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一种 B 群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法
    技术领域 本发明涉及生物工程技术领域， 更具体的说， 本发明涉及一种 B 群脑膜炎重组蛋 白嵌合疫苗。同时， 本发明还涉及所述疫苗的制备方法。
     背景技术 流行性脑脊髓膜炎 （简称流脑） 是由奈瑟氏脑膜炎球菌 （Nesseria meningitidis） 引起的急性呼吸道传染病， 流脑是细菌性脑脊髓膜炎中唯一能造成流行的疾病， 引起相当 高的病死率和致残率。流脑呈世界范围分布， 全世界流脑的平均年发病率为 1 ～ 10/10 万， 在流行地区流行期间其年发病率可达 500/10 万以上。 流脑从病原体的发现至今已超过 100 年， 目前在世界上许多国家仍未能得到有效控制， 仍是世界范围的一个严重公共健康问题。
     脑膜炎疫苗是全球儿童常规接种的细菌性疫苗之一。目前， 该类疫苗的使用形式 主要是采取多糖或者多糖结合蛋白疫苗两种形式。由于 A、 C、 W、 Y 群多糖疫苗的应用， 有效 地降低了脑脊髓膜炎的发病率。而 B 群脑膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis group B, MenB) 荚膜多糖结构因与人体神经细胞黏附分子同源， 而不能激发有效的保护性免疫， 因此其多糖不能有效预防 B 群脑膜炎奈瑟菌的感染。因此， 发展通用的蛋白质疫苗势在必 行。
     能作为候选疫苗的具有免疫原性的蛋白质需具备以下特点 ： 在大多数菌株中都表 达且结构保守 ； 可诱生杀菌抗体或保护性抗体。现有技术中， 研制与应用的有 B 群外膜囊 泡 （OMV） 疫苗， 其主要包括单价的 VA-MENGOC-BC（古巴） 、 MenBvac（挪威） 、 MENZBTM（新西 兰） ， 以及荷兰研制出的 6 价 PorA OMV 疫苗， 此类疫苗有其局限性， 只能保护特定型别的 B 群 Nm。瑞士诺华公司 （Novartis） 研制的 5CVMB 疫苗三种主要的抗原为 GNA2132、 GNA1870、 NadA， 另外的两种抗原为 GNA1030、 GNA2091， 但是此类疫苗也具有菌株的保护性差异。另外 诺华公司研制的 FHBP 蛋白疫苗， 方法是对 FHBP 进行氨基酸的替换和删除， 已经开始二期临 床试验。
     当前， 国内外 B 群 Nm 疫苗研究主要集中于一些特别的外膜蛋白上。其中脑膜炎球 菌外膜上， 与脑膜炎球菌致病性密切相关的 FHBP（Factor H-binding Protein） ， 是一外膜 脂蛋白。由于具有较高的保守性成为了最有希望的 MenB 候选疫苗抗原之一。FHBP 即为为 H 因子结合蛋白。因子 H 是补体替代途径的关键调节子， 它在因子 I 介导的 C3b 裂解为灭活 片段 iC3b 过程中发挥辅助因子作用。也促进替代途径 C3 转化酶 C3bBb 的衰变。FHBP 和 因子 H 结合可下调替代途径， 从而有利于脑膜炎奈瑟菌生存。根据 FHBP 氨基酸的差异， 可 以将 MenB 分为 V1、 V2、 V3 三个 FHBP 变异型， 变异型内高度保守而变异型间差异较大， 针对 FHBP 的抗体在变异型内具有保护作用。分析 FHBP 氨基酸序列发现， FHBP 包含有三个结构 域 ABC， A 结构域在三个变型中是一致的， 抗 V1 的抗体由 B 结构域诱导产生， 而抗 V2 或 V3 的抗体由位于 C 结构域 174-216 位的氨基酸诱导产生。因此， 由 V1 变异型的全长 FHBP 和 V2 变异型位于 C 结构域的一段抗原表位组成的融合蛋白 (FHBP-C2) 能诱发机体产生针对所 有 MenB 的保护性抗体。
     本发明利用基因工程的手段， 构建表达纯化了一种 B 群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合 疫苗。此融合蛋白 (FHBP-C2) 大小约为 37KD, 能诱导机体产生高效价的抗体， 并且此抗体 能诱发补体依赖的杀菌反应。另外， 由于该蛋白能在大肠杆菌中表达， 例如 BL21, 因而有利 于大规模培养制备。发明内容
     本发明的目的在于针对现实状况的迫切需要， 利用基因工程的手段， 提供一种 B 群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。同时， 本发明还提供一种所述重组蛋白嵌合疫苗的制备 方法。 该方法所建立的质粒的构建、 蛋白的分离纯化方法， 可以制备数种脑膜炎球菌重组蛋 白嵌合疫苗。
     本发明的目通过下述技术方案予以实现。
     * 除非另有说明， 本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
     A. 本发明提供了一种 B 群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗， 该疫苗由下列成分组 成： 含有基因工程表达并纯化的 B 群脑膜炎球菌 FHBP 融合蛋白 75000μg / ml， 氢氧化铝 佐剂 1mg / ml。 其中， ① B 群脑膜炎球菌 FHBP 融合蛋白由 B 群脑膜炎球菌 FHBP 蛋白 V1 变异型全 长氨基酸序列和 V2 变异型位于 C 结构域的一段抗原表位通过 Gly-Pro-Gly 连接肽融合而 成； ② 按照 FHBP 蛋白的趋异性可以将 B 群脑膜炎球菌分为三个变异型， 该重组蛋白疫苗是 由变异型 V1 的全长 FHBP 与变异型 V2 的位于 174-216 位的一段氨基酸 (C2) 连接而成， 中 间是一段连接肽 Gly-Pro-Gly。
     该疫苗选自下述任一氨基酸序列 ： ① SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列 ； ②在严谨 的杂交条件下与编码① 的氨基酸酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列 ； SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列， 克隆入 pET30a(+) 载体后， 导入大肠杆菌 BL21， IPTG 诱导表达， 表达产物经 SDS-PAGE 及 Western 鉴定分析， 镍离子亲和层析柱纯化， 获得的融合蛋白， 该融 合蛋白具有 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列。
     本发明对所述的 B 群脑膜炎球菌蛋白嵌合疫苗进行了蛋白含量的检测， 检测结果 如下 ： 半成品蛋白含量 >50000μg/ml ； 成品蛋白含量为 75mg/ml ； 杀菌力试验 ： 杀菌抗体滴度达到 1:32。
     B. 本发明提供了一种所述的 B 群脑膜炎球菌蛋白嵌合疫苗的制备方法， 该方法采用下 述顺序的步骤 ： （1） 采用基因工程的方法， 搭桥 PCR 构建含有 V1 的全长 FHBP 和 V2 变异型的位于 C 结 构域的一段抗原表位的融合基因片段， 中间是一段连接肽基因， 即为 SEQ ID NO:1 所示的 核苷酸序列， 克隆入 pET30a(+) 载体后， IPTG 诱导表达 ； （2） 表达产物经 SDS-PAGE 及 Western 鉴定分析， 镍离子亲和层析柱纯化， 获得的蛋白 纯度达到 90% 以上 ； 分子量的大小约为 37kD， 可以判定为 FHBP-C2 融合蛋白， 具有 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列 ； 该抗原组分在测定蛋白含量后作为半成品疫苗 ；（3） 根据半成品疫苗蛋白浓度， 以生理盐水稀释至 150mg/ml， 同时与 AL(OH)3 以对倍 （V/V） 混合， 制成实验性蛋白疫苗， 并对其进行检测 ； 其半成品蛋白含量〉 50000μg/ml， 成品 蛋白含量为 75mg/ml ； 该疫苗即为所需的脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。
     本发明所提出的质粒的构建、 蛋白的分离纯化方法还可用于制备数种脑膜炎球菌 重组蛋白嵌合疫苗。
     与现有技术相比， 本发明具有下述突出的优点 ： （1） 保护率高 : 本发明研制的 B 群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗， 虽然仅含有 FHBP-C2 一个免疫原性的强的蛋白亚单位， 但是具有抗三个变异型菌株的抗原表位， 因此可以诱发 机体产生针对所有 MenB 的保护性抗体。
     （2）有效性高 ： 将本发明研制的人用脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗免疫小鼠， ELISA 结果检测显示本蛋白疫苗能够产生很高的抗体效价。充分说明本蛋白疫苗由于含有 一个免疫原性较强的蛋白亚单位， 因此能够诱导机体产生较强的免疫应答效果。
     （3） 安全性好 ： 该融合蛋白相对分子质量相对较小， 只保留了具有抗原性的蛋白亚 单位 ； 因此副反应大大降低， 具有更好的安全性。 附图说明
     图 1 是 PCR 产物的电泳图谱 ； 图中泳道 1 表示成功扩增出目的基因 FHBP, 大小约 为 750bp 。
     图 2 是酶切产物的电泳图谱 ； 图中泳道 1、 2 表明融合基因 FHBP-C2 成功的克隆到 了表达载体 pET-30-a 上， 大小约为 900bp 。
     图 3 是第二峰 3 号管的 SDS-PAGE(14%) 电泳图谱， 出现一条带， 大小为 37KD。
     图 4 是 3 号管的 Western Blot 结果， 采用脑膜炎球菌诊断血清作为一抗， 可见出 现一条特异性条带， 根据电泳中条带位置的分子量的大小， 可明确为 FHBP-C2 融合蛋白。
     图 5 是血清 IgG 的效价图， 两次免疫血清 IgG 滴度 15849， 实验组小鼠的抗体水平 较 PBS 对照组有显著性差异 (P<0.05)， 转阳率达到 100%。证明 FHBP-C2 能后有效地诱导机 体产生特异性的 IgG 抗体。 具体实施方式
     为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明作进一步详细说明。 应当理解， 所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明， 并不用于 限定本发明的保护范围。
     实施例 1 —— 基因工程菌的构建 采用基因工程的方法， 搭桥 PCR 构建含有 B 群脑膜炎球菌 V1 变异型全长 FHBP 蛋白和 V2 变异型的位于 C 结构域的一段抗原表位的融合基因片段， 中间是一段连接肽基因， 即为 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列， 克隆入 pET30a(+) 载体后 , 转化大肠杆菌 DH5α 菌株。 单 克隆扩增， 提质粒用 BamH Ⅰ /EcoR I 双酶切鉴定， 筛选阳性克隆， 测序。经鉴定序列准确， 融合基因成功的克隆到 pET-30-a 中。将测序正确的重组质粒 pET30-a- FHBP-C2 转化大肠 杆菌 BL21（DE3） ， 挑取单克隆， 接种于 5ml LB 培养基， 37℃培养过夜。再以 1% 接种量接种到 5ml LB 培养基中， OD600 值达 0.4 ～ 0.6 时， 加入 IPTG 至终浓度 100mg/ml， 诱导后每小 时取样 ,14％ SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达情况， 结果显示诱导剂浓度达到 100mg/ml, 诱导 时间为 6 个小时， 蛋白表达量最高， 选取表达量最高的的单菌落作为发酵用的工程菌种子。
     实施例 2 ——发酵方法 将高表达的工程菌接种到五个三角瓶 （每个瓶中 300mlLB 培养基） ， 过夜培养， 至 OD 值 达到 1.2 时， 接种到含 15L LB 培养基的发酵罐中， 优化发酵条件， 控制 PH 在 7.0， 连续培养 约 4 小时， 溶氧控制在 20%—30%， 每过一个小时测其 PH 和 OD 值， 并通过补加浓氨水调节 PH， OD 值达到 2 时， 逐级补料， OD 值达到 4.5 时左右时， 开始加诱导剂 15ml, 诱导后 6 个小时开 始收菌。
     实施例 3 ——目的蛋白的纯化 将表达优势菌株发酵扩大培养， 收集菌体超声破菌。分别用 TE+300mMNacl,TE+1%Trit on-x-100,TE+3M 尿素依次洗涤， 然后先后过 CM 离子柱和 Q-HP 离子柱， 纯度达 90% 以上， 经 SDS-PAGE 电泳分析以及 Wesrernblot, 分子量的大小约为 37kD， 确定目的蛋白是 FHBP-C2 融合蛋白。其具 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序列， 目的蛋白经 TE+5% 甘油 +50mMNacl 溶液 （PH8.0） 透析 24h 复性 , 超滤浓缩 ； 该抗原组分在测定蛋白含量后作为半成品疫苗。如表 1 所示， 处理后的包涵体液先后过 CM 柱和 Q-HP 柱后， 采用试管共收集到三个峰。实施例 4 ——实验性重组蛋白嵌合疫苗的制备 根据半成品疫苗蛋白浓度， 以生理盐水稀释至 150mg/ml， 同时与 AL(OH)3 以对倍 （V/V） 混合， 制成实验性蛋白疫苗， 该疫苗即为所需的 B 群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗。
     本发明对所述的 B 群脑膜炎球菌蛋白嵌合疫苗进行蛋白含量的检测， 检测结果如 下： 其半成品蛋白含量 > 50000μg/ml ； 成品蛋白含量为 75mg/ml ； 杀菌力试验 ： 杀菌抗体滴度达到 1:32。
     实施例 5 ——基因工程菌的构建 b 根据 GenBank 中登录的脑膜炎球菌 FHBP 以及合成的基因 C2 以及 SEQ ID NO:1 所示的 核苷酸序列设计两对引物 ： P1: GGATCCCTGACCACTGCCCTGATTC
     P2: GCCCGGGCCGGCAACTTCCTGGGCTTG P3: TTCAACGGGGCCCGGGCGCCAAACAG P4: GAATTCGCTGCCGTAGCGCGTGTC 本发明的 C2 是人工合成的， 是变异型 V2 的具有免疫效应的一段抗原表位， 它位于 FHBP 的 C 结构域， 因此命名为 C2。以 Men B 基因组为模板， 以 P1 和 P2 为上下游引物 PCR 扩增目 的基因 (FHBP)， 预变性 94℃ 5min， 98℃ 10 s， 59℃ 30 ｓ， 72℃ 1 min， 共 35 个循环。1% 琼脂糖电泳， 回收目的片段 (FHBP)。然后以此目的片段 （FHBP） 和合成的基因 C2 为模板， 以 P1、 P2、 P3、 P4 为引物， 搭桥 PCR 扩增融合目的基因 (FHBP-C2) 其具有 SEQ ID NO:1 所示的 核苷酸序列， 反应条件 ： 预变性 94℃ 5min， 98℃ 10 ｓ， 58℃ 30 ｓ， 72℃ 1 min， 共 30 个循 环。1% 琼脂糖电泳， 回收目的片段 (FHBP-C2， 具有 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列 )。目 的片段 （FHBP-C2， 具有 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列） 及表达载体 pET-30-a 经 Bam H Ⅰ 和 EcoR I 双酶切后， 用 DNALigationKit （TaKaRa） 16℃连接 8h， 转化大肠杆菌 DH5α 菌株。 单克隆扩增， 提质粒用 BamH Ⅰ /EcoR I 双酶切鉴定， 筛选阳性克隆， 测序。 经鉴定序列准确。 将测序正确的重组质粒 pET30-a- FHBP-C2 转化大肠杆菌 BL21（DE3） ， 挑取单克隆， 接种于 5ml LB 培养基， 37℃培养过夜。再以 1% 接种量接种到 5ml LB 培养基中， OD600 值达 0.4 ～ 0.6 时， 加入 IPTG 至终浓度 100mg/ml， 诱导后每小时取样 ,14％ SDS-PAGE 电泳检测蛋白表 达情况， 结果显示诱导剂浓度达到 100mg/ml, 诱导时间为 6 个小时， 蛋白表达量最高。 实施例 6 ——对所述的重组蛋白嵌合疫苗的免疫原性分析 取小鼠若干只， 分为三个实验组， 分别为实验组 9 只， 阳性对照和阴性对照各 7 只， 注射 剂量为 50ug/ 只。在小鼠的皮下注射， 第二次免疫一周后取血， 分离血清， 检测血清抗体的 滴度， 其结果见表二。检测结果表明实验组小鼠 100% 地出现了抗脑膜炎球菌抗体的阳转。 采用 ELISA 试剂盒检测抗 B 群脑膜炎球菌抗体的滴度， 结果可见免疫后实验组小鼠 100% 出 现了抗相应细菌抗原抗体的阳转。
     实施例 7 ——血清抗体的杀菌力实验分析结果 参照 Frash 等的方法， 将新鲜培养的 B 群脑膜炎奈瑟氏菌菌液与乳兔补体 1:1 混合， 再以 1:2 比例加入到各稀释度的热灭活的待测血清中， 混匀后 37℃培养 1h。最后加入 TTC 琼脂培养基， 37℃过夜后观察结果， 同时设有阳性血清 （诊断血清） 对照、 补体阴性对照。判 定结果时， 以与补体阴性对照孔相比， 50% 以上杀菌率的血清最高稀释度为血清抗体杀菌滴 度， 其结果见表 3。结果表明杀菌抗体滴度在免疫两次后即达到 32， 说明该蛋白疫苗能够诱 导补体依赖的杀菌反应， 从而对机体建立起有效的保护。8102028941 A CN 102028943序列表1/5 页序列表 SEQUENCELISTING SEQIDNO:1 <110> 中国医学科学院医学生物学研究所 <120> 一种 B 群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法 <160> 1 <170> PatentInversion3.5 <210> <211> <212> <213> 1 870 DNA Neisseriameningitidis(groupB)<400> 1 ctgaccactgccctgattctgaccgcctgcagcagcggaggcggcggtgtcgccgccgac atcggcgcggggcttgccgatgcactaaccgcaccgctcgaccataaagacaaaagtttg cagtctttgacgctggatcagtccgtcaggaaaaacgagaaactgaagctggcggcacaa ggtgcggaaaaaacttatggaaacggcgacagcctcaatacgggcaaattgaagaacgac aaggtcagccgcttcgactttatccgtcaaatcgaagtggacgggcagctcattaccttg gagagcggagagttccaagtgtacaaacaaagccattccgccttaaccgcccttcagacc gagcaagtacaagattcggagcattcagggaagatggttgcgaaacgccagttcagaatc ggcgatatagcgggtgaacatacatcttttgacaaacttcccgaaggcggcagggcgaca tatcgcgggacggcattcggttcagacgatgccagtggaaaactgacctacaccatagat ttcgccgccaagcagggacacggcaaaatcgaacatttgaaatcgccagaactcaatgtt gacctggccgcctccgatatcaagccggataaaaaacgccatgccgtcatcagcggttcc960 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660102028941 A CN 102028943序列表720 780 8402/5 页gtcctttacaaccaagccgagaaaggcagttactctctaggcatctttggcgggcaagcc caggaagttgccggcccgggcgccaaacagggacacggcaaaatcgaacacctgaaaaca cccgagcaaaatgtcgagcttgccgccgccgaactcaaagcagatgaaaaatcacacgcc gtcattttgggcgacacgcgctacggcagc SEQIDNO:2 <110> 中国医学科学院医学生物学研究所 <120> 一种 B 群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法 <160> 2 <170> PatentInversion3.5 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Neisseriameningitidis(groupB) <400> 287010102028941 A CN 102028943序列表3/5 页11102028941 A CN 102028943序列表4/5 页12102028941 A CN 102028943序列表5/5 页