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1、10申请公布号CN102094033A43申请公布日20110615CN102094033ACN102094033A21申请号201010589511322申请日20101215C12N15/53200601C12N15/29200601C12N9/02200601C12N15/63200601C12N15/82200601A01H5/0020060171申请人福建省农业科学院作物研究所地址350013福建省福州市晋安区新店新党72发明人朱海生74专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊54发明名称一种草莓NCED基因及其载体的构建57摘要本发明提供了一种草莓NCED基因。
2、及其载体的构建，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所示或与SEQIDNO1具有90以上同源性，且编码相同功能蛋白质的CDNA序列。本发明从草莓中克隆了9顺式环氧类胡萝卜素双氧合酶的编码基因，该基因在成熟、萎蔫、干旱、高温和抵温等过程或条件下对ABA的合成起着关键的调节作用。本发明为研究草莓ABA合成代谢机制奠定基础，为通过基因工程调控植物体内ABA的代谢和积累提供基因源。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页序列表4页附图1页CN102094039A1/1页21一种草莓NCED基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列是以下核苷酸序列之一1）如SE。
3、QIDNO1所示；2）与SEQIDNO1具有90以上同源性，且编码相同功能蛋白质的CDNA序列。2根据权利要求1所述的草莓NCED基因，其特征在于所述基因的氨基酸序列如SEQIDNO2所示或与SEQIDNO2具有至少95的同源性并具有相同功能的氨基酸序列。3含有如权利要求1或2所述基因的重组表达载体。4如权利要求3所述的重组表达载体转化的转基因植物。权利要求书CN102094033ACN102094039A1/3页3一种草莓NCED基因及其载体的构建技术领域0001本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及一种草莓NCED基因与该基因植物表达载体的构建。背景技术0002脱落酸作为一种在植物的整个生命。
4、循环中起着重要作用的激素，在植物胚胎发育、种子休眠与萌发、果实成熟以及植物对逆境胁迫的响应等许多方面具有广泛的生理效应，对植物的生长发育起着重要的作用。ABA的间接合成途径需要经聚合、环化、异构化、氧化、裂解等一系列复杂的反应变化，其中很多细节问题还不清晰，对其调节机理的研究也才刚刚起步，合成过程中涉及的各种基因如何表达，各种酶的特异性也有待进一步证实。9顺式环氧类胡萝卜素双氧合酶NCED催化9顺式紫黄质和9顺式新黄质裂解形成黄质醛，此步骤被认为是植物ABA生物合成的关键步骤，NCED被认为是ABA合成中的一个关键酶，对ABA的合成调控起到了十分重要的作用，NCED在果实成熟、萎蔫、缺水等过程。
5、或条件下对ABA的合成起着关键的调节作用。目前并没有关于草莓NCED基因的相关报道。发明内容0003本发明的目的在于提供一种草莓NCED基因及其载体的构建，为研究草莓ABA合成代谢机制奠定了基础，本发明采取的技术方案如下本发明的基因NCED来源于草莓（FRAGARIAANANASSADUCH），该基因的核苷酸序列是以下核苷酸序列之一1）序列表中SEQIDNO1。00042）与序列表中SEQIDNO1限定的CDNA序列具有90以上同源性，且编码相同功能蛋白质的CDNA序列。0005草莓NCED基因编码的9顺式环氧类胡萝卜素双氧合酶蛋白序列，编码具有序列表中SEQIDNO2所示的氨基酸序列或与序列。
6、表中SEQIDNO2所示的氨基酸序列具有至少95的同源性并具有相同功能的氨基酸序列。0006本发明还提供了一种草莓NCED基因的植物表达载体的构建。0007本发明的有益效果本发明从草莓中克隆了9顺式环氧类胡萝卜素双氧合酶的编码基因，该基因在成熟、萎蔫、干旱、高温和抵温等过程或条件下对ABA的合成起着关键的调节作用。本发明为研究草莓ABA合成代谢机制奠定基础，为通过基因工程调控植物体内ABA的代谢和积累提供基因源。附图说明0008图1为草莓NCED基因的克隆；其中ANCED基因的保守区产物；BNCED基因的说明书CN102094033ACN102094039A2/3页43RACE产物CNCED基。
7、因的5RACE产物；CORF克隆；D全长基因克隆MDNA分子量标准DL2000；图2为PBI121NCED限制酶分析；其中1XBAI和BAMHI双酶切PBI121NCEDMECOT14DIGEST。具体实施方式0009实施例1草莓NCED基因的克隆采用TRIZOL说明提取草莓果实总RNA。按大连宝生物有限公司的PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDNASYNTHESISKIT试剂盒的方法合成CDNA第一链，逆转录引物AP序列为5GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）173。0010根据GENEBANK里大豆、豇豆、菜豆、莱菔NCED基因序列设计一对保守区简并引物，上游N15G。
8、GKCACCACTTCTTCGACGG3，下游N25CTCTTCAAACTCTCVTCGCATTC3，以这两个引物进行PCR扩增，扩增出842BP的片段，如图1A所示。0011根据草莓NCED基因保守区克隆测序结果，设计3端顺式引物N3，引物序列为5ATCTGGGTTGAGTCGCCGG3，与通用引物AUAP配对进行PCR扩增，AUAP序列为5GGCCACGCGTCGACTAGTAC3。根据3RACE的原理，扩增出了3端805BP的片段，如图1B所示，其中包括一个含19个腺苷酸的POLY（A）。0012根据草莓已获得的NCED基因测序的基础上，设计了2个5端反式引物，分别为N45AAGAGGC。
9、GGTCGTTGAAGTA3和P55GTCTCCCGATTTCACGCTCC3。以大连宝生物有限公司的PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDNASYNTHESISKIT试剂盒为基础，以N4为引物合成CDNA第一链，CDNA第一链加同聚物尾，在加尾的基础上进行CDNA第二链的合成，产物用于PCR扩增。N5与通用引物AUAP配对进行PCR扩增。根据5RACE的原理，扩增出了5端581的片段，如图1C所示。0013根据草莓NCED保守区序列、5端、3端序列结果，拼接出全长CDNA，分别设计ORF引物N6和N7以及全长引物N8和N9，进行NCEDCDNAORF和全长克隆，验证已获得的序列，如。
10、图1中D、E所示，4个引物的序列为N65ATGGCTACTCCTTCGAATAGTTG3，N75CTATGCCTGGTTTTTCAAGGC3，N85GAAACAAAACACATAAAACACCTTGC3，N95AAGGCAGAACTCCTAAATATTTACC3。0014草莓NCED全长CDNA为序列表中SEQIDNO1，该CDNA全长2228BP，两端含有53BP的5非编码区和345BP的3非编码区，以19个腺苷酸的POLY（A）结尾。具有完整的开放阅读框（第54个碱基第1880个碱基），共1827个碱基，编码609氨基酸，编码序列表中SEQIDNO2蛋白质。0015实施例2草莓NCED基因。
11、植物表达载体构建根据草莓NCED基因CDNA全序列的编码区、植物表达载体PBI121的多克隆位点，设计一对特异引物用于NCED基因完整开放阅读框的扩增，分别在5和3引入XBAI和BAMHI酶切位点（NCEDX5GCTCTAGAATGGCTACTCCTTCGAATAGTTG3；NCEDB5CGGGATCCCTATGCCTGGTTTTTCAAGGC3），PCR扩增产物经XBAI和BAMHI双酶切，回收NCED基因片段。植物表达载体PBI121质粒用XBAI和BAMHI双酶切，回收载体片段。将NCED基因片说明书CN102094033ACN102094039A3/3页5段和PBI121的载体片段在T。
12、4连接酶的作用下16连接过夜，连接产物转化感受态ECOLIDH5，涂在含有KAN的LB平板上，挑取单菌落分别以PCR、酶切和测序进行验证，如图2所示，鉴定为阳性的重组表达质粒命名为PBI121NCED即为构建好的植物表达载体。说明书CN102094033ACN102094039A1/4页6福建省农业科学院作物研究所一种草莓NCED基因及其载体的构建212228DNA草莓（FRAGARIAANANASSADUCH）1GAAACAAAACACATAAAACACCTTGCGTGCATAGTCACAAAAACACACTAGCTATGGCTA60CTCCTTCGAATAGTTGGGCTCACACGGCC。
13、CAAATACCTCACCACCTCTCCACCACCTCCT120CCACATCTTCTTCTTCTTCACTACTAAACATGAGCTTCCCCAAAAGATCCGTCGCCTTGA180ACAGAAATAGAACCGTCACCGCTCACTCGGCTCTCCAGTCTCCTTCAGTTCTTAACTTCC240CAAAACAGCCATACCATCAGCAAGTTATTACAAAAGAGGCCACTTCATCACCCTCAGCAA300AGCCTAAAACCGCAACTACAACACAGCAACCTCCACACTGGAACTTCCTCCAGAGAGCTG360CCTCCACCGCCTTG。
14、GACATGTTGGAGGGAGCTTTGGTCTCTCGTGAGAGCCGAAGCCCTC420TCCCCAAAACCGCCGACCCACGTGTCCAAATCGCCGGGAACTTCGCTCCCGTTCCGGAGC480AACCTGTCCGTCATTCACTATCCATTTCCGGCACCATACCCGAATGCATTAGCGGCGTCT540ACGTCCGTAACGGCGCCAACCCTTTACACGAGCCGGTCGCGGGGCACCACTTCTTCGACG600GTGACGGCATGGTTCACGCCGTTAGCATCAATGACGGTGCCGCCAGCTACGCATGTCGGT66。
15、0TCACTGAAACCCAAAGGCTGGTCCAGGAGCGTGAAATCGGGAGACCCGTTTTCCCAAAAG720CCATAGGCGAGCTCCACGGCCACTCCGGAATCGCACGTCTCGCCTTGTTTTACGCTCGCG780GCGCTTTGGGCCTTGTGAACCCCAGCCAAGGCATCGGAGTTGCCAACGCCGGCTTAGTCT840ACTTCAACGACCGCCTCTTGGCCATGTCCGAGGACGACATGCCGTACCAAGTCCGAATCA900CACCCTCCGGCGACATCGAAACAGTCGGCCGCTACGACTTCGAGACC。
16、CAACTCGGGTCCA960CAATGATCGCCCACCCGAAAGTCGACCCGGTATCCGGTCACCTCCACACTCTCAGCTACG1020ACATCGTGAAAATGCCTTACCTGAAATACTTTCAATTCTCCGCCAACGGGGAGAAGTCTC1080CGGACGTGGAGATCCCTCTGGCGGCCCCCACAATGATGCACGACTTCGCCATCACCGAAA1140ACTTCGTCGTGATTCCCGACCAGCAGGTGGTGTTCAAGCTGCAGGAGATGATCACCGGCG1200GGTCGCCGGTCATCTATGATCAGAATAA。
17、GAAGTCGAGGTTTGGAATACTCGCCAAAAATG1260CCACTAACGCTGATGATATAATCTGGGTTGAGTCGCCGGACACCTTTTGCTTCCACTTGT1320GGAATGCGTGGGAGGAGCCGGAGTCCGACGAGGTTGTTGTGATCGGATCATGCATGACTC1380CACCGGACTCAATATTTAACGAGTGTGACGAGAGCTTGAAGAGTGTGTTGTCCGAAATCC1440GGCTCAACTTGAAAACCGGCGAGTCGAAGAGGAGGCCAATTATTTCCGAGGAGGCGGATC1500ATGTGAAC。
18、TTGGAGGCGGGAATGGTGAACCGGAACCTTCTCGGTAGAAAGACTCGGTATG1560CTTATCTCGCCATTGCTGAACCGTGGCCCAAAGTTTCTGGTTTCGCCAAGGTAGATCTTT1620TTACTGGCGAAGTAAAAAAGCATATTTACGGGGACAGGAAGTTCGGTGGTGAGCCTTTCT1680TTCTTCCTTCGAGTTCAACTGGGGAAGAAGATGAAGGTTATATTCTGAGCTTTGTTCACG1740ACGAGAAGACGTGGAAGTCGGAGCTTCAGATTGTGAACGCCGTGAGTTTGAA。
19、GGTGGAAG1800序列表CN102094033ACN102094039A2/4页7CCACTGTGACGTTACCGTCAAGAGTTCCGTATGGATTTCACGGCACGTTCATAGACTCCA1860AGGCCTTGAAAAACCAGGCATAGCAGTAGCTGGAGAACATAGTAGGACGGAATTATTACC1920GTCTTTGGATGGTTAAAAATTAGAGGGGTTGACGACGATCAGGGGAAATTTACCAGAGGG1980ATGGGTAGACAGGCCCCCGGATTCTCCTGGAGTATTTAAAACCCTAACCACCTTTTGGTT2040。
20、TTTTGGTAGGCTTTTTTAGGCTATAAGGTTTTGATCGAGCAGGAACCAGCTTGTAGCTTT2100TGGACTGTAGGTACCTTTTGAGCTCAGCTGGTTTCGATCTGTTTCTTTCTTCCTTCTTCT2160CCATCTTTTTACTCTGTCGTAAATGGTAAATATTTAGGAGTTCTGCCTTAAAAAAAAAAA2220AAAAAAAA22282609PRT草莓（FRAGARIAANANASSADUCH）2METALATHRPROSERASNSERTRPALAHISTHRALAGLNILEPROHIS151015HISLEUSERT。
21、HRTHRSERSERTHRSERSERSERSERSERLEULEUASN202530METSERPHEPROLYSARGSERVALALALEUASNARGASNARGTHRVAL354045THRALAHISSERALALEUGLNSERPROSERVALLEUASNPHEPROLYS505560GLNPROTYRHISGLNGLNVALILETHRLYSGLUALATHRSERSERPRO65707580SERALALYSPROLYSTHRALATHRTHRTHRGLNGLNPROPROHISTRP859095ASNPHELEUGLNARGALAALASERTHRALALEUASPME。
22、TLEUGLUGLY100105110ALALEUVALSERARGGLUSERARGSERPROLEUPROLYSTHRALAASP115120125PROARGVALGLNILEALAGLYASNPHEALAPROVALPROGLUGLNPRO130135140VALARGHISSERLEUSERILESERGLYTHRILEPROGLUCYSILESER145150155160GLYVALTYRVALARGASNGLYALAASNPROLEUHISGLUPROVALALA165170175GLYHISHISPHEPHEASPGLYASPGLYMETVALHISALAVALSERILE18。
23、0185190序列表CN102094033ACN102094039A3/4页8ASNASPGLYALAALASERTYRALACYSARGPHETHRGLUTHRGLNARG195200205LEUVALGLNGLUARGGLUILEGLYARGPROVALPHEPROLYSALAILE210215220GLYGLULEUHISGLYHISSERGLYILEALAARGLEUALALEUPHETYR225230235240ALAARGGLYALALEUGLYLEUVALASNPROSERGLNGLYILEGLYVAL245250255ALAASNALAGLYLEUVALTYRPHEASNASP。
24、ARGLEULEUALAMETSER260265270GLUASPASPMETPROTYRGLNVALARGILETHRPROSERGLYASPILE275280285GLUTHRVALGLYARGTYRASPPHEGLUTHRGLNLEUGLYSERTHRMET290295300ILEALAHISPROLYSVALASPPROVALSERGLYHISLEUHISTHRLEU305310315320SERTYRASPILEVALLYSMETPROTYRLEULYSTYRPHEGLNPHESER325330335ALAASNGLYGLULYSSERPROASPVALGLUILEPROLEUALA。
25、ALAPRO340345350THRMETMETHISASPPHEALAILETHRGLUASNPHEVALVALILEPRO355360365ASPGLNGLNVALVALPHELYSLEUGLNGLUMETILETHRGLYGLYSER370375380PROVALILETYRASPGLNASNLYSLYSSERARGPHEGLYILELEUALA385390395400LYSASNALATHRASNALAASPASPILEILETRPVALGLUSERPROASP405410415THRPHECYSPHEHISLEUTRPASNALATRPGLUGLUPROGLUSERASP420425。
26、430GLUVALVALVALILEGLYSERCYSMETTHRPROPROASPSERILEPHE435440445ASNGLUCYSASPGLUSERLEULYSSERVALLEUSERGLUILEARGLEU450455460ASNLEULYSTHRGLYGLUSERLYSARGARGPROILEILESERGLUGLU465470475480ALAASPHISVALASNLEUGLUALAGLYMETVALASNARGASNLEULEU485490495GLYARGLYSTHRARGTYRALATYRLEUALAILEALAGLUPROTRPPRO序列表CN102094033ACN1。
27、02094039A4/4页9500505510LYSVALSERGLYPHEALALYSVALASPLEUPHETHRGLYGLUVALLYS515520525LYSHISILETYRGLYASPARGLYSPHEGLYGLYGLUPROPHEPHELEU530535540PROSERSERSERTHRGLYGLUGLUASPGLUGLYTYRILELEUSERPHE545550555560VALHISASPGLULYSTHRTRPLYSSERGLULEUGLNILEVALASNALA565570575VALSERLEULYSVALGLUALATHRVALTHRLEUPROSERARGVALPRO580585590TYRGLYPHEHISGLYTHRPHEILEASPSERLYSALALEULYSASNGLN595600605ALA序列表CN102094033ACN102094039A1/1页10图1图2说明书附图CN102094033A。