 方 法 (KOD-Plus-Mutagenesis Kit,TOYOBO)。引物为 ： Mut 3’ UTR of CCND1: 5’ - CGACGAACCGTTGACTTCCAGGCAC-3’和 5’ - GCAATAAGAAAATGGAGCTGCGGCCT-3’ ; Mut 3’ UTR of RAF1: 5’ - CGACGAGCTAAGGACCTTCTAGACT -3’和 5’ - TTCTCTGAAAACATGTGTTC TGCCTC -3’ 。
上 述 质 粒 载 体 采 用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 分 别 与 miR-195 和 miR-497 前体共转染 ZR-75-30 细胞， 48 小时后按 Promega 提供的方法处理细胞， 在多功能 酶标仪 （BioTek） 读取荧光值。所有实验结果重复三次。
10. 组合亚硫酸氢钠限制分析实验 （COBRA）和亚硫酸氢钠测序实验 ： 采用 California Santa Cruz (UCSC) 大学数据库测定 CpG 岛 （CGI） 跨越 miRNA-34c 基因。用于 CGI 的组合亚硫酸氢钠限制分析 (COBRA) 采用 Methprimer 6 软件设计。 亚硫酸钠转换的基 因组 （只能将非甲基化的胞嘧啶转化为脲嘧啶） 用引物的特定链进行扩增， 继而用甲基化敏 感酶进行消化。纯化的 PCR 产物克隆到 pMD19 - T 载体 （TaKaRa ： D102A） 进行测序。用于 CGI PCR 扩增引物序列为 ： mir-195/497-CG-BSF1: GTGTTTATTTGTAGTGATTT, mir-195/497-CG-BSR1: TAACTCCCTCAATCTCTTATTCTT. 11. 慢 病 毒 制 备 和 滴 度 测 定 ： 在 10 厘 米 的 组 织 培 养 板， 9μg 的 pLemir – 195 （Openbiosystems） 或 pLemir - 497（Openbiosystems） 质 粒 及 包 装 混 合 物 26ul（Openbiosystems） 共 转 染 的 187.5 微 升 Arrest-In transfection reagent （Openbiosystems） 感染 6 × 106 HEK293T。转染 48 和 72 小时后收集含有该病毒培养上 清， 用 0.45 微米的过滤器 filted 和病毒储存分装。病毒滴定于转染前一天在 24 孔组织培 养板培养 HEK293T 细胞 （5 × 104） ， 稀释后的病毒液分别用于感染细胞， 感染后 48 小时后， 统计每毫升 RFP 表达细胞数， 计算病毒滴度。
12. 统计学分析 ： 所有数据取平均值 S.E 利用 Microsoft Excel 中的 Dunnett’ s 法进行数据分析。取双尾 p<0.05 认为具有统计学意义。